JP4982636B2 - 虫歯予防用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｌａｃｔｉｓ）に属する新規乳酸菌とストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）の菌体表層タンパク質抗原に対する鶏卵抗体を含有する虫歯予防用組成物に関する。

口腔内の二大疾患として、虫歯（齲蝕）と歯周病がある。虫歯は、口腔内細菌が糖を分解して発生させた酸により、歯のエナメル質中の無機質が脱灰するために生じる。より詳細には、まず、主にストレプトコッカス・ミュータンスが、グルコシルトランスフェラーゼを用いて、口腔内の糖から粘着性の不溶性グルカンを生成して、菌体を歯面に付着させる。この付着したストレプトコッカス・ミュータンスを足場に、さらに多種多様な口腔細菌が凝集し、プラークを形成する。プラーク中では、口腔内細菌が発生した酸等の代謝物が非常に高濃度に存在するため、歯の脱灰が進行し、虫歯となる。したがって、虫歯の主な原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンスの、口腔内での増殖を抑制することや、グルコシルトランスフェラーゼ等の活性を抑制することが、虫歯の予防や治療に有効であることが期待できる。

実際に、虫歯の原因菌の増殖等を抑制し得る乳酸菌として、例えば、（１）ラクトバチルス属に属する、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）の増殖を抑制するための細菌、特にラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。

その他、歯周病の予防等に有効な食品として、例えば、（２）生きた乳酸菌、該乳酸菌含有物、該乳酸菌培養濾液、及びその処理物からなる群から選ばれた少なくとも１種と、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、トレハロース、マルチトール、マンニトール、パラチノース、還元乳糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、フラクトオリゴ糖、アスパルテーム、エゾウコギ抽出物、ドクダミ抽出物、紅麹、ウコン色素、カリン抽出物、霊芝抽出物、サンザシ抽出物、シイタケ抽出物、月桃抽出物、ステビア抽出物、ハス胚芽抽出物、ラカンカ抽出物、緑茶抽出物、マリアアザミ抽出物、紫玄米抽出物、酵素分解甘草、黄杞葉抽出物、イチョウ抽出物、ルイボス茶抽出物、ヨモギ抽出物、グリチルリチン、ギムネマ抽出物、及び刺梨抽出物からなる群から選ばれた少なくとも１種とを含有する口腔内疾患の予防及び／又は治療用組成物が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。該組成物は、キシリトール等の糖や糖アルコール類、各種植物抽出物等は、それぞれを単独で用いた場合には、口腔病原菌の増殖に対してほとんど影響を及ぼさないが、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）等のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌と同時に用いることにより、口腔病原菌の増殖を抑制できるという知見に基づくものである。

その他、例えば、（３）齲蝕誘発の病原菌としての血清型がｃ、ｅまたはｆであるストレプトコッカス・ミュータンスの下記理化学的特性、すなわち、作用及び基質特異性がスクロースに作用し、水に不溶性のグルカンを合成するものであり、 至適ｐＨが６．７〜７．０であり、作用適温の範囲が１５〜５０℃であり、失活の条件が８０℃、５分間の処理であり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した分子量が１５０〜１６５キロダルトンであり、動物において免疫原となり、該酵素に対する特異抗体を生成させ得る免疫原性を有するものであるという特性を有する菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼを免疫した鶏が産生する卵より調製された免疫グロブリンであって、前記ストレプトコッカス・ミュータンスに対して免疫活性を有する抗体が開示されている（例えば、特許文献３参照。）。また、例えば、（４）齲蝕誘発の病原菌としての血清型がｃ、ｅまたはｆであるストレプトコッカス・ミュータンスの菌体表層タンパクに対する抗体の製造方法において、ａ）前記菌体表層タンパク抗原を鶏に免疫する工程と、ｂ）該免疫された鶏が産生する卵から卵黄を分離する工程と、ｃ）該卵黄から、前記菌体表層タンパク抗原に対して誘導され、かつ前記ストレプトコッカス・ミュータンスに対する免疫活性を有する抗体を含む免疫グロブリンを抽出する工程とを有することを特徴とする抗体の製造方法が開示されている（例えば、特許文献４参照。）。これらの抗体により、ストレプトコッカス・ミュータンスの不溶性グルカンの生成等の活性を抑制し、口腔病原菌の歯面への付着を阻害することができる。

これらの乳酸菌や抗体等を用いた虫歯予防用組成物は、摂取した乳酸菌等が、口腔内において、虫歯の原因菌に作用することにより、虫歯を予防し、治療するものである。このため、該虫歯予防用組成物による虫歯等の予防効果を得るためには、該虫歯予防用組成物を継続的に経口摂取することが重要である。したがって、該虫歯予防用組成物が、風味が良好で嗜好性に優れていることや、工業上、製造することが容易であることが好ましい。
特開２００３−２９９４８０号公報 国際公開第２００２／０８０９４６号パンフレット 特許第２６４１２２８号公報 特許第２６６６２１２号公報

しかしながら、上記（１）の乳酸菌では、ラクトバチルス・ロイテリであっても、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制能が十分ではなく、虫歯の発症を抑制することは困難である。また、ラクトバチルス・ロイテリをスターターに用いたヨーグルトの製造方法も開示されているが、ラクトバチルス・ロイテリはヘテロ発酵をする乳酸菌であるため、乳中での発酵性が弱く、該製造方法により得られた発酵乳は、風味生成の点で不十分であるという問題もある。さらに、ラクトバチルス・ロイテリをスターターに用いた場合には、発酵時間が１２時間以上と極端に長くなるため、工業上の製造特性に劣るという問題もある。また、上記（２）の方法では、主に歯周病の原因菌に対する効果について触れられており、虫歯予防の観点からは代表例としてキシリトールが挙げられている。ラクトバチルス属菌のストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制能を、キシリトール等が増強することが記載されているが、該増強効果も十分とは言い難い。

一方、上記（３）及び（４）の抗体は、鶏卵由来であって、従来の抗体よりも工業上の製造特性が良好な抗体ではあるが、該抗体を単独で用いた場合には、ストレプトコッカス・ミュータンスの歯面への付着阻害効果は十分ではなく、該抗体を用いた虫歯予防剤は、未だに改善の余地がある。

本発明は、虫歯の予防及び治療に有効であり、かつ、工業上の製造特性や風味が良好な虫歯予防用組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性に優れた乳酸菌と、不溶性グルカンの生成抑制に優れたストレプトコッカス・ミュータンスに対して免疫活性を有する抗体を用いることにより、従来になくより一層効果的な虫歯予防用組成物を製造し得ることを見出した。さらに検討した結果、従来になくストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性に優れ、かつ、強い発酵性を有する乳酸菌であれば、発酵乳製造のためのスターターとして使用することが可能であり、特別な製造工程を必要とせず、虫歯予防用組成物となる発酵食品を工業上、容易に製造することができることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｌａｃｔｉｓ）ＴＬ６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７５８）の菌体及び／又は前記ＴＬ６株の培養物と、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）の菌体表層タンパク質抗原に対する鶏卵抗体を有効成分とする虫歯予防用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記菌体表層タンパク質抗原が、菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼである虫歯予防用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記虫歯予防用組成物が発酵食品である虫歯予防用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記虫歯予防用組成物が虫歯予防製剤である虫歯予防用組成物を提供するものである。

本発明の虫歯予防用組成物により、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖と歯面への付着の双方を顕著に抑制することができるため、従来になく効率的に虫歯を予防することができる。また、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株は、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性に優れているばかりではなく、発酵乳等の発酵食品の製造の際のスターターとして用いることができるという、優れた製造特性を有しているため、発酵食品である虫歯予防用組成物は、工業上、容易に製造することができる。

ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株は、ストレプトコッカス・サーモフィルスと併用した場合に培地が凝固する発酵性と、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有するものである。例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルスと併用した場合に１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地を凝固させることができるほど強い発酵性を有する乳酸菌であれば、発酵乳製造のためのスターターとして使用することが可能であり、特別な製造工程を必要とせず、発酵食品を工業上、容易に製造することができるためである。

従来より、ヨーグルト等の発酵食品の製造には、スターターとして、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・ヘルベティクス、ラクトバチルス・カゼイ等の乳酸菌が用いられている。スターターは、単一菌種であってもよく、二菌種以上であってもよいが、単一菌種では、酸生成、風味生成、組織形成で、不十分であるという問題が生ずる。ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルスと併用して培養すると、単に培地が凝固するだけではなく、風味生成及び組織形成が良好な発酵食品を製造することができる。

なお、該ストレプトコッカス・サーモフィルスは、通常、発酵乳等の発酵食品を製造するために用いられているストレプトコッカス・サーモフィルスであれば、特に限定されるものではない。該ストレプトコッカス・サーモフィルスとして、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ−１７２１６株やストレプトコッカス・サーモフィルスＡＴＣＣ１９２５８株等がある。

本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスは、例えば以下の方法により得ることができる。まず、各種の試料から菌株を分離し、この中から１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ストレプトコッカス・サーモフィルスと併用した場合の発酵性が優れたもの、すなわち、１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地で、３７℃でストレプトコッカス・サーモフィルスと併用して培養した時に、培地を凝固させることができる発酵性を有するものを選択する。次いで、選択された菌から、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有する菌株を選択することにより得ることができる。

以下、さらに詳細に説明する。
１．菌株の取得
本発明者らは、前記の性質を有する菌株を自然界から取得すべく、自然界から採集したサンプルを嫌気性希釈液（１９８０年叢文社発行、光岡知足著「腸内菌の世界」３２２ページ。以下、参考文献１と記載する。）で希釈し、Ｂｒｉｇｇｓ ｌｉｖｅｒ ｂｒｏｔｈ（前記参考文献１、３１９ページ）の平板に塗布し、３７℃で嫌気培養した。そして得られたコロニーの中でグラム陽性桿菌である菌を釣菌した。該釣菌した菌を、ＢＬ寒天培地平板に画線塗布し、前記と同様の方法で嫌気培養を反復し、純粋単離された菌株を得た。これらの菌株を、後記の試験例１に記載の方法を用いて、まず、１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地中で、ストレプトコッカス・サーモフィルスと併用した場合の発酵試験を行い、優れた発酵性を有する菌株を２０株得た。続いて、後記の試験例４に記載の方法を用いて、それぞれの菌株のストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を調べた結果、最も強い増殖抑制性を有していた菌株を１株取得した。該菌株は、ＴＬ６株と名付けられた。

２．ＴＬ６株の同定
ＴＬ６株の菌学的性質を、表１に示す。表１の結果から、明らかであるように、ＴＬ６株は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス菌種と共通の菌学的性質を有していた。なお、菌学的性質を測定するための試験は、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、Peter H. A. Sneath編、第２巻、Williams and Wilkins Company、１９８６年）にほぼ従って行った。

次に、ＴＬ６株の遺伝学的性質を調べるため、ＴＬ６株の１６Ｓ ｒＤＮＡの可変領域の塩基配列を常法により同定した。ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、国立バイオテクノロジー情報センター）の国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）上で、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）による該塩基配列についての相同性検索を行ったところ、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスの基準株であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＢＣＲＣ１１０５１株と、９８．５２％の相同性があった。

以上の菌学的性質及び遺伝学的性質の結果から、ＴＬ６株は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス菌種であることが確認された。

そこで、出願人は、ＴＬ６株を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに新規菌株として寄託した（寄託日：平成１９年１月１７日）。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７５８である。

ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株は、自然界から分離した乳酸菌の中から、発酵性、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有するものを選び出し得られたものである。したがって、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株は、口腔内に用いられる虫歯予防用組成物や食品として、安全に利用することが可能である。

本発明におけるストレプトコッカス・ミュータンスの菌体表層タンパク質抗原に対する抗体は、鶏卵抗体であることが好ましい。他の動物に免疫して得られる抗体に比べて、低コストで量産できるためである。該菌体表層タンパク質抗原は、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体表層に発現しているタンパク質性の物質であり、かつ、免疫原性を有する物質であれば、特に限定されるものではない。該鶏卵抗体が、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体表層にある抗原に結合することにより、ストレプトコッカス・ミュータンスの活性を低下させ、歯面におけるストレプトコッカス・ミュータンスによる酸発生を低減させることにより、虫歯の発生を抑制できることが期待できる。該菌体表層タンパク質抗原は、特に、菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼであることが好ましい。ストレプトコッカス・ミュータンスによる不溶性グルカンの産生を効果的に抑制し、ストレプトコッカス・ミュータンスの歯面への付着を阻害することができるためである。該鶏卵抗体は、例えば、「オーバルゲンＤＣ」（ゲン・コーポレーション社製）等の市販の抗体を用いることができる。その他、特許第２６４１２２８号や特許第２６６６２１２号に従って製造した鶏卵抗体を用いることも可能である。

本発明の虫歯予防用組成物は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株の菌体及び／又は前記ＴＬ６株の培養物と、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体表層タンパク質抗原に対する鶏卵抗体を有効成分とする虫歯予防用組成物であれば、特に限定されるものではない。ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株の生菌を有効成分とする虫歯予防用組成物であることが好ましい。該虫歯予防用組成物として、例えば、食品、虫歯予防製剤、及び飼料、並びにこれらに対する添加物等がある。摂取が簡便であること、及び、他の乳酸菌と同様に整腸作用等も期待できることから、食品や食品添加物の形態であることが好ましい。該食品は、通常乳酸菌を用いるものであれば、いずれの種類の食品であってもよい。該食品として、例えば、ヨーグルト等の発酵食品、チョコレートやキャンディー、チューインガム等の菓子類等がある。ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株の生菌を大量に摂取することができるため、発酵食品であることが特に好ましい。その他、該虫歯予防製剤として、例えば、トローチ錠や口腔洗浄剤等がある。

虫歯予防用組成物として用いる場合において、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株の、虫歯予防用組成物中の含有量や１日あたりの摂取量等は、虫歯予防効果が期待できる量であれば、特に限定されるものではない。例えば、１日あたり、１×１０^７〜１×１０^１１ＣＦＵ程度のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を摂取することが好ましい。

本発明の発酵食品、すなわち、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を含有する発酵食品は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を、単に発酵用ベースに添加して培養したものに、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体表層タンパク質抗原に対する鶏卵抗体を添加することにより、簡便かつ効率よく製造することができる。予め前培養した該乳酸菌を、スターターとして発酵用ベースに添加してもよい。また、該鶏卵抗体を予め添加した発酵用ベースに、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を添加して培養してもよい。

ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を含有する発酵食品の製造に用いられる発酵用ベースは、発酵食品の製造に通常用いられるベースであれば、特に限定されるものではないが、乳を主成分とする乳性発酵用ベースであることが好ましい。該乳を主成分とする乳性発酵用ベースとして、例えば、牛乳、脱脂乳、生クリーム、バター、全粉乳、脱脂粉乳等に、必要に応じて蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を配合し、常法に従って殺菌、均質化、冷却等することにより調製することができる。

本発明の発酵食品は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株のストレプトコッカス・ミュータンスに対する増殖抑制効果を阻害しない範囲において、他の乳酸菌を含有してもよい。該他の乳酸菌は、通常発酵乳等の発酵食品の製造に用いられるものであれば、特に限定されないが、ストレプトコッカス・サーモフィルスであることが好ましい。ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株とストレプトコッカス・サーモフィルスを、乳性発酵用ベース中で混合培養することにより、風味が良好で嗜好性に優れた発酵食品を製造することができるためである。その他、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）を含有した発酵食品であってもよい。

ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株の発酵用ベースへの接種比率は、特に限定されるものではないが、該発酵用ベースに対して０．０１〜１０（ｗ／ｗ）％が好ましく、０．１〜５（ｗ／ｗ）％が特に好ましい。また、ストレプトコッカス・サーモフィルス等の他の乳酸菌を同時に添加する場合には、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株と、ストレプトコッカス・サーモフィルス等の、スターターとしての発酵用ベースへの接種比率は、特に限定されるものではないが、１：１００〜１０：１が好ましく、１：１０〜１：１が特に好ましい。

本発明において、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株や、ストレプトコッカス・サーモフィルス等の前培養に用いられる培地は、通常乳酸菌の培養に用いられる培地であれば、特に限定されるものではないが、乳性培地であることが好ましい。取り扱いが簡便であるため、還元脱脂粉乳培地が特に好ましい。該還元脱脂粉乳培地の濃度は、３％（ｗ／ｗ）以上が好ましく、８％（ｗ／ｗ）以上が特に好ましい。さらに、酵母エキス等の生育促進物質を添加することが好ましい。例えば、０．１〜１％（ｗ／ｗ）の酵母エキスを含有した培地を用いることができる。また、前培養に用いられる培地は、殺菌処理をしたものを用いることが好ましい。該殺菌処理は、通常用いられる方法で行うことができ、例えば、８０〜１２２℃で５〜４０分間、好ましくは８５〜９５℃で５〜３５分間の加熱処理により行うことができる。

本発明の発酵食品を製造する場合の、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株の培養の温度は、３０℃〜４０℃が好ましく、３６℃〜３８℃が特に好ましい。該乳酸菌が充分に生育可能な温度範囲であるためである。また、培養時間は、製造する発酵食品の種類によって適宜決定されるが、４〜１８時間が好ましい。

培養後得られた発酵乳等の発酵食品は、そのまま食品としてもよく、例えば、均質化して液状に加工してもよい。その他、例えば、果汁、果実等を適宜添加してもよい。また、容器への充填等は、特に限定されるものではなく、通常用いられる方法で行うことができる。

本発明の虫歯予防製剤は、すなわち、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を含有する虫歯予防製剤は、例えば、該乳酸菌の生菌等の菌末に、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体表層タンパク質抗原に対する鶏卵抗体を添加したものを用いることにより、製造することができる。該菌末は、常法により調製することができる。例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を培養後、遠心分離することにより集菌した後、さらに凍結乾燥することにより、得ることができる。通常、医薬品の製造に用いられる安定剤、賦形剤、結合剤、コーティング剤、崩壊剤や、味や風味を調える甘味料や香料等を添加することができる。

次に試験例及び実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の試験例及び実施例に限定されるものではない。

（試験例１） 発酵乳の調整
発酵乳の製造に汎用されているストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ−１７２１６株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＪＣＭ１００２Ｔ株、特許文献１に記載のストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有するラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５３６０８株とラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２Ｔ株、並びに、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１０１０株、及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１２４８Ｔ株を用いて、発酵乳を製造した。酸生成、風味生成、及び組織形成が十分となるように、単一菌株ではなく、表２に記載の組合せの２菌株、すなわち、ストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ−１７２１６株と各ラクトバチルス属菌を、それぞれスターターとして、乳性発酵用ベースに添加して培養することにより、発酵乳を製造した。ここで、発酵乳１は、発酵乳の製造に汎用されている乳酸菌の組合せである。

まず、上述した乳酸菌をそれぞれ、０．５％（ｗ／ｗ）酵母エキス含有１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地に接種し、３７℃、１６時間培養したものをバルクスターターとした。また、１０％（ｗ／ｗ）脱脂粉乳からなる原料ミックスを、乳性発酵用ベースとして用いた。
該原料ミックスに、先に調製したバルクスターターをラクトバチルス属の各菌株については０．５％（ｗ／ｗ）ずつ、ストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ−１７２１６株については１．５％（ｗ／ｗ）ずつ接種し、３７℃でｐＨ４．８になるまで培養を行い、発酵乳を得た。得られた発酵乳は、１０℃で２４時間保管し、再度ｐＨを測定した。表２にｐＨ４．８に到達するまでに要した時間と、調整された発酵乳を１０℃で２４時間保存した後のｐＨをそれぞれ示した。ただし、ラクトバチルス・ロイテリを用いた発酵乳５と６は、１２時間培養した時点でｐＨ４．８に到達しなかったため、培養１２時間後のｐＨを示した。

ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを用いた発酵乳１〜４は、使用した菌株により若干発酵時間に差が認められたが、すべて発酵乳として良好な組織を得ることができた。特許文献１に記載のラクトバチルス・ロイテリの２菌株は、発酵性が弱く、発酵乳５と６は、発酵が不十分であり、１２時間経過後も充分なカードが得られなかった。すなわち、表２の結果から、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株は、乳性発酵用ベースに、ストレプトコッカス・サーモフィルスと同時に接種して、３７℃で培養した場合に、良好な発酵乳を得るために十分な発酵性を有していることが明らかである。

（試験例２） 発酵乳の風味評価
試験例１で作成した発酵乳を用いて官能検査による風味評価を行った。５名のパネリストにより、各発酵乳に関するおいしさを５段階で評価した。大きい値ほどおいしい発酵乳であることを示す。表３は評価結果を示したものである。発酵が不十分であった発酵乳５と６は、風味評価も低かったが、発酵乳１〜４は、良好な風味を有していた。特に、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１０１０株を用いて製造された発酵乳２と４は、汎用されている乳酸菌を用いて製造された発酵乳１よりも、風味が優れていることが明らかとなった。なお、ストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ-１７２１６株に代えて、ストレプトコッカス・サーモフィルスＡＴＣＣ１９２５８株等の他のストレプトコッカス・サーモフィルスを用いた場合であっても、同様に風味の良好な発酵乳が得られた。
すなわち、表３の結果から、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株とストレプトコッカス・サーモフィルスを用いることにより、風味が良好で嗜好性に優れている発酵食品を製造できることが明らかである。

（試験例３） ストレプトコッカス・ミュータンスの阻止円の形成
２００ｇ／Ｌのスクロースと０．２Ｕ／ｍＬのバシトラシンを加えたＭｉｔｉｓ Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５７０５Ｔ株を塗布した選択培地を用いて、試験例１で用いた乳酸菌のストレプトコッカス・ミュータンスの阻止円の形成能を測定した。
まず、３％（ｗ／ｖ）のショ糖を加えたＧＡＭブイヨン液体培地（ニッスイ社製）に、試験例１で使用した乳酸菌を、それぞれ単独で接種した後、３７℃で２４時間培養した。その後、得られた培養液から、それぞれ３０μＬを分取して、濾紙に染み込ませた。該濾紙を該選択培地に載せ、３７℃で４８時間培養した後、阻止円の形成を観察した。観察した結果を表４に示す。

ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスに属する全ての菌株は、特許文献１に記載のラクトバチルス・ロイテリの２菌株と同様に、濾紙周辺にストレプトコッカス・ミュータンスの阻止円が形成された。中でもＴＬ６株の培養液は、ラクトバチルス・ロイテリよりも非常に大きな阻止円を形成した。一方、発酵乳の製造に適しているストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ−１７２１６株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＪＣＭ１００２Ｔ株は阻止円を形成しなかった。すなわち、表４の結果から、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株が、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有することが明らかである。

（試験例４） ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性の検証
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株、及び、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１２４８Ｔ株（基準株）のストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を比較検証した。
まず、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５７０５Ｔ株とストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５１７５株を、それぞれＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地に接種し、３７℃で１６時間培養し、各菌株の菌溶液を調製した。また、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１２４８Ｔ株を、それぞれ０．５％（ｗ／ｗ）酵母エキス含有１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地に接種し、３７℃で１６時間培養し、各菌株の菌溶液を調製した。

次に、３％（ｗ／ｖ）のショ糖を加えたＧＡＭブイヨン液体培地（ニッスイ社製）をガラス試験管に５ｍＬずつ分注した後、１１５℃で１５分間高圧蒸気滅菌した。該ガラス試験管に、表４記載の各菌株の菌溶液を、０．１％（ｗ／ｗ）濃度となるように添加し、３７℃で培養した。１６時間後、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌数を寒天平板法により測定した。ストレプトコッカス・ミュータンスの菌数は、具体的には、各ガラス試験管中の培養液の一部を、試験例３記載の選択培地に塗布した後、３７℃で７２時間培養し、コロニー数を計数して、菌数を算出した。

表５は、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌数測定の結果を示したものである。なお、各菌数は、独立した３回の測定の平均値を示している。表５の結果から、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株が、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスの基準株よりも、非常に強いストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有していることが明らかである。

（試験例５） 鶏卵抗体によるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株の虫歯予防作用の増強効果の検証
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株との併用により、より強い虫歯予防効果を示す物質を探索した。
まず、試験例４と同様に、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５７０５Ｔ株及びＪＣＭ５１７５株の、各菌株の菌溶液を調製した。さらに、試験例４と同様に、ガラス試験管に、５ｍＬの３％（ｗ／ｖ）ショ糖含有ＧＡＭブイヨン液体培地を分注して高圧蒸気滅菌した。

該ガラス試験管に、表６記載の通りに、試料１〜６をそれぞれ調製した。具体的には、各菌株の菌溶液は０．１％（ｗ／ｗ）濃度となるように、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体表層タンパク質抗原に対する鶏卵抗体（以降、鶏卵抗体と略記する。）は１ｍｇ／ｍＬとなるように、キシリトールは１％（ｗ／ｖ）濃度となるように、それぞれ添加し、３７℃で１６時間培養した。得られた培養液中のストレプトコッカス・ミュータンスの菌数を、試験例４と同様にして計測した。さらに、該培養液中の不溶性グルカン量を測定した。具体的には、ガラス試験管内に付着した不溶性グルカンをスパテルで良くそぎ落し、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して沈殿を集めた。集めた沈殿を、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で２回洗浄した後、５ｍＬのＰＢＳを加えて測定検体とした。なお、不溶性グルカンは、「生化学実験法２３」（高橋禮子著、糖、蛋白質、糖鎖研究法 追補版）に記載のフェノール硫酸法により定量した。

表６は、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌数及び不溶性グルカン量の測定結果を示したものである。表中、ＩｇＹは鶏卵抗体を、ＴＬ６株はラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を、それぞれ表している。鶏卵抗体及びキシリトール単独では、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制効果は認められなかった。一方で、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を添加した試料４〜６では、増殖抑制効果が顕著であった。また、鶏卵抗体を添加した試料２と５では、不溶性グルカン産生の抑制が顕著であった。ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株と鶏卵抗体を同時に添加した試料５では、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖と不溶性グルカン産生の双方が顕著に抑制された。以上の結果より、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌数及び不溶性グルカン生産の両方を抑制するためには、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株と鶏卵抗体の組合せが必要であることが明らかとなった。

（試験例６） 臨床試験による効果の検証
健常成人２３名を対象に、実施例１に従って作成したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株及び鶏卵抗体を含有するヨーグルトを、１０日間に渡り１日２個（１００ｇ×２）を摂取してもらう試験を実施し、虫歯予防効果について検証した。供したヨーグルトには１個当りラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株が５×１０^９ＣＦＵ以上、鶏卵抗体が１０ｍｇ以上含まれていた。摂取開始前８日間は、指定の歯ブラシと研歯剤を用いて、朝夜の２回、通常通りの歯磨きを実施してもらった。
試験食摂取開始日及び終了日の朝、起床後すぐにサリベットを１分間左の奥歯で噛んでもらい唾液を回収した。得られた唾液を用いて、総嫌気性細菌数、付着性ストレプトコッカス・ミュータンス数、ミュータンススコア、及び唾液ｐＨについて解析を行った。

具体的には、総嫌気性細菌数は、各唾液の一部を、試験例３記載の選択培地に塗布した後、３７℃で４８時間培養し、コロニー数を計数して、菌数を算出した。また、付着性ストレプトコッカス・ミュータンス数及びミュータンススコアは、ミュータンス菌簡易菌数測定キット（商品名「ミューカウント」、昭和薬品化工株式会社製）を用いて、添付の説明書に従い、３７℃で４８時間静置培養した。培養終了後、アンプル管を静かに３回ほど反復倒立させ、管壁に付着してないストレプトコッカス・ミュータンスを落下させ、管壁に付着しているコロニー数を目視により数えた。該説明書に記載の表に従いコロニー数をスコア化した。該表を表７に示す。さらに、唾液ｐＨは、得られた唾液を直接ｐＨメーター（ＨＯＲＩＢＡ社製）にて測定した。

表８は、各唾液の測定結果を示したものである。表８の結果より、本発明のヨーグルトの摂取により、付着性ストレプトコッカス・ミュータンス菌数は著しく軽減したが、総嫌気性細菌数や唾液ｐＨに対する影響は観察されなかった。したがって、摂取した本発明のヨーグルトの、口腔内の酸性化や総菌数に対する影響は認められなかったが、付着性ストレプトコッカス・ミュータンス菌数を減少させる効果は確認された。

０．１％（ｗ／ｗ）酵母エキス含有１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｇを、１１５℃で２０分間殺菌し、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株のシードカルチャーを３０ｇ接種し、３７℃１６時間培養して、バルクスターターを調製した。一方、０．１％（ｗ／ｗ）酵母エキス含有１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｇを、９０℃で３０分間殺菌し、ストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ-１７２１６株を３０ｇ接種し、３７℃５時間培養して、バルクスターターを調製した。
これとは別に、脱脂粉乳、クリーム及び乳タンパク質等の原料を混合溶解し、乳脂肪３．０％（ｗ／ｗ）、無脂乳固形分１２．０％（ｗ／ｗ）からなる乳性発酵用ベース５０ｋｇを、７０℃に加温して、１５ＭＰａの圧力で均質化した後、９０℃で１０分間殺菌して、４０℃に冷却した。該殺菌した乳性発酵用ベースに、４倍希釈し７５℃２０秒間殺菌したオーバルゲンＤＣ（鶏卵抗体含有卵黄液、ゲン・コーポレーション社製）を２ｋｇと、前記の通り前培養を行ったラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株のバルクスターター１５０ｇと、ストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ-１７２１６株のバルクスターター４５０ｇを接種し、３７℃で４時間培養して発酵乳を得た。該発酵乳を直ちに攪拌冷却し、１００ｍＬ容の紙カップ容器に充填し、密封し、ヨーグルトを得た。得られたヨーグルトはｐＨ４．９５であり、６．５×１０^７ＣＦＵ／ｍＬのラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株と、２μｇ／ｍＬ相当の力価の該鶏卵抗体を含有していた。該ヨーグルトを、１０℃で１４日間保存した時のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株の菌数は６．３×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ（生残率：９６．９％）であり、該鶏卵抗体の力価は１．８μｇ／ｍＬ相当であった。

肉エキス５０ｇ、酵母エキス１００ｇ、ペプトン１００ｇ、乳糖２００ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ５０ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ １０ｇ、シスチン４ｇ及び水９．５ｋｇの組成からなる培地で３７℃１６時間前培養したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株のシードカルチャー５００ｇを、前記培地と同一組成の培地１０ｋｇに接種し、３７℃１６時間培養した。更に、９０℃で３０分間殺菌した前記培地と同一組成の培地２００ｋｇに、前記培養液全量（１０．５ｋｇ）を接種し、３７℃１６時間培養した。培養後の生菌数は２．４×１０^９ＣＦＵ／ｍＬであった。
次いで、シャープレス型遠心分離機を用いて、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ）により菌体を集め、培地と同量の生理食塩水（９０℃３０分間殺菌済）に再懸濁し、前記と同様遠心分離して再度集菌した。集めた菌体を、脱脂粉乳１０％（ｗ／ｗ）、蔗糖１％（ｗ／ｗ）、グルタミン酸ソーダ１％（ｗ／ｗ）からなる溶液（９０℃３０分間殺菌済）２０ｋｇに懸濁し、常法に従って凍結乾燥し、４．３×１０¹⁰ＣＦＵ／ｇのラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を含む粉末約２ｋｇを得た。
続いて第１２改正日本薬局方解説書製剤総則「錠剤」に記載の方法を参考に、上述した凍結乾燥菌末１０ｇ、オーバルゲンＤＣ（ゲン・コーポレーション社製）粉末１０ｇ、クエン酸５．４ｇ、還元麦芽糖水飴３６ｇ、還元乳糖１５．８ｇ、結晶セルロース７．２ｇ、ステアリン酸カルシウム１．８ｇ、二酸化ケイ素４５０ｍｇ、アスパルテーム３６０ｍｇ、香料（ライム）２８．８ｇを加えて均一に混合し、打錠機で圧縮成型し、１錠当り４５０ｍｇのトローチ錠を９０ｇ製造した。

本発明の虫歯予防用組成物により、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖と歯面への付着を顕著に抑制することができ、かつ、風味の良好な発酵食品等を簡便に製造することができるため、虫歯の予防や治療の分野や発酵食品等の製造分野で利用が可能である。

Claims (4)

1. ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｌａｃｔｉｓ）ＴＬ６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７５８）の菌体及び／又は前記ＴＬ６株の培養物と、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）の菌体表層タンパク質抗原に対する鶏卵抗体を有効成分とする虫歯予防用組成物。
2. 前記菌体表層タンパク質抗原が、菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼである、請求項１記載の虫歯予防用組成物。
3. 前記虫歯予防用組成物が発酵食品である、請求項１又は２記載の虫歯予防用組成物。
4. 前記虫歯予防用組成物が虫歯予防製剤である、請求項１又は２記載の虫歯予防用組成物。