JP4889263B2 - 検体処理方法、乳房炎の検査方法及び細菌性疾病検査キット - Google Patents

Description

本発明は、検体処理方法、乳房炎の検査方法及び細菌性疾病検査キットに関し、特に、細菌と細胞とが混在している検体を処理する検体処理方法、これを利用した乳房炎の検査方法、及び細菌性疾病検査キットに関する。

細菌性疾病、例えば細菌性乳房炎の防除には、早期の感染個体又は感染分房を発見し、適切な治療を行うと共に、移動、別搾あるいは廃用など、蔓延防止的な対処も肝要となる。特に感染力が強いと考えられている黄色ブドウ球菌に関しては、牛群に蔓延する前の感染早期段階で感染牛を特定することが極めて重要である。
現在、乳汁中の黄色ブドウ球菌の検出法としては、細菌培養検査法及び免疫抗体法が広く用いられているが、操作が複雑であり、所要時間も長時間になるため、頻回でしかも多頭、多分房単位での定期感染モニタリングとして使用するには現実的でない。
このような問題を解消するために、細菌遺伝子増殖、即ちＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いた黄色ブドウ球菌遺伝子の定量的検出方法が開発された（非特許文献１〜３）。この方法では、わずか１ｍｌ程度の乳汁を検体とし、黄色ブドウ球菌を遺伝子レベルで検出することができるため、乳房炎の検出を高い精度で安定して大量に行うことができる。

このように、細菌性疾病の検査では、検体中の細菌の有無を検出することが重要である。検体には、原因菌の他に被検対象由来の細胞などの夾雑物も存在していることが多く、原因菌の同定及び定量的な検出を行うために、効率よく原因菌を収集することが必要である。
例えば、特許文献１では、血液中の菌を血球と分離するために、アルカリ金属の水酸化物などを用いて血球を除去している。特許文献２では、微生物を補足可能なフィルターを用いて遠心分離を行い、簡単且つ短時間に微生物を収集可能としている。
国際公開第２００３／０３５８９９号パンフレット 特開２００４−１８０５５１号公報 日本乳房炎研究会プロシーディング、２００３年、第８巻、ｐ.３４〜３７ 畜産技術、２００４年、第５９３巻、ｐ.２〜５ 獣医畜産新報ＪＶＭ、２００５年、第５８巻、第７号、ｐ.５８７〜５９０

しかしながら、重篤な乳房炎の乳汁には、細菌の混入と同時に、好中球やリンパ球、乳腺からの脱落細胞などの細胞が大量に混入する。また、乳房炎に限らず、重度の疾病では検査対象外の細胞が検体中に大量に混入していると、フィルターなどでは機能を充分に発揮することができず、充分に分離することができない。また溶液処理では操作が複雑になり、効率よく細胞を除去できない。
従って、本発明は、細菌性疾病の病因細菌（以下、単に「細菌」と称する場合がある）と検体由来の体細胞（以下、単に「細胞」と称する場合がある）とが混在している検体に対して、精度よく短時間で、細菌性疾病、例えば乳房炎の検査を実施可能にすることを目的とする。

本発明の検体処理方法は、細菌と細胞とが混在している検体を処理する検体処理方法であって、検体と吸着液とを混合して、試料液を調製すること、表面電荷に基づいて細菌よりも細胞に親和性を有する細胞吸着担体と前記試料液とを接触させること、前記細胞吸着担体との接触後の試料液を回収すること、を含むものである。

本発明の乳房炎の検査方法は、乳汁由来の検体と吸着液とを混合して、試料液を調製すること、表面電荷に基づいて細菌よりも細胞に親和性を有する細胞吸着担体と前記試料液とを接触させること、前記細胞吸着担体との接触後の試料液を回収すること、回収後の試料液に対して、黄色ブドウ球菌検出用プローブを用いたＰＣＲを実施すること、を含むものである。

本発明の細菌性疾病検査キットは、表面電荷に基づいて細菌よりも細胞に親和性を有する細胞吸着担体と、を含むものである。
ここで、検体と混合して試料液を調製するための吸着液と、細胞吸着担体に吸着した細菌を分離するための脱着液との少なくとも一方を更に含むことが好ましい。

上記検体処理方法、乳房炎の検査方法及び検査キットにおいて、前記細胞吸着担体が、シリカ、アミノシリカ、セルロース、セファロース、ゼオライト、イオン交換樹脂、ビニルポリマー、及びキトサンからなる群より選択された少なくとも１つで構成されていることが好ましい。本発明では、シリカ、セルロース、セファロース、ゼオライト、イオン交換樹脂、ビニルポリマー、及びキトサンからなる群より選択された少なくとも１つの細胞吸着担体であって、該表面にアミノ基を有する当該細胞吸着担体が使用される。
また、試料液を回収後の細胞吸着担体に、更に、吸着した細菌を分離するための脱着液を接触させることが好ましい。

本発明は、細菌と細胞とが混在している検体を、吸着液と混合して試料液を調製した後に、表面電荷に基づいて細菌よりも細胞に親和性を有する細胞吸着担体と接触させるので、試料中の細胞が細胞吸着担体に吸着し、試料液には細菌のみが遊離する。この結果、細胞吸着担体と接触後に回収した試料液には、細菌のみが存在する。これにより、検体中の細胞と細菌とを容易に分離することができる。
このとき脱着液を更に使用すれば、細胞吸着担体に吸着した細菌を細胞吸着担体から分離することができるので、検体中の細菌をほぼすべて回収することができる。これにより、より高い精度で細菌を分離することができる。

本発明によれば、細菌と細胞とが混在している検体に対して、精度よく短時間で、細菌性疾病、例えば乳房炎の検査を実施可能にすることができる。

本発明の検体処理方法は、細菌と細胞とが混在している検体を処理する検体処理方法であって、検体と吸着液とを混合して、試料液を調製すること（調製工程）、表面電荷に基づいて細菌よりも細胞に親和性を有する細胞吸着担体と前記試料液とを接触させること（吸着工程）、前記細胞吸着担体との接触後の試料液を回収すること（回収工程）、を含むものである。
本発明では、試料液を細胞吸着担体と接触させることによって、表面電荷の差に基づいて細胞と細菌とを分離している。即ち、検体中に混在している細菌と細胞とはその表面電荷に差があり、細胞の方が強く負に帯電している。このため、表面電荷に基づいて細菌よりも細胞に親和性を有する細胞吸着担体、例えば正に帯電している細胞吸着担体を用いることによって、検体中の細胞と細菌とを分離することができる。

本発明における細胞吸着担体は、表面電荷に基づいて細菌よりも細胞に親和性を有するものであればよく、例えば、ゼータ電位に基づいて選択することができる。即ち、細胞及び細菌が安定なｐＨ７前後の条件下では、体細胞のゼータ電位は細菌のゼータ電位よりも強く負にチャージしているため、正に帯電している物質を細胞吸着担体として選択すればよい。細胞吸着担体は、分散可能な状態、例えば粉末状、ビーズ状であってもよく、固化した状態、例えば、カラム等に充填されたものであってもよいが、細胞吸着担体に対して細胞が吸着しやすいため分散状態であることが好ましい。

このような細胞吸着担体としては、シリカ、アミノシリカ、セルロース、セファロース、ゼオライト、イオン交換樹脂、例えばポリスチレン、トヨパール（登録商標）などのビニルポリマー、キトパール（登録商標）などのキトサン等を挙げることができる。この中でも、表面にアミノ基を有するもの又は表面アミノ処理が施されているものが、細胞への吸着が高いため好ましい。このような表面アミノ基としては、炭素数１〜８、好ましくは炭素数１〜４のアミノアルキル基を挙げることができる。また特に、物理化学的に安定で、試料液中での取り扱いが容易なアミノシリカが好ましい。
このようなアミノシリカの粒径は、１０〜１０００μｍ、好ましくは１００〜２００μｍとすることができる。１０μｍ以上であれば、自然沈降が可能であり、過度の遠心操作を不要にすることができる。また１０００μｍ以下であれば、体積がかさばらず、反応の重さ当りの表面積がより大きく好ましい。

調製工程では、検体と吸着液とを混合して、試料液が調製される。
本発明における吸着液としては、細胞及び細菌に対して用いられる通常の緩衝液であればよく、例えばグッドの緩衝液、リン酸緩衝液、生理食塩水などを挙げることができるが、このうち、塩濃度が生理的条件に比較的近く細胞に対して穏和なグッドの緩衝液が好ましい。このようなグッドの緩衝液には、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、コラミンクロリド、ＢＥＳ等を挙げることができる。
吸着液と検体との混合は、特に制限はなく、細胞吸着担体との接触の際に細胞及び細菌がフリーの状態を維持できる程度の最終ｐＨ（例えば、ｐＨ４〜９）及び粘度に調製できる条件であれば、いずれの条件でも適用可能である。

吸着工程では、上述したような細胞吸着担体と試料液とを接触させて、試料液中の細胞を細胞吸着担体に吸着させる。試料液と細胞吸着担体との接触は、試料液中の細菌及び細胞が均一に細胞吸着担体と接触できる条件であればよく、静置条件や、細胞吸着担体を充填したカラムのように通過させる形態であってもよいが、ゆっくりとした攪拌混合が担体に対して均一に吸着可能であるために好ましい。簡便な操作の観点から、細胞吸着担体を分散状態で用いて、攪拌混合によって接触させることが好ましい。
混合によって接触させる場合には、細胞吸着担体と試料液とが充分に混合接触可能であればよく、例えば、細胞吸着担体を１０〜５０ｍｇに対して試料液１ｍｌとすることができる。また混合は、細胞が吸着可能となる時間、例えば１０〜６０分間、好ましくは３０〜６０分程度反応させればよい。
通過によって接触させる場合には、細胞と細胞吸着担体とが反応可能な速度で試料液を流せばよく、流速が一定となるように調整してもよい。

回収工程では、接触後の試料液が回収される。細胞吸着担体との接触後の試料液には、細胞吸着担体に吸着しなかった細菌が含まれているので、これを回収することによって、容易に細菌と細胞とを分離することができる。
細胞吸着担体を分散状態で細胞と接触させた場合には、細菌を含む試料液を細胞吸着担体から分離すればよい。分離の手段としては、例えば適度な遠心分離を行えばよいが、シリカのように自然沈降するものを細胞吸着担体とした場合には、静置するだけで試料液を分離すること、またはこれらを組み合わせるもできる。

回収工程において試料液を回収した後の細胞吸着担体には、一部の細菌が弱く吸着している場合がある。このため、細胞吸着担体に吸着した細菌を更に回収するために、細胞吸着担体に吸着した細菌を分離するための脱着液を細胞吸着担体に接触させることが好ましい（脱着工程）。
ここで用いられる脱着液としては、ｐＨとイオン強度の観点から細胞に対して穏和な化合物であって、細胞吸着担体と細菌との吸着を相対的に低下させるものであればよく、例えば細胞吸着担体に対して細菌よりも高い親和性を有する化合物や、細胞吸着担体と細菌との結合を弱める化合物をあげることができる。このような脱着液としては、塩化ナトリウム溶液、界面活性剤、キレート剤、クエン酸溶液などを挙げることができ、このうち、細胞吸着担体に対する親和性が細菌よりも高いクエン酸や、細胞吸着担体と細菌との疎水的結合を弱めることができる界面活性剤、又はこれらの双方を含有することが好ましい。

脱着液は、試料液を回収した後の細胞吸着担体と均一に混合可能な量で使用すればよく、例えば細胞吸着担体２５ｍｇあたり１〜２ｍｌ、好ましくは１ｍｌとすることができる。脱着の時間は、細胞が脱着可能となる時間、例えば５分〜３０分、好ましくは１０〜２０分反応させればよい。その後の脱着液の回収は、回収工程と同様の条件で行えばよい。
ここで回収された脱着液には、細胞吸着担体に吸着していた細菌が含まれており、先に回収した試料液と混合することによって、検体中で細胞と混在していた細菌のみを高い回収率で分離することができる。

本発明の検体処理方法は、細菌と細胞とが混在している検体から効率よく細菌を分離することができるので、細菌性疾病など、検出対象外の細胞が混在している検体に対して好ましく使用することができる。
本発明における検体は、特定の細菌性疾病の検査を行うために生体から単離されたものであって、疾病の検査に有効であり且つ原因菌と体細胞とが混在しやすい検体であればよく、例えば、乳汁、尿、血液、リンパ液、唾液、糞便、髄液、腹水等の生体試料に由来する検体を挙げることができる。これらは液体状に限らず、ゲル状、固体、粉体であってもよい。ゲル状、固体、粉体の場合には、上述した吸着液によって適当な形態に調製すればよい。

また、生体から単離された形態に、細胞及び細菌以外の多くの夾雑物（例えば乳汁の場合の乳汁成分など）が存在する場合には、これらの夾雑物を予め除去しておくことが好ましい。このような前処理としては、数回の遠心分離などを挙げることができ、１〜３回程度の遠心分離を好ましく適用することができる。
ここで、各種の生体試料に由来する検体には、生体から分離した生体試料そのものであってもよく、また、本発明の処理が可能な程度にまで特定の処理を施した試料も含まれる。

また、本発明が適用可能な細菌性疾病としては、生体から単離された検体に原因菌が混入し得る疾病であればよく、乳房炎、膀胱炎、気管支炎、肺炎、腹膜炎、サルモネラ腸炎等を挙げることができる。また、検体は、原因菌が混入する生体に由来するものであればよく、鳥類、哺乳類を挙げることができ、特に、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヒトなどを挙げることができる。
本発明によって効率よく分離することができる細菌は、混在する細胞の種類にもよるが、大腸菌、ミクロコッカス、ブドウ球菌、連鎖球菌等を挙げることができ、特に乳房炎の原因菌であるブドウ球菌については高い効率で効果的に細胞と分離することができる。

従って、本発明は、乳房炎の検査方法も包含する。
本乳房炎の検査方法は、乳汁由来の検体と吸着液とを混合して、試料液を調製すること（調製工程）、表面電荷に基づいて細菌よりも細胞に親和性を有する細胞吸着担体と前記試料液とを接触させること（吸着工程）、前記細胞吸着担体との接触後の試料液を回収すること（回収工程）、回収後の試料液に対して、黄色ブドウ球菌検出用プローブを用いたＰＣＲを実施すること（ＰＣＲ工程）、を含むものである。
本乳房炎の検査方法によれば、乳汁中の細菌を、混入細胞と効率よく分離することができるので、その後の黄色ブドウ球菌検出用プローブを用いたＰＣＲを正確且つ定量的に行うことができ、精度よく乳房炎の検査を行うことができる。

本検査方法では、上述した内容をそのまま適用することができ、調製工程、吸着工程及び回収工程については、上述と同様に行うことができる。また、回収工程の後には、上述した脱着工程を好ましく行うことができる。
ＰＣＲ工程では、回収工程及び場合によって脱着工程において得られた各溶液中の細菌に対して、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲを実施するための条件は、通常の細菌に対して実施する条件をそのまま適用することができる。

ＰＣＲに用いられる検出用プローブには、乳房炎の原因菌となっている黄色ブドウ球菌を精度よく検出するため、特徴的な遺伝子領域を正確に認識することが可能なプローブを選択することが好ましい。このような遺伝子領域としては、２３Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子などを挙げることができ、特に２３Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子が好ましい。

また、本発明は、各種細菌性疾病の検査方法を容易に行うためのキットも包含する。
このような検査キットは、表面電荷に基づいて細菌よりも細胞に親和性を有する細胞吸着担体を含むものである。このキットを用いることによって、簡便に且つ精度よく乳房炎の検査を行うことができる。
本キットには、より簡便に使用可能とするために、検体と混合して試料液を調製するための吸着液と、細胞吸着担体に吸着した細菌を分離するための脱着液との少なくとも一方を更に含むものであることが好ましい。

また、本キットには、効率よく細菌性疾病を検出可能とするために、当該細菌性疾病を効率よく検出可能なＰＣＲ用の検査用プローブも含めてもよい。このような検査用プローブは、乳房炎に関して上述したものの他、対象となる細菌性疾病において既知のものをそのまま適用することができる。
キットに含まれる各溶液は適当な容器に収容されていてもよく、また濃度を調整できるように原液として含まれていてもよい。
細胞吸着担体は、粉末の形態で含まれていてもよく、細胞吸着担体をすでに充填した容器、例えばチューブ、カラムなどの形態で含まれていてもよい。

以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。なお、以下の実施例における遠心分離には、特に断らない限り、久保田製作所製のインバータマイクロ冷却遠心機（KUBOTA1720）を利用した。各遠心分離の条件は、この遠心分離器の回転数によって示している。

［実施例１］
黄色ブドウ球菌と体細胞の吸着
（１）細胞の調整
黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ１９０９５、ゼータ電位：−１．０９±３．４５）は、乾燥ブイヨン（ニッスイ）いわゆるNutrient Brothにて１６時間培養したものを使用した。体細胞（ゼータ電位：−９.２９±６．７２）は、血液由来細胞を精製し、細胞表面抗原に基づいて細胞分画した。即ち、ヘパリン採決されたウシ血液（東京芝浦臓器社製）を得て、血液を遠心（２，５００ｒｐｍ、３０分）し、中間層の白色のバッフィーコート（単球、白血球、好中球を含む）を駒込ピペットにて回収した。回収されたバフィーコート層に、等量のＡＣＫ溶解バッファ（８．２９ｇ／ｌのＮＨ₄Ｃｌ、１．００ｇ／ｌのＫＨＣＯ₃、０．０３７ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）を加え１〜３分放置することで赤血球を溶解させた。その後、大量のＰＢＳ^-を加えて懸濁し、遠心（１，４００ｒｐｍ、５〜７分）した。このＰＢＳ^-による洗いを２回繰り返した。１０ｍＭ ＭＯＰＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌに懸濁（ｐＨ７．０）し、実験に応じた濃度に調整した。

上記バフィーコート層由来の細胞（顆粒球・単球）について、フローサイトメトリーを用いて細胞を解析した。
６×１０⁶個／ｍｌにてＰＢＳに懸濁されたＧＭ細胞を遠心（１，５００ｒｐｍ，５分）し上清を除いた後、一次抗体（マウス抗ＧＭ１（ＳＷＣ３）ＩｇＧ（Ｎｏ.Ｍ３５００１、ＶＭＲＤ社製））を１０μｌずつ加え、３０分インキュベートした。ＦＡＣＳバッファを２ｍｌ加え、遠心（１，５００ｒｐｍ，５分）し各種二次抗体（ＦＩＴＣ結合ヤギＦ（ａｂ’）₂抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｎｏ，Ｍ３５００１、ＣＡＬＴＡＧ社製）を１０μｌずつ加え、３０分インキュベートした。ＦＡＣＳバッファを２ｍｌ加え、洗浄、遠心を行なった。得られた細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）にて解析した。
その結果、ほとんどが白血球細胞であることが確認できた。これにより得られた細胞を体細胞として以下の処理に用いた。
なお、ゼータ電位は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、室温の条件下で、NICOMP380ZLS（Particle Sizing System Co.社製）を用いて測定した。

（２）細胞吸着担体に対する吸着
黄色ブドウ球菌と体細胞との表面電気の差に基づいてこれらを分離するために、黄色ブドウ球菌と体細胞に対するアミノシリカ及びピュアシリカの吸着量を確認した。
黄色ブドウ球菌と体細胞とは、それぞれ表示された細胞数になるように吸着液と混合して、試料液を調製した。吸着液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳを含む水溶液であり、ｐＨは７であった。

担体としては、アミノシリカ（ＮＨ−ＤＭ１０２０、富士シリシア株式会社製）及びピュアシリカ（ＭＢ−５Ｄ、富士シリシア株式会社製）を使用し、それぞれ２５ｍｇを、１．５ｍｌ容のチューブに充填した。
試料液１ｍｌをそれぞれのチューブに添加して混合し、１時間室温で攪拌させて反応させた。１時間後に、上清をピペットで回収した。上清中の細菌数をバクテリア計算盤により計測した。結果を図１に示す。図１において横軸は、添加した細胞数を表し、縦軸は反応後の上清又は担体中の細胞数を示す。

図１に示されるように、黄色ブドウ球菌は、細胞数が多くなるに従って吸着しにくくなるがアミノシリカ及びピュアシリカの双方において同様の傾向を示している（図１（Ａ）参照）のに対して、体細胞では、アミノシリカに対して非常に強く吸着し、ピュアシリカに対しては吸着しにくく、細胞数が多いほどピュアシリカに吸着しないことが示された（図１（Ｂ）参照）。従って、特に細胞数が多いほど、アミノシリカに体細胞を吸着させることによって、体細胞と黄色ブドウ球菌とを効率よく分離できることは明らかである。

［実施例２］
脱着試験
次に、種々の脱着液を用いた場合の細菌の回収について調べた。
細菌細胞混合液を細胞吸着担体（実施例１のアミノシリカ）に吸着させた後、黄色ブドウ球菌の回収を行った（図２）。細胞混合液には、黄色ブドウ球菌（ＩＡＭ１２５４４）４．３×１０⁸個／ｍｌ（ＯＤ₆₀₀＝０．５）と、実施例１で得られた体細胞７×１０⁵個／ｍｌの各濃度となるように吸着液を用いて調整した。吸着は実施例１と同様に行った。上清を回収後、下記表１中の組成の各脱着液を添加して混合した。そのまま１５分間反応させた後、上清中に含まれる細菌数及び細胞数を６００ｎｍでの吸光度により計測した。結果を表１に示す。なおＰＥＧは平均分子量６０００のものを使用した。

表１に示されるように、ＮａＣｌ溶液、ＥＤＴＡ溶液、クエン酸溶液（ｐＨ６）と、これらに界面活性剤（Pluronic（登録商標） F-68）を混合した溶液において、黄色ブドウ球菌（ＩＡＭ１２５４４株）を効果的に回収できることが明らかであった。特に、これらの溶液はいずれも体細胞に対して脱着効果がなく、細胞吸着担体に吸着した黄色ブドウ球菌の回収に有効であることが示された。

［実施例３］
種々の細菌に対する吸着・脱着試験
次にアミノシリカの細胞吸着担体に対する吸着及び脱着効果を、種々の細菌に対して試験した。使用した菌は、表中に記載の通りである。
吸着及び脱着は、実施例１及び２と同様に行った。結果を表２及び３に示す。表中、吸着（Adsorption）、上清（Supernatant）、脱着（Desorption)、回収（Recovery）は、それぞれ以下のようにして算出した。
吸着（％）＝（細胞懸濁液中の数−上清中の数）／細胞懸濁液中の数×１００
上清（％）＝上清中の数／細胞懸濁液中の数×１００
脱着（％）＝脱着上清中の数／吸着量×１００
カッコ内＝脱着上清中の数／細胞懸濁液中の数×１００
回収（％）＝上清（％）＋脱着（％）

表２及び３に示されるように、すべての黄色ブドウ球菌に対して非常に高い回収率（８０％以上）が得られ、また他の菌、特に、E.coli、M.luteus、S.agalactiaeに比較的有効であることがわかった。また、黄色ブドウ球菌については、体細胞と異なる比率にした細胞懸濁液を用いて、ほぼ１００％の回収率であり、このとき体細胞の回収率は１〜２％程度にすぎず、ほぼ完全に細菌と体細胞とを分離できることが示された（データ示さず）。
このように、アミノシリカを用いた体細胞の吸着を行うことによって、細胞と細菌の混合液から短時間で精度よく細菌のみを分離できることは明らかである。

［実施例４］
乳汁を用いたＰＣＲ法による黄色ブドウ球菌の検出
図３には乳房炎検査のためのＤＮＡ抽出工程までを示した工程図である。乳汁中の細菌と細胞の分離は以下の通りに行った。
重度の乳房炎のウシ２頭及び軽度の乳房炎のウシ１頭からの各乳汁を、５０００ｒｐｍ１５分間の遠心分離にかけて、乳汁成分（上清）を除去した。得られた沈殿物に、溶解バッファ（０．０５％のＮ−ラウリルサルコシン、５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２．５ｍＭのＥＤＴＡ）を１ｍｌ加え、ボルテックスにかけて洗浄した。更に遠心（５０００ｒｐｍ、１５分）を行って、上清をコントロールＡとし、沈殿物と分けた。

この沈殿物に、実施例１で使用した吸着液１ｍｌとアミノシリカ（０ｍｇ、１２．５ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ）を加え、ゆっくりと撹拌し、１時間にわたって吸着反応させた。吸着後の上清を別のチューブに移しとり、遠心（５０００ｒｐｍ、１５分）し、上清を未吸着の菌画分として得た（Ｂ）。吸着後のシリカに対し、脱着液（０．１Ｍのクエン酸、０．１ＭのＮａＣｌ，０．０５％のPluronic F68（ｐＨ６)）１ｍｌを加え、ゆっくり撹拌した（１５分）。反応後、上清（吸着後、脱着した菌）を上清Ｃとして、上記上清Ｂと混合した。
上清Ｂと上清Ｃの混合液を遠心（５０００ｒｐｍ、１５分）し、上清を除き、沈殿を得た（菌画分）。なお乳汁中の細胞は、アミノシリカと共に分離された。

得られたサンプルにリゾスタフィン溶液２００μｌ（２μｌリゾスタフィン（和光純薬工業社製）、１９８μｌ溶解バッファ）を加え、よく混ぜた後、５５℃、６０分間にて反応させた。次いで、フェノール（２００μｌ）を加えて、よく混ぜ、遠心（１５０００ ｒｐｍ、５分間）した。上清に、フェノール／クロロホルム（１：１）溶液（２００μｌ）を加え、よく混ぜ、遠心（１５０００ｒｐｍ、５分間）した。３のチューブに上清をとり、そのそれぞれにエタノール（１ｍｌ）を加え、ＤＮＡを沈殿させた。得られた沈殿を乾燥させ、ＴＥバッファ（５０μｌ）に溶解させた。

得られた各ＤＮＡサンプルに対して、黄色ブドウ球菌の２３Ｓ−ｒＲＮＡ領域に対して、プライマーセット５’ａｃｇｇａｇｔｔａｃａａａｇｇａｃｇａｃ３’（配列番号１）及び５’ａｇｃｔｃａｇｃｃｔｔａａｃｇａｇｔａｃ３’（配列番号２）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、カタログＭ１８６１）を利用し、９４℃５分で反応させた後に、９４℃４５秒、５７℃４５秒、７２℃４５秒を３５サイクルして、最後に７２℃１０分で反応させた。
結果を図４に示す。
なお、図４において（ａ）は軽度の乳房炎サンプル、（ｂ）及び（ｃ）はそれぞれ異なる重度の乳房炎サンプルの場合を示している。

図４に示されるように、軽度の乳房炎であれば、アミノシリカを使用しなくても明瞭なバンドを示すことができ、原因菌の特定が可能であるのに対して、重度の乳房炎の場合には、シリカを用いた処理を行わないと、バンドがスメアとなって、有効な菌の検出ができない（図４上段第１レーン）。
これに対して、本願発明のアミノシリカを用いた処理を行うことによって、このようなサンプルであっても明瞭なバンドを示すことができる（図４上段（ｂ）及び（ｃ）参照）。このような明確なバンドが示されれば、菌の同定及び定量的な検査を精度よく実施できることは明らかである。
更に、乳房炎の重篤の度合いに応じてアミノシリカの量を変えることによって、より効率よく菌の検出及び同定を行うことができる。

このことから、本発明によれば、細菌と細胞とが混在している検体であっても、検体中の細菌を細胞から短時間で精度よく分離することができる。また、この検体処理方法を用いることによって、乳房炎などの細菌性疾病の検査を短時間で精度よく且つ効率よく行うことができる。

本発明の実施例にかかる各種細胞吸着担体への黄色ブドウ球菌（Ａ）及び体細胞（Ｂ）の吸着を示すグラフである。 本発明の実施例にかかる検体処理方法の工程を示す工程図である。 本発明の実施例にかかる乳房炎検査のためのＤＮＡ抽出工程を示す工程図である。 本発明の実施例にかかるＤＮＡの電気泳動写真である。

Claims (8)

1. 細菌性疾病の病因細菌と検体由来の体細胞とが混在している検体を処理する検体処理方法であって、
   検体と吸着液とを混合して、試料液を調製すること
   アミノシリカである細胞吸着担体と前記試料液とを接触させること
   前記細胞吸着担体との接触後の試料液を回収すること、
   を含み、
   前記細菌性疾病が乳房炎であり、前記検体が乳汁由来の検体である当該検体処理方法。
2. 試料液を回収した後に、細胞吸着担体に吸着した前記病因細菌を分離するための脱着液を細胞吸着担体に接触させ、接触後の脱着液を回収することを更に含む請求項１記載の検体処理方法。
3. 前記吸着液が、グッドの緩衝液、リン酸緩衝液又は生理食塩水である請求項１又は請求項２記載の検体処理方法。
4. 乳房炎の検査方法であって、
   乳汁由来の検体と吸着液とを混合して、試料液を調製すること、
   アミノシリカである細胞吸着担体と前記試料液とを接触させること
   前記細胞吸着担体との接触後の試料液を回収すること、
   回収後の試料液に対して、黄色ブドウ球菌検出用プローブを用いたＰＣＲを実施すること、
   を含む乳房炎の検査方法。
5. 前記吸着液が、グッドの緩衝液、リン酸緩衝液又は生理食塩水である請求項４記載の検体処理方法。
6. 乳房炎の検査キットであって、
   アミノシリカである細胞吸着担体
   を含む当該検査キット。
7. 検体と混合して試料液を調製するための吸着液と、細胞吸着担体に吸着した乳房炎の病因細菌を分離するための脱着液との少なくとも一方を更に含む請求項６記載の検査キット。
8. 前記吸着液が、グッドの緩衝液、リン酸緩衝液又は生理食塩水である請求項７記載の検体キット。