JP5066314B2 - 免疫応答におけるｂ細胞および免疫グロブリンの刺激および阻害における、ｂａｆｆ、関連するブロック剤およびそれらの使用 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｂ細胞および免疫グロブリンの発現を刺激するか、または阻害するための、腫瘍壊死ファミリーに属する、リガンド、ＢＡＦＦ、β細胞活性化因子およびそのブッロク剤の使用に関する。このタンパク質およびそのレセプターは、抗癌適用および／または免疫調節適用ならびに免疫抑制障害（例えば、ＨＩＶ）の処置への使用を有する。詳細には、このリガンドおよびそのブロック剤は、高血圧およびその関連障害の発達において役割を果たし得る。さらに、このリガンドの遺伝子でトランスフェクトされた細胞は、腫瘍、自己免疫疾患またはＢ細胞が関与する遺伝的遺伝子障害を処置するための遺伝子治療において使用され得る。ブロック剤（例えば、リガンドまたはそのレセプターに特異的な組換え改変体または抗体）は、免疫調節適用も有し得る。免疫抑制疾患のためのＢ細胞刺激物質としてのＢＡＦＦの使用（例えば、器官移植（すなわち骨髄移植）を受ける患者ならびにＢ細胞の産生を刺激する癌処置から回復する患者のための使用を含む）が、企図される。Ｂ細胞レベルを通常に近いレベルまで高める（ｂｏａｓｔ）または戻すためのアジュバントおよび／または同時刺激物質としての、ＢＡＦＦの使用もまた企図される。
【０００２】
（発明の背景）
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連サイトカインは、宿主の防衛調節および免疫調節の媒体である。このファミリーのメンバーは、膜に固定された形態で存在し、細胞間接触により局所的に作用し、またはより遠くの標的まで拡散し得る分泌タンパク質として作用する。対応するレセプターのファミリーは、これらの分子の存在のシグナルを出し、標的組織において細胞死または細胞の増殖および分化の開始を導く。現在、リガンドおよびレセプターのＴＮＦファミリーは、少なくとも１１の認識されたレセプター−リガンド対を有し、以下を含む：ＴＮＦ：ＴＮＦ−Ｒ；ＬＴ−α：ＴＮＦ−Ｒ；ＬＴ−α／β：ＬＴ−β−Ｒ；ＦａｓＬ：Ｆａｓ；ＣＤ４０Ｌ：ＣＤ４０；ＣＤ３０Ｌ：ＣＤ３０；ＣＤ２７Ｌ：ＣＤ２７；ＯＸ４０Ｌ：ＯＸ４０および４−１ＢＢＬ：４−１ＢＢ。これらのリガンドをコードするＤＮＡ配列は、最も関連した場合においてさえわずか約２５％〜約３０％の同一性を有するが、アミノ酸関連性は、約５０％である。
【０００３】
このファミリーのサイトカインレセプターの明確な特徴は、２つの別々なＴＮＦレセプターの分子クローニングにより最初に明らかにされた、システイン富化細胞外ドメインにおいて見出された。このファミリーの遺伝子は、細胞機能の活性化に関与する細胞外リガンド結合ドメイン、単一膜スパン（ｓｐａｎｎｉｎｇ）領域および細胞質領域を有する、Ｉ型膜貫通タンパク質に特徴的な糖タンパク質をコードする。システイン富化リガンド結合領域は、隙間無く密着したジスルフィド結合コアドメインを示し、これは、特定のファミリーメンバーに依存して、何度も反復される。大部分のレセプターは、４つのドメインを有するが、わずかに３つ、または６つものドメインを有するレセプターも存在し得る。
【０００４】
ＴＮＦファミリーのリガンドのタンパク質は、通常短い親水性アミノ酸の短いＮ末端範囲により特徴付けられ、しばしば膜透過停止配列として作用すると考えられるいくつかのリジン残基またはアルギニン残基を含む。次に、長さが可変の膜貫通領域および細胞外領域が続き、これにより、Ｃ末端レセプター結合ドメインが膜から離される。この領域は、「軸（ｓｔａｌｋ）」といわれることがある。Ｃ末端結合領域は、タンパク質の大部分を含み、そしてしばしば（常ではない）、グリコシル化部位を含む。これらの遺伝子は、Ｉ型膜タンパク質に特徴的な典型的シグナル配列が欠けており、ＩＩ型膜タンパク質は、細胞の外側に存在するＣ末端を有し、そして短いＮ末端ドメインは、細胞質内に存在する。いくつかの場合（例えば、ＴＮＦおよびＬＴ−α）軸領域における開裂が、タンパク質プロセシングの初期に起こり得、次いでリガンドは、主に分泌形態で見出される。しかし、大部分のリガンドは、膜形態で存在し、局在化シグナル伝達を媒介する。
【０００５】
これらのリガンドの構造は、ＴＮＦ、ＬＴ−α、およびＣＤ４０Ｌの結晶学的分析により明確にされている。ＴＮＦおよびリンホトキシン−α（ＬＴ−α）は、両方とも、「ゼリーロール」またはギリシアの鍵（Ｇｒｅｅｋ ｋｅｙ）のトポロジーで、２つの逆平行βプリーツシートのサンドイッチの構造である。Ｃα残基とβ残基との間の根平均２乗偏差は、０．６１Ｃであり、それらの分子トポロジーにおいて高度な類似性を示唆する。ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦ、およびＬＴ−αの分子研究から明らかになる構造的特徴は、オリゴマー複合体に集合する傾向である。多価リガンドを形成する隣接するサブユニットの間の接合点におけるレセプター結合部位の形成は、オリゴマー構造に固有である。ＴＮＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＬＴ−αの４次構造は、それらの結晶構造の分析により、トリマーとして存在することが示されてきた。異なるリガンドの間に保存されるアミノ酸の多くは、骨格βシートの範囲内にある。これらの骨格配列の部分は、種々のファミリーメンバーにわたって保存されるので、基本のサンドイッチ構造は、おそらくこれらの分子全てにおいて保存されている。この４次構造はまた、サブユニットのコンホメーションが同様なままでありそうなので、維持され得る。
【０００６】
ＴＮＦファミリーメンバーは、免疫系において細胞の生存および分化の両方を制御するマスタースイッチとして最も良く記述され得る。他のＴＮＦファミリーの主に膜固定メンバーと対照的に、ＴＮＦおよびＬＴαのみが、分泌サイトカインとして現在認識される。ＴＮＦの膜形態は、良く特徴付けられており、そして独特の生物学的役割を有するようであるが、分泌ＴＮＦは、誘因事象の部位からより遠い細胞に対する、一般的な警報シグナル伝達として機能する。従って、ＴＮＦ分泌は、脈管構造の内層（ｌｉｎｉｎｇ）および細胞の炎症状態における、よく説明されている変化を導く事象を増幅し得る。対照的に、このファミリーの膜結合メンバーは、ＴＮＦ型レセプターを介して、直接接触している細胞に対してのみシグナルを送る。例えばＴ細胞は、ＣＤ４０媒介「ヘルプ」を、同種ＴＣＲ相互作用を介して、直接接触にもたらされたそれらのＢ細胞に対してのみ与える。細胞死を誘発する能力における、同様の細胞−細胞接触制限は、良く研究されているＦａｓ系に適用する。
【０００７】
細胞死を誘発する能力に基づいて、ＴＮＦリガンドを３つのグループに分離し得ること考えられる。第１に、ＴＮＦ、ＦａｓリガンドおよびＴＲＡＩＬは、効率的に多くの系統において細胞死を誘発し、そしてそれらのレセプターは主に、おそらく有効な標準的死（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｄｅａｔｈ）ドメインを有する。おそらくＤＲ−３に対するリガンド（ＴＲＡＭＰ／ＷＳＬ−１）はまた、この部類に入る。次に、わずかな細胞型に限られる、より弱い死シグナルを誘発するリガンドが存在し、ＴＷＥＡＫ、ＣＤ３０リガンドおよびＬＴａｌｂ２は、このクラスの例である。このグループが、標準死ドメインの非存在下で、どのように細胞死を誘発し得るかは、興味深い問題であり、そして別々のより弱い細胞死シグナル伝達機構が存在することを示唆する。最後に、効率的に死シグナルを伝達し得ないメンバーが存在する。おそらく、全てのグループは、結果的に細胞分化を誘導するいくつかの細胞型（例えば、ＣＤ４０）に対して抗増殖効果を有し得る。Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、（１９９４）。
【０００８】
ＴＮＦファミリーは、近年劇的に、免疫系の調節を含む少なくとも１１の異なるシグナル伝達経路を包含するようになった。ＴＷＥＡＫおよびＴＲＡＩＬの広範な発現パターンは、このファミリーに包含されない、さらにより機能的な種類が存在することを示す。この局面は、ラウス肉腫ウイルスおよび単純疱疹ウイルスの複製する能力に影響を与える２つのレセプターの発見、ならびにＴＮＦが、抗ウイルス活性を有し、そしてポックスウイルスが、デコイＴＮＦレセプターをコードするという歴史的な観察において、近年特に強調されてきた。Ｂｒｏｊａｔｓｃｈら、（１９９６）；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、（１９９６）；Ｓｍｉｔｈら、（１９９４），７６ Ｃｅｌｌ ９５９−９６２；Ｖａｓｓａｌｌｉら、（１９９２），１０ ｉｍｍｕｎｏｌ．４１１−４５２。
【０００９】
ＴＮＦは、敗血症性ショックおよび悪液質の媒介物であり、そして造血細胞発生の調節に関与する。細菌性感染、ウイルス感染および寄生生物感染に対する炎症および防御の媒介物として主要な役割を果たし、ならびに抗腫瘍活性を有することが、明かである。ＴＮＦはまた、種々の自己免疫疾患に関与する。ＴＮＦは、いくつかの型の細胞（マクロファージ、線維芽細胞、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞を含む）により産生され得る。ＴＮＦは、２つの異なるレセプターに結合し、各々特異的細胞内シグナル伝達分子を介して作用し、従ってＴＮＦの異なる効果を生じる。ＴＮＦは、膜結合形態または可溶性分泌サイトカインのいずれかとして存在し得る。
【００１０】
ＬＴ−αは、多くの活性をＴＮＦと共有する（すなわち、ＴＮＦレセプターに結合する）が、ＴＮＦと異なり、主に活性化Ｔ細胞により、そしていくつかのβリンパ芽球性腫瘍により分泌されると考えられる。ＬＴ−αおよびＬＴ−βのヘテロマー複合体は、ＬＴ−βレセプターに結合する膜結合複合体である。ＬＴ−βの遺伝子破壊は、脾臓におけるＴ細胞およびＢ細胞の解体ならびにリンパ節の欠如を生じるので、ＬＴ系（ＬＴおよびＬＴ−Ｒ）は、末梢リンパ器官の発達に関与すると思われる。ＬＴ−β系はまた、いくつかの腺癌細胞株の細胞死に関与する。
【００１１】
Ｆａｓ−Ｌ（ＴＮＦファミリーの別のメンバー）は、主に活性化Ｔ細胞上で発現される。これは、プログラム細胞死またはアポトーシスとして公知の機構によりそのレセプターを保有する細胞（腫瘍細胞およびＨＩＶ感染細胞を含む）の死を含む。さらに、ＦａｓまたはＦａｓ−Ｌのいずれかにおける欠乏は、リンパ増殖障害を生じ、これは、免疫応答の調節におけるＦａｓ系の役割を確認する。このＦａｓ系はまた、肝炎慢性感染から生じる肝臓損傷、およびＨＩＶ感染患者における自己免疫に関与する。Ｆａｓ系はまた、ＨＩＶ患者におけるＴ細胞破壊に関与する。ＴＲＡＩＬ（このファミリーの別のメンバー）はまた、別種起源の広範に種々の形質転換細胞株の死に関与するようである。
【００１２】
ＣＤ４０−Ｌ（ＴＮＦファミリーの別のメンバー）は、Ｔ細胞上で発現され、そしてＣＤ４０保有Ｂ細胞の調節を誘導する。さらに、ＣＤ４０−Ｌ遺伝子における改変は、Ｘ−連鎖過剰ＩｇＭ症候群として公知の疾患を生じる。ＣＤ４０システムはまた、異なる自己免疫疾患に関与し、ＣＤ４０−Ｌは、抗ウイルス特性を有することが公知である。ＣＤ４０系は、アポトーシスＢ細胞の救出に関与し、非免疫細胞においては、アポトーシスを誘導する。ＴＮＦファミリーの多くのさらなるリンパ球メンバーはまた、同時刺激に関与する。
【００１３】
一般に、ＴＮＦファミリーのメンバーは、免疫系の制御および急性の宿主防御系の活性化における基礎的な調節の役割を有する。治療的利益のためのＴＮＦファミリーのメンバーの操作における現在の進歩を仮定すると、このファミリーのメンバーは、疾患を制御するための独特の手段を提供するようである。このファミリーのいくつかのリガンド（例えば、ＬＴ、ＴＮＦ、ＦａｓリガンドおよびＴＲＡＩＬ）は、多くの形質転換された細胞アポトーシス死を直接誘導し得る。Ｎａｇａｔａ（１９９７）８８ Ｃｅｌｌ ３５５−３６５。ＦａｓそしてあるいはＴＮＦおよびＣＤ３０のレセプター活性化は、免疫調節機能の役割を果たし得る非形質転換リンパ球における細胞死を誘導し得る。Ａｍａｋａｗａら、（１９９６）８４ Ｃｅｌｌ ５５１−５６２；Ｎａｇａｔａ（１９９７）８８ Ｃｅｌｌ ３５５−３６５；Ｓｙｔｗｕら、（１９９６）；Ｚｈｅｎｇら、（１９９５）３７７ Ｎａｔｕｒｅ ３４８−３５１。一般に、ＴＮＦレセプターの細胞質側に存在する死ドメインの凝集に続いて、死が誘発される。この死ドメインは、カスパーゼカスケードの活性化を生じる種々のシグナル伝達成分の集合を組織化する。Ｎａｇａｔａ（１９９７）８８ Ｃｅｌｌ ３５５−３６５。いくつかのレセプターは、標準的死ドメインを欠いて（例えば、ＬＴｂレセプターおよびＣＤ３０（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、（１９９６）；Ｌｅｅら、（１９９６））、たとえより弱くても、なお細胞死を誘導し得る。これらのレセプターは、主に細胞分化を誘導するように機能し、そして死はいくつかの形質転換された細胞株においては異常な結果であるようであるが、ＣＤ３０ヌルマウスでの研究は、胸腺におけるネガティブ選択において死の役割を示唆するので、この状況は不明である。Ａｍａｋａｗａら、（１９９６）８４ Ｃｅｌｌ ５５１−５６２。逆に、ＣＤ４０のような他の経路によるシグナル伝達が、細胞の生存を維持するために必要とされる。従って、ＴＮＦファミリーのメンバーであって、それにより疾患の制御および免疫系の操作のさらなる手段を提供するさらなる分子を、同定し、特徴付ける必要がある。
【００１４】
本明細書で、本発明者らは、ＴＮＦサイトカインファミリーの新規なリガンドの機能的特性を特徴付ける。ＢＡＦＦ（ＴＮＦファミリーに属するＢ細胞活性化因子）と称される新しいリガンドは、Ｂ細胞同時刺激の目的のためにＴ細胞および樹状細胞により発現されると考えられ、従ってＢ細胞機能の制御において重要な役割を果たし得る。さらに、本発明者らは、肝臓特異的プロモーターの制御下で、ＢＡＦＦ過剰発現トランスジェニックマウスを作製した。これらのマウスは過剰な数の成熟Ｂ細胞、自発的な胚中心反応、分泌自己抗体を有し、そして２次リンパ器官における多くの形質細胞数および腎臓におけるＩｇ沈着を有する。
【００１５】
（発明の要旨）
従って、本発明は、Ｂ細胞の増殖および免疫グロブリンの分泌を刺激するかまたは阻害する、ＢＡＦＦリガンド、ブロック剤およびリガンドの抗体に関する。以下でより詳細に考察されるように、本願発明は、数多くの疾患および障害における治療的適用のために使用され得、ならびに、免疫系およびそのプロセスに関する情報を得、そして操作する。さらに、本発明は、Ｂ細胞の増殖および免疫グロブリンの分泌を、刺激または阻害する方法として使用され得る。本発明により記載されるように、ＢＡＦＦ関連分子はまた、自己免疫疾患、Ｂ細胞増殖および成熟に関する障害、ＢＡＦＦリガンド調節ならびに炎症の処置において、有用性を有し得る。本発明は、高血圧ならびに高血圧に関連する腎臓および心臓血管の組織障害の調節または予防に関与し得る。
【００１６】
本発明のさらなる特徴および利点は、以下の説明において記載され、そして部分的に説明から明らかになるか、または本発明の実施により知られ得る。本発明の目的および他の利点は、記載された説明およびその特許請求の範囲、ならびに添付の図面において特に指摘される方法により現実化され、そして達成される。
【００１７】
従って、これらの利点および他の利点を達成するために、そして本発明の目的に従って、本明細書中に具体化されそして広範に記載されるように、本発明は、種々のＢＡＦＦリガンドおよび関連する分子の投与により、Ｂ細胞増殖および免疫グロブリンの分泌をもたらす方法を包含する。
【００１８】
本発明はまた、ＢＡＦＦリガンドまたはポリぺプチドの活性フラグメントの使用によるＢ細胞増殖の刺激を企図する。このポリぺプチドは、単独またはＣＤ４０リガンドもしくは抗マウス抗体とともに使用され得る。
【００１９】
他の実施形態では、本発明は、ＢＡＦＦリガンドまたはＢＡＦＦの活性フラグメントの使用による樹状細胞誘導Ｂ細胞増殖および成熟の刺激の方法に関する。また、このポリぺプチドは、単独でか、またはＣＤ４０リガンドもしくは抗μ抗体と共に使用され得る。
【００２０】
他の実施形態では、ＢＡＦＦのブロック剤およびＢＡＦＦレセプターを使用して、Ｂ細胞増殖および免疫グロブリン分泌を阻害した。これらの薬剤は、無効性組換えＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ特異的抗体、ＢＡＦＦレセプター特異的抗体、または抗ＢＡＦＦリガンド分子であり得る。
【００２１】
なお他の実施形態では、本発明は、高血圧、高血圧関連疾患、免疫障害、自己免疫疾患、炎症およびＢ細胞リンパ増殖障害を処置するための、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ関連分子、およびＢＡＦＦブロック剤の使用に関する。
【００２２】
本発明は、Ｂ細胞の増殖および／または成熟ならびに免疫グロブリンの分泌をもたらすことによって、免疫応答をもたらす際の、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとしての、ＢＡＦＦおよびＢＡＦＦ関連分子の使用を含む。
【００２３】
本発明は、他の実施形態において、ＢＡＦＦ媒介薬学的事象を直接誘発するために使用され得るＢＡＦＦを含む可溶性構築物に関する。このような事象は、癌、腫瘍の処置または免疫学的疾患を処置するための免疫系の操作において、有用な治療的利益を有し得る。
【００２４】
さらに、他の実施形態では、本願発明は、ＢＡＦＦリガンドに対して指向される抗体に関し、この抗体は、例えば、癌の処置、および免疫学的疾患を処置するための免疫系の操作のために使用され得る。
【００２５】
なお他の実施形態では、本発明は、ＢＡＦＦについての遺伝子を使用する遺伝子治療の方法に関する。
【００２６】
本発明の薬学的調製物は、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、充填剤またはほかの薬学的組成物を含み得、そして当該分野で公知の任意の多数の形態または経路で投与され得る。
【００２７】
上記の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的および説明的であり、そして特許請求の範囲の発明のさらなる説明を提供することを意図されることが理解されるべきである。
【００２８】
添付の図面は、本発明のさらなる理解を提供するために包含され、そして援用され、そして本明細書の一部を構成して、本発明のいくつかの実施形態を例示し、そして説明と共に本発明の本質を説明するのに役立つ。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
ここで、本発明の好ましい実施形態についての詳細な参照がなされる。本発明は、Ｂ細胞の増殖および成熟、ならびに免疫グロブリンの分泌をもたらすための、ＢＡＦＦ分子およびＢＡＦＦ関連分子の使用に関する。本発明は、免疫関連障害により必要とされるような免疫系の応答をもたらすための、ＢＡＦＦ分子およびＢＡＦＦ関連分子の使用に関する。さらに、本発明は、遺伝子治療方法を介してＢＡＦＦまたはＢＡＦＦ関連遺伝子の使用による、癌および免疫障害の処置を包含する。
【００３０】
本発明の配列で形質転換された宿主によって産生されるＢＡＦＦリガンドおよびそのホモログ、ならびに当該分野で公知のプロセスによって精製されたか、または既知のアミノ酸配列から産生されるネイティブＢＡＦＦは、抗癌、抗腫瘍および免疫調節性の適用についての種々の方法において有用である。これらはまた、他の疾患についての治療および方法においても有用である。
【００３１】
本発明の別の局面は、ＢＡＦＦ−リガンドをコードする単離された核酸によってコードされるポリペプチドの「アンチセンス」治療における使用に関する。本明細書中で使用される場合、「アンチセンス」治療とは、コードされたタンパク質の発現を阻害（すなわち、転写および／または翻訳の阻害によって）するために、細胞条件下で、目的のリガンドをコードする細胞のｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはそれらの誘導体の投与またはインサイチュの産生をいう。この結合は、従来の塩基対相補性によるものであり得るか、または、例えば、ＤＮＡ二重鎖への結合の場合、二重らせんの主溝における、特異的相互作用を介するものであり得る。一般に、「アンチセンス」治療とは、当該分野で一般に使用される技術の範囲をいい、そしてオリゴヌクレオチド配列への特異的結合に依存する任意の治療を含む。
【００３２】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、発現プラスミドとして誘導され得、これは、細胞内で転写される場合、Ｋａｙリガンドをコードする細胞のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なＲＮＡを産生する。あるいは、このアンチセンス構築物は、エキソビボで産生されるオリゴヌクレオチドプローブであり得る。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ耐性であり、従ってインビボで安定である、改変されたオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての使用のための例示的核酸分子は、ＤＮＡの、ホスホルアミデート、ホスホチオエート、およびメチルホスホネートアナログである（例えば、米国特許第５，１７６，９９６号；米国特許第５，２６４，５６４号；および米国特許第５，２５６，７７５号を参照のこと）。さらに、アンチセンス治療において有用なオリゴマーを構築するための一般的アプローチは、例えば、Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｋｒｏｌら、（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６；およびＳｔｅｉｎら、（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２６５９−２６６８（詳細には、本明細書中に参考として援用される）によって総説されてきた。
【００３３】
（Ｃ．ＢＡＦＦリガンド）
上記で議論されたような、本発明のＢＡＦＦリガンドは、ＴＮＦファミリーのメンバーであり、そしてＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９０３７（ＷＯ９９／１２９６４）に記載され、そしてこれは本明細書中にその全体が援用される。タンパク質、フラグメントまたはそのホモログは、広範な治療的および診断的な適用を有する。
【００３４】
ＢＡＦＦリガンドは、主に脾臓および末梢血リンパ球中に存在し、免疫系における、調節の役割を強く示す。特許請求されたＢＡＦＦリガンド配列とヒトＴＮＦファミリーの他のメンバーとの比較は、重要な構造的類似性を明らかにする。すべてのタンパク質は、細胞外ドメインにおいて、配列保存のいくつかの領域を共有する。
【００３５】
特許請求されたリガンドの正確な三次元構造は公知でないが、ＴＮＦファミリーのメンバーのように、ファミリーの他のメンバーと、特定の構造的特性を共有し得ることが予想される。
【００３６】
本発明の新規のポリペプチドは、レセプターと特異的に相互作用し、このレセプターは未だ同定されていない。しかし、本明細書中で開示されるペプチドおよび方法は、ＢＡＦＦリガンドまたはそのフラグメントに特異的に相互作用するレセプターの同定を可能にする。
【００３７】
特定の実施形態における特許請求された発明は、それらのレセプターと結合する能力を有するＢＡＦＦリガンド由来のペプチドを使用する方法を含む。ＢＡＦＦリガンドのフラグメントは、いくつかの方法において（例えば、組換え的に、ＰＣＲによって、タンパク質分解性消化または化学合成によって）産生され得る。ポリペプチドの内部フラグメントまたは末端フラグメントは、ポリペプチドをコードする核酸の片方の末端または両末端から、１つ以上のヌクレオチドを除去することによって産生され得る。変異誘発されたＤＮＡの発現は、ポリペプチドフラグメントを産生する。
【００３８】
ポリペプチドフラグメントはまた、従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−ｍｏｃまたはｔ−ｂｏｃ化学のような、当該分野で公知の技術を使用して化学的に合成され得る。例えば、本発明のペプチドおよびＤＮＡ配列は、フラグメントの重複なく、所望の長さのフラグメントに恣意的に分割され得るか、または所望の長さの重複するフラグメントに分割される。このような方法は、以下により詳細に記載される。
【００３９】
（可溶性形態のＢＡＦＦリガンドの産生）
可溶性形態のＢＡＦＦリガンドは、しばしば効率的にシグナル伝達し、そのため、現在では天然の膜形態を模倣する薬物として投与され得る。本明細書中で特許請求されたＢＡＦＦリガンドは、可溶性サイトカインとして元々で分泌され得るが、しかし、そうでない場合、分泌を強制するために遺伝子を再操作し得ることが可能である。ＢＡＦＦリガンドの可溶性分泌形態を作製するために、ＤＮＡレベルで、Ｎ末端膜貫通領域および軸領域（ｓｔａｌｋ ｒｅｇｉｏｎ）のいくつかの部分を除去し、そしてそれらを、選択された発現系において効率的なタンパク質分解性切断を可能にするＩ型リーダー配列あるいはＩＩ型リーダー配列で置換する。当業者は、レセプター結合特性および分泌効率の両方を最適化するために、分泌発現構築物に保持される軸領域の量を変化し得る。例えば、可能な全ての軸の長さ（すなわち、Ｎ末端切断）を含むこの構築物は、アミノ酸８１〜１３９で開始するタンパク質が生じるように調製され得る。最適な長さの軸配列は、この型の分析から生じる。
【００４０】
（Ｅ．ＢＡＦＦリガンドに反応性の抗体の産生）
本発明はまた、特許請求されたＢＡＦＦリガンドまたはそのレセプターに特異的に反応性の抗体を含む。抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体は、標準的なプロトコルによって作製され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照のこと）。マウス、ハムスターまたはウサギのような哺乳動物は、ペプチドの免疫原性形態で免疫され得る。タンパク質またはペプチドに免疫原性を与えるための技術は、キャリアとの結合、または当該分野で周知の他の技術を含む。
【００４１】
ＢＡＦＦリガンドまたはそのレセプターの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与され得る。免疫化の進行は、血漿または血清における抗体の力価を検出することによってモニターされ得る。標準的ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイは、抗体のレベルを評価するための抗原としてその免疫原を用いて使用され得る。
【００４２】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＢＡＦＦリガンドまたはそのレセプターの抗原決定基（例えば、配列番号２のポリペプチドの抗原決定基であり、この配列はＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９０３７（ＷＯ９９／１２９６４）において記載され、これはその全体が本明細書中で援用される）、あるいは密接に関連するヒトまたは非ヒト哺乳動物のホモログ（例えば、７０、８０または９０パーセントの相同性であり、より好ましくは少なくとも９５パーセントの相同性である）に対して免疫特異的である。本発明のなおさらなる好ましい実施形態において、抗ＢＡＦＦリガンド抗体または抗ＢＡＦＦリガンドレセプター抗体は、例えば、配列番号２または６（これは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９０３７（ＷＯ９９／１２９６４）に記載の配列であり、その全体が本明細書中で援用される）に対して８０パーセント未満相同なタンパク質；好ましくは配列番号２（これは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９０３７（ＷＯ９９／１２９６４）に記載の配列であり、その全体が本明細書中で援用される）に対して９０パーセント未満相同なタンパク質；そして最も好ましくは配列番号２（これは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９０３７（ＷＯ９９／１２９６４）に記載の配列であり、その全体が本明細書中で援用される）に対して９５パーセント未満相同なタンパク質と、実質的に交差反応（すなわち、特異的に反応）しない。「実質的に交差反応しない」ことによって、抗体が、配列番号２（これは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９０３７（ＷＯ９９／１２９６４）に記載の配列であり、その全体が本明細書中で援用される）のタンパク質に対して、１０パーセント未満、より好ましくは５パーセント未満、そしてなおより好ましくは１パーセント未満の結合親和性である、非相同タンパク質に対する結合親和性を有する抗体が意味される。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語抗体は、そのフラグメント（これはまた、ＢＡＦＦリガンドに、特異的反応性である）、またはそのレセプターを含むことが意図される。抗体は、従来の技術を使用してフラグメント化され、そしてこのフラグメントは、抗体全体についての上記と同じ様式で、有用性に関してスクリーニングされる。例えば、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントは、抗体をペプシンで処理することによって、産生され得る。得られたＦ（ａｂ’）₂フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントを産生するようにジスルフィド架橋を減少するために処理され得る。本発明の抗体は、抗ＢＡＦＦリガンド活性または抗ＢＡＦＦリガンドレセプター活性を有する、生物特異的（ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）分子およびキメラ分子を含むことがさらに意図される。従って、ＢＡＦＦリガンド、腫瘍リガンドおよびそれらのレセプターに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（Ａｂ）の両方、ならびにＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）₂のような抗体フラグメントは、リガンドおよびそのそれぞれのレセプターの作用をブロックするために使用され得る。
【００４４】
抗体の種々の形態はまた、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９（本明細書中に参考として詳細に援用される）。例えば、キメラ抗体が構築され得、そこで、動物抗体由来の抗原結合ドメインが、ヒト定常ドメインに結合される（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号（本明細書中に参考として援用される））。キメラ抗体は、ヒトの臨床処置において使用される場合、動物の抗体によって誘発される、観察される免疫原性応答を減少する。
【００４５】
さらに、ＢＡＦＦリガンドまたはそのレセプターを認識する、組換え「ヒト化抗体」が、合成され得る。ヒト化抗体は、大部分はヒトＩｇ配列を含み、特異的抗原結合を担う領域が挿入されたキメラである。動物は、所望の抗原で免疫化され、対応する抗体が単離され、そして特異的抗原結合を担う可変領域配列の部分が除去される。次いで、この動物由来の抗原結合領域は、抗原結合領域が欠失したヒト抗体遺伝子の適切な位置にクローンされる。ヒト化抗体は、ヒト抗体における異種（すなわち、種間の）配列の使用を最小化し、従って、処置された被験体における免疫応答をほとんど誘発しそうにない。
【００４６】
組換え抗体の異なるクラスの構築はまた、免疫グロブリンの異なるクラスから単離された可変ドメインおよびヒト定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含むキメラ抗体またはヒト化抗体を作製することによって達成され得る。例えば、増加した抗原結合部位結合価を有する抗体は、抗原結合部位の、ヒト：鎖定常領域を保持するベクターへのクローニングによって、組換え的に産生され得る。Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍら、（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７：１４３９−１４５０（本明細書中に参考として援用される）。
【００４７】
さらに、標準的なＤＮＡ組換え技術を使用して、抗原結合部位の近傍のアミノ酸残基を変更することによって抗原に対する組換え抗体の結合親和性を変更し得る。ヒト化抗体の抗原結合親和性は、分子モデリングに基づく変異原性によって、増加され得る。Ｑｕｅｅｎら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１００２９−３３（本明細書中に参考として援用される）。
【００４８】
（Ｆ．アナログの生成：変更されたＤＮＡおよびペプチド配列の産生）
ＢＡＦＦリガンドのアナログは、天然に存在するＢＡＦＦリガンドとは、アミノ酸配列もしくは配列を含まない方法またはその両方において異なり得る。非配列改変は、ＢＡＦＦリガンドのインビボまたはインビトロ化学誘導体化を含む。非配列改変としては、アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化またはグリコシル化における変化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
好ましいアナログは、生物学的に活性なそのＢＡＦＦリガンドフラグメントを含み、その配列は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９０３７（ＷＯ９９／１２９６４）に記載されるような配列番号２の上記配列における所定の配列とは異なり、一つ以上の保存的アミノ酸置換またはＢＡＦＦリガンドの活性を無効にしない一つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失もしくは挿入によって、その全体において本明細書中に組み込まれている。保存的置換は、代表的に、あるアミノ酸を、類似した特徴を有する別のアミノ酸と置換することを含み、例えば以下のグループ内での置換である；バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００５０】
（Ｇ．本発明の材料および方法）
抗Ｆｌａｇ Ｍ２モノクローナル抗体、ビオチン化抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体およびアガロースと結合した抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体をＳｉｇｍａより購入した。細胞培養試薬をＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＢｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。Ｆｌａｇタグ化可溶性ヒトＡＰＲＩＬ（残基Ｋ_110-Ｌ₂₅₀）を、記載されるように２９３細胞において産生した（１０、１１）。ＦＩＴＣ標識化抗ＣＤ４、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ１９抗体をＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）より購入した。ヒトＩｇＭのＦｃ₅μフラグメントに対して特異的なヤギＦ（ａｂ’）₂を、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）より購入した。二次抗体を、ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎまたはＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈのいずれかから購入し、推奨される希釈にて使用した。
【００５１】
ヒト胚性腎臓２９３Ｔ（１２）細胞および線維芽細胞株（表１）を、１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ中に維持した。ヒト胚性腎臓２９３細胞を、２％ＦＣＳを補充したＤＥＭＥ−栄養混合物Ｆ１２（１：１）中に維持した。Ｔ細胞株、Ｂ細胞株およびマクロファージ細胞株（表１）を、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ中で増殖させた。Ｍｏｌｔ−４細胞を、１０％ＦＣＳを補充したＩｓｃｏｖｅ培地中で培養した。上皮細胞株を、１０％ＦＣＳ、０．５ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ Ｎａ−Ｈｅｐｅｓおよび１ｍＭ Ｎａピルビン酸を含むＭＥＭ−α培地中で増殖させた。ＨＵＶＥＣを、２０％ＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌの上皮細胞増殖因子（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｏｔｅｃｈ、Ｄｏｔｔｉｋｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および１００μｇ／ｍｌのヘパリンナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ）を補充したＭ１９９培地中に維持した。全ての培地は、ペニシリン抗生物質およびストレプトマイシン抗生物質を含んだ。末梢性血液白血球を、健康な成人ボランティアのヘパリン処理した血液から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）勾配遠心分離法によって単離して、そしてＲＰＭ１、１０％ＦＣＳ中で培養した。
【００５２】
Ｔ細胞を、ノイラミニダーゼ処理したヒツジ赤血球を用いてロゼッティング（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）することにより、非接着性ＰＢＬから得、そしてＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離法によって非ロゼッティング細胞（ほとんど、Ｂ細胞および単球）から分離した。精製されたＴ細胞を、フィトヘマグルチニン（Ｓｉｇｍａ）（１μｇ／ｍｌ）で２４時間活性化させ、洗浄し、そしてＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２中で培養した。ＣＤ１４⁺単球を、抗ＣＤ１４抗体、ヤギ抗マウス被膜マイクロビーズおよびＭｉｎｉｍａｃｓ^TMデバイス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して磁気細胞ソーティング（ｓｏｒｔｉｎｇ）によって精製し、そしてＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ、Ｌｅｕｃｏｍａｘ（登録商標）、Ｅｓｓｅｘ Ｃｈｉｍｉｅ、Ｌｕｚｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｌｕｃｅｒｎａ Ｃｈｅｍ、Ｌｕｚｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の存在下において５日間培養し、次いでＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＴＮＦ□□（２００Ｕ／ｍｌ、Ｂｅｎｄｅｒ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いてさらに３日間培養して、ＣＤ８３⁺、樹状細胞様集団を得た。ヒトＢ細胞を＞９７％純度で、抗ＣＤ１９磁気ビーズ（Ｍ４５０、Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を記載されるように使用して、末梢血液または臍帯血から単離した。
【００５３】
（ノーザンブロット分析）
ノーザンブロット分析を、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ ＩおよびＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃７７６０−１および＃７７５９−１）を使用して、実行した。膜を、ハイブリダイゼーション溶液中（５０％ホルムアミド、２．５×デンハルト、０．２％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２×ＳＳＣ、５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ６．５、２００μｇ／ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ）で２時間、６０℃でインキュベートした。ｈＢＡＦＦのアミノ酸１３６−２８５に対応するヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡプローブを、熱変性して、そして２×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌにて、新鮮なハイブリダイゼーション溶液中に加えた。この膜を、６２℃で１６時間ハイブリダイズさせ、２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ（２５℃で３０分間）で１度洗浄し、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（６５℃で２０分間）洗浄し、−７０℃にてＸ線フィルムに曝露した。
【００５４】
（ＢＡＦＦｃＤＮＡの特徴付け）
ヒトＢＡＦＦｃＤＮＡの部分配列は、胎児の肝臓および脾臓ならびに卵巣癌ライブラリーに由来するいくつかのＥＳＴクローン（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｔ８７２９９およびＡＡ１６６６９５）に含まれた。このｃＤＮＡの５’部分を、製造業者によって推奨されるような、ヒト白血球のプールに由来する、提供されたｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして使用して、オリゴヌクレオチドＡＰ１およびＪＴ１０１３（５’−ＡＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＧＧＣ−３’）を用いる５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）増幅によって得た。生じたＰＣＲ産物を、ＰＣＲ−０ブラント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＹ Ｌｅｅｋ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）内にクローン化し、そしてＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩフラグメントとして、ＥＳＴクローンＴ８７２９９を含む、ｐＴ７Ｔ３Ｐａｃベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）内にサブクローン化した。従って、全長ｈＢＡＦＦｃＤＮＡを、ＢＡＦＦの内部ＰｓｔＩ部位を使用して５’フラグメントおよび３’フラグメントを結合することによって得た。配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１１６４５６に登録した。
【００５５】
マウスＢＡＦＦの部分６１７ｂｐ配列は、２つの重複ＥＳＴクローン（ＡＡ４２２７４９およびＡＡ２５４０４７）内に含まれた。この配列のヌクレオチド１５８〜３９１におよぶＰＣＲフラグメントを、マウス脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）をスクリーニングためのプローブとして使用した。
【００５６】
（組換えＢＡＦＦの発現）
全長ｈＢＡＦＦを、オリゴＪＴ１０６９（５’−ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＴＣＣＡＣＡ−３’）およびＪＴ６３７（５’−ＡＣＴＡＧＴＣＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＧＣ−３’）を使用して、増幅させた。ＰＣＲ産物をＰＣＲ−０ブラントにクローン化して、そしてＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてＰＣＲ−３哺乳動物発現ベクター内に再度サブクローン化した。可溶性ＢＡＦＦの短バージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）（アミノ酸Ｑ１３６−Ｌ２８５）を、オリゴＪＴ６３６（５’−ＣＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧ−３’）およびＪＴ６３７を使用して増幅した。可溶性ＢＡＦＦ（アミノ酸Ｌ８３−Ｌ２８５）の長バージョンを、内部ＰｓｔＩ部位を使用して全長ＢＡＦＦから得た。可溶性ＢＡＦＦを、ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして、改変されたＰＣＲ−３ベクターのヘマグルチニン（ｈａｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）シグナルペプチドおよびＦｌａｇ配列の後ろに再度サブクローン化し、そしてＰｓｔＩ／ＳｐｅＩフラグメントとして、Ｎ−末端Ｆｌａｇ配列（１４）を有する、改変されたｐＱＥ１６細菌発現ベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）で再度サブクローン化した。構築物を、両方の鎖について配列決定した。短い可溶性形態または全長ＢＡＦＦを発現する安定の２９３細胞株の樹立、および細菌および哺乳動物２９３細胞に由来する組換え可溶性ＢＡＦＦの発現および精製を、記載されるように実施した（１４、１５）。
【００５７】
（逆転写酵素ＰＣＲ）
Ｔ細胞、Ｂ細胞、インビトロ誘導された未熟な樹状細胞、２９３ｗｔおよび２９３−ＢＡＦＦ（全長）細胞から抽出された総ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、Ｒｅａｄｙ ｔｏ Ｇｏ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して逆転写した。ＢＡＦＦおよびβアクチンｃＤＮＡを、特定のオリゴヌクレオチド（ＢＡＦＦについて、ＪＴ１３２２ ５’−ＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＣ−３’およびＪＴ１３２３ ５’−ＣＡＡＴＴＣＡＴＣＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＧＡＣ−３’；ＩＬ−２レセプターα鎖について、ＪＴ１３６８ ５’−ＴＣＧＧＡＡＣＡＣＡＡＣＧＡＡＡＣＡＡＧＴＣ−３’およびＪＴ１３６９ ５’−ＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＧＧＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧ−３’；βアクチンについて、５’ＧＧＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＧ−３’および５’−ＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡ−３’）を使用して、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅（９４℃、５５℃および７２℃をそれぞれ１分間ずつ３０サイクルの工程）によって検出した。
【００５８】
（ゲル浸透クロマトグラフィー）
２９３Ｔ細胞を、可溶性ＢＡＦＦの短い形態を用いて一過的にトランスフェクトし、そして無血清Ｏｐｔｉｍｅｎ培地中で７時間、増殖させた。馴化上清を２０×に濃縮し、内部標準のカタラーゼおよびオボアルブミンと混合し、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００ ＨＲ１０／３０カラム上にロードした。タンパク質を、０．５ｍｌ／分にてＰＢＳ中で溶出させ、そして画分（０．２５ｍｌ）をトリクロロ酢酸で沈殿させ、そして抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体を使用してウエスタンブロッティングによって、分析した。カラムを標準タンパク質（フェリチン（４４０ｋＤａ）、カタラーゼ（２３２ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤａ）およびリボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤａ）で較正した。
【００５９】
（ＰＮＧアーゼＦ処理）
サンプルを、２０μｌの０．５％ＳＤＳ、１％２メルカプトエタノール中で３分間、９５℃にて加熱し、次いで冷却して１０％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（２μｌ）、０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５（２μｌ）およびペプチドＮグリカナーゼＦ（１２５ｕｎｉｔｓ／μｌ、１μｌまたはコントロールにおいては酵素なし）を補充した。サンプルを、ウエスタンブロット法による分析の前に３７℃で３時間インキュベートした。
【００６０】
（ＥＤＭＡＮ配列決定）
２９３Ｔ細胞を、一過的に、長い形態の可溶性ＢＡＦＦを用いてトランスフェクトし、そして無血清Ｏｐｔｉｍｅｎ培地中で７日間増殖させた。馴化上清を、２０倍に濃縮して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、これまでに記載されたようにポリビニリデンジフルオリド膜（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上にブロットし（１６）、次いで、フェニルチオヒダントインＣ１８ ２．１×２５０ｍｍカラムを装備したアナライザー（ＡＢＩ １２０Ａ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）と連結した気相シーケンサー（ＡＢＩ １２０Ａ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、配列決定した。データを、ソフトウェアＡＢＩ６１０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して分析した。
【００６１】
（抗体）
ポリクローナル抗体を、組換え可溶性ＢＡＦＦを用いて免疫化したウサギ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｓｅｒａｉｎｇ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって生成した。同じ抗原で免疫化したラットの脾臓を、ｘ６３Ａｇ８．６５３マウスミエローマ細胞と融合させ、そしてハイブリドーマを、ＢＡＦＦ特異的ＩｇＧについてスクリーニングした。これらのモノクローナル抗体の一つ（４３．９）が、ｈＢＡＦＦを特異的に認識するＩｇＧ２ａである。
【００６２】
細胞を、５０ｎｇ（または指示される量）のＦｌａｇでタグ化された短い可溶性ｈＢＡＦＦを４℃で２０分間、５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、１０％ＦＣＳ、０．０２％ＮａＮ₃）中で染色し、次に抗Ｆｌａｇ Ｍ２（１μｇ）および二次抗体によって、染色した。抗ＢＡＦＦ ｍＡｂ４３．９を４０μｇ／ｍｌにて使用した。２色ＦＡＣＳ分析のために、末梢血リンパ球を、Ｆｌａｇタグ化可溶性ＢＡＦＦ／長（２μｇ／ｍｌ）で染色し、次にビオチン化された抗−ＦｌａｇＭ２（１／４００）およびＰＥで標識されたストレプトアビジン（１／１００）によって染色し、次に、ＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ４、抗ＣＤ８または抗ＣＤ１９のいずれかによって染色した。
【００６３】
（ＰＢＬ増殖アッセイ）
末梢血白血球を、２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトμ鎖抗体（Ｓｉｇｍａ）またはコントロールＦ（ａｂ’）₂の存在下または非存在下で７２時間、９６ウェルプレート（１０％ＦＣＳを補充した１００μｌのＲＰＭＩ中で１０⁵細胞／ウェル）において、示された濃度のネイティブまたは煮沸された可溶性ＢＡＦＦ／長とともにインキュベートした。細胞を、[³Ｈ]チミジン（１μＣｉ／ウェル）を用いてさらに６時間パルスし、そして収集した。[³Ｈ]チミジンの取り込みを、液体シンチレーション計数によってモニターした。いくつかの実施形態において、組換え可溶性ＢＡＦＦを、１％パラホルムアミド中、２５℃で５分間固定された全長ＢＡＦＦ（またはコントロールとして２９３ｗｔ）で安定にトランスフェクトされた２９３細胞によって置換した。アッセイを、記載されるように実施した（１７）。さらなる実験において、ＣＤ１９⁺細胞を、磁気ビーズを用いてＰＢＬから単離し、そして残りのＣＤ１９^-細胞を、ＣＤ１９⁺細胞で再構築する前に、照射した（３０００ラド）。次いでＢＡＦＦに対する増殖アッセイを上記のように実施した。
【００６４】
（Ｂ細胞活性化アッセイ）
精製されたＢ細胞を、記載されるようにＥＬ−４培養系において活性化した（１３）。手短には、５×１０⁴個の照射されたマウスＥＬ−４胸腺腫細胞（クローンＢ５）と混合された１０⁴個のＢ細胞を、ＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）およびＰＭＡ（１ｎｇ／ｍｌ）で４８時間活性化されたヒトＴ細胞（１０⁶／ｍｌ）に由来する、５％ｖ／ｖの培養上清を含む２００μｌ培地において５〜６日間培養した。次いでＢ細胞を、抗ＣＤ１９ビーズを用いて再度単離して、さらに７日間（２００μｌ中５×１０⁴個の細胞、平底９６ウェルプレートにおける２連培養または３連培養）、培地単独または５％Ｔ細胞上清もしくは５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２（先のＧｌａｘｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｅｎｅｖａから恵与された）および各々１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４およびＩＬ−１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）を補充した培地中で、ｓＢＡＦＦの存在下または非存在下において培養した。抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体を、２μｇ／ｍｌの濃度にて添加し、そして単独では効果がなかった。培養上清中のＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡを、記載されるように、ＥＬＩＳＡアッセイによって定量した（１３）。
【００６５】
ヒトＢＡＦＦを、配列相同性によって、ＴＮＦリガンドファミリーの可能性のある新規メンバーとして同定したが、本発明者らは、改善されたプロファイル検索を使用して、公共のデータベースをスクリーニングした（１８）。２８５アミノ酸（ａａ）の完全タンパク質をコードするｃＤＮＡを、ＥＳＴクローン（３’領域をカバーする）とＰＣＲによって増幅されたフラグメント（５’領域）を結合することによって得た。シグナルペプチドの非存在は、ＢＡＦＦが、ＩＩ型膜タンパク質であり、この膜タンパク質はＴＮＦリガンドファミリーの代表的なメンバーであることを示唆した。タンパク質は、４６アミノ酸の予想細胞質ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、および２つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含む２１８アミノ酸の細胞外ドメインを有する（図１Ａ）。ＢＡＦＦの細胞外ドメインの配列は、ＡＰＲＩＬと最も高い相同性（３３％のアミノ酸同一性、４８％の相同性）を示すが、このファミリーの他のメンバー（例えば、ＴＮＦ、ＦａｓＬ、ＬＴα、ＴＲＡＩＬまたはＲＡＮＫＬ）との同一性は、２０％未満である（図１Ｂ、Ｃ）。脾臓ライブラリーから単離されたマウスＢＡＦＦｃＤＮＡクローンは、膜貫通領域と、すべてのＴＮＦリガンドメンバーにおけるレセプター結合ドメインを構成する第１のいくつかのβ鎖との間の挿入に起因する、わずかに長いタンパク質（３０９アミノ酸）をコードした（１９）。このβ鎖リッチの外部ドメインは、マウスＢＡＦＦおよびヒトＢＡＦＦとほとんど同一であり（８６％の同一性、９３％の相同性）、このことは、ＢＡＦＦ遺伝子が、進化の過程で高度に保存されてきたことを示している（図１Ａ）。
【００６６】
ＴＮＦファミリーメンバーは、膜挿入リガンドとして合成されるが、膜貫通ドメインとレセプター結合ドメインとの間のストーク（ｓｔａｌｋ）領域内の切断が、頻繁に観察される。例えば、ＴＮＦまたはＦａｓＬは、メタロプロテイナーゼによって、細胞表面から容易に切断される。２９３Ｔ細胞において組換えＢＡＦＦのいくつかの形態を産生する間、本発明者らは、レセプター結合ドメインに加えて、完全ストーク領域を含むＢＡＦＦの組換え可溶性３２ｋＤａ形態（８３〜２８５アミノ酸、ｓＢＡＦＦ／長）およびＮ末端Ｆｌａｇ−タグを、広範にプロセスして、より小さな１８ｋＤａのフラグメントにしたことに注目した（図２Ａ、Ｂ）。このフラグメントが、抗Ｆｌａｇ抗体ではなく、ＢＡＦＦの完全レセプター相互作用ドメインに対して惹起された抗体でのみ検出可能であったということから、切断は、ストーク領域内に生じた（データは示さず）。１８ｋＤａの切断形態がこの処理に対して非感受性であったのに対して、ＰＮＧアーゼＦを用いてＮ結合炭水化物の除去した際に、非プロセスｓＢＡＦＦ／長の分子量が３２ｋＤａから３０ｋＤａに減少したので、Ｎ１２４（ストーク内に位置する）だけでなく、Ｎ２４２（Ｆ−βシートの入口に位置する）もグリコシル化されることもまた、明らかにされた。この１８ｋＤａフラグメントのペプチド配列分析は、切断が、Ｒ１３３とＡ１３３との間に生じたことを確かに示した（図１Ａ）。Ｒ１３３は、ポリ塩基性領域の末端に位置し、この領域はヒト（Ｒ−Ｎ−Ｋ−Ｒ）とマウス（Ｒ−Ｎ−Ｒ−Ｒ）との間で保存されている。切断が、可溶性非天然形態のＢＡＦＦを発現させるという、単なる人為的結果ではないか否かを試験するために、膜結合全長ＢＡＦＦを、２９３Ｔ細胞（図２Ｃ）において発現させた。３２ｋＤａの完全ＢＡＦＦおよびいくつかのより大きな分子量種（おそらく、非解離性二量体および非解離性三量体に対応する）は、細胞抽出物において容易に検出され得るが、上清から回収された９５％より多くのＢＡＦＦは、プロセスされた１８ｋＤａ形態に対応した。このことは、膜結合リガンドとして合成された場合、ＢＡＦＦもまたプロセスされたことを示す。
【００６７】
プロセシング部位の２アミノ酸下流から配列が始まる、可溶性ＢＡＦＦ（Ｑ１３６−Ｌ２８５、ｓＢＡＦＦ／短）を操作した（図１Ｂ）。予期されるように、この組換え分子のＮ末端に付着したＦｌａｇ−タグが除去されず（データは示さず）、これはこの組換え分子の抗Ｆｌａｇアフィニティーカラムによる精製を可能にした。その正確な折り畳みを試験するために、精製されたｓＢＡＦＦ／短をゲルろ過によって分析し、このタンパク質は、見かけ上５５ｋＤａの分子量で溶出した（図２Ｄ）。ｓＢＡＦＦ／短を、他のＴＮＦファミリーメンバーの４次構造に一致するホモ三量体（３×２０ｋＤａ）に正確に構築する（１９）。最終的に、非プロセスｓＢＡＦＦ／長を、細菌において容易に発現させた。このことは、切断事象が真核生物細胞に特異的であったことを示している。
【００６８】
ＢＡＦＦのノーザンブロット分析は、２．５ｋｂのＢＡＦＦ ｍＲＮＡが、脾臓よびＰＢＬ内に豊富に存在することを明らかにした。胸腺、心臓、胎盤、小腸および肺は、弱い発現を示した。この限定された分布は、リンパ組織内に存在する細胞が、ＢＡＦＦの主要な供給源であったことを示唆した。ＰＣＲ分析によって、本発明者らは、ＢＡＦＦ ｍＲＮＡが、Ｂ細胞ではなく、Ｔ細胞および末梢血の単球から誘導される樹状細胞内に存在することを見出した（図３Ｂ）。未処理の場合においても、非刺激Ｔ細胞は、ＢＡＦＦ ｍＲＮＡをいくらか発現させたようであった。
【００６９】
配列タグ化部位（ＳＴＳ、ＳＨＧＣ−３６１７１）を、ヒトＢＡＦＦが含まれるデータベースにおいて見出した。この部位は、ヒト染色体１３内にマーカーＤ１３Ｓ２８６とマーカーＤ１３Ｓ１３１５との間の９ｃＭ間隔で、位置する。細胞発生マップにおいて、この間隔は、１３ｑ３２−３４に対応する。公知のＴＮＦリガンドファミリーメンバーのうち、ＲＡＮＫＬ（Ｔｒａｎｃｅ）のみが、ＢＡＦＦとはかなり離れてはいるが、この染色体（２２）に位置していた（１３ｑ１４）。
【００７０】
リガンドが、最大の生物学的効果を発揮するために、おそらく、ＢＡＦＦレセプター（ＢＡＦＦ−Ｒ）は、リンパ組織内に存在する、同じ細胞か、または隣接する細胞上のいずれかで発現される。ＦＡＣＳによって、ＢＡＦＦ−Ｒの発現を特異的に決定するための道具として組換えｓＢＡＦＦを使用して、本発明者らは、種々のＢ細胞株（例えば、バーキットリンパ腫ラージ細胞およびＢＪＡＢ）における高いレベルのレセプター発現を実際に見出した（図４Ａ、表１）。対照的に、Ｔ細胞起源、線維芽細胞起源、上皮起源および内皮起源の細胞株は、すべてネガティブであった。単球株ＴＨＰ−１に関する非常に弱い染色を観察したが、これはＦｃレセプター結合に起因し得る。従って、ＢＡＦＦ−Ｒの発現は、Ｂ細胞株に限定されるようである。試験されたこの２つのマウスＢ細胞株は、プローブとしてヒトＢＡＦＦを使用すると、ネガティブであったが、弱い結合がマウス脾細胞に対して観察された（データは示さず）。Ｂ細胞上のＢＡＦＦ−Ｒの存在を、臍帯および末梢性血液リンパ球の分析によって実証した。ＣＤ８⁺およびＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＢＡＦＦ−Ｒを欠失しているが（図４Ｂおよびデータは示さず）、大量の染色がＣＤ１９⁺Ｂ細胞上に観察された（図４Ａおよび４Ｂ）。このことは、ＢＡＦＦ−Ｒが、すべての血液のＢ細胞（ネイティブＢ細胞および記憶Ｂ細胞を含む）上に発現されたことを示す。
【００７１】
ＢＡＦＦは、血液由来のＢ細胞に結合しているので、実験を実施して、リガンドが、増殖刺激シグナルまたは阻害シグナルを送達し得るか否かを決定した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、表面ＢＡＦＦを安定に発現する固定２９３細胞とともに抗ＩｇＭ（μ）抗体を用いて、刺激した（図５Ａ）。抗−μ単独で誘導される[³Ｈ]チミジン取り込みのレベルは、制御細胞の存在によっては変更されなかったが、ＢＡＦＦをトランスフェクトした細胞の存在下においては、２倍に増加した（図５Ｂ）。ＰＢＬの用量依存性増殖はまた、ＢＡＦＦをトランスフェクトした細胞を、精製したｓＢＡＦＦによって置換した場合に得られる（図５Ｃ）。これは、ＢＡＦＦが、その活性を発揮するために膜付着を必要としないことを示す。この実験的なセットアップにおいて、ｓＣＤ４０Ｌにより誘導される増殖は、１μｇ／ｍｌを超える濃度を必要とするが、ＢＡＦＦにより媒介される場合と比べると、抗μの存在にあまり依存しなかった。精製されたＣＤ１９⁺Ｂ細胞を、照射された自己ＣＤ１９^-ＰＢＬで同時培養した場合、ＢＡＦＦによる増殖の同時刺激は、影響を受けなかった。このことは、[³Ｈ]チミジンの取り込みは、主にＢ細胞の増殖に起因しており、別の細胞型の間接的な刺激に起因しないことを実証している（データは示さず）。ＢＡＦＦに対する観察されたＢ細胞増殖応答は、全体的に抗μ抗体の存在に依存していた。これは、ＢＡＦＦが、Ｂ細胞増殖の同時刺激因子として機能したことを示している。
【００７２】
免疫グロブリン分泌に対するＢＡＦＦの可能な効果を研究するために、精製された末梢血Ｂ細胞または臍帯血Ｂ細胞を、ＰＨＡ／ＰＭＡ刺激Ｔ細胞の上清からのサイトカイン混合物の存在下でＥＬ−４ Ｔ細胞と共に同時培養することにより事前に活性化した（２３）。これらのＢ細胞を９８％の純度まで再単離し、ＢＡＦＦおよび活性化Ｔ細胞のサイトカインの存在下における二次培養の間に、サイトカイン単独と比較してＩｇ分泌の二倍の増加を生じた。非常に控えめな効果が外因性サイトカインの非存在下で生じ、そして中程度（１．５倍）の効果が組換えサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０）の存在下で観察された（図５Ｅ、図５Ｆ）。
【００７３】
ＢＡＦＦの生化学的分析はまた、ＴＮＦファミリーのメンバーの代表的なホモ三量体構造と一致する。このリガンドファミリーの中でも、ＢＡＦＦは、本発明者らが種々の腫瘍細胞の増殖を刺激するリガンドとして最近特徴付けた、ＡＰＲＩＬと最も高いレベルの配列類似性を示す（１１）。ＴＮＦおよびＬＴμ（等しく高い相同性（３３％同一性）を有する２つのファミリーのメンバーであり、そしてこれらの遺伝子は、第６染色体に関連付けされる）と異なり、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦは、同じ染色体上にクラスター化されない。ＡＰＲＩＬは、第１７染色体上に位置し（Ｊ．Ｌ．Ｂ．、未発表データ）、一方ＢＡＦＦは、ヒト第１３染色体の末端アーム（１３ｑ３４）に位置する。この遺伝子座における異常は、ｍｙｃ遺伝子に関するＩｇ遺伝子座への転座（２５）の他に、二番目に最も頻繁な欠損としてバーキットリンパ腫において特徴付けられた（２４）。分析される全てのバーキットリンパ腫細胞株でのＢＡＦＦ−Ｒの高い発現レベル（表１を参照のこと）を考慮すると、このことは、いくらかのバーキットリンパ腫が、ＢＡＦＦ発現を調節解除したかもしれず、そのようにしてオートクライン様式で増殖を刺激したという興味深い可能性を生じる。
【００７４】
免疫応答の異なる段階の間の抗原特異的Ｂリンパ球の役割は、ヘルパーＴ細胞および抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）からのシグナルおよび接触に非常に依存する（２０）。Ｂリンパ球がリンパ様組織中のＢ細胞濾胞の端でＴ細胞と相互作用する場合、Ｂリンパ球は、免疫応答間の初期にこれらのシグナルを最初に受け、これらの増殖および低親和性抗体産生細胞への分化を誘導する（１８）。同時に、いくつかの抗原特異的Ｂ細胞はまた、Ｂ細胞の濾胞へ遊走し、そして胚中心（Ｂ細胞増殖の別の部位であるが、また記憶Ｂ細胞および高親和性形質細胞の親和性成熟および生成の部位でもある）の形成に貢献する（１９）。
【００７５】
ＴＮＦスーパーファミリーの別のメンバー（ＣＤ４０Ｌ）により誘発されるシグナルは、Ｔ細胞依存性免疫応答の複数の段階で、Ｂリンパ球の機能について重要であることが示された。しかし、いくつかの研究は、ＣＤ４０Ｌ/ＣＤ４０相互作用が、接触依存性のＴ細胞によるＢ細胞の補助全てを説明するわけではないことを明確に示した。実際、ノックアウトマウスまたはＸ連鎖性過剰ＩｇＭ症候群の患者のどちらかから単離したＣＤ４０Ｌ欠損Ｔ細胞が、Ｂ細胞の増殖およびその形質細胞への分化を首尾よく誘導することが示された。ＣＤ４０Ｌに対する遮断抗体を使用した研究は、ヒト扁桃腺から単離された表面ＩｇＤ陽性Ｂ細胞のサブセットが、ＣＤ４０非依存性様式にて活性化Ｔ細胞に応答して増殖および分化することを示した。ＴＮＦファミリーの他のメンバー（例えば、膜結合ＴＮＦおよびＣＤ３０Ｌ）はまた、Ｂ細胞のＣＤ４０非依存性および表面Ｉｇ非依存性刺激に関与することが示された。ＢＡＦＦに関する本発明者らの結果と同様に、表面Ｉｇレセプターが同時に誘発される限り、ＣＤ４０欠損Ｂ細胞が、ヘルパーＴ細胞により刺激されて増殖し、そして形質細胞へと分化し得ることが示された。ＢＡＦＦならびにＣＤ３０ＬおよびＣＤ４０Ｌは、Ｔ細胞により発現されるが、その独自性は、樹状細胞による発現ならびにＢ細胞上のそのレセプターの非常に特異的な位置にあり、これは、その発現が多くの異なる細胞について記載されたＣＤ４０、ＣＤ３０およびＴＮＦレセプターと対照的である。この観察は、Ｂ細胞における、独立かつ特異的なＢＡＦＦが誘導する機能を示唆する。
【００７６】
Ｔ細胞およひ樹状細胞が誘導するＢ細胞の増殖および潜在的な成熟おけるＢＡＦＦについての役割を支持し、本発明者らは、ＢＡＦＦがＢ細胞レセプターとの架橋と同時に、従って、ＣＤ４０のシグナル伝達から独立して、血液由来Ｂ細胞の増殖を同時刺激することを見出した。さらに、前形質細胞/ＧＣ様Ｂ細胞（１４）へとインビトロで分化したＣＤ１９陽性Ｂ細胞を使用して、本発明者らは、活性化Ｔ細胞からの上清またはＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の混合物の存在下でのこれらのＢ細胞によるＩｇ分泌に対するＢＡＦＦの同時刺激の効果を観察した。興味深いことに、サイトカインの混合物と比較する場合、同時刺激の効果は、活性化Ｔ細胞の上清の存在下でより強く、ＢＡＦＦと相乗作用し得る抗体産生に関与する活性化Ｔ細胞により分泌されるさらなる可溶性因子またはさらなるＢＡＦＦ自体を示唆した。従って、ＢＡＦＦがこれらのＧＣ様Ｂ細胞の血漿への分化に能動的に寄与することが可能である。
【００７７】
ＢＡＦＦが、インビトロで、ナイーブＢ細胞ならびにＧＣ関連Ｂ細胞の両方においてシグナル伝達し得ることは明らかである。この知見が正常な免疫応答の間に変換するか否かは、適切なインビボ実験により取り扱われなければならない。
【００７８】
Ｂ細胞中でＢＡＦＦにより誘導される生物学的応答は、ＣＤ４０Ｌの生物学的応答とは区別される。なぜなら、ＣＤ４０Ｌにより誘発される増殖は抗μ同時刺激にほとんど依存しなかった（１７）（および図５Ｄ）からである。さらに、ＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞において、Ｂ細胞レセプターの作動後にアポトーシスシグナルを相殺し得（２９）、一方Ｒａｍｏｓ細胞はＢＡＦＦ−Ｒを発現するという事実（表１；Ｆ．Ｍ．およびＪ．Ｌ．Ｂ．、未発表の知見）にも関わらず、ＢＡＦＦは、抗μ媒介アポトーシスからＢ細胞株（Ｒａｍｏｓ）をレスキューし得なかった。従って、ＣＤ４０ＬおよびＢＡＦＦは、異なる機能を果たすようである。この点に関して、ＢＡＦＦが、ＣＤ４０を含む試験されたＴＮＦファミリーの１６種類の組換えレセプターのいずれとも相互作用しなかったこと（Ｐ．ＳおよびＪ．Ｔ、未発表の観察）は、注目すべきである。
【００７９】
Ｂ細胞増殖は、膜貫通ドメインを欠く組換え可溶性ＢＡＦＦで効率的に同時刺激された。この活性は、膜結合性リガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬおよびＣＤ４０Ｌ）としてのみ活性であるいくつかのＴＮＦファミリーのメンバーと対照的である。これらのリガンドの可溶形態は、これらの架橋により増強され得る乏しい生物学的活性しか有さず、これにより、膜結合性リガンドを模倣する（１５）。対照的に、抗Ｆｌａｇ抗体とＦｌａｇタグ化ｓＢＡＦＦを架橋すること、または上皮細胞の表面上に発現された膜結合性ＢＡＦＦの使用は、ＢＡＦＦのマイトジェン活性をさらには増強せず、このことは、ＴＮＦが作用するのと同様に、ＢＡＦＦが、分泌されたサイトカインとして全身的に作用し得ることを示唆した。このことは、ＢＡＦＦの柄に存在するポリ塩基配列がプロテアーゼの基質として作用したという知見と一致する。同様のポリ塩基配列はまた、ＡＰＲＩＬおよびＴＷＥＡＫの両方における対応する位置に存在し、これらの両方について、タンパク質分解性プロセシングの証拠が存在する（３０）（Ｎ．Ｈ．およびＪ．Ｔ、未発表の知見）。切断を担うプロテアーゼが決定されるべく残っているが、これは、その配列優先度が完全に異なるので、膜結合性ＴＮＦの放出を担うメタロプロテイナーゼではないようである（２１）。ＢＡＦＦ（Ｒ−Ｎ−Ｋ−Ｒ）、ＡＰＲＩＬ（Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｒ）およびＴｗｅａｋ（Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｒ）の複数塩基モチーフは、プロタンパク質コンバターゼファミリーのプロトタイプである、フューリン（Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｒ）に対する最小切断シグナル（３１）を連想させる。
【００８０】
他のように記載されない限り、本発明の実施は、当該分野技能に含まれる、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、文献に記載される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）、１９８５；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編）、１９８４；米国特許第４，６８３、１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）、１９８４；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編），１９８４；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）．Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ），１９８４；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕら編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編）、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）、１９８６；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８６を参照のこと。
【００８１】
以下の実施例は、本発明を図示するために提供され、そしてこれらは、本発明の限定として解釈されるべきではない。
【００８２】
（実施例）
以下の実験手順を、実施例１〜６において使用した。
【００８３】
（マウスＢＡＦＦ Ｔｇマウスの作製のためのＤＮＡ構築物）
ヒトｃＤＮＡ配列およびマウスｃＤＮＡ配列は、両方とも以前に記載されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９９）。全長マウスＢＡＦＦをコードするＰＣＲフラグメントを、ＲＴ−ＰＣＲにより作製した。第１鎖ｃＤＮＡを、製造者のプロトコール（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）に従う、オリゴｄＴを使用して、マウス肺ポリＡ＋（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ、Ａｌｔｏ、ＣＡ）から合成した。このＰＣＲ反応物は、１×Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌａ，ＣＡ），０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，１０％ ＤＭＳＯ，１２．５ｐＭ プライマー，５ユニットのＰｆｕ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＮｏｔ１制限部位を有する以下のプライマー：５’−ＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡ−３’および５’−ＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＡＣＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＡＡ−３’を含んだ。鋳型を９４℃１分間、５４℃２分間および７２℃３分間の３０サイクル、続いて７２℃で１０分間の伸長の間に増幅した。この配列は、ＧｅｎＢａｎｋファイルＡＦ１１９３８３のヌクレオチド２１４〜１１７１に対応する。このＰＣＲフラグメントをＮｏｔ１で消化し、次いで変形型ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にクローン化した。マウスＢＡＦＦを有するフラグメントを、ＳＶ４０ ポリＡ付加部位の配列を含ませるためにＸｂａＩで取り出した。このフラグメントをプロモーター配列を付加したｐＵＣベースのベクター中にクローン化した。このプロモーター（ヒトＡｐｏＥエンハンサーおよびＡＡＴ（α抗トリプシン）プロモーターを含む１Ｋｂの平滑末端Ｂｇ１２−Ｎｏｔ１フラグメントを含む）を、プラスミドクローン５４０Ｂ（Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｐａｒｋｅｒ Ｐｏｎｄｅｒ博士（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からの好意の提供）から精製した。ＥｃｏＲＶ／Ｂｇｌ２フラグメントを最終ベクターから精製し、そしてトランスジェニックマウスの作製に使用した。導入した結果である子孫Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（雌性）×ＤＢＡ／２Ｊ（雄性）Ｆ１（ＢＤＦ１）マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配した。マイクロインジェクションおよびトランスジェニックマウスの作製の技術は、以前に記載されている（Ｍｃｋｎｉｇｈｔｓら、１９８３）。
【００８４】
（分析方法）
血清サンプルを、リニアーな（ｌｉｎｅａｒ）１２．５％ゲルを使用して還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。製造者の指針に従い、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）製の単離キットを使用してマウス肝臓由来の総ＲＮＡを、調製し、そしてノーザンブロット分析のために処理した。ＢＡＦＦ導入遺伝子特異的ｍＲＮＡを、その導入遺伝子構築物のＳＶ４０ポリＡテールにまたがるプローブを使用して検出し、そしてＸｂａ１およびＢａｍＨ１を用いて、改変型ｐＣＥＰ４ベクターの消化により得た。このプローブは、ＢＡＦＦ導入遺伝子由来のｍＲＮＡに対応する１．８〜２Ｋｄのバンドを認識する。ＢＡＦＦ Ｔｇマウス由来のテールＤＮＡのＰＣＲ分析を、１×Ｔａｑ ポリメラーゼ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．２ｎＭのｄＮＴＰ、１０％ ＤＭＳＯおよび５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む反応物中で、１２．５ｐＭの以下のプライマー：５’−ＧＣＡＧＴＴＴＣＡＣＡＧＣＧＡＴＧＴＣＣＴ−３’および５’−ＧＴＣＴＣＣＧＴＴＧＣＧＴＧＡＡＡＴＣＴＧ−３’を使用して行った。７１９ｂｐの導入遺伝子を、９４℃にて３０秒間、５４℃にて１分間および７２℃にて１．５分間の３５サイクル、続いて７２℃で１０分間の伸長の間に増幅した。
【００８５】
マウスの尿中のタンパク質の存在を、尿分析のためのＭｕｌｔｉｓｔｉｘ １０ ＳＧ試薬ストリップ（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を使用して測定した。
【００８６】
（細胞−ダイン（ｄｙｎ）および細胞蛍光分析（ＦＡＣＳ））
ＥＤＴＡで抗凝固化された新鮮な全血の示差的なＷＢＣ計数を、Ａｂｂｏｔｔ Ｃｅｌｌ Ｄｙｎｅ ３５００装置（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いて行った。ＦＡＣＳ分析のために、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識したラット抗マウス抗体、Ｃｙ−クロム−標識したラット抗マウス抗体、およびフィコエリトリン（ＰＥ）標識したラット抗マウス抗体：抗Ｂ２２０、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４３、抗ＩｇＭ、抗ＣＤ５、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ２４、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ２１、抗ＣＤ４４、抗Ｌ−セレクチンおよびハムスター抗Ｂｃｌ−２／コントロールハムスターＩｇキットをＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。組換えＥ．ｃｏｌｉならびに哺乳動物細胞由来のヒトＦｌａｇタグ化ＢＡＦＦおよびマウスＦｌａｇタグ化ＢＡＦＦの生成は、以前に記載された（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９９）。全ての抗体を製造者の仕様書に従い使用した。ＰＢＬを以下のようにマウスの血液から精製した：マウスの血液をＥＤＴＡの入ったマイクロチューブに収集し、そしてＰＢＳで１／２に希釈した。５００μｌの希釈した血液を４ｍｌのガラス試験管中の１ｍｌのフィコール（Ｃｅｌａｒｄａｎｅ，Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）の上にアプライし、勾配遠心を２０００ｒｐｍで３０分間室温にて行い、そしてリンパ球を含む界面を収集し、そしてＦＡＣＳ染色の前にＰＢＳ中で２回洗浄した。脾臓、骨髄および腸間膜リンパ節を粉砕して、ＲＰＭＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で単一細胞懸濁液にし、そしてＦＡＣＳ緩衝液（２％のウシ胎仔血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）を補充したＰＢＳ）中で洗浄した。最初に細胞をブロック試薬（１０μｇ／ｍｌのヒトＩｇ（Ｓａｎｄｏｚ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および１０μｇ／ｍｌの抗マウスＦｃ遮断抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を補充したＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、そして蛍光色素標識抗体で染色する前に氷上で３０分間インキュベートした。全ての抗体を上記のブロック試薬を含むＦＡＣＳ緩衝液中に希釈した。サンプルを、ＦＡＣＳｃａｎ細胞蛍光測定器（Ｂｅｃｔｈｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。
【００８７】
（ＥＬＩＳＡアッセイによるマウス血清中の総マウスＩｇおよびリウマチ因子の検出）
ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｇｌａｓｓ ｗｏｒｋｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を、５０ｍＭの炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の１０μｇ／ｍｌのヤギ抗総マウスＩｇ（Ｓｏｕｔｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）の溶液を用いて一晩４℃にてコーティングした。プレートをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、そしてＰＢＳ中で１％ゼラチンで一晩ブロックした。１００μｌ／ウェルの血清段階希釈物または標準の希釈物を、３０分間３７℃にてプレートに添加した。マウスＩｇを、３０分間３７℃にて、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識ヤギ抗総マウスＩｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）の１μｇ／ｍｌの溶液を１００μｌ／ウェル使用して検出した。最終洗浄（ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎの３回）後、酵素反応を、１０％のジエタノールアミン中の１０μｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の溶液を使用して発色させた。この反応を１００μｌ ３Ｎ ＮａＯＨ／ウェルを添加することにより停止した。光学密度（Ｏ．Ｄ．）を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）からの分光光度計を使用して４０５ｎｍで測定した。標準曲線を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから購入した精製されたマウスＩｇを使用して得た。リウマチ因子（ＲＦ）の検出の場合、このプレートを、ヤギ抗マウスＩｇの代わりに正常ヤギＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ））を用いてコートし、マウスＩｇの検出を上記のように行った。ＲＦアッセイにおけるマウスアイソタイプの検出を、ＡＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３を使用して行い、ならびに標準曲線のために精製マウスＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｈｅｃｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して行った。全ての統計学的比較を分散分析により実行した。
【００８８】
（マウス血清中の循環免疫複合体（ＣＩＣ）の検出およびクリオグロブリンの沈降）
このアッセイを、以下の改変を伴って、以前に記載された（Ｊｕｎｅら、１９７９；ＳｉｎｇｈおよびＴｉｎｇｌｅ、１９８２）ように実施した：ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｇｌａｓｓ ｗｏｒｋｓ）を、５０ｍＭの炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌのヒトＣｌｑ（Ｑｕｉｄｅｌ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて４℃にて一晩コートした。このプレートをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。５０μｌ／ウェルの０．３Ｍ ＥＤＴＡを、５０μｌ／ウェルの血清の段階希釈物または既知濃度の標準の免疫複合体（ＤＡＫＯ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）製のペルオキシダーゼ−マウス抗ペルオキシダーゼ（ＰＡＰ））の溶液を加えたプレートに添加した。このプレートを３０分間３７℃にてインキュベートした。このプレートをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。この免疫複合体中のマウスＩｇを、ＥＬＩＳＡアッセイについて上記するように、１００μｌ／ウェルの、Ａｐ標識ヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）の１μｇ／ｍｌ溶液を使用して検出した。クリオグロブリンを水で１／１５に希釈したマウス血清を４℃で一晩インキュベートすることにより検出し、そして沈降物を視覚的に評価した。
【００８９】
（抗二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡアッセイおよび抗一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡアッセイ） 抗ｓｓＤＮＡをＮＵＮＣ−ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して行った。初めに、プレートを１００μｇ／ｍｌのメチル化ＢＳＡ（Ｃａｌｂｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて、次いで５０μｇ／ｍｌのグレードＩ仔ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて４℃にて一晩コートした。この仔ウシ胸腺ＤＮＡは、使用前に超音波処理により剪断され、次いでＳ１ヌクレアーゼで消化した。抗ｓｓＤＮＡアッセイのために、使用前にこのＤＮＡを１０分間ボイルし、そして氷上で冷却した。ブロッキング後、血清サンプルの段階希釈物を添加し、そして室温にて２時間インキュベートした。自己抗体をヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＰ（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出し、そしてＥＬＩＳＡアッセイについて上記に記載するように発色させた。標準曲線を既知量の抗ＤＮＡ ｍＡｂ ２０５を使用して得た。この抗ＤＮＡ ｍＡｂ ２０５は、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡの両方に特異的である（Ｄａｔｔａら、１９８７）。
【００９０】
（免疫組織化学）
脾臓およびリンパ節をＯ．Ｔ．Ｃ．包埋培地（Ｍｉｌｅｓ、Ｅｌｋｈａｒｔ、ＩＮ）中で凍結し、そして低温槽切片化のために封入した。７〜１０μｍ厚の切片を乾燥し、そしてアセトン中で固定した。全てのＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）を、Ｔｒｉｓ−緩衝化生理食塩水Ａ（ＴＢＳ−Ａ、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ｖ／ｖ）、０．２５％ ＢＳＡ）に希釈した後、室温にて、１時間加湿ボックス中でインキュベーションし、ＴＢＳ−Ｂ（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）中でリンスし、そして酵素反応を誘発する前に、メタノール中で１分間固定した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）活性およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性を、各々、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）錠剤基質キット（Ｓｉｇｍａ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して発色させた。染色した組織切片を最終的に５分間メタノール中で固定し、そしてＧｉｅｍｓａ（Ｆｌｕｋａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で対比染色した。ビオチン標識したラット抗Ｂ２２０抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ｓｙｎｄｅｃａｎ−１抗体ならびに非標識のラット抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８μ抗体および抗ＣＤ８μ抗体をＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。ビオチン標識したピーナッツ凝縮素（ＰＮＡ）をＶｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から得た。（ＨＰＲ）標識マウス抗ラットＩｇおよび（ＨＲＰ）−ストレプトアビジンをＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から、そしてＡｐ標識ストレプトアビジンをＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。Ｉｇ沈着を検出するための腎組織についての免疫組織化学の場合、パラフィン切片を用い、パラフィンを取り除き、そしてＶｅｃｔｏｒ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）からの希釈したウマ血清を使用してブロックし、その後Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ製のＨＰＲ−ヤギ抗マウスＩｇで染色した。上記のように検出を行った。
【００９１】
（実施例１：ＢＡＦＦトランスジェニック（ＢＡＦＦ Ｔｇ）創始マウスは、異常な表現型を有する）
全長マウスＢＡＦＦを、ＡＰＯ Ｅエンハンサーを伴う肝臓特異的α-１抗トリプシンプロモーターを使用して、トランスジェニックマウスにおいて発現させた。全長バージョンは、ＢＡＦＦが切断されそして全身的に作用するか、または膜結合性形態で保たれるかのどちらかであり、膜結合形態で保たれる場合に局所的な肝臓特異的な異常が観察されて、おそらく機能的な端緒を提供するという予想のもと、選択した。本発明者らは、ＢＡＦＦ導入遺伝子について陽性である１３匹の創始マウスを得た（表２）。これらのマウスのうちの４匹を若齢で屠殺した。慣用的な病理学をマウス８１１およびマウス８１６に対して行った（表２）。これらのマウスにおいて明らかな感染はなかったが；しかし心血管異常および腎臓異常が明確であり、そして重篤な高血圧症について記載される異常（Ｆｕ、１９９５）と類似していた（表２）。創始８１６のヘマトキシリンおよびエオシン（ＨおよびＥ）で染色された腎組織切片は、そのマウスにおける糸球体の形態が異常であり、一方腎組織の残りは、正常のようであったことを示した（データは示さず）。多くのＢＡＦＦトランスジェニック創始マウスは、タンパク尿を有した（表２）。マウス８１６からの脾臓凍結組織切片の免疫組織化学は、異常かつ広範なＢ細胞染色およびＴ細胞についての染色の減少を明らかにし、そしてこの観察は、その子孫において確認された（以下の図１２を参照のこと）。
【００９２】
２色のＦＡＣＳ分析を使用して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞％に対するＢ２２０陽性Ｂ細胞％の割合を計算した。この割合は、コントロールの陰性ＢＤＦ１マウスと比較した場合、ＢＡＦＦ Ｔｇ創始マウスにおいて２〜７倍高く（表２）、このことは、ＢＡＦＦ ＴｇマウスにおけるＢ細胞集団の増加を示唆した。本発明者らは、これらの創始マウスのうちの９匹を選択し、表２において下線を引くような、本発明者らのトランスジェニックマウスの異なる系統を作製した。残りのＢＡＦＦ Ｔｇ創始マウスまたはその由来する子孫は、創始９６９、７００、８１１および８１６の早い死後数ヶ月、健康障害のいずれの徴候も示さず、このことはこれらの４匹のマウスが、これらの死を引き起こした高レベルのＢＡＦＦを発現したかもしれないことを示した。トランスジェニックマウスの肝臓におけるＢＡＦＦの過剰発現を、ノーザンブロット分析により確認した（データは示さず）。組織学的に試験された全てのＢＡＦＦ−Ｔｇマウスにおいて、その肝臓は、異常を示さず、このことは、ＢＡＦＦの局所的な過剰発現は、いかなる免疫学的事象または病理学的事象をも誘導しないことを示した。マウスＢＡＦＦについてのＥＬＩＳＡアッセイは、利用可能ではないが；しかし本発明者らは、コントロールマウス由来ではなくＢＡＦＦ Ｔｇマウス由来の２％の血清が、ＢＪＡＢ細胞への哺乳動物細胞由来マウス可溶性Ｆｌａｇタグ化ＢＡＦＦの結合をブロックしたことを示した。さらに、コントロールマウス由来ではなくＢＡＦＦ Ｔｇマウス由来の５％血清が、抗μの存在下でＰＢＬ由来のヒトＢ細胞の増殖を増加した（データは示さず）。これらのデータは、相当量の可溶性ＢＡＦＦがＢＡＦＦ Ｔｇの血液中に存在することを示唆する。
【００９３】
（実施例２：ＢＡＦＦ Ｔｇマウスにおける末梢リンパ球増加症は、増加したＢ細胞数が原因である）
コントロールのネガティブ同腹子と比較した場合、トランスジェニックマウス集団が血液中でより多くのリンパ球を有することを見出し、１３０００リンパ球／□ｌ血液程度の高い値に達した（図７Ａ）。対照的に、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスおよびコントロールマウスの両方において血液□ｌあたりの顆粒球の数は、通常の範囲内のままであった（図７Ａ）。６匹の異なる創始マウスから生まれた１８匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウス由来の末梢血細胞（ＰＢＬ）の抗ＣＤ４抗体および抗Ｂ２２０抗体を用いるＦＡＣＳ分析が、増加したＢ／Ｔ比を示したので（図７Ｂおよび７Ｃ）、上昇したリンパ球レベルは、増殖したＢ細胞部分集合に起因した。同様に、この方法を用いて、ＣＤ４循環Ｔ細胞の絶対数の計算は、コントロールマウスと比較した場合、ＢＡＦＦ Ｔｇマウス中のこのＴ細胞部分集合の５０％の減少を示し、そしてこの同様の観察が、ＣＤ８ Ｔ細胞部分集合についてなされた（データは示さず）。ＢＡＦＦ ＴｇマウスのＰＢＬ由来の全てのＢ細胞を、コントロールマウス由来のＢ細胞と比較した場合、ＭＨＣクラスＩＩ発現およびＢｃｌ−２発現が増加し（それぞれ、図７Ｄおよび図７Ｅ）、ＢＡＦＦ ＴｇマウスのＰＢＬにおいていくらかのレベルのＢ細胞活性化を示した。ＢＡＦＦ Ｔｇマウスの血液中のＴ細胞は、早期活性化マーカーＣＤ６９またはＣＤ２５を発現しなかった；しかし、４０〜５６％のＣＤ４Ｔ細胞またはＣＤ８Ｔ細胞は、コントロール同腹子のわずか８％〜１２％のみに対して、ＣＤ４４^hi、Ｌ−セレクチン^lo表現型を有する活性化エフェクターＴ細胞であった（図７Ｆ）。従って、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスは、明らかにＴ細胞改変とともにＢ細胞リンパ球増加症および全Ｂ細胞活性化の徴候を示す。
【００９４】
（実施例３ 増殖したＢ細胞画分は、成熟細胞からなる）
トランスジェニックマウスにおけるＢＡＦＦの過剰発現が、骨髄における中枢Ｂ細胞画分に、そして二次リンパ器官における末梢Ｂ細胞に影響するか否かを調査するために、本発明者らは、４匹の異なる創始マウス由来の全７匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウスおよび７匹のコントロール同腹子由来の脾臓、骨髄および腸間膜リンパ節をＦＡＣＳにより試験した。成熟Ｂ細胞画分を、抗Ｂ２２０抗体および抗ＩｇＭ抗体の両方で染色することにより分析した。２匹の代表のＢＡＦＦ Ｔｇマウスおよび１匹の代表のコントロール同腹子を図８に示す。成熟Ｂ細胞画分（ＩｇＭ＋。Ｂ２２０＋）は、脾臓および腸間膜リンパ節の両方において上昇した（図８Ａ、それぞれ、上パネルおよび下パネル）。骨髄におけるＢ２２０＋／ＩｇＭ＋Ｂ細胞（図７Ａ、中パネル）画分またはプロＢ細胞（ＣＤ４３＋／Ｂ２２０＋）画分およびプレＢ細胞（ＣＤ４３−／Ｂ２２０＋）画分の分析（図８）は、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスおよびコントロール同腹子が、類似であることを示した。これらのデータは、ＢＡＦＦの過剰発現が、末梢における成熟Ｂ細胞の増殖に影響しているが、骨髄における前駆Ｂ細胞の増殖には影響していないことを示す。脾臓におけるＢ細胞部分集団のＦＡＣＳによる分析は、コントロールマウスと比較した場合、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスにおける辺縁層（ＭＺ）Ｂ細胞の上昇した割合を示した（表３）。新しく形成されたＢ細胞の画分が、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスにおいてわずかに減少するのに対して、小胞Ｂ細胞の集団は、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスおよびコントロールマウスの両方において釣り合ったままであった（表３）。この結果はまた、Ｂ２２０⁺脾臓Ｂ細胞において、抗ＣＤ３８対抗ＣＤ２４抗体および抗ＩｇＭ対抗ＩｇＤ抗体を使用して、そして先に記載された（Ｏｌｉｖｅｒら、１９９７）ようにＭＺ Ｂ細胞集団についてＣＤ３８^hi／ＣＤ２４⁺およびＩｇＭ^hi／ＩｇＤ^loのそれぞれで分析して確認した（データは示さず）。抗マウスＩｇＭ抗体を使用する免疫組織化学分析は、コントロールマウスと比較した場合、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスの脾臓におけるＩｇＭブライト（ｂｒｉｇｈｔ）ＭＺ Ｂ細胞領域の拡大を示した（データは示さず）。全てのＢＡＦＦ Ｔｇ Ｂ２２０⁺脾臓Ｂ細胞はまた、コントロールマウス由来の脾臓Ｂ細胞と比較して、より高レベルのＭＨＣクラスＩＩ（表３）およびＢｃｌ−２（データは示さず）を発現し、このことは、脾臓Ｂ細胞およびＰＢＬ由来のＢ細胞は、活性化状態であることを示す。
【００９５】
（実施例４ ＢＡＦＦ Ｔｇマウスは、それらの血清中に高レベルの全免疫グロブリン、リウマチ因子および循環免疫複合体を有する）
ＢＡＦＦ Ｔｇマウスにおける上昇したＢ細胞画分は、これらの動物の血液中の全Ｉｇのレベルをまた、上昇し得ることを示唆した。ＢＡＦＦ Ｔｇマウスおよびコントロール同腹子由来の血清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、重鎖ＩｇＧバンドおよび軽鎖ＩｇＧバンドが、コントロール血清と比較して、４匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウスのうち３匹において、少なくとも１０倍よりも多いことを示した（図９Ａ）。同様に、ＢＡＦＦ Ｔｇマウス由来の血清に対するＥＬＩＳＡ測定は、コントロールマウスのＥＬＩＳＡ測定と比較した場合、有意に高い全Ｉｇレベルを示す（図９Ｂ）。
【００９６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示される高レベルにもかかわらず、いくらかのマウス（例えば、６９７−５、８１６−８−３および８２３−２０）におけるＥＬＩＳＡ測定により示される過度の高レベルのＩｇは、血清中のリウマチ因子（ＲＦ）、またはＩｇＧのＦｃフラグメント上の抗原決定基に対する自己抗体の存在を推測することにつながる（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，１９９５）。これらの抗体は、ＥＬＩＳＡプレートを被覆するために使用したヤギ抗マウスＩｇに結合し得、そして間違って高い値を与え得る。ＥＬＩＳＡプレートを、通常の無関係のヤギＩｇで被覆して、そしてＢＡＦＦ Ｔｇ Ｉｇの通常のヤギＩｇへの結合を測定した。図９Ｃは、ほとんどのＢＡＦＦ Ｔｇマウス由来の血清が、通常のヤギＩｇと反応するＩｇを含んでいたが、これに対して、１９匹のコントロールマウスのうち２匹だけが、同様のアッセイにおいて反応性を示したことを示す。これらのＲＦは、主にＩｇＭアイソタイプ、ＩｇＡアイソタイプおよびＩｇＧ２ａアイソタイプのＲＦである（データは示さず）。
【００９７】
ＲＦの存在は、血液中の高レベルの循環免疫複合体（ＣＩＣ）およびクリオグロブリンの存在と関連し得る（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，１９９５）。ＢＡＦＦ Ｔｇマウスが、異常な血清レベルのＣＩＣを有するか否かを実証するために、Ｃｌｑベース結合アッセイを使用して、上記の分析された２１匹のＢＡＦＦ ＴｇマウスにおいてＣＩＣを検出した。５匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウスのみが、コントロールマウスと比較した場合、有意に高いレベルのＣＩＣを示したが、それにも関わらず、これらのマウスは、最も高い全Ｉｇレベルおよびリウマチ因子レベルを有する動物と一致した（図９Ｄ）。本発明者らはまた、ＢＡＦＦ Ｔｇマウス血清を水で１／１５に希釈した場合、沈殿形成を観察したが、コントロール血清では、観察されず、このことは、これらのＢＡＦＦ Ｔｇマウスにおけるクリオグロブリンの存在を示す（データは示さず）。従って、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスは、Ｂ細胞増殖に加えて、ＲＦおよびＣＩＣに関連する重篤な高グロブリン血症を示す。
【００９８】
（実施例５ 何匹かのＢＡＦＦ Ｔｇマウスは、高レベルの抗一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ自己抗体および抗二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ自己抗体を有する）
最初に、本発明者らは、本発明者らの創始マウスのうち２匹において狼瘡様疾患の腎臓異常レミニッセントを観察した（表ＩＩ）。抗ＤＮＡ自己抗体の存在はまた、ＳＬＥ患者またはＳＬＣ様（ＳＷＲ×ＮＺＢ）Ｆ１（ＳＮＦ１）マウスにおいて、記載されている（Ｄａｔｔａら、１９８７）。抗ｓｓＤＮＡ自己抗体レベルを、最も高いレベルの全血清Ｉｇを有することが先に示されたＢＡＦＦ Ｔｇマウスにおいて、検出した（図１０Ａ）。本発明者らは、５匹のコントロール同腹子と平行して、ｓｓＤＮＡに対する抗体に対して陰性の２匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウス（６９７−５および８１６−１−１）および抗ｄｓＤＮＡ抗体の存在に対して抗ｓｓＤＮＡ抗体を分泌する３匹のトランスジェニックマウス（８２０−１４、８１６−８−３および８２０−７）の血清を分析した。ＢＡＦＦ Ｔｇマウスはまた、抗ｄｓＤＮＡを分泌したが、分泌のレベルは、抗ｓｓＤＮＡ抗体の分泌のレベルと必ずしも相関していたわけではなかった。なぜなら、検出可能なレベルの抗ｓｓＤＮＡ抗体を含まないＢＡＦＦ Ｔｇマウス６９７−５由来の血清が、抗ｄｓＤＮＡの存在に対して明らかに陽性であったからである（図１０Ｂ）。従って、最も重篤な高グロブリン血症を示すＢＡＦＦ Ｔｇマウスは、病理学的レベルの抗ＤＮＡ自己抗体を分泌する。さらに、そしてこれらのマウスにおける狼瘡様問題のレミニッセントもまた示し、本発明者らは、分析した６匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウスの腎臓において、免疫グロブリン沈着を検出した（図１０Ｃ）。これらのマウスのうち３匹は、検出可能なレベルの抗ＤＮＡ抗体を分泌しなかった（データは示さず）。
【００９９】
（実施例６ ＢＡＦＦ Ｔｇマウスは、脾臓および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）の両方において増大したＢ細胞小胞、多数の胚芽中心、減少した樹状細胞数そして上昇した血漿細胞数を有する）
ＢＡＦＦ Ｔｇマウスは、大きな脾臓、ＭＮＬ（データは示さず）およびパイアー斑を有する（図１１）。免疫組織化学は、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスにおいて増大したＢ細胞小胞および減少した末梢小動脈リンパシート（ＰＡＬＳまたはＴ細胞領域）の存在を示した（図１２Ｂ）。興味深いことには、ごくわずかの胚芽中心を非免疫化コントロール同腹子において観察し（そして一般的にこのコロニーを代表する）、そしてこれらの存在は、免疫の非存在下で多数の胚芽中心を有するＢＡＦＦ Ｔｇマウス（図１２Ｄ）に対して小さかった（図１２Ｃ）。コントロールマウスのＴ細胞領域および辺縁層における樹状細胞に対する抗ＣＤ１１ｃでの染色（図１２Ｅ）は、ＢＡＦＦ Ｔｇマウス（図１２Ｆ）において、かなり減少した。Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１陽性形質細胞は、コントロール同腹子由来の脾臓においてほとんど検出可能ではなかったが（図１２Ｇ）、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスの赤色脾髄は、なおｓｙｎｄｅｃａｎ−１に対して強陽性であった（図１２Ｈ）。非常によく似た観察が、ＭＬＮについてもなされた（図１３）。ＢＡＦＦ ＴｇマウスのＭＮＬにおいて、Ｂ細胞領域は、正常の節と対照的に劇的に拡大した（図１３Ｂ）。ここでＢ細胞小胞は、代表的な副皮質のＴ細胞領域を有する被膜の下の末梢の節で容易に認識可能であった（図１３Ａ）。ＢＡＦＦ Ｔｇマウス由来のＭＬＮの髄質は、おそらく形質細胞であるｓｙｎｄｅｃａｎ−１陽性細胞で満たされた（図１３Ｈ）。結論として、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスにおける二次リンパ器官の分析は、多細胞異常および強い免疫活性を示す増殖したＢ細胞表現型と一致した。
【０１００】
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【０１０１】
【表１】

【０１０２】
【表２】

【０１０３】
【表３】

【図面の簡単な説明】
【図１】 図１（Ａ）は、ヒトＢＡＦＦおよびマウスＢＡＦＦの推定アミノ酸配列を示す。推定膜貫通ドメイン（ＴＭＤ、破線）、潜在的Ｎ連結グリコシル化部位（星印）およびヒトＢＡＦＦの天然プロセシング部位（矢印）が、示される。ｈＢＡＦＦの上の二重線は、ＢＡＦＦのプロセシングされた形態のエドマン分解により得られた配列を示す。（Ｂ）は、ＢＡＦＦの細胞外タンパク質配列と、ＴＮＦリガンドファミリーのいくつかのメンバーとの比較を示す。同一な残基および相同な残基は、黒い枠および影の付いた枠でそれぞれ表される。（Ｃ）は、ＴＮＦファミリーリガンドの系統樹を示す。
【図２】 図２は、組換えＢＡＦＦの概略的特徴付けである。（Ａ）組換えＢＡＦＦ構築物の概略的表現。Ｌｅｕ₈₃およびＧｌｎ₁₃₆で始まる可溶性組換えＢＡＦＦは、Ｎ末端Ｆｌａｇタグ、および６アミノ酸リンカーに融合されて発現される。この長い形態は、２９３Ｔ細胞において、Ａｒｇ₁₃₃およびＡｌａ₁₃₄の間（矢印）で切断され、ＢＡＦＦのプロセシングされた形態を生ずる。Ａｓｎ₁₂₄およびＡｓｎ₂₄₂は、Ｎグリコシル化コンセンサス部位に属する。Ａｓｎ₁₂₄上に存在するＮ連結グリカンは、Ｙとして示される。ＹＭＤ：膜貫通ドメイン。（Ｂ）組換えＢＡＦＦのペプチドＮグリカナーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）処理。示されるように、Ｆｌａｇタグ化ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬを含む濃縮された上清を、脱グリコシルし、そしてポリクローナル抗ＢＡＦＦ抗体または抗ＦｌａｇＭ２を使用するウエスタンブロット法により分析した。プロセシングされたＢＡＦＦを除く全てのバンドがまた、抗ＦｌａｇＭ２と反応した（データは示されていない）。（Ｃ）全長ＢＡＦＦが、プロセシングされて可溶性形態になる。２９３Ｔ細胞を、全長ＢＡＦＦで一時的にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞およびそれらの濃縮された上清を、ポリクローナル抗ＢＡＦＦ抗体を使用するウエスタンブロット法により分析した。１０倍量の細胞に対応する上清を、ゲル上にロードした。（Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００上での可溶性ＢＡＦＦのサイズ排除クロマトグラフィー。可溶性ＢＡＦＦ／短鎖を含む濃縮された上清を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム上で分画し、そして溶出された画分を抗ＦｌａｇＭ２抗体を使用するウエスタンブロット法により分析した。分子量マーカー（ｋＤａ）の移動部分が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥについて左手側上に、そしてサイズ排除クロマトグラフィーについて図の上部に示される。
【図３】 図３は、ＢＡＦＦの発現を示す。（Ａ）種々のヒト組織のノーザンブロット（１レーン当たり２μｇポリＡ⁺ＲＮＡ）を、ＢＡＦＦアンチセンスｍＲＮＡを用いて証明した。（Ｂ）ＰＨＡ活性化の種々の時点における精製された血液Ｔ細胞、Ｅ−ロゼットテスト（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）陰性血球（Ｂ細胞および単球）、インビトロ由来未熟樹状細胞、２９３細胞、および全長ＢＡＦＦを用いて滅菌トランスフェクトされた２９３細胞（２９３−ＢＡＦＦ）のＲＮＡに由来する、ＢＡＦＦ、ＩＬ−２レセプターα鎖およびアクチンの逆転写酵素増幅。コントロール増幅を、添加ｃＤＮＡの非存在下で行なった。ＩＬ−２レセプターα鎖を、Ｔ細胞活性化のマーカーとして増幅した。
【図４】 図４は、成熟Ｂ細胞に結合するＢＡＦＦを示す。（Ａ）可溶性ＢＡＦＦの、ＢＪＡＢおよびＪｕｒｋａｔ細胞株、ならびに臍帯血の精製ＣＤ１９⁺細胞への結合。細胞を、指示量（ｎｇ／５０μｌにおける）のＦｌａｇ−ＢＡＦＦで染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。（Ｂ）可溶性ＢＡＦＦのＰＢＬへの結合。ＰＢＬを、抗ＣＤ８−ＦＩＴＣまたは抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣで染色し（横軸）、そしてＦｌａｇ−ＢＡＦＦおよびＭ２−ビオチンならびにアビジン−ＰＥで染色した（縦軸）。Ｆｌａｇ−ＢＡＦＦを、コントロールにおいて省略した。
【図５】 図５は、Ｂ細胞増殖を同時刺激するＢＡＦＦを示す。（Ａ）安定にトランスフェクトされた２９３細胞におけるＢＡＦＦの表面発現。２９３−ＢＡＦＦおよび２９３野生型細胞を、抗ＢＡＦＦ ｍＡｂ４３．９で染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。（Ｂ）２９３−ＢＡＦＦ細胞によるＰＢＬの同時刺激。ＰＢＬ（１０⁵／ウェル）は、１５．０００のグルタルアルデヒド固定２９３細胞（２９３ｗｔまたは２９３−ＢＡＦＦ）と共に、抗Ｂ細胞レセプター抗体（抗−μ）の存在下または非存在下で、インキュベートした。単独の固定２９３細胞は、１００ｃｐｍ取り込んだ。（Ｃ）抗−μの存在下での可溶性ＢＡＦＦによるＰＢＬ増殖の用量依存性同時刺激。増殖を、インキュベーションの７２時間後に、［³Ｈ］−チミジン取り込みによって決定した。コントロールは、抗−μの代わりに、ＢＡＦＦ単独、熱変性ＢＡＦＦまたは無関係のアイソタイプ適合抗体で処理した細胞を含む。（Ｄ）ＰＢＬ増殖に対するｓＣＤ４０ＬおよびｓＢＡＦＦの（同時）刺激効果の比較。実験を、パネルＣの記載のように行った。（Ｅ）ＢＡＦＦは、前活性化ヒトＢ細胞のＩｇの分泌を同時刺激する。精製ＣＤ１９⁺Ｂ細胞を、ＥＬ−４Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞上清で５〜６日間同時培養することによって活性化し、次いで、再単離し、そして培地のみ（−）、または５％の活性化Ｔ細胞上清（Ｔ−ＳＵＰ）を含んで、あるいはサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０）のブレンドの存在下で、さらに７日間培養した。この柱は、１μｇ／ｍｌのＢＡＦＦを含むか、または含まない培養物についてのＩｇ濃度の平均を表す。「倍増加」に関する平均±ＳＤは、培地のみに関しては１．２３±０．１１であり、Ｔ細胞上清を使用して２．０６±０．１８（４実験）、そしてＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を使用すると１．４５±０．０６（２実験）であった。これらは、末梢血細胞（３実験）または臍帯血Ｂ細胞（１実験；Ｔ細胞上清を使用して２．３倍増加、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を使用して１．５倍増加）を使用して行った。（Ｆ）Ｔ細胞上清を含む培養物中のＢＡＦＦの効果についての用量応答曲線は、パネルＤ、３実験の平均値±ＳＤで示される。
【図６】 図６は、ＢＡＦＦが、Ｂ細胞増殖の補因子として作用することを示す。ヒトＰＢＬの増殖を、単独で（５００ｃｐｍ）、ＢＡＦＦリガンド単独の存在下で、ヤギ抗マウス（ｍｕ）単独の存在下で、そしてＢＡＦＦリガンドおよび抗−ｍｕの両方を用いて測定した。抗−ｍｕおよびＢＡＦＦの両方の組合わせは、ＢＡＦＦの濃度が増加するにつれてＰＢＬの増殖を顕著に惹起し、これは、ＢＡＦＦの補因子特性を示唆する。
【図７Ａ】 図７は、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスにおける増加したＢ細胞数を示す。
（Ａ）ＢＡＦＦ Ｔｇマウスにおける増加したリンパ球数。このグラフは、１２匹のコントロール同腹仔（左パネル）と１２匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウス（右パネル）を比較する。リンパ球数は丸で示され、そして顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球を含む）は菱形で示される。
【図７Ｂ】（Ｂ）ＢＡＦＦ Ｔｇマウス由来のＰＢＬにおけるＢ細胞の増大した比率。ＰＢＬを、ＦＡＣＳ分析のために、抗Ｂ２２０−ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ４−ＰＥの両方で染色し、そして前方側散乱（ｆｏｒｗａｒｄ ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ）を使用して生きた細胞にゲートした。ＣＤ４およびＢ２２０陽性細胞の百分率が示される。１匹のコントロールマウス（左）および２匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウス（右）が示され、そしてその結果は、各々のグループで分析される７匹の動物の代表である。
【図７Ｃ】（Ｃ）ＰＢＬにおけるＢ細胞のＴ細胞に対する比率のＦＡＣＳ分析。（Ａ）および（Ｃ）におけるコントロール動物とＢＡＦＦ Ｔｇマウスとの間の差異は、統計的に有意であった（Ｐ＜０．００１）。
【図７Ｄ】（Ｄ）ＢＡＦＦ ＴｇマウスＰＢＬ由来のＢ細胞上の増加したＭＨＣクラスＩＩ発現。
ＭＨＣクラスＩＩ発現を、ＦＡＣＳによって分析した。
【図７Ｅ】（Ｅ）ＢＡＦＦ ＴｇマウスＰＢＬ由来のＢ細胞における増加したＢｃｌ−２発現。
Ｂｃｌ−２発現を、細胞質内の染色によって測定し、そして細胞を、ＦＡＣＳによって分析した。
（Ｄ）および（Ｅ）の両方において、生きた細胞を、前方側散乱にゲートした。４匹のコントロール同腹仔（白棒）および４匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウスが示され、そして各々のグループについて分析される少なくとも１２匹の動物の代表である。ＭＦＩ：蛍光強度の平均。コントロール動物とＢＡＦＦ Ｔｇマウスの間の差異は、統計的に有意であった（Ｐ＜０．００５）。
【図７Ｆ】（Ｆ）ＢＡＦＦ ＴｇマウスにおけるエフェクターＴ細胞の増加した発現。ＰＢＬを、抗ＣＤ４−サイクローム（Ｃｙｃｈｒｏｍｅ）、抗ＣＤ４４−ＦＩＴＣおよび抗Ｌセレクチン−ＰＥで染色した。ＣＤ４⁺ゲート細胞が示される。ＣＤ４４^hi／Ｌ−セレクチン^lo細胞の百分率が示される。１匹のコントロールマウス（左）および２匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウス（右）が示され、その結果は、各々のグループで分析される８匹の動物の代表である。
【図８Ａ】 図８は、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスの脾臓中で増加するが、骨髄においては増加しないＢ細胞画分を示す。
（Ａ）脾臓（上パネル）、骨髄（中パネル）およびＭＬＮ（下パネル）における、抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣおよび抗Ｂ２２０−ＰＥの両方を使用した、成熟Ｂ細胞に対するＦＡＣＳ染色。Ｂ２２０＋／ＩｇＭ＋成熟Ｂ細胞の百分率が示される。
【図８Ｂ】（Ｂ）抗ＣＤ４３−ＦＩＴＣ、抗Ｂ２２０−Ｃｙ−クロムおよび抗ＩｇＭ−ＰＥを同時に使用する、骨髄におけるプレＢ細胞（Ｂ２２０＋／ＣＤ４３−）およびプロＢ細胞（Ｂ２２０＋／ＣＤ４３＋）に対するＦＡＣＳ染色。ＩｇＭ陰性集団上にゲートされる細胞が示される。プレＢ細胞（Ｂ２２０＋／ＣＤ４３−）およびプロＢ細胞（Ｂ２２０＋／ＣＤ４３＋）の百分率が示される。
全ての図（ＡおよびＢ）について、１匹のコントロールマウス（左）および２匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウス（右）が示され、そして結果は、各々のグループで分析される７匹の動物の代表である。
【図９Ａ】 図９は、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスにおける、増加したＩｇ、ＲＦおよびＣＩＣのレベルを示す。
（Ａ）参照としての指示量の精製マウスＩｇＧと並行する、２つのコントロール血清（−）および４つＢＡＦＦ Ｔｇマウス由来の血清（＋）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。全てのレーンにおいて同様のアルブミンバンドの強度は、ゲル上にロードされた物質が、全てのサンプルに関して等価量であることを示す。
【図９ＢＣＤ】１９匹のコントロール同腹子（白棒）および２１匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウス（黒棒）の血清中の、全マウスＩｇ（Ｂ）、ＲＦ（Ｃ）ならびにＣＩＣ（Ｄ）のＥＬＩＳＡベース分析。適切なＲＦコントロールがない場合において、ＲＦの力価（ｌｏｇベース２）は、バックグラウンドのＯ．Ｄ．よりも３倍高いＯ．Ｄ．を与える血清の希釈度として規定される。ＣＩＣの量は、試験される血清を用いて得られるＯ．Ｄ．と等価のＯ．Ｄ．を生成するために必要なＰＡＰの量として、規定される。コントロール動物とＢＡＦＦ Ｔｇマウスとの間の差異は、統計的に有意であった（（Ｂ）および（Ｃ）でＰ＜０．００１、（Ｄ）でＰ＜０．００３）。
【図１０ＡＢ】 図１０は、いくつかのＢＡＦＦ Ｔｇマウス中の、抗ｓｓＤＮＡおよび抗ｄｓＤＮＡ自己抗体の存在を示す。
（Ａ）１９匹のコントロール同腹子（灰色棒）および２１匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウス（黒棒）中の抗ｓｓＤＮＡ自己抗体の、ＥＬＩＳＡによる分析。
（Ｂ）５匹のコントロール同腹子および（Ａ）からの抗ｓｓＤＮＡ自己抗体のレベルを示す５匹の動物における抗ｓｓＤＮＡ自己抗体の、ＥＬＩＳＡによる分析。
【図１０Ｃ】（Ｃ）コントロールマウス（左）およびＢＡＦＦ Ｔｇマウス（右）由来の腎臓の、ヤギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰで染色されたパラフィン切片。Ｉｇの析出は、褐色の染色によって示される。これらの写真は、分析された６匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウスの代表である。
【図１１】 図１１は、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスにおける拡大したパイアー斑を示す。
コントロールマウス（左）およびＢＡＦＦ Ｔｇマウス（右）の小腸上のパイアー斑（矢印で示される）の写真。この写真は、各々のグループの、屠殺された少なくとも１２匹のマウスの代表である。拡大率５×。
【図１２】 図１２は、ＢＡＦＦ Ｔｇマウスの脾臓における、破壊されたＴおよびＢ細胞の組織、激しい胚中心反応、樹状細胞数の減少および血漿細胞数の増加を示す。コントロールマウスは、Ａ、Ｃ、ＥおよびＧに示され、そしてＢＡＦＦ ＴｇマウスはＢ、Ｄ、ＦおよびＨに示される。Ｂ細胞は青であり、そしてＴ細胞は褐色である（ＡおよびＢ）。胚中心は矢印で示される（ＣおよびＤ）。コントロールマウス（Ｃ）において、わずかな残留胚中心が見られる。ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞は褐色であり、そしてＴ細胞区域、架橋チャネルおよび辺縁区域（Ｅ）に現れる。ＢＡＦＦ Ｔｇマウス（Ｆ）にはほとんど存在しない。Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１陽性血漿細胞は、ＢＡＦＦ Ｔｇマウス（Ｈ）の赤脾髄においてのみ検出可能であるが、コントロールマウス（Ｇ）では検出可能でない。
これらの写真は、分析された少なくとも１２匹のＢＡＦＦ Ｔｇマウスおよび１２匹のコントロールマウスの代表である。
拡大率５０×であるＣおよびＤを除いて、全ての写真は拡大率１００×である。Ｂ：Ｂ細胞小胞、Ｔ：ＰＡＬＳ、ＷＰ：白脾髄、ＲＰ：赤脾髄。
【図１３】 図１３は、ＢＡＦＦ ＴｇマウスのＭＬＮにおける、破壊されたＴおよびＢ細胞の組織、激しい胚中心反応、および多数の血漿細胞を示す。
コントロールマウスは、Ａ、Ｃ、ＥおよびＧに示され、そしてＢＡＦＦ Ｔｇマウスは、Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨに示される。免疫組織化学は、図６に記載のように行われた。ＴおよびＢ細胞の染色は、ＡおよびＢに示され、胚中心はＣおよびＤに示され、樹状細胞はＥおよびＦ、そして血漿細胞はＧおよびＨに示される。ＧＣ：胚中心。拡大率１００×。

Claims (14)

1. Ｂ細胞増殖に関連するがんの処置のための薬学的組成物の調製のための、ＢＡＦＦに特異的なアンタゴニスト抗体またはそのような抗体のアンタゴニストフラグメントの使用であって、該抗体またはフラグメントは、Ｂ細胞増殖を促進するＢＡＦＦ誘導活性を拮抗し得る、使用。
2. 前記がんがバーキットリンパ腫である、請求項１に記載の使用。
3. 前記アンタゴニスト抗体がモノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の使用。
4. 前記アンタゴニスト抗体のアンタゴニストフラグメントがＦａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）_２フラグメントから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
5. 前記アンタゴニスト抗体がキメラ抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
6. 前記アンタゴニスト抗体がヒト化抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. 前記ＢＡＦＦが可溶性ＢＡＦＦである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
8. ＢＡＦＦに特異的なアンタゴニスト抗体またはそのような抗体のアンタゴニストフラグメントを含む、Ｂ細胞増殖に関連するがんを処置するための組成物であって、該抗体またはフラグメントは、Ｂ細胞増殖を促進するＢＡＦＦ誘導活性を拮抗し得る、組成物。
9. 前記がんがバーキットリンパ腫である、請求項８に記載の組成物。
10. 前記アンタゴニスト抗体がモノクローナル抗体である、請求項８または９に記載の組成物。
11. 前記アンタゴニスト抗体のアンタゴニストフラグメントがＦａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）_２フラグメントから選択される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. 前記アンタゴニスト抗体がキメラ抗体である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
13. 前記アンタゴニスト抗体がヒト化抗体である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
14. 前記ＢＡＦＦが可溶性ＢＡＦＦである、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の組成物。

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