JP5052500B2

JP5052500B2 - Ｄｎａの同時分解を伴う逆転写及びｒｎａの増幅

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Publication number: JP5052500B2
Application number: JP2008503416A
Authority: JP
Inventors: クリスチャンコルフハーゲ; ラルフパイシュト; ディルクレッフェルト
Original assignee: キアゲンゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 2005-04-01
Filing date: 2006-03-27
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2026-03-27
Also published as: EP1707623A1; ATE488580T1; DE502006008330D1; WO2006103039A1; JP2008533997A

Description

本発明は、ＲＮＡの処理のための方法、特にＲＮＡ反応方法、および本発明に記載のＲＮＡ反応方法を実施するためのキットに関する。

分子生物学における多数の方法が、リボ核酸（ＲＮＡ）の分析に繋がる。ＲＮＡの分析を可能にするためには、すべての阻害物質および混入物質から精製されなければならない。したがって、たとえば、ゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の混入は、阻害作用を有しうるかまたは偽陽性結果に繋がりうる。分子ＲＮＡ分析のいくつかの方法は、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写で始まる。ｃＤＮＡはゲノムＤＮＡと、構造および配列の両方で、非常に似ているかまたは同一でさえある。したがってゲノムＤＮＡによる混入は、ｃＤＮＡを分析すべき場合（たとえばｃＤＮＡ量の光度測定またはＰＣＲによるその定量）には誤った結果に繋がりうる。

ＲＮＡを確実に分析するためには、したがって、対応する分析の前にたとえばゲノムＤＮＡといった他のすべての妨害核酸をＲＮＡから分離するか、またはそれらを個々の成分へ分解する必要がある。ＤＮＡおよびＲＮＡについてしばらく使用された分離方法が、いわゆる密度勾配遠心分離である。密度勾配遠心分離のための標準的な物質は、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）およびショ糖である。ＣｓＣｌの場合では、密度勾配は、たとえば開始溶液の密度に依存して、遠心分離中に平衡状態において成立し、その中で個々の高分子が、勾配中で固有の密度に対応するゾーンに整列する。遠心分離後に遠心分離容器内で成立した核酸バンドを可視化するために、エチジウムブロマイドがＣｓＣｌ溶液に添加され、これは核酸に取り込まれおよびＵＶ光で蛍光を発する。この方法は、個々のＤＮＡ断片の沈降速度が近いため他の方法では互いに区別するのが非常に困難な、個々のＤＮＡ断片の信頼性の高い分離を可能にする。ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離では、１．０ないし１．９ｇ／ｍｌの密度値が通常使用される。ＲＮＡの浮遊密度は通常、１．９ｇ／ｍｌより大であるため、平衡遠心分離（等密度遠心分離ともいう）では、ＲＮＡは密度上限が１．９ｇ／ｍｌである勾配中で試料容器の底に沈む一方、他のすべての種類の分子（ＤＮＡを含む）は勾配中でそれぞれのバンドを形成する。このようにして、対応する分離操作はＲＮＡおよびＤＮＡの良好な分離に繋がる。しかし、密度勾配遠心分離法は、使用する化学物質のために相対的に高額であり、装置が非常に複雑であり、およびまた非常に時間がかかる（従来のＣｓＣｌ勾配では平衡が成立するまでに最大２日間の長い遠心分離運転を必要とする）。

したがって、ＤＮＡ混入を酵素的に分解するためにＲＮＡ調製中または調製後に一種類のＤＮアーゼまたは数種類のＤＮアーゼが実験バッチに添加されることによるＲＮＡの単離のために製品が作られている。この目的のための系（いわゆる「キット」）が、キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））によって「ＲＮイージー・マイクロ・キット（ＲＮｅａｓｙＭｉｃｒｏＫｉｔ）」および「ＲＮイージー・線維組織キット（ＲＮｅａｓｙＦｉｂｒｏｕｓＴｉｓｓｕｅＫｉｔ）」の名称で、およびプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））によって「ＳＶ総ＲＮＡ単離システム（ＳＶＴｏｔａｌＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）」の名称で市販されている。しかし、これらのＲＮＡ調製方法は、純粋なＲＮＡの単離には繋がらない。単離されたＲＮＡはむしろ、ゲノムＤＮＡ、塩類、阻害剤などで異なる程度に汚染された材料として存在する。上記で挙げたキットで達成可能な純度のレベルは、多数の用途について実際に適当でありうるが、しかしこれはいくつかの他の分野の用途（たとえばＲＴ−ＰＣＲ）については当てはまらない。

ＲＮＡをさらに濃縮しおよびＤＮＡの量を低減するためにクロマトグラフィー法（たとえばイオン交換クロマトグラフィー、オリゴ−ｄＴクロマトグラフィー）が用いられる別の方法もまた使用されている。しかし、リボソームＲＮＡをこの方法で精製することは不可能である。

最後に、米国特許出願２００２００４２０５２号は、増幅反応用のバッチからの核酸不純物の除去のための別の方法を記載する。ここでは、増幅バッチ中の不要な二本鎖ＤＮＡを実際の増幅反応の前に常に分解する熱不安定性ＤＮアーゼが用いられる。その熱不安定性のため、使用されるＤＮアーゼは、遅くともＰＣＲ反応中の９０℃を上回る最初の加熱中に非可逆的に不活性化される。ＰＣＲ反応は、ＤＮアーゼ反応が終了して初めて開始されうる。引用された米国公開明細書から公知の方法では、ＤＮＡ分解反応およびＲＮＡ反応の同時性はしたがって示唆されない。

また、すべてのこれらのより近年の方法は、しかし、一部で時間がかかりコスト集約的であり、および、いくつかのＲＮＡ調製の同時処理中にクロスコンタミネーションにおそらく繋がりうる。さらに、上記の従来公知の方法では、ＤＮＡ分解はＲＮＡ反応またはＲＮＡ分析とは同時に起こらないが、しかしＤＮＡ分解は実際のＲＮＡ反応またはＲＮＡ分析の前に常に実施されるということもまた当てはまる。

このように、本発明の基礎となる問題は、上記の公知の方法の欠点を有しない、ＲＮＡ分析のための方法を提供することである。その新しい方法は、費用効果的で、および要する時間がより短く、および装置についての経費を適度に保たなければならない。

本発明はこの問題を、独立請求項１に記載の方法および独立請求項１３に記載のキットによって解決する。本発明の別の有利な実施形態、態様および詳細は、従属請求項、説明、実施例および図面によって提供される。

本発明はしたがって、ＤＮＡ二本鎖特異的エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素によって二本鎖ＤＮＡの分解が行われることによってＲＮＡ反応および存在する二本鎖ＤＮＡの分解が同一の容器内で起こる点で特徴づけられるＲＮＡ反応方法に関する。ＲＮＡ反応および存在する二本鎖ＤＮＡの分解は、好ましくは同時に起こる。このことは、反応バッチ中に存在する不要な二本鎖ＤＮＡが完全に分解されるかまたは少なくともＲＮＡ反応または随伴する分析反応に干渉しないほど分解されるまでＲＮＡ反応の開始を待つ必要がもう無いという顕著な長所を有する。また、本発明に記載の方法によって、反応容器を頻繁に開けることによって不純物が反応バッチへ導入される危険が低減される。

また、本発明に記載の方法では、一方でのＲＮＡ反応および他方でのＤＮＡ分解は、同一の温度にて実施されうる。温度はしたがって、たとえば、１０ないし８０℃、好ましくは２０ないし７０℃、特に２０ないし６０℃の範囲でありうる。

このように本発明は初めて、試料のＤＮＡ混入除去をＲＮＡ反応と同一の処理に組み合わせる、すなわち一方でＤＮＡ混入除去および他方でＲＮＡ反応またはＲＮＡ分析が連続的にまたは同時にまたは平行して全く同一の反応容器で行われる。典型的なＲＮＡ反応は、たとえば、逆転写、１段階ＲＴ−ＰＣＲ（１段階での逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）またはＲＮＡのタグ化反応であるが、しかしこれらに限定されない。

本発明はこのように、分析物としてＲＮＡを含む反応（たとえば逆転写、上記参照）と同時の、望ましくない二本鎖ＤＮＡ（たとえばゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、直鎖または環状ＤＮＡ、たとえばプラスミドＤＮＡ）の分解を確実にする。二本鎖ＤＮＡの分解は、ＤＮＡ二本鎖特異的エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素によって、分析物としてＲＮＡを含む反応中に起こる。この酵素は、分子間または分子内二本鎖として存在するＤＮＡのヌクレオチド鎖切断加水分解によって、特異的に切断、または、完全にまたは少なくとも部分的に切断する、一種類のデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）またはいくつかのＤＮアーゼである。さらに、これらのＤＮアーゼはＤＮＡ一本鎖およびＲＮＡ一本鎖およびまたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドとして存在するＲＮＡおよびＤＮＡの切断が起こらないかまたは非常に小さい程度である点で特徴づけられる。本発明を用いて、たとえば、ＲＮＡが一本鎖ＤＮＡへ転写されるｃＤＮＡ合成反応の存在下での、合成過程によって生じたばかりの一本鎖ｃＤＮＡがごくわずかしかまたは全く分解されない、二本鎖ＤＮＡの分解のための二本鎖特異的ＤＮアーゼの同時使用が初めて可能となる。本発明に記載の使用されうるＤＮＡ二本鎖特異的エンドヌクレアーゼは、熱安定性または熱不安定性でありうる。

上述の通り、本発明は、同時の処理における一方でのｄｓＤＮＡ混入の低減および他方でのＲＮＡ反応の組み合わせに関する。したがって重要なのは、ｄｓＤＮＡ混入除去がたとえば二本鎖特異的ＤＮアーゼを用いて実施される、ＤＮＡ分解およびまたＲＮＡとの反応が起こるのを等しく可能にする反応条件である。

ＲＮＡ単離物中の「ＤＮＡ混入」は、別起源でありうる、および望ましくない分子としてＲＮＡと一緒に同一の反応容器中に存在する任意の二本鎖デオキシリボ核酸分子と定義される。ＤＮＡの二本鎖性はまた、一本鎖ＤＮＡが自己ハイブリダイゼーションによって折りたたまれて存在しおよびそのようにして二本鎖として少なくともしばらく存在する場合に生じうる。

二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は、ＲＮＡもまた単離されている元の生物材料に由来しうる。これは本質的に核、色素体、またはミトコンドリアＤＮＡでありうる。ｄｓＤＮＡはまた、感染、形質転換、融合、組み込みなどといった生物学的手段によって外部起源から元の生物材料へ移行される可能性もあり、およびしたがって、たとえば、ウイルス、原核または真核起源でありうる。さらに、ＤＮＡはまた、たとえば、エレクトロポレーション、形質転換、トランスフェクションまたは他の方法といった自然でない手段によって元の生物材料へ移行されうる。それはゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、二本鎖オリゴヌクレオチド（たとえばプライマー二量体といった）または他の形の二本鎖ＤＮＡでありうる。さらに、二本鎖ＤＮＡはまた、ＲＮＡ単離中または単離後にＲＮＡ調製へ導入されうる。

たとえば下記が「ＲＮＡ反応」として定義される：
（１）たとえば、分解、タグ化、伸長、修飾などといった、ＲＮＡへの任意の形の変化。ＲＮＡはしたがって一本鎖、二本鎖として、またはハイブリッド分子（たとえばＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）として存在しうる；
分解に関して、たとえば、リボザイム、ＲＮアーゼＨおよび／またはｓｉＲＮＡによってＲＮＡが選択的に分解される、選択的分解である。たとえば変異または化学修飾によって得られたＲＮアーゼＨ^-酵素もまたＲＮアーゼＨとして使用されうる；
（２）たとえば、（ａ）逆転写または（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼによる転写などといった、ＲＮＡがポリメラーゼ反応のテンプレートとして用いられる、任意の形の変換；
（ａ）に関して：逆転写はたとえば、ウイルス、レトロトランスポゾン、細菌などに由来する逆転写酵素といった変異または非変異ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって実施されうる。これらはＲＮアーゼＨ活性を有しうるか、または逆転写酵素のＲＮアーゼＨ活性が制限されたかまたは存在しないほど変異した逆転写酵素が使用されうる（たとえばＭＭＬＶ−ＲＴＲＮアーゼＨ^-）。ＲＮＡ依存性ＤＮＡ合成（逆転写）はまた、変異または反応条件変更によって変化した核酸依存性を示しおよびそのようにしてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの機能を得た酵素によっても実施されうる。例としてここに引用されるのは、Ｔｔｈ−ＤＮＡポリメラーゼであり、これはＤＮＡ依存性であり、および変更した反応条件を用いることによってＲＮＡもまたマトリクスとして使用されうる。
（ｂ）に関して：マトリクスとしてＲＮＡから開始されるＲＮＡポリメラーゼ反応は、たとえば、ウイルス、原核生物または真核生物に由来する変異および非変異ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて実施されうる。ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成はまた、変異または反応条件変更によって変化した核酸依存性を有しおよびそのようにしてＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの機能を得た酵素を用いても実施されうる。例としてここに引用されるのは、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡをマトリクスとして用いるＲＮＡ増幅方法である（ＥＰ１０５６８８４）；
（３）ＲＮＡがたとえば、リボザイムなどといった触媒として機能する、任意の形の変換；
（４）任意の形の結合反応。少なくとも一つのパートナーがＲＮＡとなるように、結合反応に異なる結合パートナーが含まれうる。下記の結合反応が実行可能であり、たとえば、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＰＮＡ（ハイブリダイゼーションとして大変広く知られている）、ＲＮＡ抗体反応、ＲＮＡアプタマー反応、たとえば抗生物質などといった他の分子とのＲＮＡの認識反応；
（５）上記の反応（１）から（４）が反応全体のうちの成分である、任意の形の複合反応、たとえば、直鎖ＲＮＡ増幅反応（たとえばエバーワイン（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）、エピクローンズ（ｅｐｉｃｌｏｎｅｓ）、ニュージェン（Ｎｕｇｅｎ））、指数ＲＮＡ増幅方法（たとえばＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ）または他の増幅方法（たとえばＳＡＧＥ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＣＡ）。

本発明について、議論が、「反応参加者」としてのＲＮＡまたは「ＲＮＡ反応方法」、「ＲＮＡ反応」または「ＲＮＡ分析」に関する場合、これはＲＮＡが各反応または分析に実際に関与するがしかし必ずしも変化しないことを意味する。また、本発明に従って、ＲＮＡが変化せずに回収される反応（たとえばＲＮＡが触媒またはマトリクスとして用いられる場合）において、または考察が「ＲＮＡ反応方法」、「ＲＮＡ反応」または「ＲＮＡ分析」に言及する場合、ＲＮＡは「反応参加者」と呼ばれる。

本発明に関連して「同時に」または「同時性」、「平行して」、「同時の」などが用いられる場合、ｄｓＤＮＡ分解およびＲＮＡ反応が同一の反応容器内で起こると理解すべきである。ｄｓＤＮＡ混入物の分解およびＲＮＡ反応はしたがって同時におよび全く同一の反応バッチにおいて実施される。同時性は、ＲＮＡ反応およびｄｓＤＮＡ混入物の分解が、同時に同一の反応容器内でおよび同一の反応条件下で起こることを表すことが意図される。

本発明に記載の方法において、特に米国特許出願２００２００４２０５２号により公知の方法とは対照的に、本発明に記載の方法は均一温度にて起こりうること、すなわちＲＮＡ反応およびｄｓＤＮＡ分解が同一の温度にて起こりうることもまた有利である。さらに、本発明に記載の方法では、ＤＮアーゼを用いたｄｓＤＮＡ分解後におよび新しい酵素（９０℃を超える加熱によっておそらく不可逆的に損傷されうる）を加えるために反応容器を再び開ける必要が無く、そのようにして不必要な混入が回避されうる点でもまた、ＵＳ２００２００４２０５２より公知の方法とは対照的に有益である。

本発明によると、ＲＮＡ反応は、ＲＮＡ反応を決定するだけでなく同時にｄｓＤＮＡ混入物の分解も可能にすべき反応条件によって限定される。これは、最適条件がＲＮＡの反応についておよびｄｓＤＮＡの分解についてそれぞれ設定されないことを意味し、ＲＮＡ反応およびＤＮＡの分解のための条件が全体を通じて互いに適用されうる。本発明は、ＲＮＡ反応およびｄｓＤＮＡの分解が同時に全く同一の反応容器内で起こることを初めて可能にする。

「デオキシリボヌクレアーゼ」、または短縮された「ＤＮアーゼ」はここでは、分子間または分子内二本鎖として存在するＤＮＡのヌクレオチド鎖切断加水分解によって特異的に完全にまたは少なくとも部分的に切断（分解）する酵素、すなわちＤＮＡ二本鎖特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素として定義される。このＤＮアーゼはしたがって、ＲＮＡ一本鎖のおよびＤＮＡ一本鎖のおよびまたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドとして存在するＲＮＡまたはＤＮＡの分解または切断が、起こらないかまたは無視可能な小さい程度でしか起こらない点で特徴づけられる。本発明の意味内でのＤＮアーゼは、配列特異的であるかまたはｄｓＤＮＡを非特異的に切断する。両方の変異体が本発明に関連して使用されうる。同様に、熱不安定性および／または熱安定性ＤＮアーゼを使用することもまた可能である。このように、各ＲＮＡ反応の、またはそれぞれの後続の反応を考慮して、酵素が適していることが当業者に明らかである。

ｄｓＤＮＡの「分解」によって、分解過程はこれまですべての場合においてＤＮＡが、ＲＮＡ反応または以降の用途に対してわずかしかまたはまったく破壊的作用を示さないことが理解されるべきである。分解は、二本鎖ＤＮＡのその個別成分（ヌクレオチド）への完全な崩壊を意味しうるが必ずしも必要ではない。本発明の意味において、ｄｓＤＮＡの分解は少なくとも一部がＲＮＡ反応と同時に起こる。

下記の酵素が、二本鎖ＤＮＡの分解に、特に逆転写酵素反応に使用されうる：
１）配列非依存性（配列非特異的）エンドヌクレアーゼ：これらのエンドヌクレアーゼは、天然酵素（生物からの単離物）または遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）から調製され、またはこれらの酵素の変異体でありうる。配列非依存性エンドヌクレアーゼの例は、ＤＮアーゼＩであり、これは本発明によるとｄｓＤＮＡの分解のために特に好ましい；
２）配列特異的エンドヌクレアーゼ：これらのエンドヌクレアーゼは、天然酵素（生物からの単離物）または遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）から調製され、またはこれらの酵素の変異体でありうる。配列特異的エンドヌクレアーゼの例は、酵素ＡｌｕＩまたはＨａｅＩＩＩである。配列特異的エンドヌクレアーゼの混合物もまた使用されうる。
３）配列特異的エンドヌクレアーゼおよび配列非特異的エンドヌクレアーゼの組み合わせ。

エンドヌクレアーゼは、反応バッチが約０．０１から約１００Ｕ、好ましくは約０．０５から約２０Ｕ、より好ましくは約０．１から約１０Ｕの酵素活性を含むような方法で一般的に用いられる。国際合意によると、１Ｕ（ユニット、酵素単位）と表される酵素活性は、ａ）配列非特異的ＤＮＡ二本鎖特異的エンドヌクレアーゼについては１分当たり基質１μｍｏｌを２５℃にて最適条件下で変換するのに必要な酵素の量、およびｂ）配列特異的ＤＮＡ二本鎖特異的制限エンドヌクレアーゼについては１時間当たりラムダＤＮＡ１μｇを３７℃にて最適条件下で変換するのに必要な酵素の量に相当する。

ＲＴ−ＰＣＲの場合には、ｄｓＤＮＡの分解は、逆転写酵素の存在下で実施される。適当な逆転写酵素は、たとえば、ＨＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＬＶ、オムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ^(R)）（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮＧｍｂＨ））、センシスクリプト（Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ^(R)）（キアゲン社）などといったレトロウイルス由来の、またはレトロトランスポゾン由来の逆転写酵素である。逆転写酵素は、アミノ酸配列について元の生物に対応する可能性があり、または元の生物からの変動、たとえば、ＲＮアーゼＨ活性の欠損、進化性の変化または酵素の熱安定性への影響に繋がる変化を有しうる。逆転写酵素活性をほとんどまたはまったく有しないＤＮＡポリメラーゼもまた使用することができ、および適当な反応条件の使用によってまたは変異によって（たとえばｒＴｔｈポリメラーゼ）、逆転写酵素として使用されうる。

逆転写酵素の存在下でその中でｄｓＤＮＡ分解が起こる水系緩衝溶液は少なくとも下記を含む：
１）ＤＮＡ二本鎖特異的エンドヌクレアーゼ（上記の通り）；
２）逆転写酵素（上記の通り）；
３）実験バッチのｐＨ値を干渉する緩衝物質；
４）ｐＨ値６ないし１０、特に好ましい７ないし９；および
５）逆転写酵素反応およびゲノムＤＮＡの酵素分解を支持する、たとえば、Ｍｇ²⁺（濃度範囲０．１ないし５０ｍＭで）、Ｍｎ²⁺（濃度範囲０．０１ないし１０ｍＭで）、またはＣａ²⁺（濃度範囲０．０１ないし５０ｍＭで）といった２価陽イオン。

反応バッチはまた、たとえば、他の酵素、２価陽イオンまたは塩といった他の成分を含みうる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼもまたしたがって存在しうる。

反応温度は、たとえば、１０ないし７０℃、好ましくは１５℃ないし６０℃、特に非常に好ましくは２０℃ないし５０℃でありうる。

本発明はさらに、請求項１から１２のいずれかに記載の方法を実施するためのキットに関し、キットは請求項１から１２のいずれかに記載の方法を実施するための少なくとも一つの逆転写酵素、ＤＮＡ二本鎖特異的エンドヌクレアーゼおよび反応緩衝液を含み、および一個の容器内でのｄｓＤＮＡ分解を含む。好ましくはキットは、ｃＤＮＡ合成の実施用かまたは１段階ＲＴ−ＰＣＲの実施用である。キットが１段階ＰＣＲの実施に用いられる場合は、キットは追加で熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含みうる。

本発明は実施例によって下記により詳細に記載される。

実施例１
各例でＨｅＬａ細胞由来のｇＤＮＡ１μｇおよび総ＲＮＡ１μｇを、逆転写酵素反応での使用のために混合した。逆転写酵素反応は、逆転写のためのオリゴ−ｄＴプライマー、ｄＮＴＰ、ＲＮアーゼ阻害剤、緩衝液（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮＧｍｂＨ）（ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）のオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）ＲＴキットからの緩衝液ＲＴ）および逆転写酵素（オムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ^(R)）、キアゲン社（ドイツ、ヒルデン）の商標）を含む水系媒体中で実施された。さらに異なる二本鎖特異的ＤＮアーゼが添加された：
（１）１０Ｕ量のＡｌｕＩ制限エンドヌクレアーゼ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）（ドイツ、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ））より入手可能）；
（２）１０Ｕ量のＨａｅＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ（ロシュ社）。
（３）１０Ｕ量のＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩ（ロシュ社）；
（４）１０Ｕ量のＡｌｕＩ制限エンドヌクレアーゼ（ロシュ社）および１０Ｕ量のＨａｅＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ（ロシュ社）。

別の一つの反応バッチにはＤＮアーゼは添加されなかった。このバッチは対照として用いられた。反応混合物は１時間３７℃にてインキュベートされ、および次いで（Ａ）ＰＣＲによってｃＤＮＡ分解に関して分析され、および（Ｂ）ＲＮＡ完全性およびＤＮＡ分解に関してアガロースゲル（１．２％）で分析された。

結果を図１に示す。ｇＤＮＡの分解は、ＤＮアーゼＡｌｕＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＤＮアーゼＩを用いてまたはＤＮアーゼＡｌｕＩおよびＨａｅＩＩＩの混合物を用いて認識可能であり、それによってｒＲＮＡの完全性は損傷されなかった。同様に、β−アクチン転写物のＲＴ−ＰＣＲシグナルに基づいて、ＤＮアーゼＡｌｕＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＤＮアーゼＩ、またはＤＮアーゼＡｌｕＩおよびＨａｅＩＩＩの混合物の存在は、シグナル強度の変化を生じないことが明らかになり、このことは使用したＤＮアーゼがＲＴ反応を損なわなかったことを実証する。

実施例２
各回でＨｅＬａ細胞由来の総ＲＮＡ１ｎｇが、逆転写酵素反応での使用のために１μｇの０．２〜９．５ｋＢＲＮＡラダー（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と混合された。逆転写酵素反応は、逆転写のためのオリゴ−ｄＴプライマー、ｄＮＴＰ、ＲＮアーゼ阻害剤、緩衝液（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮＧｍｂＨ）（ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）のオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）ＲＴキットからの緩衝液ＲＴ）および逆転写酵素（オムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ^(R)）、キアゲン社（ドイツ、ヒルデン）の商標）を含む水系媒体中で実施された。さらにＤＮＡ二本鎖特異的−エンドヌクレアーゼＤＮアーゼＩ（ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩ）が添加された。エキソヌクレアーゼＶＩＩ（「エキソＶＩＩ」）が他のバッチに添加された。

ＤＮアーゼＩ（ウシ膵臓由来；ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）（ドイツ、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ））より入手可能）およびエキソヌクレアーゼＶＩＩは異なる量で用いられた。別の一つの反応バッチにはヌクレアーゼは添加されなかった。このバッチは陽性対照として用いられた。エキソヌクレアーゼＶＩＩを含むバッチは陰性対照として用いられた。エキソヌクレアーゼＶＩＩは二本鎖特異的でなく、および一本鎖ＤＮＡを分解できる。各反応混合物は１時間３７℃にてインキュベートされ、および次いでＰＣＲによってｃＤＮＡ分解に関して分析された。β−アクチン転写物全体がＰＣＲで増幅された。

結果を図２に示す。ＤＮアーゼＩは逆転写酵素反応の障害に繋がらなかった。これは陽性対照と明らかに逆である。ＤＮアーゼＩはＲＴ−ＰＣＲ断片について陽性対照の強度に相当するシグナル強度を示す。陰性対照として使用された一本鎖特異的ヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼＶＩＩだけが、一本鎖−ｃＤＮＡの相当な分解に繋がり、そのためＲＴ−ＰＣＲ特異的シグナルは見つからなかった。

実施例３
それぞれＨｅＬａ細胞由来のゲノムＤＮＡ１μｇおよび総ＲＮＡ１μｇを、逆転写酵素反応での使用のために混合した。逆転写酵素反応は、逆転写のためのオリゴ−ｄＴプライマー、ｄＮＴＰ、ＲＮアーゼ阻害剤および緩衝液（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮＧｍｂＨ）（ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）のオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）ＲＴキットからの緩衝液ＲＴ）を含む水系媒体中で実施された。さらに異なる量の二本鎖特異的ヌクレアーゼが添加された：
（１）０〜１０Ｕ量のＡｌｕＩ制限エンドヌクレアーゼ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）（ドイツ、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）））；
（２）０〜１０Ｕ量のＨａｅＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ（ロシュ社（ドイツ、マンハイム））；および
（３）０〜１０Ｕ量のＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩ（ロシュ社（ドイツ、マンハイム））。

一本鎖ｃＤＮＡの合成に対するヌクレアーゼの影響を調べることができるように、逆転写酵素が一組のバッチに添加された。ゲノムＤＮＡの分解を追跡できるように、別の一組のバッチには逆転写酵素は添加されなかった。反応混合物は１時間３７℃にてインキュベートされ、および次いでＰＣＲによって分析された。ｃＤＮＡ合成が追跡されたバッチでは、β−アクチン転写物の完全なｃＤＮＡが増幅された。ゲノムＤＮＡの分解が追跡されたバッチでは、β−アクチン遺伝子の５'末端由来の領域が増幅された。プライマーセットはイントロンを補うため、ゲノム増幅物は６００ｂｐを超えるサイズを示し、一方でｃＤＮＡの増幅物は約２００ｂｐのサイズを有する。

結果を図３に示す。図３は異なるヌクレアーゼ濃度を用いたバッチがトラック上で調べられている１％アガロースゲルの写真を示す。図３から、逆転写は試験したヌクレアーゼの存在によって障害されなかったのがわかり、このことは３種類すべてのヌクレアーゼについてｃＤＮＡバンドがすべての濃度で明瞭に見えるままである点で認められる、図３の上部参照。対照的に、ヌクレアーゼの使用は、ゲノムＤＮＡ一定の最小量のヌクレアーゼ（５Ｕ）が添加される場合にゲノムＤＮＡのおおよそ完全な分解に繋がることが等しく明らかである、図３の下部参照。

実施例４
各回でＨｅＬａ細胞由来の総ＲＮＡ１５０ｎｇが、逆転写酵素反応条件下でＤＮアーゼ反応を実施するために、ｇＤＮＡ１５０ｎｇと混合された。反応は、逆転写のためのオリゴ−ｄＴプライマー、ｄＮＴＰ、ＲＮアーゼ阻害剤および緩衝液（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮＧｍｂＨ）（ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）のオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）ＲＴキットからの緩衝液ＲＴ）を含む水系媒体中で実施された。さらに０；０．１；０．５；または２．５単位の二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩ）がバッチに添加された。また、塩化マグネシウム０ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭまたは２．５ｍＭがバッチに添加された。逆転写酵素反応条件下でのＤＮアーゼＩ活性を調べるために、逆転写酵素は添加されなかった。反応混合物１時間３７℃にてインキュベートされた。ＤＮＡ分解は次いで定量リアルタイムＰＣＲによって分析された。このために各回１μｌの反応混合物がリアルタイムＰＣＲ用に使用された。β−アクチンの５'末端由来の２００ｂｐ断片を増幅したプライマー対が使用された。結果として生じた増幅物はＳＹＢＲグリーンで検出された。

結果を図４および表１に示す。ゲノムＤＮＡの分解はＣＴ値から決定し、および使用したＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩの量に依存する。ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩの活性は、ＣＴ最高値がＤＮアーゼ２．５Ｕおよび２ｍＭＭｇＣｌ₂で得られたため、追加の塩化マグネシウムの添加によって調節されうる。

実施例５
各回でＨｅＬａ細胞由来の総ＲＮＡ１５０ｎｇが、逆転写酵素反応での使用のために、ｇＤＮＡ０ｎｇまたは１５０ｎｇと混合された。反応は、逆転写のためのオリゴ−ｄＴプライマー、ｄＮＴＰ、ＲＮアーゼ阻害剤および緩衝液（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮＧｍｂＨ）（ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）のオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）ＲＴキットからの緩衝液ＲＴ）を含む水系媒体中で実施された。さらに、２．５単位の二本鎖特異的エンドヌクレアーゼ（ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩ）が一部のバッチに添加された。一本鎖ｃＤＮＡの合成に対するヌクレアーゼの影響を調べることができるように、逆転写酵素が一組のバッチに添加された。ゲノムＤＮＡの分解を追跡できるように、別のバッチには逆転写酵素は添加されなかった。反応混合物は１時間３７℃にてインキュベートされた。次いでｃＤＮＡ合成およびＤＮＡ分解が定量リアルタイムＰＣＲによって分析された。各例で１μｌおよび０．１μｌの逆転写酵素反応物がリアルタイムＰＣＲに使用された。β−アクチンの３'末端由来の２１０ｂｐ断片を増幅したプライマー対が使用された。結果として生じた増幅物はＳＹＢＲグリーンで検出された。

この試験の結果は、逆転写はＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩの存在によって障害されなかったということであった。ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩの使用によって、ゲノムＤＮＡは１０００倍を超えて分解された。同時に、生じたｃＤＮＡは消化されなかったかまたは有意でない消化しかされなかった。結果を表２に列記する。

ＤＮアーゼ段階はまた、実際のＲＮＡ修飾反応の前に非常に短い反応で実施することができ、それによって、しかし、上記のバッチでのようにＤＮアーゼは反応混合物中に残りおよび熱不活性化または精製段階によって系から除去されない。

実施例６
各回でＨｅＬａ細胞由来の総ＲＮＡ１０ｐｇから１μｇが、逆転写酵素反応での使用のために、等量のｇＤＮＡと混合された。反応は、逆転写のためのオリゴ−ｄＴプライマー、ランダム８量体、ｄＮＴＰ、ＲＮアーゼ阻害剤および緩衝液（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮＧｍｂＨ）（ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）のクオンティテクト（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ^(R)）逆転写キットからのｇＤＮＡワイプアウト緩衝液およびクオンティスクリプト（Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ）ＲＴ緩衝液）を含む水系媒体中で実施された。また２．５単位の二本鎖特異的エンドヌクレアーゼ（ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩ）が一部のバッチへ添加された。一本鎖ｃＤＮＡの合成に対するヌクレアーゼの影響を調べることができるように、逆転写酵素が一組のバッチに添加された。ゲノムＤＮＡの分解を追跡できるように、別の一組のバッチには逆転写酵素は添加されなかった。実際のｃＤＮＡ合成の前に、ＤＮアーゼ段階が２分間３７℃にて実施された。その後はじめて反応混合物が１５分間逆転写酵素の存在下で３７℃にてインキュベートされた。次に、ｃＤＮＡ合成およびＤＮＡ分解が定量リアルタイムＰＣＲによって分析された。各例で１μｌの逆転写酵素反応物がリアルタイムＰＣＲに使用された。クオンティテクト（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ）遺伝子発現アッセイ（キアゲン社（ドイツ、ヒルデン））がＧｅｎＲＰＳＬＡに、クオンティテクト・プローブＰＣＲキット（同じくキアゲン社より）と一緒に用いられ、これはホットスター（ＨｏｔＳｔａｒ）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社）、反応緩衝液およびｄＮＴＰといったすべての必要な反応成分を含む。ホットスターＴａｑＤＮＡポリメラーゼは１５分間９５℃にて再活性化され、その後ＰＣＲが５０サイクル、下記の温度プロファイルを用いて実施された：１５秒５６℃、３０秒７６℃、３０秒９４℃。逆転写酵素反応は、ＰＣＲ反応での使用の前に、５分間９５℃にて不活性化された。ゲノムＤＮＡ減少の程度は下記の表３でＣＴ値として報告される：

結果は、インキュベートが実際の逆転写酵素段階の前に行われるＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩの使用によって、ゲノムＤＮＡが一般的に１０００倍を超えて減少することを示す。

別のバッチを用いて、ＤＮアーゼ段階もまたいわゆる１段階ＲＴ−ＰＣＲの処理に統合可能であることが示された。１段階ＲＴ−ＰＣＲ反応では、逆転写酵素段階および続くＰＣＲ段階に必要なすべての試薬を含む反応バッチ全体が混合される。反応は逆転写で開始され、および反応容器を開けることなくＰＣＲ段階へ直接続く。下記の実施例は、ＤＮアーゼ段階もまた、操作者がそれ以上干渉できないそのような連続的な方法の系へ導入されうることを示す。

実施例７
各例でＨｅＬａ細胞由来の総ＲＮＡ２０ｎｇおよび高分子ｇＤＮＡ２０ｎｇがそれぞれの１段階ＲＴ−ＰＣＲに用いられた。ＣａＣｌ₂１５０μＭが反応に添加された。各反応はクオンティテクト（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ）ＲＴ−ＰＣＲキット（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮＧｍｂＨ）（ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））を使用して実施され、このキットは逆転写酵素、ホットスター（ＨｏｔＳｔａｒ）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝液およびｄＮＴＰといったすべての必要な反応成分を含む。反応はＤＮアーゼＩありまたは無しで開始された。逆転写酵素ｃＤＮＡ由来の追加のシグナルを得ることのないように、ゲノムＤＮＡを検出するためだけの反応で使用されなかった。ＤＮアーゼＩが使用された反応バッチに、０．２５単位のＤＮアーゼＩを加えた。ゲノムＤＮＡ中に同一の配列が存在する転写物領域が標的遺伝子として検出された。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡから生じたＰＣＲ産物は同一のサイズを有し、およびしたがって同一の効率で増幅および検出されるはずである。

結果は図５に示され、および下記のように要約されうる。ゲノムＤＮＡのＣＴ値はＤＮアーゼの使用によって６サイクルより大きく増加し、これは１００倍のｇＤＮＡ分解に相当し、一方でｃＤＮＡのＣＴ値は有意でない変化しかしない。このことは、ｇＤＮＡ除去段階もまた１段階ＲＴ−ＰＣＲにおいて使用可能でありおよびゲノムＤＮＡの有意な分解に繋がり、一方でｃＤＮＡは未変化のままであり、または有意でない分解しかされないという結論に繋がる。ＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の使用に際してのＣＴ値の上昇は、本質的に、ＲＮＡ試料に含まれるゲノムＤＮＡの減少に帰することができる。

実施例１に記載の電気泳動の結果を示すアガロースゲルの写真。さまざまなヌクレアーゼによる逆転写酵素反応の可能な作用に関する実験の結果が示される棒グラフ（実施例２）。実施例３に記載の電気泳動の結果を示すアガロースゲルの写真。表１に列記する結果を図示する図。実施例７に記載の、ｃＤＮＡおよびｇＤＮＡシグナルに対する膵臓ＤＮアーゼの作用を示す棒グラフ。

Claims

二本鎖ＤＮＡの分解が制限エンドヌクレアーゼを用いて実施されることにより、逆転写および存在する二本鎖ＤＮＡの分解が同一の反応容器内で同時におよび同一の温度にて実施される点で特徴づけられる逆転写方法であって、
逆転写のためのポリメラーゼ反応の鋳型としてＲＮＡが用いられ、逆転写反応が、ＲＮアーゼＨ活性を有する、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって実施される、方法。
ＲＮＡのタグ化、伸長および／または修飾をさらに含む、請求項１に記載の方法。
ＲＮＡが触媒として作用する点で特徴づけられる、請求項１または２項に記載の方法。
反応がｐＨ値６ないし１０にて実施される点で特徴づけられる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
反応がｐＨ値７ないし９にて実施される、請求項４に記載の方法。
反応バッチが２価陽イオンを含む点で特徴づけられる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
２価陽イオンがＭｇ2+、Ｍｎ²⁺および／またはＣａ²⁺である点で特徴づけられる、請求項６に記載の方法。
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＡｌｕＩ及びＨａｅＩＩＩのうちの少なくとも一つである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
キットが少なくとも一つのＲＮアーゼＨ活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、および反応緩衝液を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット。