JP4981134B2 - 乳癌細胞におけるｇタンパク質共役型受容体キナーゼ４遺伝子発現量の定量および抑制 - Google Patents

Description

本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ４（ＧＲＫ４）遺伝子発現量の定量法および抑制法に関する。さらに詳しくは、ＧＲＫ４遺伝子発現量を定量リアルタイムＰＣＲにより定量し、ｓｉＲＮＡにより抑制することに関する。

乳癌は、ほとんどの文明諸国の女性に最もみられる悪性疾患であり、浸潤性乳癌に進展することは、女性の生涯を通じて１０％を超えるリスクがある（非特許文献１：Krupnick JG, Benovic JL: The role of receptor kinases and arrestins in G protein-coupled receptor regulation, Annu Rev Pharmacol Toxicol 1998, 38:289-319）。浸潤性乳癌は、相互に関連し合う、複雑な複数の増殖経路により維持されている混成的な疾患である。ヒト乳癌の古典的な分類として、治療目的のために２つの異なる範疇に分けられている：１つはホルモンが関係しており、他方はホルモンが関わっていない。最近の広範な研究から、浸潤性乳癌の１５〜２０％においてＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子が増幅され、過剰に発現されており（非特許文献２：Weiss ER, Raman D, Shirakawa S, Ducceschi MH, Bertram PT, Wong F, Kraft TW, Osawa S: The cloning of GRK7, a candidate cone opsin kinase, from cone- and rod-dominant mammalian retinas, Mol Vis 1998, 4:27）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）が乳癌の０〜１４％では増幅されていたことが明らかにされた（非特許文献３：Pi M, Oakley RH, Gesty-Palmer D, Cruickshank RD, Spurney RF, Luttrell LM, Quarles LD: Beta-arrestin- and G protein receptor kinase-mediated calcium-sensing receptor desensitization, Mol Endocrinol 2005, 19:1078-1087）（非特許文献４：Sallese M, Mariggio S, Collodel G, Moretti E, Piomboni P, Baccetti B, De Blasi A: G protein-coupled receptor kinase GRK4. Molecular analysis of the four isoforms and ultrastructural localization in spermatozoa and germinal cells, J Biol Chem 1997, 272:10188-10195）。さらに現在のところ、トラスツズマブ（ハーセプチン）が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕが過剰発現している腫瘍の治療のために最初に認可された薬剤である。標的化治療およびホルモン療法はいずれも乳癌患者の生存に対しかなり著しい影響を与えたが、転移性の疾患治療は、今なお対症的のままであり、またアジュバント療法は、最適の結果を保証するものではない。

Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ（G-protein-coupled receptor kinase、本願ではＧＲＫまたはＧＰＫとも称する）は、活性化されたＧタンパク質共役型受容体（非特許文献５：Spyratos F, Delarue JC, Andrieu C, Lidereau R, Champeme MH, Hacene K, Brunet M: Epidermal growth factor receptors and prognosis in primary breast cancer, Breast Cancer Res Treat 1990, 17:83-89）の３番目の細胞質ループもしくはテイルをリン酸化することにより、相応の脱感作を開始する（非特許文献５：Spyratos F, Delarue JC, Andrieu C, Lidereau R, Champeme MH, Hacene K, Brunet M: Epidermal growth factor receptors and prognosis in primary breast cancer, Breast Cancer Res Treat 1990, 17:83-89）（非特許文献６：Ro J, North SM, Gallick GE, Hortobagyi GN, Gutterman JU, Blick M: Amplified and overexpressed epidermal growth factor receptor gene in uncultured primary human breast carcinoma, Cancer Res 1988, 48:161-164）。これにより細胞が細胞外のシグナルの変化に適応することを可能にする。ＧＲＫはセリン／スレオニンに特異なプロテインキナーゼであり、７個のイソ型からなり、３つのファミリーに分割される（非特許文献７：Virlon B, Firsov D, Cheval L, Reiter E, Troispoux C, Guillou F, Elalouf JM: Rat G protein-coupled receptor kinase GRK4: identification, functional expression, and differential tissue distribution of two splice variants, Endocrinology 1998, 139:2784-2795）。

ＧＲＫ１およびＧＲＫ７は、ロドプシンキナーゼ／視覚ファミリーからなり、例外なくレチナで発現しており、桿状体および錐体においてオプシンの脱感作に参加している（非特許文献８：Sallese M, Salvatore L, D'Urbano E, Sala G, Storto M, Launey T, Nicoletti F, Knopfel T, De Blasi A: The G-protein-coupled receptor kinase GRK4 mediates homologous desensitization of metabotropic glutamate receptor 1, Faseb J 2000, 14:2569-2580）（非特許文献９：Perroy J, Adam L, Qanbar R, Chenier S, Bouvier M: Phosphorylation-independent desensitization of GABA(B) receptor by GRK4, Embo J 2003, 22:3816-3824）（非特許文献１０：Oikawa K, Ohbayashi T, Kiyono T, Nishi H, Isaka K, Umezawa A, Kuroda M, Mukai K: Expression of a novel human gene, human wings apart-like (hWAPL), is associated with cervical carcinogenesis and tumor progression, Cancer Res 2004, 64:3545-3549）。

ＧＲＫ２およびＧＲＫ３は、もともとはβ−アドレナリン受容体を調節しているとして同定され、ＡＲＫファミリーを構成する。ＧＲＫ４ファミリーは、ＧＲＫ４、ＧＲＫ５およびＧＲＫ６からなる。ＧＲＫ−仲介リン酸化は該受容体／Ｇタンパク質相互作用を低下させ、リン酸化されたＧＰＣＲにアレスチン（ａｒｒｅｓｔｉｎ）結合を開始させることが示されてきた（非特許文献１１：Rankin ML, Marinec PS, Cabrera DM, Wang Z, Jose PA, Sibley DR: The D1 dopamine receptor is constitutively phosphorylated by G protein-coupled receptor kinase 4, Mol Pharmacol 2006, 69:759-769）。ＧＲＫ２、３、５および６は哺乳類組織中に極めて広範に分布して存在するが、対照的にＧＲＫ４は、圧倒的に精巣（非特許文献１２：Miller WE, Lefkowitz RJ: Expanding roles for beta-arrestins as scaffolds and adapters in GPCR signaling and trafficking, Curr Opin Cell Biol 2001, 13:139-145）に見出され、これより少ないがプルキニエ細胞および腎臓（非特許文献１３：Lefkowitz RJ, Shenoy SK: Transduction of receptor signals by beta-arrestins, Science 2005, 308:512-517）（非特許文献１４：Luttrell LM, Ferguson SS, Daaka Y, Miller WE, Maudsley S, Della Rocca GJ, Lin F, Kawakatsu H, Owada K, Luttrell DK, Caron MG, Lefkowitz RJ: Beta-arrestin-dependent formation of beta2 adrenergic receptor-Src protein kinase complexes, Science 1999, 283:655-661）にも見出されている。最近、ＧＲＫの発現様式およびＧＲＫの調節の機構に関する理解は進んでいるにもかかわらず、それらの特異性および機能的な役割については余り知られていない。

本発明者らは、ＧＲＫ４がヒト乳癌細胞において高度に発現されていることを初めて発見し、さらに研究を進めたところ、ＧＲＫ４を過剰発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞が癌化する活性を示し、ＧＲＫ４ ｓｉＲＮＡがヒト乳癌細胞の増殖を抑制することも見出した。加えてＧＲＫ４はβ−アレスチンと相互作用をしており、細胞外シグナルに調節されるキナーゼ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ：ＥＲＫ）１／２経路を活性化させることの知見を得た。本発明者らはこれらの知見に基づき、ＧＲＫ４によるヒト乳癌の診断、治療に関わる本発明を完成した。

本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意検討した結果、ある特定の配列を有するプライマーセットを使用した場合に定量リアルタイムＰＣＲによる遺伝子の増幅効率が良く、またある特定の配列を有するｓｉＲＮＡがＧＲＫ４タンパク質の発現を有意に抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下に記載した事項により特定される。

ＰＣＲ用のＧタンパク質共役型受容体キナーゼ４（ＧＲＫ４）遺伝子に特異的なプライマーセットであることを特徴とし、該プライマーセットが、以下の配列またはその配列アナログを有する。

５’−ＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣ−３’
５’−ＴＴＴＧＴＴＡＣＧＧＧＴＴＧＣＣＴＴＴＣ−３’
また、乳癌細胞において、ＧＲＫ４ ｍＲＮＡの発現量を、前記プライマーセットを使用し、定量リアルタイムＰＣＲ法により決定することができる。

乳癌細胞において、ＧＲＫ４遺伝子、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子、および／またはＥＧＦＲ遺伝子の発現プロファイルを作成するためのキットであり、少なくとも
（ｉ）ＧＲＫ４遺伝子、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子およびＥＧＦＲ遺伝子のうち、少なくとも１つに特異的なプライマーセット、および
（ｉｉ）定量リアルタイムＰＣＲ用の試薬類
を含むことを特徴とする。

また、上記キットは、マイクロアレイ化されていてもよい。

ＧＲＫ４α遺伝子、ＧＲＫ４β遺伝子、ＧＲＫ４γ遺伝子およびＧＲＫ４δ遺伝子からなるＧＲＫ４遺伝子サブファミリーの発現パターンにおいて、それらのバリアントに特異的な抗体を用いる免疫分析により、乳癌検出、乳癌の病態判別、増殖のステータスもしくは亢進の可能性、または再発可能性を診断、評価または予見するためのデータを提供する乳癌検査方法であることを特徴とする。

乳癌細胞において、細胞増殖を阻害または細胞死を誘導するためのＧＲＫ４遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）であることを特徴とする。

上記ＧＲＫ４遺伝子特異的ｓｉＲＮＡが、以下の同じ番号を有するセンス鎖およびアンチセンス鎖に３’末端のオーバーハングを付加した二本鎖ＲＮＡからなることを特徴とする。

（センス鎖００１）ＵＣＧＡＧＡＡＣＡＵＣＧＵＧＧＣＣＡＡ
（アンチセンス鎖００１）ＵＵＧＧＣＣＡＣＧＡＵＧＵＵＣＵＣＧＡ
（センス鎖００２）ＧＣＵＧＡＡＡＧＣＧＣＧＵＣＡＡＧＧＡ
（アンチセンス鎖００２）ＵＣＣＵＵＧＡＣＧＣＧＣＵＵＵＣＡＧＣ
（センス鎖００３）ＧＡＡＡＧＣＧＣＧＵＣＡＡＧＧＡＧＧＡ
（アンチセンス鎖００３）ＵＣＣＵＣＣＵＵＧＡＣＧＣＧＣＵＵＵＣ
（センス鎖００４）ＵＣＡＡＧＧＡＧＧＡＵＡＵＧＧＣＡＡＡ
（アンチセンス鎖００４）ＵＵＵＧＣＣＡＵＡＵＣＣＵＣＣＵＵＧＡ
（センス鎖００５）ＡＧＧＡＧＧＡＵＡＵＧＧＣＡＡＡＡＡＡ
（アンチセンス鎖００５）ＵＵＵＵＵＵＧＣＣＡＵＡＵＣＣＵＣＣＵ
（センス鎖００６）ＡＡＡＡＡＧＵＧＧＵＣＧＵＡＧＵＡＡＡ
（アンチセンス鎖００６）ＵＵＵＡＣＵＡＣＧＡＣＣＡＣＵＵＵＵＵ
（センス鎖００７）ＡＡＡＡＧＵＧＧＵＣＧＵＡＧＵＡＡＡＡ
（アンチセンス鎖００７）ＵＵＵＵＡＣＵＡＣＧＡＣＣＡＣＵＵＵＵ
（センス鎖００８）ＡＡＡＡＡＵＧＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＣＵ
（アンチセンス鎖００８）ＡＧＵＡＵＣＵＣＣＵＵＣＣＡＵＵＵＵＵ
（センス鎖００９）ＧＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＣＵＧＡＣＡＣＵ
（アンチセンス鎖００９）ＡＧＵＧＵＣＡＧＵＡＵＣＵＣＣＵＵＣＣ
（センス鎖０１０）ＣＡＧＣＣＡＧＵＧＣＡＧＵＧＡＧＣＵＵ
（アンチセンス鎖０１０）ＡＡＧＣＵＣＡＣＵＧＣＡＣＵＧＧＣＵＧ
（センス鎖０１１）ＵＧＡＡＡＡＧＧＡＵＵＡＵＡＧＣＡＧＵ
（アンチセンス鎖０１１）ＡＣＵＧＣＵＡＵＡＡＵＣＣＵＵＵＵＣＡ
（センス鎖０１２）ＧＡＡＡＡＧＧＡＵＵＡＵＡＧＣＡＧＵＣ
（アンチセンス鎖０１２）ＧＡＣＵＧＣＵＡＵＡＡＵＣＣＵＵＵＵＣ
（センス鎖０１３）ＣＡＡＧＣＡＡＣＣＧＡＵＡＧＧＡＡＧＡ
（アンチセンス鎖０１３）ＵＣＵＵＣＣＵＡＵＣＧＧＵＵＧＣＵＵＧ
（センス鎖０１４）ＣＵＡＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＵＵＧＡＡＵ
（アンチセンス鎖０１４）ＡＵＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＣＵＵＵＡＧ
（センス鎖０１５）ＣＡＧＡＡＵＡＵＧＡＡＧＵＵＧＣＣＧＡ
（アンチセンス鎖０１５）ＵＣＧＧＣＡＡＣＵＵＣＡＵＡＵＵＣＵＧ
（センス鎖０１６）ＧＡＵＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＧＵＧＡＵＵ
（アンチセンス鎖０１６）ＡＡＵＣＡＣＵＵＣＧＧＵＣＣＵＣＡＵＣ
（センス鎖０１７）ＧＧＡＣＣＧＡＡＧＵＧＡＵＵＧＵＧＧＡ
（アンチセンス鎖０１７）ＵＣＣＡＣＡＡＵＣＡＣＵＵＣＧＧＵＣＣ
（センス鎖０１８）ＣＣＧＡＡＧＵＧＡＵＵＧＵＧＧＡＣＵＧ
（アンチセンス鎖０１８）ＣＡＧＵＣＣＡＣＡＡＵＣＡＣＵＵＣＧＧ
（センス鎖０１９）ＧＧＡＣＵＧＵＣＡＡＵＣＵＵＡＧＡＵＡ
（アンチセンス鎖０１９）ＵＡＵＣＵＡＡＧＡＵＵＧＡＣＡＧＵＣＣ
（センス鎖０２０）ＡＧＡＡＡＵＡＣＣＵＣＣＡＧＡＵＧＵＵ
（アンチセンス鎖０２０）ＡＡＣＡＵＣＵＧＧＡＧＧＵＡＵＵＵＣＵ
（センス鎖０２１）ＣＵＣＣＡＧＡＵＧＵＵＧＵＧＡＣＡＧＡ
（アンチセンス鎖０２１）ＵＣＵＧＵＣＡＣＡＡＣＡＵＣＵＧＧＡＧ
（センス鎖０２２）ＧＡＡＵＧＵＡＧＡＵＵＧＧＧＡＣＵＧＡ
（アンチセンス鎖０２２）ＵＣＡＧＵＣＣＣＡＡＵＣＵＡＣＡＵＵＣ
（センス鎖０２３）ＧＡＵＵＧＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＧＡ
（アンチセンス鎖０２３）ＵＣＣＵＣＣＵＵＣＡＧＵＣＣＣＡＡＵＣ
（センス鎖０２４）ＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＵＵＣＣＡＡＡＡ
（アンチセンス鎖０２４）ＵＵＵＵＧＧＡＡＧＧＧＵＵＣＵＣＣＵＣ
（センス鎖０２５）ＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＵＵＣＣＡＡＡＡＡ
（アンチセンス鎖０２５）ＵＵＵＵＵＧＧＡＡＧＧＧＵＵＣＵＣＣＵ
（センス鎖０２６）ＧＧＡＧＡＡＣＣＣＵＵＣＣＡＡＡＡＡＡ
（アンチセンス鎖０２６）ＵＵＵＵＵＵＧＧＡＡＧＧＧＵＵＣＵＣＣ
（センス鎖０２７）ＣＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＵＵＵＧＡＧＧＡ
（アンチセンス鎖０２７）ＵＣＣＵＣＡＡＡＧＧＣＵＵＵＵＵＵＧＧ
（センス鎖０２８）ＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＵＵＵＧＡＧＧＡＡ
（アンチセンス鎖０２８）ＵＵＣＣＵＣＡＡＡＧＧＣＵＵＵＵＵＵＧ
（センス鎖０２９）ＡＡＡＡＡＡＧＣＣＵＵＵＧＡＧＧＡＡＵ
（アンチセンス鎖０２９）ＡＵＵＣＣＵＣＡＡＡＧＧＣＵＵＵＵＵＵ
（センス鎖０３０）ＧＡＧＧＡＡＵＧＵＡＣＵＡＧＡＧＵＵＧ
（アンチセンス鎖０３０）ＣＡＡＣＵＣＵＡＧＵＡＣＡＵＵＣＣＵＣ
（センス鎖０３１）ＧＵＡＣＵＡＧＡＧＵＵＧＣＣＣＡＵＡＡ
（アンチセンス鎖０３１）ＵＵＡＵＧＧＧＣＡＡＣＵＣＵＡＧＵＡＣ
（センス鎖０３２）ＧＧＧＡＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＧＡＡＵＡ
（アンチセンス鎖０３２）ＵＡＵＵＣＵＵＣＡＡＡＵＧＧＵＵＣＣＣ
（センス鎖０３３）ＣＡＡＵＧＧＡＡＡＵＧＧＣＵＧＧＡＡＡ
（アンチセンス鎖０３３）ＵＵＵＣＣＡＧＣＣＡＵＵＵＣＣＡＵＵＧ
（センス鎖０３４）ＧＧＡＡＡＵＧＧＣＵＧＧＡＡＡＧＧＣＡ
（アンチセンス鎖０３４）ＵＧＣＣＵＵＵＣＣＡＧＣＣＡＵＵＵＣＣ
（センス鎖０３５）ＧＡＡＡＵＧＧＣＵＧＧＡＡＡＧＧＣＡＡ
（アンチセンス鎖０３５）ＵＵＧＣＣＵＵＵＣＣＡＧＣＣＡＵＵＵＣ
（センス鎖０３６）ＣＵＧＧＡＡＡＧＧＣＡＡＣＣＣＧＵＡＡ
（アンチセンス鎖０３６）ＵＵＡＣＧＧＧＵＵＧＣＣＵＵＵＣＣＡＧ
（センス鎖０３７）ＣＡＡＡＧＡＡＣＡＣＡＵＵＵＡＧＡＣＡ
（アンチセンス鎖０３７）ＵＧＵＣＵＡＡＡＵＧＵＧＵＵＣＵＵＵＧ
（センス鎖０３８）ＡＵＵＡＣＡＧＡＧＵＵＣＵＡＧＧＡＡＡ
（アンチセンス鎖０３８）ＵＵＵＣＣＵＡＧＡＡＣＵＣＵＧＵＡＡＵ
（センス鎖０３９）ＵＵＡＣＡＧＡＧＵＵＣＵＡＧＧＡＡＡＡ
（アンチセンス鎖０３９）ＵＵＵＵＣＣＵＡＧＡＡＣＵＣＵＧＵＡＡ
（センス鎖０４０）ＡＧＧＡＡＡＡＧＧＣＧＧＡＵＵＵＧＧＡ
（アンチセンス鎖０４０）ＵＣＣＡＡＡＵＣＣＧＣＣＵＵＵＵＣＣＵ
（センス鎖０４１）ＧＡＡＡＡＧＧＣＧＧＡＵＵＵＧＧＡＧＡ
（アンチセンス鎖０４１）ＵＣＵＣＣＡＡＡＵＣＣＧＣＣＵＵＵＵＣ
（センス鎖０４２）ＡＧＧＣＧＧＡＵＵＵＧＧＡＧＡＧＧＵＵ
（アンチセンス鎖０４２）ＡＡＣＣＵＣＵＣＣＡＡＡＵＣＣＧＣＣＵ
（センス鎖０４３）ＡＧＵＧＣＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＡＡＡ
（アンチセンス鎖０４３）ＵＵＵＵＣＣＵＧＵＧＧＣＵＣＧＣＡＣＵ
（センス鎖０４４）ＧＡＡＡＡＡＵＧＵＡＵＧＣＣＵＧＣＡＡ
（アンチセンス鎖０４４）ＵＵＧＣＡＧＧＣＡＵＡＣＡＵＵＵＵＵＣ
（センス鎖０４５）ＣＵＧＣＡＡＡＡＡＧＣＵＡＣＡＡＡＡＡ
（アンチセンス鎖０４５）ＵＵＵＵＵＧＵＡＧＣＵＵＵＵＵＧＣＡＧ
（センス鎖０４６）ＡＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧ
（アンチセンス鎖０４６）ＣＵＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵＵＵＡＵＵＣＵ
（センス鎖０４７）ＵＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧＵＧＡ
（アンチセンス鎖０４７）ＵＣＡＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵＵＵＡ
（センス鎖０４８）ＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧＵＧＡＡ
（アンチセンス鎖０４８）ＵＵＣＡＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵＵＵ
（センス鎖０４９）ＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧＵＧＡＡＧＣＵＡＵ
（アンチセンス鎖０４９）ＡＵＡＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵ
（センス鎖０５０）ＧＡＧＧＡＡＡＧＧＵＧＡＡＧＣＵＡＵＧ
（アンチセンス鎖０５０）ＣＡＵＡＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＵＣＣＵＣ
（センス鎖０５１）ＧＣＵＣＵＡＡＡＵＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡ
（アンチセンス鎖０５１）ＵＵＣＵＵＵＵＣＵＣＡＵＵＵＡＧＡＧＣ
（センス鎖０５２）ＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＵＵＣＵＧＧＡＧＡ
（アンチセンス鎖０５２）ＵＣＵＣＣＡＧＡＡＵＵＣＵＵＵＵＣＵＣ
（センス鎖０５３）ＡＧＡＡＡＡＧＡＡＵＵＣＵＧＧＡＧＡＡ
（アンチセンス鎖０５３）ＵＵＣＵＣＣＡＧＡＡＵＵＣＵＵＵＵＣＵ
（センス鎖０５４）ＧＡＡＡＡＧＡＡＵＵＣＵＧＧＡＧＡＡＡ
（アンチセンス鎖０５４）ＵＵＵＣＵＣＣＡＧＡＡＵＵＣＵＵＵＵＣ
（センス鎖０５５）ＡＡＡＧＡＡＵＵＣＵＧＧＡＧＡＡＡＧＵ
（アンチセンス鎖０５５）ＡＣＵＵＵＣＵＣＣＡＧＡＡＵＵＣＵＵＵ
（センス鎖０５６）ＵＧＧＡＧＡＡＡＧＵＧＣＡＡＡＧＵＡＧ
（アンチセンス鎖０５６）ＣＵＡＣＵＵＵＧＣＡＣＵＵＵＣＵＣＣＡ
（センス鎖０５７）ＧＧＡＧＡＡＡＧＵＧＣＡＡＡＧＵＡＧＡ
（アンチセンス鎖０５７）ＵＣＵＡＣＵＵＵＧＣＡＣＵＵＵＣＵＣＣ
（センス鎖０５８）ＧＡＧＡＡＡＧＵＧＣＡＡＡＧＵＡＧＡＵ
（アンチセンス鎖０５８）ＡＵＣＵＡＣＵＵＵＧＣＡＣＵＵＵＣＵＣ
（センス鎖０５９）ＣＡＡＡＧＵＡＧＡＵＵＣＧＵＡＧＵＵＡ
（アンチセンス鎖０５９）ＵＡＡＣＵＡＣＧＡＡＵＣＵＡＣＵＵＵＧ
（センス鎖０６０）ＧＵＡＧＡＵＵＣＧＵＡＧＵＵＡＧＵＵＵ
（アンチセンス鎖０６０）ＡＡＡＣＵＡＡＣＵＡＣＧＡＡＵＣＵＡＣ
（センス鎖０６１）ＣＣＡＡＡＧＡＵＧＣＣＵＵＧＵＧＣＵＵ
（アンチセンス鎖０６１）ＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＣＡＵＣＵＵＵＧＧ
（センス鎖０６２）ＡＣＡＵＵＵＡＣＡＡＣＣＵＧＧＧＣＡＡ
（アンチセンス鎖０６２）ＵＵＧＣＣＣＡＧＧＵＵＧＵＡＡＡＵＧＵ
（センス鎖０６３）ＵＧＧＡＡＧＡＵＵＵＡＣＡＧＡＧＧＧＡ
（アンチセンス鎖０６３）ＵＣＣＣＵＣＵＧＵＡＡＡＵＣＵＵＣＣＡ
（センス鎖０６４）ＧＡＡＧＡＵＵＵＡＣＡＧＡＧＧＧＡＡＡ
（アンチセンス鎖０６４）ＵＵＵＣＣＣＵＣＵＧＵＡＡＡＵＣＵＵＣ
（センス鎖０６５）ＧＧＡＡＡＧＡＡＵＵＧＵＡＵＡＣＡＧＡ
（アンチセンス鎖０６５）ＵＣＵＧＵＡＵＡＣＡＡＵＵＣＵＵＵＣＣ
（センス鎖０６６）ＡＣＡＧＡＧＡＣＵＵＧＡＡＧＣＣＵＧＡ
（アンチセンス鎖０６６）ＵＣＡＧＧＣＵＵＣＡＡＧＵＣＵＣＵＧＵ
（センス鎖０６７）ＡＣＵＵＧＡＡＧＣＣＵＧＡＧＡＡＵＡＵ
（アンチセンス鎖０６７）ＡＵＡＵＵＣＵＣＡＧＧＣＵＵＣＡＡＧＵ
（センス鎖０６８）ＣＡＧＡＧＡＵＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡ
（アンチセンス鎖０６８）ＵＧＵＣＣＵＵＣＵＧＧＧＡＵＣＵＣＵＧ
（センス鎖０６９）ＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＵＵＣ
（アンチセンス鎖０６９）ＧＡＡＣＣＣＵＣＵＧＵＣＣＵＵＣＵＧＧ
（センス鎖０７０）ＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＵＵＣＧＡＧＧＡＡ
（アンチセンス鎖０７０）ＵＵＣＣＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＵＧＵＣＣ
（センス鎖０７１）ＡＣＡＧＡＧＧＧＵＵＣＧＡＧＧＡＡＧＡ
（アンチセンス鎖０７１）ＵＣＵＵＣＣＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＵＧＵ
（センス鎖０７２）ＵＣＧＡＧＧＡＡＧＡＧＵＵＧＧＡＡＣＡ
（アンチセンス鎖０７２）ＵＧＵＵＣＣＡＡＣＵＣＵＵＣＣＵＣＧＡ
（センス鎖０７３）ＧＡＧＵＵＧＧＡＡＣＡＧＵＣＧＧＣＵＡ
（アンチセンス鎖０７３）ＵＡＧＣＣＧＡＣＵＧＵＵＣＣＡＡＣＵＣ
（センス鎖０７４）ＣＵＡＣＡＵＧＧＣＡＣＣＵＧＡＡＧＵＵ
（アンチセンス鎖０７４）ＡＡＣＵＵＣＡＧＧＵＧＣＣＡＵＧＵＡＧ
（センス鎖０７５）ＣＡＣＣＵＧＡＡＧＵＵＧＵＣＡＡＵＡＡ
（アンチセンス鎖０７５）ＵＵＡＵＵＧＡＣＡＡＣＵＵＣＡＧＧＵＧ
（センス鎖０７６）ＡＵＧＡＡＡＵＧＡＵＵＣＡＧＧＧＡＣＡ
（アンチセンス鎖０７６）ＵＧＵＣＣＣＵＧＡＡＵＣＡＵＵＵＣＡＵ
（センス鎖０７７）ＧＧＧＡＣＡＵＵＣＵＣＣＡＵＵＣＡＡＡ
（アンチセンス鎖０７７）ＵＵＵＧＡＡＵＧＧＡＧＡＡＵＧＵＣＣＣ
（センス鎖０７８）ＧＧＡＣＡＵＵＣＵＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡ
（アンチセンス鎖０７８）ＵＵＵＵＧＡＡＵＧＧＡＧＡＡＵＧＵＣＣ
（センス鎖０７９）ＡＡＧＡＧＡＡＡＧＵＣＡＡＡＵＧＧＧＡ
（アンチセンス鎖０７９）ＵＣＣＣＡＵＵＵＧＡＣＵＵＵＣＵＣＵＵ
（センス鎖０８０）ＵＣＡＡＡＵＧＧＧＡＧＧＡＧＧＵＣＧＡ
（アンチセンス鎖０８０）ＵＣＧＡＣＣＵＣＣＵＣＣＣＡＵＵＵＧＡ
（センス鎖０８１）ＧＧＧＡＧＧＡＧＧＵＣＧＡＵＣＡＡＡＧ
（アンチセンス鎖０８１）ＣＵＵＵＧＡＵＣＧＡＣＣＵＣＣＵＣＣＣ
（センス鎖０８２）ＣＧＡＵＣＡＡＡＧＡＡＵＣＡＡＧＡＡＵ
（アンチセンス鎖０８２）ＡＵＵＣＵＵＧＡＵＵＣＵＵＵＧＡＵＣＧ
（センス鎖０８３）ＧＡＵＣＡＡＡＧＡＡＵＣＡＡＧＡＡＵＧ
（アンチセンス鎖０８３）ＣＡＵＵＣＵＵＧＡＵＵＣＵＵＵＧＡＵＣ
（センス鎖０８４）ＡＧＡＡＵＧＡＵＡＣＣＧＡＧＧＡＧＵＡ
（アンチセンス鎖０８４）ＵＡＣＵＣＣＵＣＧＧＵＡＵＣＡＵＵＣＵ
（センス鎖０８５）ＡＧＧＡＧＵＡＵＵＣＵＧＡＧＡＡＧＵＵ
（アンチセンス鎖０８５）ＡＡＣＵＵＣＵＣＡＧＡＡＵＡＣＵＣＣＵ
（センス鎖０８６）ＵＧＡＧＡＡＧＵＵＵＵＣＡＧＡＧＧＡＵ
（アンチセンス鎖０８６）ＡＵＣＣＵＣＵＧＡＡＡＡＣＵＵＣＵＣＡ
（センス鎖０８７）ＧＧＡＵＧＵＵＡＣＵＣＡＣＣＡＡＧＡＡ
（アンチセンス鎖０８７）ＵＵＣＵＵＧＧＵＧＡＧＵＡＡＣＡＵＣＣ
（センス鎖０８８）ＵＣＡＧＧＡＧＧＣＵＧＧＡＧＧＣＡＡＡ
（アンチセンス鎖０８８）ＵＵＵＧＣＣＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＵＧＡ
（センス鎖０８９）ＧＵＡＡＧＧＡＣＧＵＣＣＵＧＧＡＵＡＵ
（アンチセンス鎖０８９）ＡＵＡＵＣＣＡＧＧＡＣＧＵＣＣＵＵＡＣ
（センス鎖０９０）ＣＣＧＣＡＧＡＵＧＡＡＧＡＣＵＵＣＵＡ
（アンチセンス鎖０９０）ＵＡＧＡＡＧＵＣＵＵＣＡＵＣＵＧＣＧＧ
（センス鎖０９１）ＣＡＧＡＡＵＧＡＧＡＵＧＡＵＣＧＡＡＵ
（アンチセンス鎖０９１）ＡＵＵＣＧＡＵＣＡＵＣＵＣＡＵＵＣＵＧ
（センス鎖０９２）ＵＣＡＡＣＡＡＡＡＧＵＧＡＡＡＧＵＧＡ
（アンチセンス鎖０９２）ＵＣＡＣＵＵＵＣＡＣＵＵＵＵＧＵＵＧＡ
（センス鎖０９３）ＣＡＡＣＡＡＡＡＧＵＧＡＡＡＧＵＧＡＧ
（アンチセンス鎖０９３）ＣＵＣＡＣＵＵＵＣＡＣＵＵＵＵＧＵＵＧ
（センス鎖０９４）ＣＡＡＡＡＧＵＧＡＡＡＧＵＧＡＧＧＡＡ
（アンチセンス鎖０９４）ＵＵＣＣＵＣＡＣＵＵＵＣＡＣＵＵＵＵＧ
（センス鎖０９５）ＧＵＧＡＡＡＧＵＧＡＧＧＡＡＧＣＵＵＵ
（アンチセンス鎖０９５）ＡＡＡＧＣＵＵＣＣＵＣＡＣＵＵＵＣＡＣ
（センス鎖０９６）ＧＵＧＡＧＧＡＡＧＣＵＵＵＧＣＣＡＵＵ
（アンチセンス鎖０９６）ＡＡＵＧＧＣＡＡＡＧＣＵＵＣＣＵＣＡＣ
（センス鎖０９７）ＣＡＵＵＡＧＡＵＣＵＡＧＡＣＡＡＧＡＡ
（アンチセンス鎖０９７）ＵＵＣＵＵＧＵＣＵＡＧＡＵＣＵＡＡＵＧ
（センス鎖０９８）ＡＧＡＡＧＧＡＡＧＵＧＧＡＡＣＣＣＡＡ
（アンチセンス鎖０９８）ＵＵＧＧＧＵＵＣＣＡＣＵＵＣＣＵＵＣＵ
（センス鎖０９９）ＧＧＡＡＧＵＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＡＡ
（アンチセンス鎖０９９）ＵＵＧＣＵＵＧＧＧＵＵＣＣＡＣＵＵＣＣ
（センス鎖１００）ＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＣＡＵＧＵＧＵＵＡ
（アンチセンス鎖１００）ＵＡＡＣＡＣＡＵＧＣＵＣＣＵＵＣＣＵＧ
また、上記ＧＲＫ４遺伝子特異的ｓｉＲＮＡが、少なくともＧＲＫ４遺伝子、ＧＰＫ４ ｍＲＮＡ、またはＧＰＫ４を作用標的とする物質を含む乳癌治療用薬剤を製造するために使用されることを特徴とする。

さらに、ＧＲＫ４タンパク質および／またはＧＲＫ４遺伝子を標的分子とする乳癌の分子標的治療方法であることを特徴とする。

本発明は、乳癌細胞において、ある特定の配列を有するプライマーセットを使用した場合に定量リアルタイムＰＣＲによる遺伝子の増幅効率に優れ、またＧＲＫ４タンパク質の発現を有意に抑制するある特定の配列を有するｓｉＲＮＡを提供することができる。

以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。

本発明のプライマーセットは、ＰＣＲ用のＧタンパク質共役型受容体キナーゼ４（ＧＲＫ４）遺伝子に特異的なプライマーセットであり、好ましくはそのプライマーセットが、以下の配列またはその配列アナログを有する。

５’−ＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣ−３’
５’−ＴＴＴＧＴＴＡＣＧＧＧＴＴＧＣＣＴＴＴＣ−３’
ＰＣＲは、その種類を問わないが、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ４（ＧＲＫ４）遺伝子またはそのＤＮＡの増幅に使用される。

上記配列のアナログ（ａｎａｌｏｇｕｅ）とは、上記提示の配列の類似配列であり、かつ、ＰＣＲでの増幅においてプライマー機能を発揮する塩基配列である。一例としてのヒトＧＲＫ４の塩基配列（図８）において具体的に検索されるが、ｃＤＮＡ完全長、好ましくは選択的スプライシングの影響を受けない領域、より好ましくは高度に保存された領域、もっとも好ましくは１０７７〜１２３５塩基の領域の塩基配列から選ばれる配列が望ましい。特に上記の塩基配列を有するプライマーが増幅効率上、最適であると考えられる。

上記プライマーセットまたはその配列アナログは、特に乳癌細胞において、ＧＲＫ４ ｍＲＮＡの発現量を、前記プライマーセットを使用し、定量リアルタイムＰＣＲ法により決定する場合に好適に使用することができる。このプライマーセットを使用する定量リアルタイムＰＣＲ法は、乳癌組織で発現が亢進しているＧＲＫ４タンパク質をコードするＧＲＫ４ ｍＲＮＡの発現量、あるいはこのＧＲＫ４ ｍＲＮＡとともに、他の発癌遺伝子のｍＲＮＡ発現量を併せて調べることにより発現プロファイルを作成するための有力な手法として本発明では利用される。

〔Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ４（ＧＲＫ４）〕
Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＰＫ）は、セリン／スレオニンに特異的なプロテインキナーゼであり、７個のイソ型からなり、３つのファミリーに分割される。また、ＧＲＫ４のサブファミリーは、ＧＲＫ４α、β、γおよびδと名づけられた４つの選択的スプライシングバリアント（引用文献１７、２０および２９）を有する（図２のＡ）。

さらに、ＧＲＫ４は、圧倒的に精巣（Miller WE, Lefkowitz RJ: Expanding roles for beta-arrestins as scaffolds and adapters in GPCR signaling and trafficking, Curr Opin Cell Biol 2001, 13:139-145）に見出され、これより少ないがプルキニエ細胞および腎臓（Lefkowitz RJ, Shenoy SK: Transduction of receptor signals by beta-arrestins, Science 2005, 308:512-517）（Luttrell LM, Ferguson SS, Daaka Y, Miller WE, Maudsley S, Della Rocca GJ, Lin F, Kawakatsu H, Owada K, Luttrell DK, Caron MG, Lefkowitz RJ: Beta-arrestin-dependent formation of beta2 adrenergic receptor-Src protein kinase complexes, Science 1999, 283:655-661）にも見出されている。

〔乳癌〕
なお、本明細書において「乳癌」は、終末乳管から発生する乳管癌および小葉から発生する小葉癌の両方を含む。ここで「癌」は「悪性腫瘍」をいうが、単に「腫瘍」と言及することもある。また、「悪性転換」と「癌化」とは同義のように使用することもある。

被験者からの腫瘍組織は通常、生検（バイオプシー）によって得られる。その詳細は後述する。冷凍保存されていた腫瘍の試料を１０％の中性緩衝化ホルマリン中において固定し、通常どおりに処理し、パラフィン中に包埋した。組織学的診断を原発腫瘍の１から４の原断面を精査することによって確認した。すべての腫瘍を組織型について同時に見直し、この臨床データを知らされていない熟練病理学者２人によって格付けした。もっとも代表的なブロックを、免疫組織化学的アッセイ用に、新しく５μｍの厚さに切った切片から選んだ。この研究において使用した腫瘍の試料を表１にまとめた。これらの試料より、ｍＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法を行うことにより乳癌の発症、増殖に関わる遺伝子発現が測定される。

〔乳癌に関係する遺伝子の発現〕
試料として乳癌細胞と正常な乳房細胞とから別々にｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡを別々の蛍光色素により標識し、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡ）を合成する。これら標識化されたｃＤＮＡを混合し、ガラス板上にスポットして固定化されたＤＮＡと結合させる操作（ハイブリダイゼーション）を用いて、遺伝子の発現量の比を検出する。

乳癌切除検体（乳管癌１０例および小葉癌３例）よりＲＮＡを抽出し、症例ごとにマイクロアレイを用い２万遺伝子の遺伝子発現プロファイルを解析した。その結果により乳癌の腫瘍形成、増殖に関わる遺伝子の検索が可能となる。

〔定量リアルタイムＰＣＲ法〕
本発明の定量リアルタイムＰＣＲ法は、リアルタイムＰＣＲとＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）とを組み合わせ、ｍＲＮＡの定量に使用される実験法である。これにより、細胞内のある時点での遺伝子の発現量を定量することができる。ここで、リアルタイムＰＣＲとは、定量ＰＣＲの一つであって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を経時的（リアルタイム）に測定することにより、増幅率に基づいて鋳型ＤＮＡを定量することができる実験法をいう。この定量は、蛍光色素を用いて行なわれ、二種類の方法がある。１）二本鎖ＤＮＡに特異的に挿入（インターカレート）して蛍光を発する色素（ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ）を用いる方法と、２）鋳型ＤＮＡの配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたものをプローブとして用いる方法である。本発明では上記１）の方法を用いたが、これに限定されるものではない。

具体的には、最初の鎖であるｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）_１７プライマーとＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）により全ＲＮＡ１μｇから合成した。リアルタイムＰＣＲ法を、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲバージョン２．１（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社、滋賀、日本）、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｃａｍｂｒｅｘ、ワシントンＤＣ）とともにＭｘ３００５Ｐ ＱＰＣＲ系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ・ホヤ、カリフォルニア州）を使用し実行した。本発明者らは、ＧＲＫ４特異的プライマーとして５’−ＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣ−３’および５’−ＴＴＴＧＴＴＡＣＧＧＧＴＴＧＣＣＴＴＴＣ−３’を、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ特異的プライマーとして５’−ＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧＴＡＣＴＴＧ−３’および５’−ＴＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧ−３’を、およびＥＧＦＲ特異的プライマーとして５’−ＣＣＡＡＧＣＣＡＴＡＴＧＡＣＧＧＡＡＴＣ−３’および５’−ＡＣＴＡＴＣＴＧＣＧＴＣＴＡＴＣＡＴＣＣ−３’を使用した。β−アクチン特異的プライマーは、既に記載されている（Ｏｉｋａｗａら ２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）。反応混合物を９５℃で３０秒間変性させ、次に９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間ＰＣＲの５０サイクルに供した。ＧＲＫ４、Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＥＧＦＲのｍＲＮＡレベルをβ−アクチンのシグナルに対して標準化した。本発明者らは、ｍＲＮＡレベルを決定するためにこれらの実験を二重に行った。

なおマイクロアレイとは、数万〜数十万に区切られたガラス板またはシリコン基盤の上に、ＤＮＡの部分配列を高密度に配置し固定したものである。これにより、数万〜数十万の遺伝子発現を一度に調べることが可能である。

本発明のキットは、乳癌細胞において、ＧＲＫ４遺伝子、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子、および／またはＥＧＦＲ遺伝子の発現プロファイルを作成するためのキットであり、少なくとも
（ｉ）ＧＲＫ４遺伝子、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子およびＥＧＦＲ遺伝子のうち、少なくとも１つに特異的なプライマーセット、および
（ｉｉ）定量リアルタイムＰＣＲ用の試薬類
を含むことを特徴としている。

そのキットは、ＧＲＫ４遺伝子単独の発現を調べるためのキットでもよく、この遺伝子のほかにＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子、および／またはＥＧＦＲ遺伝子の発現をも測定して発現プロファイルを作成するためのキットであってもよい。具体的には、そのキットには、検体を溶解するための溶解液、各種器材または資材、試薬および／または遺伝子増幅を実施するためのプライマー類、試薬を含むものである。これらの試薬の中には、各種酵素類、緩衝液、洗浄液、溶解液なども含まれる。キット要素として、さらに多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレート、ＤＮＡ増幅用具などの必要な器材一式、使用説明書などを含んでもよい。

本発明のハイスループットな態様は、マイクロアレイ化されているか、あるいは上記キットの中に、マイクロリアクタ形態のもの、具体的にはチップ形状の器材（例えば発現プロファイル作成用マイクロアレイ）を含んでもよい。このような構成では、チップから得られる信号についての数値化されたものを取り込み、ファイルを作成し、コンピュータ上の所定のディレクトリに保存する形態を採用するシステムが好ましい。数値データを統計的に処理し、乳癌検出、乳癌の病態判別、増殖のステータスもしくは亢進の可能性を診断、評価または予見するためのデータを提供する。そのためのデータ処理は、必要な補正、正規化を経て、統計的解析を可能とする好適なソフトウェアを使用して行われる。

〔検査方法〕
本発明の検査方法は、ＧＲＫ４α遺伝子、ＧＲＫ４β遺伝子、ＧＲＫ４γ遺伝子およびＧＲＫ４δ遺伝子からなるＧＲＫ４遺伝子サブファミリーの発現パターンにおいて、それらのバリアントに特異的な抗体を用いる免疫分析により、乳癌検出、乳癌の病態判別、増殖のステータスもしくは亢進の可能性、または再発可能性を診断、評価または予見するためのデータを提供する乳癌検査方法であることを特徴とする。

〔乳癌検査法〕
一般的な乳癌のスクリーニング検査としては、問診、触診、軟Ｘ線乳房撮影（マンモグラフィー）、超音波検査等が実施され、臨床的に疑いが生じると、生検が実施され組織学的診断により癌を判別する。以下の乳癌検出および病態判別、増殖のステータスもしくは亢進の可能性、ならびに再発可能性における診断、評価または予見するために、ＧＲＫ４のｍＲＮＡの発現量とＧＲＫ４に特異的な抗体を用いる免疫分析とのデータが有効である。

〔乳癌検出〕
診察やスクリーニング検査で乳房にしこりなどの異常が見つかった場合は、さらに検査を行う必要がある。マンモグラフィ検査以外の方法で異常が見つかった場合には、まずマンモグラフィ検査を行う。

充実性のしこりの場合は嚢胞よりも癌の可能性が高いため、生検を行う。吸引生検といい、注射器を使用ししこりから細胞を吸引する方法がよく行われる。また、組織の一部を切除する方法（切開生検）や、しこり全体を摘出する方法（切除生検）も行なうことがある。

生検では、採取した組織を顕微鏡で観察して癌細胞の有無を確認する。癌細胞が検出された場合は試料をさらに分析し、癌細胞の特性、たとえばエストロゲンあるいはプロゲステロン受容体の有無、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ受容体の数、癌細胞の増殖速度などを調べる。これらの情報は癌が転移する速度を予測し、より有効な治療法を選ぶのに役立つ。

癌が転移しているかどうかを診断するため、胸部Ｘ線検査と肝機能を調べる血液検査を行う。腫瘍が大きい場合、あるいはリンパ節が腫れている場合は、全身の骨のＸ線撮影（骨スキャン）を実施することもある。

〔病態判別〕
乳癌の病期（ステージ）は一般に、非浸潤癌（上皮内癌）、局所浸潤癌、領域浸潤癌、遠隔転移癌（転移癌）という名称または、数字でステージ０〜ＩＶとして表現する。

非浸潤癌（上皮内癌）は、局所にとどまっている癌という意味であり、最も初期の癌に相当する。乳房内で著しく大きくなっていることもあるが、周囲の組織への浸潤や体内の他の部位への転移は起こしていない。通常はマンモグラフィ検査で発見される。

局所浸潤癌は、周囲の組織に浸潤しているものの乳房内にとどまっている癌をいう。

領域浸潤癌は、胸壁やリンパ節など乳房周囲の組織にも浸潤している癌をいう。

遠隔転移癌（転移癌）は、乳房から体内の別の部位に転移した癌をいう。

また、乳癌は、癌細胞が最初に発生した組織の種類と、病巣の広がりの範囲によって分類される。乳管で発生した癌を乳管癌といい、乳癌のおよそ９０％はこのタイプである。乳腺で発生した癌は小葉癌という。脂肪組織や結合組織から発生したものは肉腫というが、乳房の癌ではまれなタイプである。

非浸潤性乳管癌は、乳管内に限局した癌である。この癌は乳房周囲の組織には浸潤していないが、乳管に沿って広がり、乳房内でかなり大きくなることもある。この癌は乳癌の２０〜３０％を占める。

非浸潤性小葉癌は、乳腺の内部で増殖する。両側の乳房の複数の部位に生じることも多い。非浸潤性小葉癌は乳癌の１〜２％を占める。

浸潤性乳管癌は、乳管内で発生するが、管壁を越えて周囲の乳腺組織に浸潤した癌である。乳房以外の部位にも転移することがあり、乳癌の６５〜８０％を占めている。

浸潤性小葉癌は、乳腺内で発生して周囲の乳腺組織に浸潤し、さらに乳房以外の部位にも転移する癌である。この癌は乳癌の１０〜１５％を占めている。

他に、乳癌全体のおよそ１％を占める炎症性乳癌、および乳頭のパジェット病が知られ、さらに発生頻度が低い乳管由来の浸潤性癌として、髄様癌、管状癌、粘液癌（膠様癌）などがある。

〔増殖のステータスもしくは亢進の可能性〕
乳癌の病期（ステージ）は腫瘍のサイズ、リンパ節への浸潤の有無、癌細胞の遠隔転移により決定される。ステージは、具体的に以下の０〜ＩＶに分類される。

ステージ０：腫瘍が乳管または乳腺に限局し、周囲の乳腺組織への浸潤がない（上皮内癌、非浸潤癌）。

ステージＩ：腫瘍の直径が２ｃｍ未満で、乳房外への転移がない。

ステージＩＩ：腫瘍の直径が２〜５ｃｍで、腫瘍と同じ側の腋（片側または両側）のリンパ節に転移がみられる。

ステージＩＩＩ：腫瘍の直径が５ｃｍを超え、リンパ節への転移があり、周囲の組織への癒着やリンパ節内の癒着がみられる。あるいは腫瘍の大きさに拘わらず皮膚、胸壁、乳房より下流の胸部リンパ節への転移がみられる。

ステージＩＶ：腫瘍の大きさに拘わらず、乳房から離れた肺や骨などの臓器や組織、あるいは乳房から離れた部位のリンパ節への転移がみられる。

上記遺伝子群の発現プロファイルを作成するか、あるいは発現の調節を調べることに基づいて高感度・高精度な乳癌の早期検出・診断を行うことができる。乳癌に関係する遺伝子の発現プロファイルを調べることにより、乳癌細胞の増殖、病態などに関する情報が得られることの裏づけとなる知見および実験的証拠は、下記に示す本発明者らの研究により積み上げられている。

このようにして乳癌の診断、すなわち、乳癌の検出、乳癌の病態、増殖亢進もしくは転移を評価するためのデータ、さらに予後不良病型への進展を早期検出するデータを得ることができる。特に、それに基づき、患者に病態に関する必要な情報を提供し、経過観察の際に適切に指導して自己管理に役立てることとなる。

〔ＧＲＫ４遺伝子に基づく乳癌の遺伝子治療〕
本発明のｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）は、乳癌細胞において、細胞増殖を阻害または細胞死を誘導するためのＧＲＫ４遺伝子特異的ｓｉＲＮＡであることを特徴とする。すなわち本発明のｓｉＲＮＡは、遺伝子の発現を配列特異的に抑制することができる約１０〜３０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子をいう。したがって、ＧＲＫ４遺伝子に基づく乳癌遺伝子治療は、乳癌細胞において、ＧＲＫ４遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを利用し、ＧＲＫ４遺伝子の発現をＲＮＡ干渉によって阻止することに基づく。

本発明のＧＲＫ４遺伝子特異的ｓｉＲＮＡは、以下の表２に示されている同じ番号を有するセンス鎖およびアンチセンス鎖に、３’末端のオーバーハングを付加した二本鎖ＲＮＡからなることを特徴とする。なお、表２「Ｇｅｎｅ」の欄は、ＧＲＫ４遺伝子におけるｓｉＲＮＡの標的塩基の番号を示し、「ＣＤＳ」の欄は、ＧＲＫ４タンパク質のアミノ酸をコードする配列（ＣＤＳ）におけるｓｉＲＮＡの標的塩基の番号を示す。

上記３’末端のオーバーハングとは、５’末端から１９塩基が相補的な配列である２本のＲＮＡ鎖が対合して二本鎖を形成したとき、１９塩基対の両端から突出する３’末端の２塩基の部分をいう。前記３’末端オーバーハングの２塩基の配列は、特に制限されないが、ＴＴ（−チミン・チミン）、ＡＵ（−アデニン・ウラシル）、ＡＧ（−アデニン・グアニン）等があげられる。また、ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖におけるオーバーハング部分が、同じ塩基配列でも、異なる塩基配列でもよい。例えば、センス鎖のオーバーハングがＡＧ、アンチセンス鎖のオーバーハングがＡＵでもよいし、センス鎖のオーバーハングがＡＵ、アンチセンス鎖のオーバーハングがＡＧでもよい。

なお、前記３’オーバーハングの２塩基の配列は、これに制限されず、ＲＮＡ干渉効果に実質的に影響を及ぼさない範囲であれば、任意の天然核酸塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル）、並びに、天然及び人工の公知の修飾塩基であってもよい。

また、前記３’末端オーバーハング部分のヌクレオチドは、通常、リボヌクレオチドを使用できるがこれに制限されず、ＲＮＡ干渉効果に実質的に影響を及ぼさない範囲であれば、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、その他の公知のヌクレオチド類似体を使用してもよい。さらに、本発明において、前記二本鎖ｓｉＲＮＡは、必要に応じて、前記３’末端オーバーハングに代えて、５’末端オーバーハングとしてもよい。

ｓｉＲＮＡは、例えば、インビトロで化学的又は酵素的に合成してもよく、また、インビボで合成してもよく、特に制限されないが、従来公知の方法により化学合成して製造することが好ましい。合成ｓｉＲＮＡであれば、例えば、濃度調節が容易であり、また、コンタミネーションの防止が容易であるため、安全性においても利点がある。例えば、配列番号１に示す配列を含むオーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡを製造する場合、まず、配列番号１の配列の３’末端に２塩基のオーバーハングを加えたＲＮＡ鎖と、前記配列番号１の配列と相補的な配列の３’末端に２塩基のオーバーハングを加えたＲＮＡ鎖とをそれぞれ化学合成する。次に、前記２本のＲＮＡ鎖が対合する条件で対合させ、オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡを得る。使用に際しては、必要に応じて、従来公知の方法により適宜精製することが好ましい。

本発明において、ＧＲＫ４遺伝子を標的とするアンチセンスは、特に制限されず、ＧＲＫ４遺伝子の塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有し、かつ、ＧＲＫ４遺伝子発現を阻害するものであればよい。アンチセンスは、前述のように、例えば、ｍＲＮＡへのスプライシングを阻害してもよいし、ＧＲＫ４タンパク質への翻訳を阻害してもよい。このようなアンチセンスの長さは、特に制限されないが、例えば、１０〜４０塩基が好ましく、より好ましくは１７〜３０塩基、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。

また、本発明のＧＲＫ４遺伝子特異的ｓｉＲＮＡは、単独で使用してもよいし、２種以上組み合わせて使用してもよい。単独で使用するときよりも２種以上組み合わせて使用する方が、ＲＮＡ干渉効果が高いことがある。

本発明に係るＧＲＫ４遺伝子特異的ｓｉＲＮＡの検索の方法は、特に限定されない。好ましい検索方法として、具体的には次のようにして行われる。ＭＣＦ−７およびＨＭＣ１−８を、６０ｍｍ培養ディッシュにおいてメーカーの推奨方法にしたがいＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）試薬１２μｌとともにヒトＧＲＫ４（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）と特異的なｓｉＴｒｉｏ Ｆｕｌｌ Ｓｅｔの５０ｎＭをトランスフェクトする。トランスフェクション後、この細胞を培養し、トリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ）により処理し、２４時間毎にエリスロメーター（ｅｒｙｔｈｒｏｍｅｔｅｒ）により数える。この細胞から調製した全ＲＮＡを、ウェスタンブロット法に供する。ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ（ＡＵＣＣＧＣＧＣＧＡＵＡＧＵＡＣＧＵＡｄＴｄＴ）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社が合成した）もまた、ネガティブコントロール用の細胞にトランスフェクトする。

また本発明として、上記ＧＲＫ４遺伝子特異的ｓｉＲＮＡが、少なくともＧＲＫ４遺伝子、ＧＰＫ４ ｍＲＮＡ、またはＧＰＫ４を作用標的とする物質を含む乳癌治療用薬剤を製造するために使用される方法も含まれる。

さらに、本発明はＧＲＫ４タンパク質および／またはＧＲＫ４遺伝子を標的分子とする乳癌の分子標的治療方法であることを特徴とする。

産業上の利用可能性
ＧＲＫに特異的な抗体を用いる免疫分析により、乳癌検出、乳癌の病態判別、増殖のステータスもしくは亢進の可能性、または再発可能性を診断、評価または予見するためのデータを提供する乳癌検査方法、およびＧＲＫ４遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを使用した、少なくともＧＲＫ４遺伝子、ＧＰＫ４ ｍＲＮＡ、またはＧＰＫ４を作用標的とする物質を含む乳癌治療用薬剤に利用可能である。

以下に、本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定する意図で掲げるものではない。以下の実施例において、使用材料はこの発明の範囲内の好適例にすぎない。また、以下の実施例中で用いる装置名および、使用材料の濃度、使用量、処理時間、処理温度等の数値的条件、処理方法等はこの発明の範囲内の好適例にすぎない。なお、以下の説明をいくつかの図を参照して行うがこれら図はこの発明を理解できる程度に概略的に示してあるにすぎない。

〔免疫組織化学〕
免疫組織化学的アッセイを、Ｖｅｎｔａｎａ ＨＸ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）によりホルマリン固定してパラフィン包埋した切片に行なった。抗ヒトＧＲＫ４αおよびβに特異的な単クローン抗体（Ｖｅｎｔａｎａ、ツーソン、アリゾナ州）および抗小胞体（ＥＲ）抗体（Ｖｅｎｔａｎａ、ツーソン、アリゾナ州）をそれぞれ使用した。ＨＥＲ−２／ｎｅｕステータスを、Ｄａｋｏ ＨｅｒｃｅｐｔＴｅｓｔ（Ｄａｋｏ Ｊａｐａｎ、京都、日本）を使用し免疫組織化学的アッセイにより決定し、Ｄａｋｏ採点システムにより採点した。２＋または３＋のスコアを有する試料を、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ陽性と見なした。細胞の１％が核染色を示した場合、本発明者らはＥＲ陽性と見なした。ＧＲＫ４染色の強度を、以下の基準を使用し評価した：強陽性（２＋）、５０％以上の腫瘍細胞における暗褐色染色が、膜と細胞質とを完全に覆い隠す；弱陽性（１＋）、よりいくらか低い度合いの茶色の染色が、腫瘍細胞の膜および細胞質において感知できる；陰性（０として採点した）、腫瘍細胞において感知できる染色がない。

〔細胞培養〕
ＮＩＨ３Ｔ３を仔牛血清（ＢＳ）を１０％補完したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）中において培養し、ＭＣＦ−７、ＨＭＣ１−８およびＭＲＫｎｕ−１を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％補完したＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）中において培養し、ＧＲＫ４発現ベクターによるトランスフェクションのためのＭＣＦ−７細胞を、木炭／デキストラン処理したウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州）を５％含有するＲＰＭＩ１６４０培地中において維持した。細胞を５％の二酸化炭素雰囲気下において３７℃にて維持した。

〔ＧＲＫ４の一過性的発現〕
完全長のＧＲＫ４α、β、γおよびδの発現ベクターは、既に記載されている（引用文献２０）。一過性的なトランスフェクション実験用に、このプラスミド２μｇを、ＤｏＦｅｃｔ ＧＴ１トランスフェクション試薬（同仁化学研究所）を使用しメーカーの推奨方法にしたがい、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。

〔形質転換のインビトロ法〕
足場依存的増殖を研究するために、ＧＲＫ４を一過性的に発現させた１．５×１０^４細胞を、仔牛血清を２０％含有するＤＭＥＭとバクトアガー（ｂａｃｔｏａｇａｒ）０．３６（ｗ／ｖ）％との１：１混合物中に懸濁し、バクトアガー０．７２（ｗ／ｖ）％を含む同じ培地のクッションの上にプレートした。コロニーを、プレートして２週間後に倒立顕微鏡の下で数えた。

〔免疫ブロット法および免疫沈降法〕
細胞を、ＩＰ緩衝液（プロテアーゼ阻害剤の混合物とともに、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ−４０、１０％ グリセロール）中において溶解し、その後その溶解物を、特異的な抗β−アレスチン単クローン抗体（Ｓｉｇｍａ）またはマウスＩｇＧとともにインキュベートした。この免疫複合体を５０％のタンパク質セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により反応した。タンパク質抽出物および免疫沈降物を、ＳＤＳ添加緩衝液中に懸濁した。沸騰後、タンパク質または免疫沈澱物の等量（１０μｇ）を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに泳動し、次に半乾性ブロット法によりＩｍｍｏｂｉｌｏｎ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。この膜を、標準技術を用いて抗体とともにインキュベートした。シグナルをＥＣＬプラス（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ）により可視化し、ＬＡＳ−３０００ミニ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）により検出した。抗ヒトＧＲＫ４（Ｈ−７０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタクルーズ、カリフォルニア州）、抗ＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｓｃ３２２３３）および抗β−アレスチン（Ｓｉｇｍａ）単クローン抗体をそれぞれ、１：５００、１：１０００および１：５００に希釈した。ＧＡＰＤＨを添加対照として使用した。

〔統計分析〕
データを、平均±標準偏差として示した。スチューデントｔ−検定を、ＧＲＫ４陽性腫瘍とＧＲＫ４陰性腫瘍との間の臨床学的因子を比較するために使用し、有意性をＰ＜０．０５に設定した。

〔実施例１：乳癌に発現するＧＲＫ４〕
本発明者らは、定量リアルタイムＰＣＲ法により乳癌試料中のＧＲＫ４ ｍＲＮＡの発現を分析した。具体的な実施法を以下に詳述する。

最初の鎖であるｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）１７プライマーとＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）により全ＲＮＡ１μｇから合成した。リアルタイムＰＣＲ法を、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲバージョン２．１（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社、滋賀、日本）、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｃａｍｂｒｅｘ、ワシントンＤＣ）とともにＭｘ３００５Ｐ ＱＰＣＲ系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ・ホヤ、カリフォルニア州）を使用し実行した。本発明者らは、ＧＲＫ４特異的プライマーとして
５’−ＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣ−３’および
５’−ＴＴＴＧＴＴＡＣＧＧＧＴＴＧＣＣＴＴＴＣ−３’を、
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ特異的プライマーとして
５’−ＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧＴＡＣＴＴＧ−３’および
５’−ＴＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧ−３’を、
およびＥＧＦＲ特異的プライマーとして
５’−ＣＣＡＡＧＣＣＡＴＡＴＧＡＣＧＧＡＡＴＣ−３’および
５’−ＡＣＴＡＴＣＴＧＣＧＴＣＴＡＴＣＡＴＣＣ−３’を使用した。β−アクチン特異的プライマーは、既に記載されている（Ｏｉｋａｗａら ２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）。反応混合物を、９５℃で３０秒間変性させた後に、５０サイクル（９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間）のＰＣＲに供した。ＧＲＫ４、ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＥＧＦＲのｍＲＮＡレベルをβ−アクチンのシグナルに対して標準化した。本発明者らは、ｍＲＮＡレベルを決定するためにこれらの実験を二重に行った。

本発明者らは、正常な乳房組織と比較し浸潤性小葉癌および浸潤性乳管癌においてＧＲＫ４ ｍＲＮＡの発現が高いレベルであることを発見した（図１）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよび上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、遺伝子操作的に増幅され、侵襲性の強い乳癌において過剰発現されている。しかし、ＧＲＫ４の発現パターンは、図１に示すようにＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＥＧＦＲの発現パターンと異なっていた。

〔実施例２：ＧＲＫ４イソ型の発現〕
ＧＲＫ４のサブファミリーは、ＧＲＫ４α、β、γおよびδと名づけられた４つの選択的スプライシングバリアント（引用文献１７、２０および３６）を有する（図２のＡ）。ＧＲＫ４のサブファミリーの発現パターンを評価するために、本発明者らは、ＧＲＫ４全イソ型に反応する抗ＧＲＫ４抗体を使用し、代表的に乳癌、線維腺腫および正常組織の試料のウェスタンブロット法を実行した。本発明者らは、５つの浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）ケースのうち３つにおいてＧＲＫ４サブファミリーの発現を確認したが、線維腺腫および正常組織においてＧＲＫ４はほとんど検出不可能であることが分かった（図２のＢ）。興味深いことに、ケース６（ＩＤＣ）は、ＧＲＫ４γおよびδの弱い発現と比較しＧＲＫ４βがおもに発現し、ケース７（ＩＤＣ）は、ＧＲＫ４βの弱い発現と比較して主にＧＲＫ４αが発現したことから（図２のＢ）、乳房腫瘍は、ＧＲＫ４サブファミリーの特異的な発現パターンを示さないことが示唆される。

次に、本発明者らは免疫組織化学的アッセイを行った。あいにく、ウェスタンブロット法に使用する抗体は、免疫組織化学には適用できない。したがって、本発明者らは、ＧＲＫ４αおよびβのみに特異的なもう一つの抗体を使用した。言い訳が立つことに、ＧＲＫ４αは完全長バージョンであり、ＧＲＫ４の４つのイソ型より他のＧＲＫにより高い相同性を有する。ＧＲＫ４αは、他のイソ型ではないが、ドーパミン受容体（引用文献３２）およびロドプシン（引用文献２０）をリン酸化する。

本発明者らは、「陰性」から「強陽性」までに及ぶ組織の試料においてＧＲＫ４αおよび／またはＧＲＫ４βの発現パターンを分類した（図１）。調べた７８ケースのうち、ＧＲＫ４αおよび／またはＧＲＫ４βは、３０ケース（３８．５％；点数２＋）において強く染色され、２６ケース（３３．３％；点数１＋）において弱く染色され、そして２２ケース（２８．２％；点数０）において染色されなかった（詳細は表１に示す）。乳房腫瘍組織の免疫組織化学的アッセイによって、ＧＲＫ４αおよびβに対する陽性染色が癌細胞に特異的であるように見え、正常な乳管上皮細胞においてほとんど検出されなかった（図３）。ほとんどのケースにおいて、ＧＲＫ４αおよびβは、腫瘍細胞の細胞質に局在し、原形質膜に局在するケースはほとんどなかった（図３）。さらに、本発明者らは、ＧＲＫ４発現の生物学的、臨床病理学的意義を評価した。表１に示したように、本発明者らはリンパ節転移（陽性においてより高い；スチューデントｔ−検定によりＰ＜０．０５）がＧＲＫ４発現（点数１＋〜２＋）に有意に関与することを発見した。本発明者らはまたヒトの正常な全組織を含む組織マイクロアレイを用いて、ヒトの正常な組織におけるＧＲＫ４αおよび／またはβタンパク質の発現を調べ、ＧＲＫ４αおよびβタンパク質が、小脳プルキニエ細胞、精巣の精上皮細胞および腎臓の尿細管において発現していたことを発見した（データ示さず）。これらの結果は、既出の知見と一致する（引用文献２０，２１および２２）。

〔実施例３：ＧＲＫ４の形質転換活性〕
本発明者らは、乳癌におけるＧＲＫ４の高いレベルの発現を観察したので、本発明者らは、ＧＲＫ４の過剰発現が腫瘍成長を促すかどうかを決定するために模索した。本発明者らは、ＧＲＫ４α、β、γまたはδの発現ベクターをそれぞれＮＩＨ３Ｔ３細胞に一過的にトランスフェクトした（図４のＡ）。次に、本発明者らは、軟寒天コロニー形成法を実行した。本発明者らは、ＧＲＫ４α、β、γまたはδを過剰発現している細胞が、対照ベクターをトランスフェクトした細胞と比較してコロニーの数が増加したことを発見した（図４のＢ）。これらの結果から、形質転換活性が強くないにも関わらず、ＧＲＫ４の過剰発現が、腫瘍形成に関与することを示唆する。

〔実施例４：乳癌細胞の増殖を抑制するＧＲＫ４ ｓｉＲＮＡ〕
ＧＲＫ４の高いレベルでの発現が、乳癌細胞の増殖または生存において役割を果たすかどうか評価するために、本発明者らは、ＧＲＫ４に特異的な２１ヌクレオチドの二本鎖ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）の３つの混合物（ｓｉＴｒｉｏ Ｆｕｌｌ Ｓｅｔ）により２つの乳癌細胞ＭＣＦ−７およびＨＭＣ１−８を処理した。使用したｓｉＴｒｉｏ Ｆｕｌｌ Ｓｅｔは、表２に示されるＣａｎｄ＃２８、７０および７８の配列を有する。以下、それらの配列に３’末端のオーバーハングを付加した配列を列挙する。

（センス鎖０２８＋ＴＴ）ＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＵＵＵＧＡＧＧＡＡＴＴ
（アンチセンス鎖０２８＋ＴＴ）ＵＵＣＣＵＣＡＡＡＧＧＣＵＵＵＵＵＵＧＴＴ
（センス鎖０７０＋ＴＴ）ＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＵＵＣＧＡＧＧＡＡＴＴ
（アンチセンス鎖０７０＋ＴＴ）ＵＵＣＣＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＵＧＵＣＣＴＴ
（センス鎖０７８＋ＴＴ）ＧＧＡＣＡＵＵＣＵＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＴＴ
（アンチセンス鎖０７８＋ＴＴ）ＵＵＵＵＧＡＡＵＧＧＡＧＡＡＵＧＵＣＣＴＴ
その結果、ｓｉＲＮＡは、細胞のＧＲＫ４発現を減少させ、細胞の増殖を有意に抑制した（図５）。これらのデータから、ＧＲＫ４発現の正の調節が乳房癌細胞の増殖または生存に関与し、ＧＲＫ４が、新規の癌治療の標的分子になる可能性があることを示唆した。

〔実施例５：乳癌においてβ−アレスチンを経由してＭＡＰキナーゼカスケードを調節するＧＲＫ４〕
ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２およびＥＲＢＢ３またはＥＲを含む、ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路が、乳癌における癌の発生および進行に重要であると報告されている。本発明者らは、ＧＲＫ４発現が、乳癌細胞においてＭＡＰキナーゼのシグナル伝達を活性化するかどうかを調べた。乳癌細胞株におけるＭＡＰキナーゼが、培地中においてＥＧＦまたはＥＲ等の因子によって通常活性化されるので、本発明者らは、ＭＣＦ−７細胞のプロセシングが、６ヶ月間その因子が不在のまま増殖することによってＭＡＰキナーゼを不活性化したことを立証した。次に、本発明者らはＧＲＫ４またはＧＲＫ４の欠損変異体の発現ベクターをＭＣＦ−７細胞にトランスフェクションによって導入した。その後、本発明者らは、トランスフェクションから２４時間後にＥＲＫ１／２、ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｊｕｎ アミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の発現およびリン酸化を調べた。本発明者らは、ＥＲＫ１／２およびｃ−Ｊｕｎが、対照ベクター、欠損変異体またはＧＲＫ４δの発現ベクターをトランスフェクトした細胞と比較してＧＲＫ４α、βまたはγを過剰発現している細胞においてリン酸化されたことを発見した。ＪＮＫのリン酸化はＧＲＫ４イソ型の一つまたは変異したＧＲＫ４を発現している全細胞において検出された（図６のＡ）。これらの結果は、ＧＲＫ４が、乳癌細胞においてＥＲＫおよびＪＮＫシグナル伝達経路を通してＭＡＰキナーゼを誘導することを示す。ＧＰＣＲのＧＲＫ４によるリン酸化は、ＧＰＣＲに結合しその内在化を始めるβ−アレスチンをリクルートする。

β−アレスチンは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）脱感作を仲介し、アゴニストが占有した受容体との複合体にシグナル伝達分子をリクルートするためのアダプターまたは足場として機能することによりＧＰＣＲシグナル伝達に寄与する細胞質タンパク質である（引用文献４０、２１）。マイトジェン活性化タンパク質および細胞外シグナル伝達調節キナーゼ（ＭＥＫ）−細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）１／２カスケードは、一般的に乳癌において活性化され、ＥＧＦ−ＥＧＦＲシグナル伝達経路の重要な成分である。最近の研究から、β−アレスチンがＳｒｃ、Ｒａｆ、Ｅｒｋ、ＡＳＫ１およびＪＮＫ３などの分子と相互作用し、いくつかの経路を調節し、ＭＡＰキナーゼを活性化することが示された（引用文献２４、２５および２７）。したがって、ＧＲＫ４がβ−アレスチンのシグナル伝達経路に関わるかどうかを調べるために、本発明者らは、ヒトの乳癌細胞株ＨＭＣ１−８およびＭＲＫｎｕ−１を使用し免疫沈降法を実施した。その結果は、β−アレスチンがＧＲＫ４αおよびβと複合体を形成することを示す。したがって、ＧＲＫ４は、ヒト乳癌細胞株においてβ−アレスチンに関与する可能性がある。

〔考察〕
ＧＲＫ類は、光とにおい物質のシグナルを媒介者へ伝達し、ホルモン的作用に関わるだけと考えられてきた。しかしながら本発明者は、ＧＲＫ４が乳癌の増殖に関わっていることを初めて明らかにし、ＧＲＫ４機能の知られていなかった局面に光を当てたのである。ＧＲＫ４は、アゴニストで活性化されたＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）類のシグナル伝達に重要な役割を演じていることから、乳癌においてＧＲＫ４の発現が高いのでＧＰＣＲが何らかの形で乳癌の進展に関わっていると考えるのが自然である。

ＧＲＫ４バリアント遺伝子は、それぞれ２つのカセットエクソンとカルボキシル末端を含むため、選択的ＲＮＡスプライシングを受ける（図２のＡ）。ＧＲＫ４δが、他のＧＲＫ４イソ型と比較して最強の悪性転換活性を示したことは興味深い（図４）。他方、ＧＲＫ４αは、ほとんどＥＲＫ１／２経路のリン酸化活性を有している（図６のＡ）。腫瘍試料のウェスタンブロットから、ＧＲＫ４イソ型の一様でない発現が示された（図２のＢ）。これらの結果から、ＧＲＫ４イソ型のコンビネーション発現は、インビボでＧＲＫ４が誘導する腫瘍発生に重要であることがわかった。

乳癌におけるＧＲＫ４の分子的機作およびシグナル伝達の実体は、依然として捉えどころがない。多くのＧＰＣＲについては、アゴニストへの暴露により、応答性の急速かつ劇的な可逆的喪失が起きることが示されてきた（相同的な脱感作）。典型的には、ＧＲＫ４はアゴニストにより活性化されたＧＰＣＲをリン酸化し、その機能的共同因子であるβアレスチンとともにＧＰＣＲの相同的な脱感作の端緒とする（引用文献２４〜２６、３１）。アンジオテンシンＩＩタイプ１Ａ（引用文献２８）、ニューロキニン１（引用文献２９）およびプロテアーゼ活性化受容体（引用文献３０）が活性化されると、β−アレスチンは、細胞外シグナルで調節されるキナーゼ（ＥＲＫ）カスケードの成分、Ｒａｆ−１、ＭＥＫ１およびＥＲＫ１／２が該受容体との複合体を形成するための足場を提供し、これがＥＲＫ１／２活性化につながる（引用文献２７）。さらに、ＧＲＫ５または６の過剰発現はβ−アレスチンが仲介するＥＲＫ活性化を増強することが報告された（引用文献２７）。本発明者らの研究で、ＧＲＫ４がこのβ−アレスチンと協同し、ＥＲＫシグナル伝達の活性化を誘導することを見出された（図６）。よってＧＲＫ４の異所性発現は、β−アレスチンが仲介するＥＲＫ活性化を助長させ、細胞増殖を亢進させることが想定される。

ＧＲＫ４発現レベルは、リンパ節転移と関係していた（表１）。このことはヒトの癌におけるＧＲＫ４発現の予後的な意義を示す最初の成果である。癌転移に関してＧＲＫ４の分子的機作の詳細は不明である。最近、β−アレスチンが腫瘍タンパク質のＭｄｍ２を調節することが報告された（引用文献３３）。さらにＭｄｍ２は、Ｅ−カドヘリン分解を調節する（引用文献３４）。これらのことからＧＲＫ４の異所性発現は、β−アレスチン・シグナル伝達経路を介してＥ−カドヘリン分解を調節すると本発明者らは仮説を立てている。この仮説の実証にはさらに研究を進める必要がある。

ＧＰＣＲ系は、治療薬剤の開発の主要ターゲットであったし、いわゆるオーファンＧＰＣＲのさらなる同定は、将来の薬学研究と治療の発展の機会を提供する（引用文献３３）。最近の分子レベルの技術進歩は、乳癌治療を支える仕組みの理解を向上させている。これらの患者の生存に、分子を標的とする化合物とホルモンを用いる治療は、著しい効果を及ぼした。しかしながら、転移性疾患の治療は依然として対症的のままであり、またアジュバント療法は、最適の結果を保証するものではない。

ＧＲＫ４ ｓｉＲＮＡがヒト乳癌細胞の増殖を抑制することが見出された（図５）。ＧＲＫ４は、ＧＰＣＲ系のシグナル伝達に参加していると考えられているので、ＧＲＫ４により調節されているオーファンＧＰＣＲは、乳癌治療の優れたターゲットになるであろう。ＧＲＫ４は、実質的に精巣、プルキニエ細胞および腎臓だけで発現しており、これに対してＧＲＫ２、３、５および６は、ヒトの正常組織で広範に発現されている。分子標的治療の目標は、正常細胞に対して最少の影響にとどめながら、悪性転換する形質の抑制である。さらにＧＲＫ４シグナル伝達の上流部は、既知のＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＥＧＦＲのシグナル伝達とは異なっているかも知れない（図７）。それゆえ、ＧＲＫ４は乳癌治療において標的とすべき強力な候補の一つであると期待される。

〔引用文献リスト〕
［引用文献１７］
Premont RT, Macrae AD, Stoffel RH, Chung N, Pitcher JA, Ambrose C, Inglese J, MacDonald ME, Lefkowitz RJ: Characterization of the G protein-coupled receptor kinase GRK4. Identification of four splice variants, J Biol Chem 1996, 271:6403-6410
［引用文献２０］
Miller WE, Lefkowitz RJ: Expanding roles for beta-arrestins as scaffolds and adapters in GPCR signaling and trafficking, Curr Opin Cell Biol 2001, 13:139-145
［引用文献２１］
Lefkowitz RJ, Shenoy SK: Transduction of receptor signals by beta-arrestins, Science 2005, 308:512-517
［引用文献２２］
Luttrell LM, Ferguson SS, Daaka Y, Miller WE, Maudsley S, Della Rocca GJ, Lin F, Kawakatsu H, Owada K, Luttrell DK, Caron MG, Lefkowitz RJ: Beta-arrestin-dependent formation of beta2 adrenergic receptor-Src protein kinase complexes, Science 1999, 283:655-661
［引用文献２４］
DeFea KA, Zalevsky J, Thoma MS, Dery O, Mullins RD, Bunnett NW: beta-arrestin-dependent endocytosis of proteinase-activated receptor 2 is required for intracellular targeting of activated ERK1／2, J Cell Biol 2000, 148:1267-1281
［引用文献２５］
Kim J, Ahn S, Ren XR, Whalen EJ, Reiter E, Wei H, Lefkowitz RJ: Functional antagonism of different G protein-coupled receptor kinases for beta-arrestin-mediated angiotensin II receptor signaling, Proc Natl Acad Sci U S A 2005, 102:1442-1447
［引用文献２６］
Willets JM, Challiss RA, Nahorski SR: Non-visual GRKs: are we seeing the whole picture?, Trends Pharmacol Sci 2003, 24:626-633
［引用文献２７］
Zeng C, Sanada H, Watanabe H, Eisner GM, Felder RA, Jose PA: Functional genomics of the dopaminergic system in hypertension, Physiol Genomics 2004, 19:233-246
［引用文献２８］
Premont RT, Inglese J, Lefkowitz RJ: Protein kinases that phosphorylate activated G protein-coupled receptors, Faseb J 1995, 9:175-182
［引用文献２９］
Chuang TT, Paolucci L, De Blasi A: Inhibition of G protein-coupled receptor kinase subtypes by Ca2+／calmodulin, J Biol Chem 1996, 271:28691-28696
［引用文献３０］
Wilson CJ, Applebury ML: Arresting G-protein coupled receptor activity, Curr Biol 1993, 3:683-686
［引用文献３１］
Luttrell LM, Roudabush FL, Choy EW, Miller WE, Field ME, Pierce KL, Lefkowitz RJ: Activation and targeting of extracellular signal-regulated kinases by beta-arrestin scaffolds, Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 98:2449-2454
［引用文献３２］
DeFea KA, Vaughn ZD, O'Bryan EM, Nishijima D, Dery O, Bunnett NW: The proliferative and antiapoptotic effects of substance P are facilitated by formation of a beta -arrestin-dependent scaffolding complex, Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97:1
1086-11091
［引用文献３３］
Wang P, Gao H, Ni Y, Wang B, Wu Y, Ji L, Qin L, Ma L, Pei G: Beta-arrestin 2 functions as a G-protein-coupled receptor-activated regulator of oncoprotein Mdm2, J Biol Chem 2003, 278:6363-6370
［引用文献３４］
Yang JY, Zong CS, Xia W, Wei Y, Ali-Seyed M, Li Z, Broglio K, Berry DA, Hung MC: MDM2 promotes cell motility and invasiveness by regulating E-cadherin degradation, Mol Cell Biol 2006, 26:7269-7282
［引用文献３６］
Chuang TT, Paolucci L, De Blasi A. Inhibition of G protein-coupled receptor kinase subtypes by Ca2+／calmodulin. J Biol Chem 1996, 271:28691-28696
［引用文献４０］
Attramadal H, Arriza JL, Aoki C, Dawson TM, Codina J, Kwatra MM, et al. Beta-arrestin2, a novel member of the arrestin／beta-arrestin gene family. J Biol Chem 1992, 267:17882-17890
なお、本出願は、２００７年８月３日に出願された日本国特許出願第２００７−２０３１８９号に基づいており、その開示内容は、参照により全体として引用されている。

乳癌および正常な乳房組織におけるＧＲＫ４、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＥＧＦＲのｍＲＮＡレベルを明示する定量リアルタイムＰＣＲ法。カラムは調べた試料の平均を示す図である。最小のｍＲＮＡ発現レベルは図中において適宜０．１に設定した；他のｍＲＮＡシグナルをこの値に標準化した。バーは標準偏差を示す。 乳癌組織におけるＧＲＫ４タンパク質の構造およびＧＲＫ４発現。（Ａ）ヒトＧＲＫ４スプライスバリアントの図。この図は、ＧＲＫ４ ｍＲＮＡの選択的スプライシングの結果、４つのＧＲＫ４イソ型のアミノ酸配列を示す図である。ＧＲＫ４のｄｅｌＤは、ＧＲＫ４の欠損変異体である。（Ｂ）浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）、線維腺腫（ＦＡ）、および正常な乳房（Ｎ）からのＧＲＫ４タンパク質のウェスタンブロット法。ＧＲＫ４α、β、γまたはδを過剰発現している細胞もまた対照として示す。 乳癌組織におけるＧＲＫ４発現の免疫組織化学的アッセイを示す図である。 ＧＲＫ４の形質転換活性を示す図である。（Ａ）ＧＲＫ４を過剰発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞からのＧＲＫ４タンパク質のウェスタンブロット法。（Ｂ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用したコロニー形成法。カラムは軟寒天中のコロニー数を表す。バーは、標準偏差を示す。 ＧＲＫ４のノックダウンにより乳癌細胞株の増殖が阻害されることを示す図である。（Ａ）ＭＣＦ−７およびＨＭＣ１−８細胞における活性化ｓｉＲＮＡによるＧＲＫ４転写産物の減少。ｓｉＲＮＡをトランスフェクションして４８時間後、ＭＣＦ−７およびＨＭＣ１−８細胞を回収した。全ＲＮＡを細胞から抽出し、リアルタイムＰＣＲ法に供した。ＧＲＫ４：ＧＲＫ４特異的活性化ｓｉＲＮＡ、Ｃｏｎｔ：ｓｉＲＮＡのネガティブコントロール、およびＵＴ：トランスフェクトしない野生型である。データは、図中に適宜１に設定されたＭＣＦ−７においてＵＴのｍＲＮＡレベルに標準化した。バーは標準偏差を示す。（Ｂ）ＧＲＫ４特異的活性化ｓｉＲＮＡは細胞増殖を阻害する。ｓｉＲＮＡまたは負の対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＭＣＦ−７およびＨＭＣ１−８細胞は、トランスフェクションして２４時間後、４８時間後および７２時間後に回収された。細胞数は、エリスロメーターを使用して数えた。バーは標準偏差を示す。 ＧＲＫ４はβ−アレスチンと相互作用し、ＧＲＫ４はＥＲＫ１／２シグナル伝達経路を活性化したことを示す図である。（Ａ）ＥＲＫ１／２シグナル伝達経路におけるＧＲＫ４の過剰発現の効果。ＭＣＦ−７細胞は、示したようなＧＲＫ４α、β、γまたはδをトランスフェクトした。その後細胞を、リン酸化ＥＲＫ１／２、全ＥＲＫ１／２、リン酸化ＪＮＫ、全ＪＮＫ、リン酸化ｃ−Ｊｕｎまたは全ｃ−Ｊｕｎ抗体により分析した。カラムは、リン酸化ＥＲＫ１／２および全ＥＲＫ１／２およびリン酸化ＪＮＫおよび全ＪＮＫおよびリン酸化ｃ−Ｊｕｎおよび全Ｊｕｎの比を表す。データを、図中適宜１に設定した対照のベクターの比に対して標準化した。（Ｂ）ＨＭＣ１−８およびＭＲＫｎｕ−１細胞を、ＧＲＫ４またはβ−アレスチン抗体により免疫沈降に供した。ＩＰ、免疫沈降；ＷＢ、ウェスタンブロット。 乳癌の発症に関連したＧＲＫ４のモデルを示す図である。 ヒトＧＲＫ４遺伝子の塩基配列の一例を示す図である。

Claims (3)

1. 乳癌細胞において、細胞増殖を阻害または細胞死を誘導し、以下の同じ番号を有するセンス鎖およびアンチセンス鎖に３’末端のオーバーハングを付加した二本鎖ＲＮＡからなることを特徴とするＧＲＫ４遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）。
   （センス鎖０２８）ＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＵＵＵＧＡＧＧＡＡ
   （アンチセンス鎖０２８）ＵＵＣＣＵＣＡＡＡＧＧＣＵＵＵＵＵＵＧ
   （センス鎖０２９）ＡＡＡＡＡＡＧＣＣＵＵＵＧＡＧＧＡＡＵ
   （アンチセンス鎖０２９）ＡＵＵＣＣＵＣＡＡＡＧＧＣＵＵＵＵＵＵ
   （センス鎖０７０）ＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＵＵＣＧＡＧＧＡＡ
   （アンチセンス鎖０７０）ＵＵＣＣＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＵＧＵＣＣ
   （センス鎖０７１）ＡＣＡＧＡＧＧＧＵＵＣＧＡＧＧＡＡＧＡ
   （アンチセンス鎖０７１）ＵＣＵＵＣＣＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＵＧＵ
   （センス鎖０７７）ＧＧＧＡＣＡＵＵＣＵＣＣＡＵＵＣＡＡＡ
   （アンチセンス鎖０７７）ＵＵＵＧＡＡＵＧＧＡＧＡＡＵＧＵＣＣＣ
   （センス鎖０７８）ＧＧＡＣＡＵＵＣＵＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡ
   （アンチセンス鎖０７８）ＵＵＵＵＧＡＡＵＧＧＡＧＡＡＵＧＵＣＣ
2. 前記ｓｉＲＮＡが、以下の同じ番号を有するセンス鎖およびアンチセンス鎖に３’末端のオーバーハングを付加した二本鎖ＲＮＡからなることを特徴とする、請求項１に記載のＧＲＫ４遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）。
   （センス鎖０２８）ＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＵＵＵＧＡＧＧＡＡ
   （アンチセンス鎖０２８）ＵＵＣＣＵＣＡＡＡＧＧＣＵＵＵＵＵＵＧ
   （センス鎖０７０）ＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＵＵＣＧＡＧＧＡＡ
   （アンチセンス鎖０７０）ＵＵＣＣＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＵＧＵＣＣ
   （センス鎖０７８）ＧＧＡＣＡＵＵＣＵＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡ
   （アンチセンス鎖０７８）ＵＵＵＵＧＡＡＵＧＧＡＧＡＡＵＧＵＣＣ
3. 少なくともＧＲＫ４遺伝子、ＧＲＫ４ ｍＲＮＡ、またはＧＲＫ４を作用標的とする物質を含む乳癌治療用薬剤を製造するための請求項１または２に記載のＧＲＫ４遺伝子特異的ｓｉＲＮＡの使用。

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