JP4898441B2

JP4898441B2 - 物質の製造法

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Publication number: JP4898441B2
Application number: JP2006528631A
Authority: JP
Inventors: 信一橋本; 和彦田畑
Original assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Current assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2025-06-24
Also published as: US8211688B2; CN101065477B; WO2006001380A1; EP1783203A4; JPWO2006001380A1; ES2337379T3; EP1783203A1; DE602005019063D1; EP1783203B1; ATE455845T1; US20080038786A1; CN101065477A

Description

本発明は、Ｌ−グルタミンまたはＬ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物、および該微生物を用いたＬ−グルタミンまたは該物質の製造法に関する。

エシェリヒア属に属する微生物などにおいて、Ｌ−グルタミンは自身が蛋白質合成の基質であるとともに、プリンやピリミジンの核酸およびＬ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−トリプトファンおよびＬ−アスパラギンなどのアミノ酸の生合成において、窒素の供給基質となっている。
一方、Ｌ−グルタミンの生合成はｇｌｎＡ遺伝子にコードされるグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）によって行われるが、ＧＳ活性は非常に厳密かつ複雑な制御を受けることが知られている。すなわちＧＳはアデニリル化されることで活性を負に調節されている。このアデニリル化および脱アデニリル化はｇｌｎＥ遺伝子にコードされるグルタミンシンテターゼアデニリルトランスフェラーゼ（以下、ＧｌｎＥ蛋白質と称す）によって触媒され、どちらの方向を触媒するかはさらにｇｌｎＢ遺伝子にコードされるグルタミンシンテターゼ調節蛋白質ＰＩＩ（ＰＩＩｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ。以下、ＧｌｎＢ蛋白質と称す）によって決定される。ＧｌｎＢ蛋白質がウリジリル化されている場合はＧｌｎＥ蛋白質によるＧＳの脱アデニリル化を促進し、逆にＧｌｎＢ蛋白質がウリジリル化されていない場合はＧｌｎＥ蛋白質によるＧＳのアデニリル化を促進する。ＧｌｎＢ蛋白質のウリジリル、脱ウリジリル化はｇｌｎＤ遺伝子にコードされる蛋白質によって決定される。Ｌ−グルタミンは脱ウリジリル化を促進するため、ＧＳはアデニリル化されて活性が低下し、Ｌ−グルタミンの合成が低下する調節が働く。一方、２−オキソグルタル酸はＧｌｎＢ蛋白質のウリジリル化を促進するため、上記と逆のスキームによりＬ−グルタミン合成が促進される（非特許文献１および２）。

上記した複雑な調節機構を解除することによりＬ−グルタミンを発酵生産する試みがなされている。特許文献１には、GSのアデニリル化部位をアデニリル化されないように改変し、かつglnA遺伝子の発現を強化することでＬ−グルタミンを生成、蓄積するエシェリヒア・コリが取得されたとの記載はあるが、その生産量は1.3g/Lにすぎない。
また、グルタミン生産菌としては、glnE遺伝子が欠損したコリネバクテリウム・フラバム（特許文献２）、glnA遺伝子を改変しかつgdh遺伝子の発現を強化したコリネバクテリウム・フラバム(特許文献２)、Ｌ−アルギニン生産菌としては、argA遺伝子を導入したエシェリヒア・コリ(特許文献３)など、Ｌ−トリプトファン生産菌としては、トリプトファンオペロン、aroG遺伝子およびserA遺伝子を導入したエシェリヒア・コリ (特許文献４)など、L-ヒスチジン生産菌としては、アミノキノリン耐性を付与したエシェリヒア・コリ（特許文献５）など、核酸生産菌としては、５’−イノシン酸を生産するpurA、deoD、purR、add、gsk、edd、xapA、ushAおよびaphの各遺伝子が欠損し、脱感作型purF遺伝子の発現を強化したエシェリヒア・コリ(特許文献６)など、５’−グアニル酸を生産するpurA、deoD、purR、add、gsk、edd、xapA、ushAおよびaphの各遺伝子を欠損し、脱感作型purF遺伝子およびguaAB遺伝子の発現を強化したエシェリヒア・コリ(特許文献６)などが知られているが、GlnE蛋白質およびGlnB蛋白質の活性が低下もしくは喪失した微生物であり、かつＬ−グルタミンまたはＬ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物、および該微生物を用いたＬ−グルタミンまたは該物質の製造法は知られていない。
E.coli and Salmonella, Second Edition(1996) FEMS Microb. Lett., 201, 91-98(2001) 特開2003-164297号特開2002-300887号特開昭57-5693号米国特許第5,939,295号特開2001-86998号特開2002-355087号

本発明の目的は、Ｌ−グルタミンまたはＬ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物、および該微生物を用いたＬ−グルタミンまたは該物質の製造法を提供することにある。

本発明は、以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）グルタミンシンテターゼアデニリルトランスフェラーゼ（以下、ＧｌｎＥ蛋白質と称す）およびグルタミンシンテターゼ調節蛋白質ＰＩＩ（ＰＩＩｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ。以下、ＧｌｎＢ蛋白質と称す）の活性が低下または喪失し、かつＬ−グルタミンまたはＬ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物。
（２）エシェリヒア属に属する微生物が野生型のＧｌｎＥ蛋白質をコードする遺伝子（以下、ｇｌｎＥ遺伝子と称す）、および野生型のＧｌｎＢ蛋白質をコードする遺伝子（以下、ｇｌｎＢ遺伝子と称す）の塩基配列中に塩基の欠失、置換または付加がある該遺伝子を有する微生物である、上記（１）の微生物。
（３）エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒア・コリである、上記（１）または（２）の微生物。
（４）Ｌ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸または核酸である、上記（１）〜（３）のいずれか１つの微生物。
（５）アミノ酸がＬ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−グルタミン酸からなる群よりえらばれるアミノ酸である、上記（４）の微生物。
（６）核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ウリジン、チミジン、５’−アデニル酸、５’−イノシン酸、５’−グアニル酸、５’−シチジル酸、５’−キサンチル酸、５’−ウリジル酸および５’−チミジル酸からなる群よりえらばれる核酸である、上記（４）の微生物。
（７）上記（１）〜（３）のいずれか１つの微生物を培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミンまたはＬ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積させ、該培地からＬ−グルタミンまたは該物質を採取することを特徴とするＬ−グルタミンまたは該物質の製造法。
（８）Ｌ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸または核酸である、上記（７）の製造法。
（９）アミノ酸がＬ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸からなる群よりえらばれるアミノ酸である、上記（８）の製造法。
（１０）核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ウリジン、チミジン、５’−アデニル酸、５’−イノシン酸、５’−グアニル酸、５’−シチジル酸、５’−キサンチル酸、５’−ウリジル酸および５’−チミジル酸からなる群よりえらばれる核酸である、上記（８）の製造法。

本発明により、Ｌ−グルタミンまたはＬ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物、および該微生物を用いたＬ−グルタミンまたは該物質を製造する方法が提供される。

１． GlnE蛋白質およびGlnB蛋白質の活性が低下または喪失したエシェリヒア属に属する微生物とその調製
GlnE蛋白質およびGlnB蛋白質の活性が低下または喪失したエシェリヒア属に属する微生物は、既存のエシェリヒア属に属する微生物が有するglnE遺伝子またはglnB遺伝子欠損変異をP1形質導入［J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)］によって１種のエシェリヒア属に属する微生物に集積する方法、UV照射などの変異処理後、GlnE蛋白質またはGlnB蛋白質の活性が低下または喪失した菌株を選択する方法、またはエシェリヒア属に属する微生物の染色体ＤＮＡ上のglnE遺伝子およびglnB遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法などにより取得することができる。ここで、glnE遺伝子およびglnB遺伝子は、それぞれGlnE蛋白質またはGlnB蛋白質をコードする塩基配列にプロモーター配列などの該遺伝子の発現を調節する領域を含む塩基配列が付加した配列よりなる。
本発明においてGlnE蛋白質およびGlnB蛋白質の活性が低下したエシェリヒア属に属する微生物とは、上記変異を導入することにより、該変異導入前の株（親株）に比べ、GlnE蛋白質およびGlnB蛋白質の活性が低下している微生物であり、好ましくは８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下に低下した微生物をいう。GlnE蛋白質およびGlnB蛋白質の活性は、公知の方法により測定することができる。

微生物の染色体ＤＮＡの遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩基の欠失等を導入したい宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができ、好ましい相同組換えを利用した方法としてはラムダファージの相同組換え系を利用して、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１−６６４５（２０００）］をあげることができる。

該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜１日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体ＤＮＡ上において２回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体ＤＮＡ上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認することができる。また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖ＤＮＡを用いた方法をあげることができる。

具体的には、塩基の欠失、置換または付加を導入したい遺伝子を含有する直鎖ＤＮＡを細胞内に取り込ませ、染色体ＤＮＡと導入した直鎖ＤＮＡとの間で相同組換えが起こさせる方法である。本方法は、直鎖ＤＮＡを取り込む能力を有するエシェリヒア属に属する微生物、好ましくはエシェリヒア・コリ、より好ましくはλファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を発現しているシェリヒア・コリに用いることができる。

λＲｅｄ組換え系を発現しているエシェリヒア・コリとしては、λＲｅｄ組換え系遺伝子を有するプラスミドＤＮＡであるｐＫＤ４６［エシェリヒア・コリジェネティックストックセンター（米国エール大学）より入手可能］を保有するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株等をあげることができる。
相同組換えに用いられるＤＮＡとしては、
（ａ）塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に存在するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（ｂ）塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に存在するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡが連結した直鎖ＤＮＡ、
（ｃ）薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子からなるＤＮＡの両端に、塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に存在するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを有する直鎖ＤＮＡ、および
（ｄ）上記（ａ）の直鎖ＤＮＡにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に存在するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡの間に、さらに酵母由来のＦｌｐｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，５８７５（１９８５）〕が認識する塩基配列を有するＤＮＡ、
をあげることができる。

薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿主微生物にエシェリヒア・コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。

ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来のｓａｃＢ遺伝子［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９，１３６１−１３６６（１９９３）］、およびエシェリヒア属に属する微生物由来のｒｐｓＬ遺伝子［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７２，９９−１０４（２００１）］等をあげることができる。

上記の直鎖ＤＮＡの両末端に存在する、置換または欠失の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に存在するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡは、直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上の方向と同じ方向に配置され、その長さは１０ｂｐ〜１００ｂｐ程度が好ましく、２０ｂｐ〜５０ｂｐ程度がより好ましく、３０〜４０ｂｐ程度がさらに好ましい。
酵母由来のＦｌｐｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および該ＤＮＡにおいて１個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のＦｌｐｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。

上記の相同性を有するＤＮＡとは、上記直鎖ＤＮＡが、染色体ＤＮＡ上の目的とする領域において、相同組換えが起こる程度の相同性を有するＤＮＡであり、具体的な相同性としては、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。

上記直鎖ＤＮＡ断片は、ＰＣＲにより作製することができる。また上記直鎖ＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖ＤＮＡを得ることもできる。
相同組換えを利用した微生物の染色体ＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加を導入する、より具体的な方法としては、以下の方法１〜４をあげることができる。
方法１：上記（ａ）または（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法２：上記方法１により取得された形質転換株に、上記（ｂ）の直鎖ＤＮＡを導入し、該方法により染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体ＤＮＡ上の領域を置換または欠失させる方法。
方法３：
［１］上記（ｃ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ上における方向と同一の方向で連結したＤＮＡを合成し、上記［１］で得られた形質転換株に導入する、
［３］ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記［２］の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体ＤＮＡ上から削除された株として選択する方法。
方法４：
［１］上記（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］上記［１］で得られた形質転換株にＦｌｐｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記［１］で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。

上記方法で用いられる、直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。

方法２または方法３［２］で用いられる直鎖ＤＮＡにおいて、該ＤＮＡの中央部付近に、染色体ＤＮＡ上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだ直鎖ＤＮＡを用いることにより、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体ＤＮＡ上に挿入することができる。
上記方法２〜４は、最終的に得られる形質転換株の染色体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法である。よって、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り返すことにより、容易に染色体ＤＮＡ上の位置の異なる２以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。

上記方法により取得されたＧｌｎＥ蛋白質およびＧｌｎＢ蛋白質の活性が低下もしくは喪失した微生物が、Ｌ−グルタミンまたはＬ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有することは、該微生物を培地に培養し、該培地中に生成、蓄積するＬ−グルタミンまたは該物質を公知の方法、例えばＨＰＬＣを用いた分析またはバイオアッセイ等により容易に確認することができる。

上記方法により調製できるＧｌｎＥ蛋白質およびＧｌｎＢ蛋白質の活性が喪失し、かつＬ−グルタミンを生成、蓄積するエシェリヒア属に属する微生物としては、ｇｌｎＥ遺伝子およびＧｌｎＢ遺伝子が欠損しているエシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１をあげることができる。
上記したＧｌｎＥ蛋白質およびＧｌｎＢ蛋白質の活性が低下または喪失したエシェリヒア属に属する微生物は、Ｌ−グルタミンを生成、蓄積する能力を有するだけでなく、Ｌ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力も有する。

Ｌ−グルタミンからから供給される窒素を利用して生合成される物質としてはアミノ酸および核酸などをあげることができ、アミノ酸としては、好ましくはＬ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−トリプトファンおよびＬ−グルタミン酸など、核酸としては、好ましくはアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ウリジン、チミジン、５’−アデニル酸、５’−イノシン酸、５’−グアニル酸、５’−シチジル酸、５’−キサンチル酸、５’−ウリジル酸および５’−チミジル酸などをあげることができる。

GlnE蛋白質およびGlnB蛋白質の活性が低下または喪失し、かつＬ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物としては、エシェリヒア・コリJGLBE1をあげることができる他、上記方法で得られる微生物に、さらに、
（ａ）該物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）該物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）該物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）該物質の生合成経路から該物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、該物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、などの方法を単独または組み合わせて用いて取得される微生物をあげることができる。

該物質がアミノ酸である場合、上記（ａ）については、例えばＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１０５−１１１（１９７９）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１０，７６１−７６３（１９７２）およびＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９，３１８−３２３（１９９３）など、上記（ｂ）については、例えばＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１０５−１１１（１９７９）およびＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１０，７６１−７６３（１９７２）など、上記（ｃ）については、例えばＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９，３１８−３２３（１９９３）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，３７１−３７７（１９８７）など、上記（ｄ）については、例えばＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．，３８，１８１−１９０（１９７９）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４２，１７７３−１７７８（１９７８）など、上記（ｅ）については、例えばＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，１６７５−１６８４（１９７２）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４１，１０９−１１６（１９７７）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，２０１３−２０２３（１９７３）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，２０８９−２０９４（１９８７）などに記載されている。また、該物質が核酸である場合、上記（ａ）〜（ｅ）の具体的な方法は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｓｅｃｏｎｄ，ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｒｅｖｉｓｅｄｅｄｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｈ．Ｊ．Ｒｅｈｍ，Ｇ．Ｒｅｅｄ，Ａ．Ｐｕｈｌｅｒ，ａｎｄＰ．Ｓｔａｄｌｅｒ，ｖｏｌ．６，“ｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｐｒｉｍａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ”ｅｄ．Ｍ．Ｒｏｅｈｒ，ＶＣＨｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９９６）および特開２００２−３５５０８７号などに記載されている。

また、Ｌ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生産する能力を有することがすでに知られているエシェリヒア属に属する微生物のＧｌｎＥ蛋白質およびＧｌｎＢ蛋白質の活性を上記した方法により低下または喪失させる方法によって得られる微生物も本発明の微生物としてあげることができる。
Ｌ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生産する能力を有する公知のエシェリヒア属に属する微生物としては、Ｌ−アルギニン生産菌であるエシェリヒア・コリ（特開昭５７−５６９３号）など、Ｌ−トリプトファン生産菌であるエシェリヒア・コリ（米国特許第５，９３９，２９５号）、Ｌ−ヒスチジン生産菌であるエシェリヒア・コリ（特開２００１−８６９９８）、Ｌ−グルタミン酸生産菌であるエシェリヒア・コリ（特開平５−２４４９７０）、５’−イノシン酸生産菌である、エシェリヒア・コリ（特開２００２−３５５０８７）、５’−グアニル酸生産菌であるエシェリヒア・コリ（特開２００２−３５５０８７）などをあげることができる。
２．本発明の製造法
上記１の方法で調製することができるエシェリヒア属に属する微生物を培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミンまたはＬ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積させ、該培地からＬ−グルタミンまたは該物質を採取することによりＬ−グルタミンまたは該物質を製造することができる。

Ｌ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質としては、上記１の物質をあげることができる。
本発明の製造法で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど本発明の微生物の増殖、およびＬ−グルタミンまたはＬ−グルタミンからから供給される窒素を利用して生合成される物質の生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。

炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよく、グルコース、フラクトースのような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などをあげることができる。
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などをあげることができる。

無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウムなどをあげることができる。
ビタミンとしては、ビオチンやチアミンなどをあげることができる。さらに必要に応じて本発明の微生物が生育に要求する物質（例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸）を添加することができる。

培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２０〜４２℃、より好ましくは２８〜３８℃である。培養ｐＨは５〜９、好ましくは６〜７．５である。培養時間は、５時間〜５日間、好ましくは１６時間〜３日間である。
培地中に蓄積したＬ−グルタミンまたはＬ−グルタミンからから供給される窒素を利用して生合成される物質は、通常の精製方法によって採取することができる。例えばＬ−グルタミンは、培養後、遠心分離などで菌体や固形物を除いたあと、イオン交換、濃縮、結晶分別によって採取することができる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

ｇｌｎＥ遺伝子、ｇｌｎＢ遺伝子が欠損した微生物の作製
エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡ上の特定遺伝子の欠損は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７，６６４１−６６４５（２０００）］に従って行った。なお、以下に示すプラスミドｐＫＤ４６、ｐＫＤ３およびｐＣＰ２０は、エシェリヒア・コリジェネティックストックセンター（米国エール大学）から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、当該株から公知の方法により抽出して用いた。
（１）遺伝子欠損用薬剤耐性遺伝子断片のクローニング
エシェリヒア・コリＫ１２株のｇｌｎＥ、ｇｌｎＢの各遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている［Ｓｃｉｅｎｃｅ，５３３１，１４５３−１４７４（１９９７）］。報告されている塩基配列に基づいてパーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、ｇｌｎＥ遺伝子欠損用のプライマーＤＮＡとして配列番号１および２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、ｇｌｎＢ遺伝子欠損用のプライマーＤＮＡとして配列番号３および４で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。合成したプライマーＤＮＡは、各々の欠失の標的遺伝子の上流と下流に位置する３６ｂｐからなる塩基配列に基づき設計した。

上記合成ＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、ｐＫＤ３ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲはプラスミドＤＮＡ１０ｎｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５ｕｎｉｔｓ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）４μＬ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μＬを用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。

該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）溶液を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを沈殿させた後、該ＤＮＡを２０μＬのＴＥに溶解した。上記操作により、ｇｌｎＥ遺伝子欠損用、およびｇｌｎＢ遺伝子欠損用のクロラムフェニコール耐性遺伝子断片をそれぞれ取得した。
（２）染色体ＤＮＡ上のｇｌｎＥ遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリＪＭ１０１株の作製
エシェリヒア・コリＪＭ１０１株をｐＫＤ４６で形質転換した後、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上でｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＫＤ４６と称す）を選択した。１０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−アラビノースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリン存在下で培養したエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＫＤ４６を、電気パルス法によりｇｌｎＥ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて形質転換し、ＪＭ１０１株の染色体ＤＮＡ上のｇｌｎＥ遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入され、ｇｌｎＥ構造遺伝子が欠損するように組換えられた株を２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上で選択した。

取得したクロラムフェニコール耐性株を、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、４２℃で保温した状態で単コロニー分離を実施した。得られた各コロニーを２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール含むＬＢ寒天培地、および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、クロラムフェニコール耐性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。次にこのｐＫＤ４６脱落株をｐＣＰ２０で形質転換し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。

生育してきたアンピシリン耐性株を薬剤無添加のＬＢ寒天培地にレプリカし、４２℃で保温した状態で単コロニー分離を実施した。得られた各コロニーを薬剤無添加のＬＢ寒天培地、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール含むＬＢ寒天培地、および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。ここで得られた各株からそれぞれ染色体ＤＮＡを常法（生物工学実験書、日本生物工学会編９７〜９８頁、培風館、１９９２年）により調製した。ｇｌｎＥ遺伝子の内部配列を元に設計した配列番号５および６で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡを用いて、コロニーＰＣＲを行った。
コロニーＰＣＲは、２００μｌのピペットチップをコロニーに触れさせることで取得した量の菌体、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μＬ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。ＰＣＲに供した株のうちで遺伝子増幅の見られなかった株は、ｇｌｎＥ遺伝子欠損株であることを確認し、エシェリヒア・コリＪＧＬＥ１と命名した。

また、上記と同様の操作により、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＫＤ４６をｇｌｎＢ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて形質転換し、ｇｌｎＢ遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリを取得し、エシェリヒア・コリＪＧＬＢ１と命名した。
（３）染色体ＤＮＡ上のｇｌｎＥ遺伝子およびｇｌｎＢ遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリＪＭ１０１株の作製
上記（２）で得られたエシェリヒア・コリＪＧＬＥ１株をｐＫＤ４６で形質転換した後、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で一晩培養することによりｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリＪＧＬＥ１株（以下、エシェリヒア・コリＪＧＬＥ１／ｐＫＤ４６と称す）を取得した。上記（２）と同様の操作により、エシェリヒア・コリＪＧＬＥ１／ｐＫＤ４６をｇｌｎＢ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて電気パルス法により形質転換し、染色体ＤＮＡ上のｇｌｎＢ遺伝子が欠損するように組換えられた株を取得した。ｇｌｎＢ遺伝子の内部配列を元に設計した配列番号７および８で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡを用いて、上記（２）の条件下でコロニーＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより遺伝子増幅が見られなかった株は、ｇｌｎＢ遺伝子欠損株であることを確認し、エシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１と命名した。

ｇｌｎＥ遺伝子、ｇｌｎＢ遺伝子が欠損した微生物を用いたＬ−グルタミンの発酵生産（１）
エシェリヒア・コリＪＭ１０１、実施例１で得られたエシェリヒア・コリＪＧＬＢ１、エシェリヒア・コリＪＧＬＥ１およびエシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１をそれぞれ８ｍｌのＬＢ培地［１０ｇ／ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／ｌイーストエキス（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム］が入っている試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液をそれぞれ生産培地［１６ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、１４ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、１ｇ／Ｌクエン酸（無水）、５ｇ／Ｌカザミノ酸（ディフコ社製）、１０ｇ／Ｌグルコース、１０ｍｇ／ＬビタミンＢ_１、２５ｍｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、５０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄・７水和物、ｐＨ７．２に１０ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムで調整、グルコース、ビタミンＢ_１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後添加した］が８ｍｌ入っている試験管に１％接種し、３０℃で２４時間培養した後、該培養液を遠心分離し培養上清を取得した。

培養上清中の生成物をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後にＨＰＬＣ法により分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、分離カラムにＯＤＳ−ＨＧ５（野村化学社製）、溶離液としてＡ液（酢酸６ｍｌ／ｌ、２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８に調整）およびＢ液（酢酸６ｍｌ／ｌ、７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８に調整）を用い、分析開始後５分まではＡ液：Ｂ液＝８：２、５分〜２０分までは、２０分に達したときにＡ液：Ｂ液＝１：１になるようにリニアーグラジエントをかける条件で分析を行った。結果を表１に示す。

表１に示すように、ｇｌｎＥ遺伝子またはｇｌｎＢ遺伝子の単独欠損株であるエシェリヒア・コリＪＧＬＢ１およびエシェリヒア・コリＪＧＬＥ１に比べ、ｇｌｎＥ遺伝子およびｇｌｎＢ遺伝子が欠損しているエシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１は、培地中に著量のＬ−グルタミンを蓄積することがわかった。

ｇｌｎＥ遺伝子およびｇｌｎＢ遺伝子が欠損した微生物を用いたＬ−グルタミンの発酵生産（２）
実施例１で得られたエシェリヒア・コリＪＧＬＢＥ１を５０ｍｌのＬＢ培地が入っている３００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２８℃で１７時間培養した。

該培養液を９５０ｍｌのジャー培養用生産培地［７ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、５ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、１ｇ／Ｌクエン酸（無水）、５ｇ／Ｌ酵母エキス（極東製薬工業社製）、１０ｍｇ／Ｌ硫酸マンガン・７水和物、２０ｇ／Ｌグルコース、１０ｍｇ／ＬビタミンＢ_１、２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．２ｇ／Ｌ硫酸鉄・７水和物、ｐＨ７．２に１０ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムで調整、グルコース、ビタミンＢ_１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後添加した］が入っている２Ｌのジャーファーメンターに１％接種した。培養中の培地ｐＨは１８％水酸化アンモニウムでｐＨ７．０に保持し、培養温度３０℃、撹拌速度９００ｒｐｍ、滅菌フィルターで除菌した圧縮空気を１．０ｖｖｍで通気しながら培養した。最初に添加したグルコースがなくなった後（２４時間後）、滅菌した６０％グルコース溶液を１時間あたり１０〜１３ｍｌの速度で供給した。
５０時間培養した後の培養液を実施例２と同様の方法で分析した結果、培養液中には８．０ｇ／ＬのＬ−グルタミンが蓄積していた。

本発明により、Ｌ−グルタミンまたはＬ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を効率よく製造することができる。

配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims

親株の染色体ＤＮＡ上にあるグルタミンシンテターゼアデニリルトランスフェラーゼ（以下、ＧｌｎＥ蛋白質と称す）をコードする遺伝子およびグルタミンシンテターゼ調節蛋白質ＰＩＩ（ＰＩＩｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ。以下、ＧｌｎＢ蛋白質と称す）をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入したことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下または喪失し、かつＬ−グルタミンまたはＬ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物。
エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒア・コリである、請求項１記載の微生物。
Ｌ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸または核酸である、請求項１または２記載の微生物。
アミノ酸がＬ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−グルタミン酸からなる群より選ばれるアミノ酸である、請求項３記載の微生物。
核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ウリジン、チミジン、５’−アデニル酸、５’−イノシン酸、５’−グアニル酸、５’−シチジル酸、５’−キサンチル酸、５’−ウリジル酸および５’−チミジル酸からなる群より選ばれる核酸である、請求項３記載の微生物。
請求項１または２記載の微生物を培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミンまたはＬ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積させ、該培地からＬ−グルタミンまたは該物質を採取することを特徴とするＬ−グルタミンまたは該物質の製造法。
Ｌ−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸または核酸である、請求項６記載の製造法。
アミノ酸がＬ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−グルタミン酸からなる群より選ばれるアミノ酸である、請求項７記載の製造法。
核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ウリジン、チミジン、５’−アデニル酸、５’−イノシン酸、５’−グアニル酸、５’−シチジル酸、５’−キサンチル酸、５’−ウリジル酸および５’−チミジル酸からなる群よりえらばれる核酸である、請求項７記載の製造法。