JP4822409B2

JP4822409B2 - タンパク質の分析方法

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Publication number: JP4822409B2
Application number: JP2005304478A
Authority: JP
Inventors: 祥夫鈴木; 憲二横山; 一寿生田目
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Katayanagi Institute; Sharp Corp; Toppan Inc
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Katayanagi Institute; Sharp Corp; Toppan Inc
Priority date: 2005-10-19
Filing date: 2005-10-19
Publication date: 2011-11-24
Anticipated expiration: 2025-10-19
Also published as: EP1947453A1; EP1947453A4; US20090045060A1; US8062492B2; WO2007046537A1; JP2007114009A; EP1947453B1

Description

本発明は、電気泳動によりタンパク質を効率的に検出、定性分析又は定量分析する方法に関する。

体内のタンパク質を網羅的に調べて病気の状態や原因を探るプロテオーム研究が進められており、例えば、ガンマーカータンパク質のように疾患の目印となるタンパク質を決定しようとする研究が進んでいる。

また、近年ではDNAチップ技術の向上によりRNAの発現を網羅的に解析するトランスクリプトーム解析も盛んに行われている。しかしながら、このRNA発現プロファイルとタンパク質の発現プロファイルとは必ずしも一致するわけでなく、その相関は50％以下であると言われている。そのためには、RNAの網羅的解析に加えて、タンパク質の網羅的解析が重要であり、最近では著しく発達している二次元電気泳動法や質量分析さらにはプロテインチップのようなゲノム解析に匹敵するハイスループット分析を駆使して、タンパク質の機能を明らかにする試みがなされている。

このように、タンパク質の研究の発展ともに、より効率的にタンパク質を分析する方法が求められており、多種多様なタンパク質を簡便かつ迅速に分析する技術の確立が重要となっている。

タンパク質を分析する方法として電気泳動法が広く行われている。プロテオーム研究において電気泳動法は、例えば、正常組織及び疾患組織に含まれるタンパク質成分を互いに比較するために用いられたり（ディファレンシャルディスプレイ）、タンパク質同定に用いるタンパク質を調製するために用いられたりしている。

電気泳動法では検出のためにタンパク質を染色（標識）する必要があるが、染色方法としては大きく分けて２つに分類される。

１つは電気泳動を行う前にタンパク質を標識する前染色法であり、もう１つは電気泳動を行った後に標識する後染色法である。前者に使用される方法として、Ettan DIGE法、後者に使用される方法としてBio-Safe CBB染色法、及びSypro Ruby染色法が挙げられる。それぞれの方法の特徴を以下の表に示す。

Ettan DIGE法では、電気泳動を行う前に試料中のタンパク質は共有結合により蛍光試薬で予め標識される。この方法は全操作時間が短く、汎用性も高いが、１つのタンパク質分子に複数の蛍光試薬が結合し、しかもタンパク質ごとに蛍光試薬の結合数が異なるため、プロテオーム解析において、電気泳動により分離されたタンパク質の質量分析ができない。

後染色法であるBio-Safe CBB法及びSypro Ruby法の場合、電気泳動終了後に、
ａ．タンパク質のゲルへの固定化とSDSの除去
ｂ．蛍光試薬によるタンパク質の染色
ｃ．余分な蛍光試薬の洗浄
ｄ．検出
といった一連の複雑な工程を経なければならない。特に、ａとｃの操作を省いたり、あるいは操作時間を短くしたりすると、タンパク質が蛍光試薬によって十分に染色されなかったり、バックグラウンドの蛍光が高くなってしまったりするために、タンパク質のスポットを検出することが困難になるという問題が生じる。

本発明者らは、タンパク質と錯体を形成してその蛍光や発光が変化することにより、タンパク質を迅速且つ簡便に分析できる試薬を報告している（特願２００５−１６７６１３号）。

特願２００５−１６７６１３

本発明は、タンパク質の分析に用いられる電気泳動法に関連する問題点、即ち：
・操作工程数が多く、また時間がかかる
・検出感度が悪い
・分離後のタンパク質を質量分析することができない
などの問題を解決し、多種多様なタンパク質を迅速、簡便に且つ高感度で分析することを可能とする、電気泳動法を用いるタンパク質の分析方法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、試料を電気泳動用ゲルにセットし、特定の標識化合物を溶解させた電気泳動用緩衝液を用いて試料の電気泳動を行ない、次いで標識化合物とタンパク質との複合体を分光学的測定により検出することにより、タンパク質を迅速、簡便に且つ高感度で分析することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は以下の発明を包含する。

（１）試料を電気泳動用担体にセットし、式Ｉ：

［式中、Ｒ_１は置換されていてもよいアリール基又はヘテロアリール基であり、Ｒ_２は置換されていてもよい複素環式基であり、ｎは１〜５の整数である。］
の標識化合物を溶解させた電気泳動用緩衝液を用いて試料の電気泳動を行ない、次いで式Ｉの化合物とタンパク質との複合体を分光学的測定により検出することを含む、試料中のタンパク質の分析方法。

（２）Ｒ_２が、式ＩＩ：

［式中、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、互いに独立して、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、フェニル基（該フェニル基はアミノ基、ハロゲン及びニトロ基から選択される１つ以上の基により置換されていてもよい）、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基（若しくはその塩、エステル、アミド）、スルホン酸（若しくはその塩、エステル、アミド）、チオール基、水酸基（若しくはその塩）、炭素数１〜１０のアシル基、ハロゲン及び糖からなる群より選択され、Ｘは窒素原子、酸素原子又は硫黄原子であり、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６のいずれかは結合である。］
で表される基である前記（１）記載の方法。

（３）Ｒ_１が、置換されていてもよい、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基又はフリル基である前記（１）又は（２）記載の方法。

従来の電気泳動法によるタンパク質の分析方法では、感度・精度が低かったり、操作が煩雑であったり、時間がかかる等の欠点があったが、本発明の方法は以下の特徴、
・標識試薬とタンパク質とは非共有結合による複合体であるので、電気泳動により分離されたタンパク質をさらに質量分析により解析することが可能となる；
・工程及び操作が簡略化されるとともに、時間を大幅に短縮化（特に染色及び洗浄時間）することができる；
・検出感度が良い；
を有し、試料中のタンパク質を電気泳動法を用いて短時間で正確に且つ簡便に検出、定性分析及び定量分析することができる。

本発明は、試料を電気泳動用ゲルにセットし、式Ｉ：

［式中、Ｒ_１は置換されていてもよいアリール基又はヘテロアリール基であり、Ｒ_２は置換されていてもよい複素環式基であり、ｎは１〜５の整数である。］
の標識化合物を溶解させた電気泳動用緩衝液を用いて試料の電気泳動を行ない、次いで式Ｉの化合物とタンパク質との複合体を分光学的測定により検出することを含む、タンパク質の分析方法である。なお、本発明において言う「タンパク質」とは、アミノ酸残基が数十残基程度である「ペプチド」も含む概念である。

本発明の方法では、先の出願（特願２００５-１６７６１３号）に記されているタンパク質分析用標識試薬を用いて電気泳動を行うことにより、タンパク質の染色（標識）と分離とが同時に行われる。そのため、ゲル電気泳動を行うための緩衝液中に予め標識試薬を混ぜておく。電気泳動が開始されると、標識試薬は電気浸透流に乗ってゲル中に染み込み、ゲルにセットされた試料中に存在するタンパク質と複合体（CT錯体）を形成する。複合体を形成することにより標識試薬の蛍光や発光等が変化するので、これを分光学的手段（目視による確認も含む）を用いて測定することにより、タンパク質を分析する。

本発明で用いられる電気泳動用担体としては、電気泳動の担体として通常使用されるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、膜（セルロールアセテート膜、ニトロセルロース膜又はポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜等）及びゲル（ポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル等）等が挙げられる。本発明においては、担体としてゲルを用いることが好ましく、とりわけＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いることが特に好ましい。

式Ｉで表される化合物は分析試料中に含まれるタンパク質を標識(染色)するためのものであり、タンパク質と複合体を形成することによりその蛍光、発光、発色、吸収波長（紫外部、可視部、赤外部の吸収等）等が変化し又は生じ、それを分光学的手段（目視による確認も含む）により検知することが可能な化合物がこのましい。

式Ｉにおいて、Ｒ_１は置換されていてもよいアリール基又はヘテロアリール基であり、Ｒ_２は置換されていてもよい複素環式基であり、ｎは１〜５の整数である。

アリール基としては、例えば、フェニル、２〜４個のベンゼン環が縮合した多環芳香族基（例えば、ナフチル、アントリル、ピレニル）等が挙げられる。また、ヘテロアリール基とは、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群より選択される少なくとも１個のヘテロ原子をその環原子として含有するアリール基をいう。これらのアリール基又はヘテロアリール基はさらに別の芳香環又は複素芳香環と縮合したものであってもよい。アリール基及びヘテロアリール基の具体例としては、例えば、ピリジル基、フリル基、ダンシル基、クマリン、ベンゾチアゾ−ル、フルオレセイン、ローダミン、アゾベンゼン等が挙げられる。

前記アリール基又はヘテロアリール基は、炭素数１〜１０（好ましくは炭素数１〜６）のアルキル基、炭素数１〜１０（好ましくは炭素数１〜６）のアルコキシ基、フェニル基（該フェニル基はアミノ基、ハロゲン及びニトロ基から選択される１つ以上の基により置換されていてもよい）、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基（若しくはその塩、エステル、アミド）、スルホン酸（若しくはその塩、エステル、アミド）、チオール基、水酸基（若しくはその塩）、炭素数１〜１０（好ましくは炭素数１〜６）のアシル基、ハロゲン及び糖からなる群より選択される１つ以上の基により置換されていてもよい。前記アリール基又はヘテロアリール基は、水溶性及び電子供与性の付与のために水酸基で置換されていることが好ましい。

複素環式基としては、蛍光基又は発色基（紫外部、可視部、赤外部の吸収、蛍光の測定が可能なもの）であって、少なくとも１つのヘテロ原子を環原子として有し、式Ｉのオレフィン部分-(CH=CH)n-と共役系を形成するものが好ましく、そのようなものとしては、例えば、クマリン、ベンゾチアゾ−ル、フルオレセイン、ローダミン等が挙げられる。本発明では、式ＩＩ：

［式中、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、互いに独立して、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、フェニル基（該フェニル基はアミノ基、ハロゲン及びニトロ基から選択される１つ以上の基により置換されていてもよい）、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基（若しくはその塩、エステル、アミド）、スルホン酸（若しくはその塩、エステル、アミド）、チオール基、水酸基（若しくはその塩）、炭素数１〜１０のアシル基、ハロゲン及び糖からなる群より選択され、Ｘは窒素原子、酸素原子又は硫黄原子であり、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６のいずれかは結合である。］
で表される基が好ましく、さらには、下記式：

で表される基が好ましい。

蛍光基又は発色基であるＲ_２に、アルケニル基及び芳香族基を接続することにより共役系が伸長し、蛍光・発色波長の長波長化が促される。

式Ｉの化合物は公知の方法により容易に合成することができる。例えば、下記式：

の化合物は、４-ヒドロキシベンズアルデヒドと4-(ジシアノメチレン)-2,6-ジメチル-4H-ピランとをエタノール中、塩基（例えばピペリジン等のアミン）の存在下で反応させることにより製造することができる。

次に、本発明の方法の手順について説明する。本発明の方法は、従来の方法と比較して電気泳動法を用いる点では同じだが、標識に用いる化合物及び工程が簡略化されている点で異なる。本発明と従来法との比較を以下のスキームに示す。

即ち、従来の方法では、電気泳動終了後にタンパク質を検出するまでに、電気泳動−タンパク質の固定化−染色−洗浄−検出、という一連の工程が必要であったが、本発明の方法では式Ｉの化合物を標識試薬として用いることにより、電気泳動を行いながらタンパク質を染色−検出、という短い工程で行うことができ、分析に要する時間を大幅に短縮することができる。

本発明の方法では、まず、タンパク質が含まれている試料を電気泳動担体にアプライする。電気泳動用緩衝液としては通常用いられるものでよいが、本発明ではこれに式Ｉの化合物を溶解させたものを用いる。そして、通常の方法と同様にして電気泳動を行って試料中のタンパク質を分画する。

電気泳動を行っている間に、式Ｉの化合物を含む緩衝液は電気浸透流により移動しながら、それと同時に疎水性相互作用及び電荷移動相互作用により試料中のタンパク質と複合体（電荷移動錯体）を形成する（即ち、タンパク質が標識される）。複合体を形成することにより、式Ｉの化合物に固有の吸収波長や吸収強度又は蛍光波長や蛍光強度等に変化が生じる。この変化は色調の変化として目視で観察できる場合もある。

電気泳動終了後、担体（ゲル）を取り出す。担体は所望により洗浄液で洗浄してもよい。取り出した担体は、蛍光、発光、発色、吸収波長（紫外部、可視部、赤外部の吸収等）等を検知できる分光学的手段（例えば、蛍光光度計・吸光光度計。また目視による確認も含む）により観察する。蛍光を生じる試薬を用いた場合には蛍光検出器で、可視部に吸収波長を生じる試薬を用いた場合には目視で観察することにより容易にタンパク質のスポットを検出することができる。このようにして、試料中のタンパク質を検出又は定性分析することができる。また、蛍光、発光又は発色等の強度を測定することにより定量分析することも可能である。

本発明の方法は、１次元電気泳動だけでなく２次元電気泳動にも応用することができる。

以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１：色素１の合成

50ml三口フラスコに、4-ヒドロキシベンズアルデヒド0.70g(5.81mmol)、4-(ジシアノメチレン)-2,6-ジメチル-4H-ピラン1.0g(5.81mmol)、ピペリジン0.50g(5.81mmol)、エタノール50mlを加え、Ar気流下、12時間加熱還流した。溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー(SiO₂, CHCl₃ : MeOH = 10 : 1 v/v)で精製し、目的化合物を得た。収率 30％。

実施例２：色素２の合成

50ml三口フラスコに、バニリン0.70g(5.81mmol)、4-(ジシアノメチレン)-2,6-ジメチル-4H-ピラン1.0g(5.81mmol)、ピペリジン0.50g(5.81mmol)、エタノール50mlを加え、Ar気流下、12時間加熱還流した。溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー(SiO₂, CHCl₃ : MeOH = 10 : 1 v/v)で精製し、目的化合物を得た。収率 20％。

実施例３：色素３の合成

50ml三口フラスコに、4-ヒドロキシ-1-ナフトアルデヒド0.70g(5.81mmol)、4-(ジシアノメチレン)-2,6-ジメチル-4H-ピラン1.0g(5.81mmol)、ピペリジン0.50g(5.81mmol)、エタノール50mlを加え、Ar気流下、12時間加熱還流した。溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー(SiO₂, CHCl₃ : MeOH = 10 : 1 v/v)で精製し、目的化合物を得た。収率 25％。

実施例４：１次元電気泳動によるタンパク質の分析
標識試薬として実施例３で調製した色素３を用いた。電気泳動は担体としてSDS-ポリアクリルアミドゲルを用いる１次元電気泳動であり、その測定条件は以下のとおりである。
＜電気泳動装置＞
Sure Blot F1 Gel system：アステラス製薬株式会社製
＜電気泳動用緩衝液＞
色素３のストック溶液（500mg/mL濃度のDMSO溶液）をSure Blot F1 Gel system付属の電気泳動緩衝液で希釈し、0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mLとした溶液を用いた
＜試料中のタンパク質濃度＞
[BSA]＝0.08〜20μg/well及び[Sheep IgG]＝0.21〜50μg/well
＜洗浄液の組成＞
AcOH：MeOH：H₂O＝3：10：87v/v
＜蛍光検出装置＞
ProXpress imaging system (Perkin-Elmer社製)及びLS400 scanner (Tecan社製)

上部バッファー（陰極側）に電気泳動緩衝液（色素３の濃度0.5mg/mL）を加え、試料（BSA及びIgG）をアプライしたSDS-PAGEをセットして電気泳動を行った。電気泳動終了後、ゲルを取り出して蛍光検出器を用いて観察した（図１Ａ）。その後、洗浄液を用いてゲルの洗浄を30分間行い、蛍光検出器を用いてタンパク質のスポットを観察した（図１Ｂ）。

また、色素３の濃度を0.1mg/mLとした電気泳動緩衝液を用いて同様にして電気泳動を行った。電気泳動終了後、ゲルを取り出して蛍光検出器を用いて観察した（図２Ａ）。その後、洗浄液を用いてゲルの洗浄を30分間行い、蛍光検出器を用いてタンパク質のスポットを観察した（図２Ｂ）。

いずれの場合においてもタンパク質のスポットが明瞭に確認され、タンパク質が電気泳動中に標識試薬と複合体を形成して、蛍光を発するように変化したことがわかる。また、図１Ｂ及び図２Ｂに示されるように、ゲルを洗浄することによりバックグラウンドが低減して、より明瞭にタンパク質のスポットを検出することができた。さらに、図２Ａ及び図２Ｂに示されるように、電気泳動緩衝液中の標識試薬の濃度を0.1mg/mLにすることによってもタンパク質のスポットを明瞭に観察することができた。

実施例５：２次元電気泳動によるタンパク質の分析
標識試薬として実施例３で調製した色素３を用いた。２次元目の電気泳動にSDS-ポリアクリルアミドゲル担体を用いた。測定条件は以下のとおりである。
＜電気泳動装置＞
１次元目：等電点電気泳動(Isoelectric focusing); ZOOM IPG runner system (Invitrogen社製)
２次元目：SDS-PAGE Sure Blot F1 Gel system (アステラス製薬株式会社製)
＜電気泳動用緩衝液＞
色素３のストック溶液（500mg/mL濃度のDMSO溶液）をSure Blot F1 Gel system付属の電気泳動緩衝液で希釈し、0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mLとした溶液を用いた
＜試料中のタンパク質濃度＞
[Mouse Brain Lysate]＝40μg/strip
＜洗浄液の組成＞
AcOH：MeOH：H₂O＝3：10：87v/v
＜蛍光検出装置＞
ProXpress imaging system (Perkin-Elmer社製)及びLS400 scanner (Tecan社製)

試料を等電点電気泳動(Isoelectric focusing)にかけて１次元目の電気泳動を行った。次いで、上部バッファー（陰極側）に電気泳動緩衝液（色素３の濃度0.5mg/mL）を加え、試料をアプライしたSDS-PAGEをセットして２次元目の電気泳動を行った。電気泳動終了後、ゲルを取り出して蛍光検出器を用いて観察した（図３Ａ）。その後、洗浄液を用いてゲルの洗浄を30分間行い、蛍光検出器を用いてタンパク質のスポットを観察した（図３Ｂ）。いずれの場合においてもタンパク質のスポットが明瞭に確認され、タンパク質が電気泳動中に標識試薬と複合体を形成して、蛍光を発するように変化したことがわかる。また、図３Ｂに示されるように、ゲルを洗浄することによりバックグラウンドが低減して、より明瞭にタンパク質のスポットを検出することができた。

本発明のタンパク質の分析方法により多種多様なタンパク質のハイスループット解析が可能となり、本発明の方法は、例えば、生化学、医療、分析化学、プロテオーム研究等の分野において、高感度、網羅的かつ簡便なタンパク質の分析に有用である。

実施例４による電気泳動後の蛍光観察図である（標識試薬濃度0.5mg/mL； A：洗浄前、B：洗浄後；励起波長 480nm；検出波長530nm）実施例４による電気泳動後の蛍光観察図である（標識試薬濃度0.1mg/mL； A：洗浄前、B：洗浄後；励起波長 480nm；検出波長530nm）実施例５による２次元電気泳動後の蛍光観察図である（標識試薬濃度0.1mg/mL； A：洗浄前、B：洗浄後；励起波長 480nm；検出波長530nm）

Claims

試料を電気泳動用担体にセットし、式Ｉ：

［式中、Ｒ_１は置換されていてもよいアリール基又はヘテロアリール基であり、Ｒ_２は置換されていてもよい複素環式基であり、ｎは１〜５の整数である。］
の標識化合物を溶解させた電気泳動用緩衝液を用いて試料の電気泳動を行ない、次いで式Ｉの化合物とタンパク質との複合体を分光学的測定により検出することを含む、試料中のタンパク質の分析方法。
Ｒ_２が、式ＩＩ：

［式中、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、互いに独立して、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、フェニル基（該フェニル基はアミノ基、ハロゲン及びニトロ基から選択される１つ以上の基により置換されていてもよい）、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基（若しくはその塩、エステル、アミド）、スルホン酸（若しくはその塩、エステル、アミド）、チオール基、水酸基（若しくはその塩）、炭素数１〜１０のアシル基、ハロゲン及び糖からなる群より選択され、Ｘは窒素原子、酸素原子又は硫黄原子であり、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６のいずれかは結合である。］
で表される基である請求項１記載の方法。
Ｒ_１が、置換されていてもよい、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基又はフリル基である請求項１又は２記載の方法。