JP5116468B2 - 診断用マーカー - Google Patents
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Description
本発明は、消化器癌の内視鏡による早期発見／治療のための診断用マーカーに関するものである。
食物の通過・消化・吸収部位である食道、胃、十二指腸、小腸及び大腸等に発生する悪性腫瘍は消化器癌に分類される。肺癌・乳癌と並び、患者数の多い重篤な疾患群である。中でも大腸癌は、日米欧、男女を問わず、発生件数及び死亡者数の上位を占める癌腫である（各地域における年間の患者数：１０万人以上）。胃癌は、本邦において発生頻度が高いという特異性を示すが（年間患者数：約１０万人）、欧米諸国でも１万人規模の年間患者数が報告されている。食道癌の発生件数は、大腸癌、胃癌に比べて少ないものの、本邦の男性に６番目に多い癌腫であり（男：女＝６：１）、毎年１万人以上が羅患している。患者数も死亡者数も多い消化器癌であるが、ポリープ（腺腫）や粘膜内に留まる早期癌であれば、内視鏡的粘膜切除術により治療することができる。
しかしながら、病変が大腸壁を超えているときは外科的に腸を摘出する。さらに発見が遅れ、遠隔転移がある場合、外科的療法に化学療法を組み合わせて治療する。大腸癌に対する化学療法剤として、プラチナ製剤のオキザリプラチンや抗体医薬のアバスチンなど、近年、有望な新薬が開発されているものの、治療成績に対する満足度は十分でない。
しかしながら、病変が大腸壁を超えているときは外科的に腸を摘出する。さらに発見が遅れ、遠隔転移がある場合、外科的療法に化学療法を組み合わせて治療する。大腸癌に対する化学療法剤として、プラチナ製剤のオキザリプラチンや抗体医薬のアバスチンなど、近年、有望な新薬が開発されているものの、治療成績に対する満足度は十分でない。
これらの消化器癌の最善の治療法は、早期発見かつ病巣部位切除である。癌は粘膜側から発生するが、病巣が粘膜内に留まる早期癌の場合、内視鏡的粘膜切除術による治療が適切であり、この方法の適用拡大は、患者の負担軽減、治療成績の向上、医療経済性の改善等、多くの利益が見込まれている。
しかし、現在の内視鏡診断では、多臓器への転移リスクが急激に高まる１〜２ｃｍの大きさの腫瘍を発見できるに留まっている。
このような背景から、癌細胞或いは癌組織を特異的に染色する診断用マーカーが試みられており、例えば特許文献１に記載されている。
しかし、この診断用マーカーは、癌細胞や癌組織に特異的に結合する抗体を蛍光化合物と結合（あるいは蛍光性官能基を抗体に導入）したものであり、確かに癌組織あるいはその周辺の粘膜組織を染色することができるが、癌組織以外の正常組織上にもある程度結合してしまい、また抗体当たりの蛍光化合物量が少なく、従って癌組織と正常組織のコントラストが低く診断精度の高いものではなかった。
しかし、現在の内視鏡診断では、多臓器への転移リスクが急激に高まる１〜２ｃｍの大きさの腫瘍を発見できるに留まっている。
このような背景から、癌細胞或いは癌組織を特異的に染色する診断用マーカーが試みられており、例えば特許文献１に記載されている。
しかし、この診断用マーカーは、癌細胞や癌組織に特異的に結合する抗体を蛍光化合物と結合（あるいは蛍光性官能基を抗体に導入）したものであり、確かに癌組織あるいはその周辺の粘膜組織を染色することができるが、癌組織以外の正常組織上にもある程度結合してしまい、また抗体当たりの蛍光化合物量が少なく、従って癌組織と正常組織のコントラストが低く診断精度の高いものではなかった。
従って、本発明の目的は、癌組織と正常組織のコントラストを高くすることが可能で、消化器癌の内視鏡による早期発見／治療に有益な診断用マーカー、及びその製造方法を提供することにある。
本発明は、粒子径１ｎｍ〜１００μｍの粒子であって、その粒子の表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位を有し、且つ上記粒子中に識別性物質を有する、当該粒子を含有し、上記粒子が、下記式（３）で表される構造を有するポリマーを主成分とするものであることを特徴とする、診断用マーカーを提供することにより、上記目的を達成したものである。
（式中、Ｒ'は水素原子又は炭素原子数１〜４の炭化水素基を表す。ｎは１０〜４００の数を表す。ｍは１０〜４００の数を表す。ｋは１０〜２００の数を表す。Ａはレクチンを表す。ｗ、ｘ、ｙ、ｚはポリマーの分子量を１万〜１００万とする数であり、且つ（ｘ＋ｙ）：ｚ：ｗ＝１：０．２〜２．５：５〜３００の割合である。尚、ｘとｙは何れか一方が０であってもよい。ｗ、ｘ、ｙ、ｚの各繰り返し数に対応する各繰り返し単位の主鎖における順序は任意である。）
また本発明は、下記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は下記式（５）で表されるマクロモノマーと、下記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させてポリマー微粒子を得、得られたポリマー微粒子に蛍光発光性物質を含有させるか、あるいは、下記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は下記式（５）で表されるマクロモノマーと、下記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させるに際して、重合系内に蛍光発光性物質を存在させることによって、ポリマー微粒子を得ると同時に該ポリマー微粒子内に蛍光発光性物質を含有させ、次いでこのポリマー微粒子の表面に抗体及び／又はレクチンを結合又は吸着させることを特徴とする、診断用マーカーの製造方法を提供することにより、上記目的を達成したものである。
まず、本発明の診断用マーカーを好ましい実施態様について説明する。
本発明に用いられる粒子は、粒子径１ｎｍ〜１００μｍの粒子であって、その粒子の表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位を有し、且つ該粒子中に識別性物質を有するものであれば特に限定されるものではなく、ベースとなる粒子としても特に限定されるものではなく、シリカ等の無機粒子でも、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリル酸エステル等の有機ポリマーでもよいが、好ましくは水中や生理食塩水中での分散安定性の観点からは有機ポリマーが適している。
本発明に用いられる粒子は、粒子径１ｎｍ〜１００μｍの粒子であって、その粒子の表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位を有し、且つ該粒子中に識別性物質を有するものであれば特に限定されるものではなく、ベースとなる粒子としても特に限定されるものではなく、シリカ等の無機粒子でも、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリル酸エステル等の有機ポリマーでもよいが、好ましくは水中や生理食塩水中での分散安定性の観点からは有機ポリマーが適している。
上記粒子は、その粒子径が１ｎｍ〜１００μｍの粒子であることが必要であり、好ましくは１０ｎｍ〜１００μｍ、より好ましくは５０ｎｍ〜１００μｍ、最も好ましくは１００ｎｍ〜１０μｍの粒子であることがよい。粒子径が小さすぎても大きすぎても癌組織と正常組織のコントラストを高くすることができない。
本発明の診断用マーカーに含有される粒子は、その粒子の表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位を有するものである。
この消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位としては、特に限定されるものではないが、好ましくは抗体及び／又はレクチンを例示することができ、好ましくはレクチンを例示することができる。
この消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位としては、特に限定されるものではないが、好ましくは抗体及び／又はレクチンを例示することができ、好ましくはレクチンを例示することができる。
例えば大腸癌を例にとると、大腸癌が発生した部位には、大腸粘膜細胞の癌化によって、正常な粘膜表面とは異なる糖鎖構造を呈す事が知られている。中でもガラクトシルβ１−３−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（以下、ＴＦ抗原という場合がある。）が良く知られている。
このＴＦ抗原に対する特異的な結合性の高い物質としてはレクチンが知られており、例えば、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（ピーナッツレクチン。以下、ＰＮＡと略記する場合がある。）、又はＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ（マッシュルームレクチン。以下、ＡＢＡと略記する場合がある。）、又はＢａｕｈｉｎｉａ ｐｕｒｐｕｒｅａ（以下、ＢＰＡと略記する場合がある。）などを例示することができ、これらの物質を粒子の表面に存在させることにより、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位とすることができる。
このＴＦ抗原に対する特異的な結合性の高い物質としてはレクチンが知られており、例えば、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（ピーナッツレクチン。以下、ＰＮＡと略記する場合がある。）、又はＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ（マッシュルームレクチン。以下、ＡＢＡと略記する場合がある。）、又はＢａｕｈｉｎｉａ ｐｕｒｐｕｒｅａ（以下、ＢＰＡと略記する場合がある。）などを例示することができ、これらの物質を粒子の表面に存在させることにより、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位とすることができる。
ＴＦ抗原は大腸癌以外の消化器癌においても発生するので、これらのレクチンは同様に消化器癌全般を対象とする診断用マーカーとする場合に利用することができるが、特に大腸癌には顕著であるので、大腸癌を対象とする診断用マーカーの場合に特にこれらのレクチンは好ましい。
そのほか、消化器癌においては、他にも細胞の癌化の結果としてＮ−アセチルノイラミン酸や、Ｎ−アセチルガラクトサミンがα２，６結合したもの（シアリルＴｎ）等も存在することから、これらと特異的に結合性の高いレクチンを選択する事も可能である。
また、レクチン以外の、消化器癌細胞認識性分子として、抗体等、例えば市販されているａｎｔｉ−Ｔｈｏｍｓｅｎ Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ Ａｎｔｉｇｅｎ， ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ， ｃｌｏｎｅ Ａ７８−Ｇ／Ａ７等を選択することも可能である。
また、レクチン以外の、消化器癌細胞認識性分子として、抗体等、例えば市販されているａｎｔｉ−Ｔｈｏｍｓｅｎ Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ Ａｎｔｉｇｅｎ， ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ， ｃｌｏｎｅ Ａ７８−Ｇ／Ａ７等を選択することも可能である。
消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位とするため、これらの消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い物質を粒子の表面に導入する方法については、特に限定されない。共有結合による方法が最も好ましいが、物理的吸着によってもよい。
消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い物質を共有結合で結合させる場合、その方法は限定されないが、一般的にタンパク質やペプチドの固定化に用いられる縮合剤（カルボジイミドなど）を用いたアミド結合の形成による導入が最も好ましい。ここで用いられる縮合剤は特に限定されないが、特に１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）や１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＩ）が好ましい。
消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い物質を共有結合で結合させる場合、その方法は限定されないが、一般的にタンパク質やペプチドの固定化に用いられる縮合剤（カルボジイミドなど）を用いたアミド結合の形成による導入が最も好ましい。ここで用いられる縮合剤は特に限定されないが、特に１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）や１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＩ）が好ましい。
また、本発明の診断用マーカーに含有される粒子において、その粒子の表面に有する消化器粘膜に対する結合性の低い部位としては、特に限定されるものではないが、ノニオン性で且つ水和力が高いものがよく、例えば、Ｎ−ビニルアセトアミドを構成単位とする重合鎖やポリエチレングリコール鎖などが、消化器粘膜に対する結合性の低い部位として好ましい。
具体的には、消化器粘膜に対する結合性の低い部位としては、下記式（１）で表される構造及び／又は下記式（２）で表される構造を含むものが好ましい。
具体的には、消化器粘膜に対する結合性の低い部位としては、下記式（１）で表される構造及び／又は下記式（２）で表される構造を含むものが好ましい。
このような消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位を、その表面に有する粒子として、好ましくは、例えば下記式（３）で表される構造を有するポリマーを主成分とする粒子を例示することができる
尚、上記式（３）で表される構造を有するポリマーは、本発明の効果を阻害しない範囲内でその他の構造（例えば、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリル酸、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアミン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等）を有していてもよい。
本発明の診断用マーカーに使用する粒子は、上記のような消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位を、その粒子の表面に有するものである。
本発明の診断用マーカーに使用する粒子においては、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位それぞれの、消化器粘膜上での結合性の強弱の特徴が反映されれば良いので、これらの部位が存在する本発明で言うところの「粒子の表面」とは、必ずしも粒子の最外層末端にこれらの部位が存在する必要はなく、概ね最外層末端から１０ｎｍの深さまでのなかに存在すればよい。従って、粒子径が２０ｎｍ以下の粒子の場合は、単に粒子中に有することと同義であり、そのような状態でも差し支えない。
尚、最外層末端から１０ｎｍの深さまでのなかの分子構造の存在量は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって分析可能である。また、レクチン等を結合させる場合、粒子形成後に結合させれば当然に粒子表面に存在することとなり、粒子全体としてのレクチンの存在量を分析すれば得ることができる。
本発明の診断用マーカーに使用する粒子においては、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位それぞれの、消化器粘膜上での結合性の強弱の特徴が反映されれば良いので、これらの部位が存在する本発明で言うところの「粒子の表面」とは、必ずしも粒子の最外層末端にこれらの部位が存在する必要はなく、概ね最外層末端から１０ｎｍの深さまでのなかに存在すればよい。従って、粒子径が２０ｎｍ以下の粒子の場合は、単に粒子中に有することと同義であり、そのような状態でも差し支えない。
尚、最外層末端から１０ｎｍの深さまでのなかの分子構造の存在量は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって分析可能である。また、レクチン等を結合させる場合、粒子形成後に結合させれば当然に粒子表面に存在することとなり、粒子全体としてのレクチンの存在量を分析すれば得ることができる。
本発明の診断用マーカーにおいて、粒子中に有する識別性物質は、特に限定されるものではなく、内視鏡等による観察において、裸眼で認識可能か、或いは装置、例えば分光光度計又は蛍光光度計等を用いて検出できるかの何れかによって、その存在が識別可能なものであれば良いが、好ましくは蛍光発光性物質が良い。
このような蛍光発光性物質としては、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ダンシル類、ＮＢＤ型色素、フィコビリプロテイン、ＢＯＤＩＰＹ誘導体等を例示することができ、またこれらの蛍光発光性物質を疎水性の高い物質（例えばコレステロールなど）と結合させた誘導体も使用することができる。
これらの中でも感度や用いる光源の観点からフルオレセイン類の蛍光発光性物質及びその誘導体（例えばコレステロールをフルオレセイン類物質と結合させた、ラベル化コレステロールなど）や、発光強度が強く水溶性の低いクマリン類（例えばクマリン６など）が最も好ましい。
このような蛍光発光性物質としては、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ダンシル類、ＮＢＤ型色素、フィコビリプロテイン、ＢＯＤＩＰＹ誘導体等を例示することができ、またこれらの蛍光発光性物質を疎水性の高い物質（例えばコレステロールなど）と結合させた誘導体も使用することができる。
これらの中でも感度や用いる光源の観点からフルオレセイン類の蛍光発光性物質及びその誘導体（例えばコレステロールをフルオレセイン類物質と結合させた、ラベル化コレステロールなど）や、発光強度が強く水溶性の低いクマリン類（例えばクマリン６など）が最も好ましい。
蛍光発光性物質の上記粒子への導入方法についても特に限定されず、識別に必要な感度を保ち、水性環境に溶出が起こらなければ良い。例えば、粒子の合成を行う過程で合成反応系内に導入することにより粒子を構成する分子間に挟持させても良い。このような蛍光発光性物質として好ましい具体例としては、クマリン６（Coumarin 6, Sigma-Aldrich社製）を例示することができる。
また、粒子を合成した後に蛍光発光性物質を粒子内に吸収させるなどして導入しても良い。このような蛍光発光性物質として好ましい具体例としては、ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ−５−ｃａｒｂｏｎｙｌ ａｚｉｄｅ， ｄｉａｃｅｔａｔｅ（Ｆ６２１８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）を、疎水性の高いコレステロールと結合させたラベル化コレステロール（フルオレセイン化コレステロールとも言う）を例示することができる。このようなラベル化コレステロールはポリマー製の粒子を合成した後に、蛍光発光性物質をその粒子の内部に容易に吸収させて、粒子内に蛍光発光性物質を含有させることができる点からも好ましいものである。
また、粒子を合成した後に蛍光発光性物質を粒子内に吸収させるなどして導入しても良い。このような蛍光発光性物質として好ましい具体例としては、ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ−５−ｃａｒｂｏｎｙｌ ａｚｉｄｅ， ｄｉａｃｅｔａｔｅ（Ｆ６２１８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）を、疎水性の高いコレステロールと結合させたラベル化コレステロール（フルオレセイン化コレステロールとも言う）を例示することができる。このようなラベル化コレステロールはポリマー製の粒子を合成した後に、蛍光発光性物質をその粒子の内部に容易に吸収させて、粒子内に蛍光発光性物質を含有させることができる点からも好ましいものである。
本発明の診断用マーカーにおいて、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位、消化器粘膜に対する結合性の低い部位、及び識別性物質の存在量（濃度）は、それぞれ下記の通りである。
消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位の存在量（濃度）：粒子１ｇ当たりの該部位の存在質量として、好ましくは１ｍｇ／ｇ〜１ｇ／ｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｇ〜１００ｍｇ／ｇ、さらに好ましくは２ｍｇ／ｇ〜５０ｍｇ／ｇ。
消化器粘膜に対する結合性の低い部位の存在量（濃度）：好ましくは１〜９９質量％、より好ましくは５〜９０質量％、さらに好ましくは２０〜７０質量％。
識別性物質の存在量（濃度）：好ましくは０．００５〜５質量％、より好ましくは０．０１〜１質量％。
消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位の存在量（濃度）：粒子１ｇ当たりの該部位の存在質量として、好ましくは１ｍｇ／ｇ〜１ｇ／ｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｇ〜１００ｍｇ／ｇ、さらに好ましくは２ｍｇ／ｇ〜５０ｍｇ／ｇ。
消化器粘膜に対する結合性の低い部位の存在量（濃度）：好ましくは１〜９９質量％、より好ましくは５〜９０質量％、さらに好ましくは２０〜７０質量％。
識別性物質の存在量（濃度）：好ましくは０．００５〜５質量％、より好ましくは０．０１〜１質量％。
本発明の診断用マーカーは、上記で説明したような粒子を含有するものであり、どのような態様で含有していてもよいが、好ましくは上記粒子を分散媒に分散させた態様であることがよい。この場合、分散媒としては、生体への毒性が少なく、上記粒子中のタンパク質を失活させないものであれば特に限定されず、例えば、医薬製剤もしくは医療用製剤に使用されることが知られている水性の分散媒であれば使用することができる。このような分散媒の一例としては、例えば生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＣａやＭｇを含有しているものでも、していないものでも可）などを例示することができる。
また、本発明の診断用マーカーにおける上記粒子の濃度は特に限定されるものではないが、極端に低いと診断効率が低下し、極端に高いと流動性が低下してやはり診断効率が低下するので、好ましくは０．０１μｇ／ｍＬ〜９９０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは０．５μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬがよい。
また、本発明の診断用マーカーには、本発明の効果を阻害しない範囲内で、所望により、医薬製剤もしくは医療用製剤に使用されることが知られている添加剤を、その添加剤が通常使用される添加量で含有することができる。
また、本発明の診断用マーカーにおける上記粒子の濃度は特に限定されるものではないが、極端に低いと診断効率が低下し、極端に高いと流動性が低下してやはり診断効率が低下するので、好ましくは０．０１μｇ／ｍＬ〜９９０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは０．５μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬがよい。
また、本発明の診断用マーカーには、本発明の効果を阻害しない範囲内で、所望により、医薬製剤もしくは医療用製剤に使用されることが知られている添加剤を、その添加剤が通常使用される添加量で含有することができる。
次に本発明の診断用マーカーの好ましい製造方法について説明する。
本発明の診断用マーカーは、下記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は下記式（５）で表されるマクロモノマーと、下記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させてポリマー微粒子を得、得られたポリマー微粒子に蛍光発光性物質を含有させるか、あるいは、下記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は下記式（５）で表されるマクロモノマーと、下記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させるに際して、重合系内に蛍光発光性物質を存在させることによって、ポリマー微粒子を得ると同時に該ポリマー微粒子内に蛍光発光性物質を含有させ、次いでこのポリマー微粒子の表面に抗体及び／又はレクチンを結合又は吸着させることにより、製造される。
本発明の診断用マーカーは、下記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は下記式（５）で表されるマクロモノマーと、下記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させてポリマー微粒子を得、得られたポリマー微粒子に蛍光発光性物質を含有させるか、あるいは、下記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は下記式（５）で表されるマクロモノマーと、下記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させるに際して、重合系内に蛍光発光性物質を存在させることによって、ポリマー微粒子を得ると同時に該ポリマー微粒子内に蛍光発光性物質を含有させ、次いでこのポリマー微粒子の表面に抗体及び／又はレクチンを結合又は吸着させることにより、製造される。
上記式（４）で表されるマクロモノマーの製造方法は、任意であり特に限定されず常法によればよいが、例えばまず、２−メルカプトエタノールを出発物質としてＮ−ビニルアセトアミド（ＮＶＡ）を、重合開始剤（例えば、Ｎ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）など）の存在下に、有機溶媒（例えばトルエンなど）中で重合させるなどして次式で表されるポリマーを得る。
次いで、このポリマーをビニルベンジルクロライドと反応（例えばジメチルフォルムアミド溶媒中で、ＮａＨ及びテトラブチルホスホニウムブロマイドの存在下で反応）させることにより得ることができる。
上記式（５）で表されるマクロモノマーの製造方法は、任意であり特に限定されず常法によればよいが、例えば、常法により重合させたポリエチレングリコール（或いはさらに水酸化ナトリウムなどを反応させた後にメチルクロライドなどのアルキルクロライド等を反応させて末端をアルキル化した誘導体）を、ビニルベンジルクロライドと反応させることにより得ることができる。
上記式（６）で表されるマクロモノマーの製造方法は、任意であり特に限定されず常法によればよいが、例えばまず、２−メルカプトエタノールを出発物質として、メタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−ＢＭＡ）を、重合開始剤（例えば、Ｎ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）など）の存在下に、有機溶媒（例えばＴＨＦなど）中で重合させるなどして次式で表されるポリマーを得る。
次いで、このポリマーをビニルベンジルクロライドと反応（例えばジメチルフォルムアミド溶媒中で、ＮａＨ及びテトラブチルホスホニウムブロマイドの存在下で反応）させた後、加水分解することによりｔ−Ｂｕ基を外すことによって得ることができる。
本発明の診断用マーカーの製造方法はまず、上記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は上記式（５）で表されるマクロモノマーと、上記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させてポリマー微粒子を得る。
上記式（４）で表されるマクロモノマーのモル数を〔４〕、上記式（５）で表されるマクロモノマーのモル数を〔５〕、上記式（６）で表されるマクロモノマーのモル数を〔６〕、スチレンのモル数を〔Ｓ〕とすると、本発明の診断用マーカーの製造方法においては、これらの割合は、（〔４〕＋〔５〕）：〔６〕：〔Ｓ〕＝１：０．２〜２．５：５〜３００となる割合である。尚、この割合は、それぞれのマクロモノマー或いはモノマーの実際に重合反応する割合であり、反応条件等によってそれぞれのマクロモノマー或いはモノマーの反応率が１００％に満たなければ反応率を勘案して、実際に使用するマクロモノマー或いはモノマーの割合は上記範囲の通りでなくても差し支えない。
上記式（４）で表されるマクロモノマーのモル数を〔４〕、上記式（５）で表されるマクロモノマーのモル数を〔５〕、上記式（６）で表されるマクロモノマーのモル数を〔６〕、スチレンのモル数を〔Ｓ〕とすると、本発明の診断用マーカーの製造方法においては、これらの割合は、（〔４〕＋〔５〕）：〔６〕：〔Ｓ〕＝１：０．２〜２．５：５〜３００となる割合である。尚、この割合は、それぞれのマクロモノマー或いはモノマーの実際に重合反応する割合であり、反応条件等によってそれぞれのマクロモノマー或いはモノマーの反応率が１００％に満たなければ反応率を勘案して、実際に使用するマクロモノマー或いはモノマーの割合は上記範囲の通りでなくても差し支えない。
上記極性溶媒としては、特に限定されるものではなく、例えば、水などの無機極性溶媒、エタノールなどの有機極性溶媒、或いはこれら無機極性溶媒と有機極性溶媒の混合溶媒など、周知の極性溶媒を利用することができるが、マクロモノマー或いはモノマーの溶解性ないしは分散性の観点からエタノールなどの極性有機溶媒、若しくはこれと水などの無機極性溶媒との混合溶媒（混合溶媒の場合、好ましくは無機極性溶媒は３０容量％以下がよい）を用いることが好ましい。
これらマクロモノマー或いはモノマーの重合は、周知の反応条件、例えば、ＡＩＢＮなどの触媒を用いて、例えば４０℃〜８０℃の温度で３時間〜４８時間程度反応させることにより行なうことができる。
これらマクロモノマー或いはモノマーは、上記極性溶媒中で重合させると、重合したポリマーは、極性溶媒に対する溶解性の高い、上記の式（４）〜式（６）で表されるマクロモノマーに由来する構造部分を外側に、上記極性溶媒に対する溶解性の低いスチレンに由来する構造部分を内側となるように集積されて粒子化する。その結果、このようにして得られるポリマー微粒子は、粒子表面に、上記式（１）で表される構造及び／又は上記式（２）で表される構造を含むものとなる。また同様に粒子表面に、上記の式（４）〜式（６）で表されるマクロモノマーに由来する構造部分を有するものとなる。
これらマクロモノマー或いはモノマーは、上記極性溶媒中で重合させると、重合したポリマーは、極性溶媒に対する溶解性の高い、上記の式（４）〜式（６）で表されるマクロモノマーに由来する構造部分を外側に、上記極性溶媒に対する溶解性の低いスチレンに由来する構造部分を内側となるように集積されて粒子化する。その結果、このようにして得られるポリマー微粒子は、粒子表面に、上記式（１）で表される構造及び／又は上記式（２）で表される構造を含むものとなる。また同様に粒子表面に、上記の式（４）〜式（６）で表されるマクロモノマーに由来する構造部分を有するものとなる。
得られたポリマー微粒子の粒子径は、使用するマクロモノマー或いはモノマーの割合や極性溶媒の種類にもよるが、得られるポリマーの分子量を概ね１万〜１００万程度に制御すれば、概ね５０ｎｍ〜１００μｍ程度の微粒子となる。
尚、本発明の効果を阻害しない範囲内で、上記の式（４）〜式（６）で表されるマクロモノマー及びスチレンの他に、その他のモノマーを使用してもよく、例えば、ポリマー構造として、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリル酸、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアミン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等を導入しても差し支えない。
尚、本発明の効果を阻害しない範囲内で、上記の式（４）〜式（６）で表されるマクロモノマー及びスチレンの他に、その他のモノマーを使用してもよく、例えば、ポリマー構造として、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリル酸、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアミン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等を導入しても差し支えない。
次に、得られたポリマー微粒子に蛍光発光性物質を含有させる。蛍光発光性物質は上記と同様の蛍光発光性物質を用いればよく、好ましい蛍光発光性物質も上記と同様である。ポリマー微粒子に蛍光発光性物質を含有させる方法は特に限定されるものではなく、例えば、上記のような好ましい蛍光発光性物質であるフルオレセイン化コレステロールであれば、エタノールなどの有機極性溶媒中で上記ポリマー微粒子を蛍光発光性物質に含浸させることでポリマー微粒子に蛍光発光性物質を含有させることができる。
例えば、上記の方法で得たポリマー微粒子をエタノールに分散させ、これにフルオレセイン化コレステロールのエタノール溶液を混合し、攪拌しながらイオン交換水を１０倍量加え、これを凍結乾燥することでフルオレセイン化コレステロールを含有するポリマー微粒子を得ることができる。
また、上記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は上記式（５）で表されるマクロモノマーと、上記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させるに際して、重合系内に蛍光発光性物質を存在させることによって、ポリマー微粒子を得ると同時に該ポリマー微粒子内に蛍光発光性物質を含有させることもできる。
例えば、上記の方法で得たポリマー微粒子をエタノールに分散させ、これにフルオレセイン化コレステロールのエタノール溶液を混合し、攪拌しながらイオン交換水を１０倍量加え、これを凍結乾燥することでフルオレセイン化コレステロールを含有するポリマー微粒子を得ることができる。
また、上記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は上記式（５）で表されるマクロモノマーと、上記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させるに際して、重合系内に蛍光発光性物質を存在させることによって、ポリマー微粒子を得ると同時に該ポリマー微粒子内に蛍光発光性物質を含有させることもできる。
次に、上記のようにして蛍光発光性物質を含有させたポリマー微粒子の表面に、抗体及び／又はレクチンを結合又は吸着させる。
ここで用いる抗体及びレクチンは上記と同様であり、好ましい抗体及び好ましいレクチンも上記と同様である。
抗体及び／又はレクチンをポリマー微粒子の表面に結合又は吸着させる方法については特に限定されず、共有結合によっても物理的吸着によってもよいが、好ましくは共有結合によることがよい。
抗体及び／又はレクチンをポリマー微粒子の表面に共有結合させる方法も特に限定されないが、一般的にタンパク質やペプチドの固定化に用いられる縮合剤（例えばカルボジイミド等）を用いたアミド結合の形成による導入が最も好ましい。ここで用いられる縮合剤は特に限定されないが、特に１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）や１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＩ）が好ましい。
ここで用いる抗体及びレクチンは上記と同様であり、好ましい抗体及び好ましいレクチンも上記と同様である。
抗体及び／又はレクチンをポリマー微粒子の表面に結合又は吸着させる方法については特に限定されず、共有結合によっても物理的吸着によってもよいが、好ましくは共有結合によることがよい。
抗体及び／又はレクチンをポリマー微粒子の表面に共有結合させる方法も特に限定されないが、一般的にタンパク質やペプチドの固定化に用いられる縮合剤（例えばカルボジイミド等）を用いたアミド結合の形成による導入が最も好ましい。ここで用いられる縮合剤は特に限定されないが、特に１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）や１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＩ）が好ましい。
以下に実施例を挙げ本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔マクロモノマーＡの製造〕
Ｎ−ビニルアセトアミド５０ｇ、２−メルカプトエタノール１８．４ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル０．９６ｇをトルエン２５０ｍＬに加えて、窒素バブリングしながら６０℃で６時間攪拌還流させた。沈殿物をエタノールに溶解させて、アセトンへ再沈殿させることで生成物２４ｇを回収した。生成物であるＮ−ビニルアセトアミドポリマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した結果、その分子量はＭｗ／Ｍｎ＝１４，０００／５，０００であった。前記式（４）のｎに相当する数としては約６０であった。
得られたＮ−ビニルアセトアミドポリマー２０ｇをＤＭＦ１００ｍＬに溶解させて、ＮａＨ（オイルディスパージョン）０．２６ｇ及びテトラブチルホスホニウムブロマイド０．３４ｇ加えて室温で３時間攪拌した後、４―ビニルベンジルクロライド２．６ｇを添加して室温で２４時間攪拌した。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物１５ｇを回収した。生成物であるビニルベンジル末端Ｎ−ビニルアセトアミドポリマーを 1Ｈ−ＮＭＲで分析した結果、ビニルベンジル基のプロトン由来のピークを確認した。これをマクロモノマーＡとする。
Ｎ−ビニルアセトアミド５０ｇ、２−メルカプトエタノール１８．４ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル０．９６ｇをトルエン２５０ｍＬに加えて、窒素バブリングしながら６０℃で６時間攪拌還流させた。沈殿物をエタノールに溶解させて、アセトンへ再沈殿させることで生成物２４ｇを回収した。生成物であるＮ−ビニルアセトアミドポリマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した結果、その分子量はＭｗ／Ｍｎ＝１４，０００／５，０００であった。前記式（４）のｎに相当する数としては約６０であった。
得られたＮ−ビニルアセトアミドポリマー２０ｇをＤＭＦ１００ｍＬに溶解させて、ＮａＨ（オイルディスパージョン）０．２６ｇ及びテトラブチルホスホニウムブロマイド０．３４ｇ加えて室温で３時間攪拌した後、４―ビニルベンジルクロライド２．６ｇを添加して室温で２４時間攪拌した。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物１５ｇを回収した。生成物であるビニルベンジル末端Ｎ−ビニルアセトアミドポリマーを 1Ｈ−ＮＭＲで分析した結果、ビニルベンジル基のプロトン由来のピークを確認した。これをマクロモノマーＡとする。
〔マクロモノマーＢの製造〕
メタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル５０ｇ、２−メルカプトエタノール０．２９ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル０．５５ｇをＴＨＦ１００ｍＬに溶解させて、窒素バブリングしながら６０℃で６時間攪拌還流させた。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物３５ｇを回収した。生成物であるメタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチルポリマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した結果、その分子量はＭｗ／Ｍｎ＝１８，０００／９，６００であった。前記式（６）のｋに相当する数としては約７０であった。
得られたメタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチルポリマー２０ｇをＤＭＦ４００ｍＬに溶解させて、ＮａＨ（オイルディスパージョン）０．４３ｇ及びテトラブチルホスホニウムブロマイド３．２０ｇ加えて室温で３時間攪拌した後、４―ビニルベンジルクロライド３．０ｇを添加して室温で２４時間攪拌した。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物１８ｇを回収した。得られた生成物１８ｇをエタノール２００ｍＬに溶解し、これに濃塩酸２０ｍＬ及びヒドロキノン０．８ｇを加えた。これを７０℃で６時間還流させることで加水分解を行いポリメタクリル酸に誘導した。エタノールを留去後、イオン交換水に溶媒を置換して、さらに中性になるまでイオン交換水で透析を行った。これを凍結乾燥してビニルベンジル末端メタクリル酸ポリマーを得た。得られたビニルベンジル末端メタクリル酸ポリマーを 1Ｈ−ＮＭＲで分析した結果、ビニルベンジル基のプロトン由来のピークを確認した。これをマクロモノマーＢとする。
メタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル５０ｇ、２−メルカプトエタノール０．２９ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル０．５５ｇをＴＨＦ１００ｍＬに溶解させて、窒素バブリングしながら６０℃で６時間攪拌還流させた。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物３５ｇを回収した。生成物であるメタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチルポリマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した結果、その分子量はＭｗ／Ｍｎ＝１８，０００／９，６００であった。前記式（６）のｋに相当する数としては約７０であった。
得られたメタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチルポリマー２０ｇをＤＭＦ４００ｍＬに溶解させて、ＮａＨ（オイルディスパージョン）０．４３ｇ及びテトラブチルホスホニウムブロマイド３．２０ｇ加えて室温で３時間攪拌した後、４―ビニルベンジルクロライド３．０ｇを添加して室温で２４時間攪拌した。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物１８ｇを回収した。得られた生成物１８ｇをエタノール２００ｍＬに溶解し、これに濃塩酸２０ｍＬ及びヒドロキノン０．８ｇを加えた。これを７０℃で６時間還流させることで加水分解を行いポリメタクリル酸に誘導した。エタノールを留去後、イオン交換水に溶媒を置換して、さらに中性になるまでイオン交換水で透析を行った。これを凍結乾燥してビニルベンジル末端メタクリル酸ポリマーを得た。得られたビニルベンジル末端メタクリル酸ポリマーを 1Ｈ−ＮＭＲで分析した結果、ビニルベンジル基のプロトン由来のピークを確認した。これをマクロモノマーＢとする。
〔マクロモノマーＣの製造〕
Ｎ−ビニルアセトアミド５０ｇ、２−メルカプトエタノール２３．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル０．９６ｇをエタノール２５０ｍＬに加えて、窒素バブリングしながら６０℃で６時間攪拌還流させた。反応溶液にエタノール５０ｍＬを加えて、アセトン中へ再沈殿させることで生成物１６．１ｇを回収した。生成物であるＮ−ビニルアセトアミドポリマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した結果、その分子量はＭｗ／Ｍｎ＝９，５００／４，０００であった。前記式（４）のｎに相当する数としては約５０であった。
得られたＮ−ビニルアセトアミドポリマー２０ｇをＤＭＦ１００ｍＬに溶解させて、ＮａＨ（オイルディスパージョン）０．２６ｇ及びテトラブチルホスホニウムブロマイド０．３４ｇを加えて室温で３時間攪拌した後、４―ビニルベンジルクロライド２．６ｇを添加して室温で２４時間攪拌した。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物１５ｇを回収した。生成物であるビニルベンジル末端Ｎ−ビニルアセトアミドポリマーを 1Ｈ−ＮＭＲで分析した結果、ビニルベンジル基のプロトン由来のピークを確認した。これをマクロモノマーＣとする。
Ｎ−ビニルアセトアミド５０ｇ、２−メルカプトエタノール２３．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル０．９６ｇをエタノール２５０ｍＬに加えて、窒素バブリングしながら６０℃で６時間攪拌還流させた。反応溶液にエタノール５０ｍＬを加えて、アセトン中へ再沈殿させることで生成物１６．１ｇを回収した。生成物であるＮ−ビニルアセトアミドポリマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した結果、その分子量はＭｗ／Ｍｎ＝９，５００／４，０００であった。前記式（４）のｎに相当する数としては約５０であった。
得られたＮ−ビニルアセトアミドポリマー２０ｇをＤＭＦ１００ｍＬに溶解させて、ＮａＨ（オイルディスパージョン）０．２６ｇ及びテトラブチルホスホニウムブロマイド０．３４ｇを加えて室温で３時間攪拌した後、４―ビニルベンジルクロライド２．６ｇを添加して室温で２４時間攪拌した。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物１５ｇを回収した。生成物であるビニルベンジル末端Ｎ−ビニルアセトアミドポリマーを 1Ｈ−ＮＭＲで分析した結果、ビニルベンジル基のプロトン由来のピークを確認した。これをマクロモノマーＣとする。
〔フルオレセイン化コレステロールの製造〕
コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、シグマグレード）２００ｍｇを脱水ＤＭＦ５ｍＬに溶解し、これにｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ−５−ｃａｒｂｏｎｙｌ ａｚｉｄｅ， ｄｉａｃｅｔａｔｅ（Ｆ６２１８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）を１０ｍｇ加えた。これを８０℃で一時間還流し、５０％ヒドロキシアミン水溶液（和光純薬製）を一滴加えて３０分間攪拌した。これにイオン交換水を加えて生成物を沈殿させることでフルオレセイン化コレステロールを取り出した。フルオレセイン基の導入は蛍光光度測定及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で確認した。また、フルオレセイン化コレステロールは、イオン交換水及び生理食塩水に溶出しないことをＵＶ−ｖｉｓスペクトル測定装置（日本分光社製、Ｖ−５５０）で確認した。フルオレセイン化コレステロール中のフルオレセイン濃度は１質量％であった。
コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、シグマグレード）２００ｍｇを脱水ＤＭＦ５ｍＬに溶解し、これにｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ−５−ｃａｒｂｏｎｙｌ ａｚｉｄｅ， ｄｉａｃｅｔａｔｅ（Ｆ６２１８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）を１０ｍｇ加えた。これを８０℃で一時間還流し、５０％ヒドロキシアミン水溶液（和光純薬製）を一滴加えて３０分間攪拌した。これにイオン交換水を加えて生成物を沈殿させることでフルオレセイン化コレステロールを取り出した。フルオレセイン基の導入は蛍光光度測定及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で確認した。また、フルオレセイン化コレステロールは、イオン交換水及び生理食塩水に溶出しないことをＵＶ−ｖｉｓスペクトル測定装置（日本分光社製、Ｖ−５５０）で確認した。フルオレセイン化コレステロール中のフルオレセイン濃度は１質量％であった。
〔実施例１〕
上記で得られたマクロモノマーＡ１．０ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬとエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで、封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。
遠心分離によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は４００ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子１００ｍｇに対して上記で得られたフルオレセイン化コレステロールを５ｍｇ加え、これをエタノール５ｍＬに分散させた後に、攪拌しながらイオン交換水を１０倍容量加えた。これを遠心分離して微粒子を取り出し、イオン交換水へ再分散を３回繰り返し、これを凍結乾燥することでフルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有する微粒子（ラベル化微粒子）を得た。
得られたラベル化微粒子１０ｍｇを、ピーナッツレクチン１ｍｇをリン酸緩衝食塩水（商品名：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｄ８５３７、シグマアルドリッチジャパン社製。以下ＰＢＳと略記する。）１ｍＬに溶解した溶液に加えて攪拌してラベル化微粒子を分散させた。これを４℃で２４時間震蕩させることでラベル化微粒子の表面にピーナッツレクチンを吸着させた。その後、遠心分離とＰＢＳへの再分散を３回繰り返す事で未吸着のピーナッツレクチンを除去した。最後にリン酸緩衝食塩水（Ｃａ及びＭｇ含有）（商品名：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｄ８６６２、シグマアルドリッチジャパン社製。以下ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）と略記する。）に分散させた状態で、本発明の診断用マーカー１を得た。
上記で得られたマクロモノマーＡ１．０ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬとエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで、封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。
遠心分離によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は４００ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子１００ｍｇに対して上記で得られたフルオレセイン化コレステロールを５ｍｇ加え、これをエタノール５ｍＬに分散させた後に、攪拌しながらイオン交換水を１０倍容量加えた。これを遠心分離して微粒子を取り出し、イオン交換水へ再分散を３回繰り返し、これを凍結乾燥することでフルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有する微粒子（ラベル化微粒子）を得た。
得られたラベル化微粒子１０ｍｇを、ピーナッツレクチン１ｍｇをリン酸緩衝食塩水（商品名：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｄ８５３７、シグマアルドリッチジャパン社製。以下ＰＢＳと略記する。）１ｍＬに溶解した溶液に加えて攪拌してラベル化微粒子を分散させた。これを４℃で２４時間震蕩させることでラベル化微粒子の表面にピーナッツレクチンを吸着させた。その後、遠心分離とＰＢＳへの再分散を３回繰り返す事で未吸着のピーナッツレクチンを除去した。最後にリン酸緩衝食塩水（Ｃａ及びＭｇ含有）（商品名：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｄ８６６２、シグマアルドリッチジャパン社製。以下ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）と略記する。）に分散させた状態で、本発明の診断用マーカー１を得た。
〔実施例２〕
上記で得られたマクロモノマーＡ０．７５ｇ、上記で得られたマクロモノマーＢ０．２５ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬとエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。遠心分離によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は４７０ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子１００ｍｇに対し、実施例１と同様にしてフルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有させ、ラベル化微粒子を得た。
得られたラベル化微粒子１０ｍｇを、０．０５Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 水溶液８００μＬに分散させた。一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 水溶液に水溶性カルボジイミド〔１−エチル−３−（３' −ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド〕を１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、これを加えて４℃で３０分間震蕩した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ，１０分間）で上澄みを除去し、ピーナッツレクチン１ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を加えて攪拌してラベル化微粒子を分散させた。これを４℃で２４時間震蕩させることでラベル化微粒子の表面にピーナッツレクチンを結合させた。その後、遠心分離とＰＢＳへの再分散を３回繰り返す事で未反応のピーナッツレクチンを除去した。最後にＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた状態で、本発明の診断用マーカー２を得た。
上記で得られたマクロモノマーＡ０．７５ｇ、上記で得られたマクロモノマーＢ０．２５ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬとエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。遠心分離によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は４７０ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子１００ｍｇに対し、実施例１と同様にしてフルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有させ、ラベル化微粒子を得た。
得られたラベル化微粒子１０ｍｇを、０．０５Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 水溶液８００μＬに分散させた。一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 水溶液に水溶性カルボジイミド〔１−エチル−３−（３' −ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド〕を１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、これを加えて４℃で３０分間震蕩した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ，１０分間）で上澄みを除去し、ピーナッツレクチン１ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を加えて攪拌してラベル化微粒子を分散させた。これを４℃で２４時間震蕩させることでラベル化微粒子の表面にピーナッツレクチンを結合させた。その後、遠心分離とＰＢＳへの再分散を３回繰り返す事で未反応のピーナッツレクチンを除去した。最後にＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた状態で、本発明の診断用マーカー２を得た。
〔実施例３〕
上記で得られたマクロモノマーＡ０．５０ｇ、上記で得られたマクロモノマーＢ０．５０ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬとエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。遠心分離によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は４００ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子１００ｍｇに対し、実施例２と同様にしてフルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有させ、ラベル化微粒子を得た。
得られたラベル化微粒子１０ｍｇに対し、実施例２と同様にしてピーナッツレクチンをラベル化微粒子の表面に結合させ、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた状態で、本発明の診断用マーカー３を得た。
上記で得られたマクロモノマーＡ０．５０ｇ、上記で得られたマクロモノマーＢ０．５０ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬとエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。遠心分離によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は４００ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子１００ｍｇに対し、実施例２と同様にしてフルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有させ、ラベル化微粒子を得た。
得られたラベル化微粒子１０ｍｇに対し、実施例２と同様にしてピーナッツレクチンをラベル化微粒子の表面に結合させ、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた状態で、本発明の診断用マーカー３を得た。
〔実施例４〕
マクロモノマーＡを０．２５ｇ、マクロモノマーＢを０．７５ｇに変更した他は、実施例３と同様にして微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は３６０ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子を、実施例３と同様にしてラベル化し、実施例３と同様にしてピーナッツレクチンをラベル化微粒子の表面に結合させ、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた状態で、本発明の診断用マーカー４を得た。
マクロモノマーＡを０．２５ｇ、マクロモノマーＢを０．７５ｇに変更した他は、実施例３と同様にして微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は３６０ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子を、実施例３と同様にしてラベル化し、実施例３と同様にしてピーナッツレクチンをラベル化微粒子の表面に結合させ、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた状態で、本発明の診断用マーカー４を得た。
〔実施例５〕
実施例４で得られたラベル化微粒子の表面にピーナッツレクチンを結合させる際に、ピーナッツレクチンの使用量を０．１２５ｍｇに変更した他は実施例４と同様にして、ラベル化微粒子の表面にピーナッツレクチンを結合させ、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた状態で、本発明の診断用マーカー５を得た。
実施例４で得られたラベル化微粒子の表面にピーナッツレクチンを結合させる際に、ピーナッツレクチンの使用量を０．１２５ｍｇに変更した他は実施例４と同様にして、ラベル化微粒子の表面にピーナッツレクチンを結合させ、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた状態で、本発明の診断用マーカー５を得た。
〔実施例６〕
上記で得られたマクロモノマーＢ０．５ｇ、上記で得られたマクロモノマーＣ０．５ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬとエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。
遠心分離によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は２３０ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子１００ｍｇに対し、実施例２と同様にしてフルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有させ、ラベル化微粒子を得た。
得られたラベル化微粒子１０ｍｇに対し、実施例２と同様にしてピーナッツレクチンをラベル化微粒子の表面に結合させ、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた状態で、本発明の診断用マーカー６を得た。
上記で得られたマクロモノマーＢ０．５ｇ、上記で得られたマクロモノマーＣ０．５ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬとエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。
遠心分離によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は２３０ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子１００ｍｇに対し、実施例２と同様にしてフルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有させ、ラベル化微粒子を得た。
得られたラベル化微粒子１０ｍｇに対し、実施例２と同様にしてピーナッツレクチンをラベル化微粒子の表面に結合させ、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた状態で、本発明の診断用マーカー６を得た。
〔実施例７〕
上記で得られたマクロモノマーＢ０．５ｇ、上記で得られたマクロモノマーＣ０．５ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇ、更にクマリン６（Coumarin 6 Sigma-Aldrich社製）２ｍｇを、イオン交換水５ｍＬとエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで、クマリン６を内包したラベル微粒子を生成させた。
遠心分離によってこのラベル化微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としてのラベル化微粒子を得た。ラベル化微粒子の平均粒子径は２３０ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
実施例２と同様にしてピーナッツレクチンをラベル化微粒子の表面に結合させ、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた状態で、本発明の診断用マーカー７を得た。
上記で得られたマクロモノマーＢ０．５ｇ、上記で得られたマクロモノマーＣ０．５ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇ、更にクマリン６（Coumarin 6 Sigma-Aldrich社製）２ｍｇを、イオン交換水５ｍＬとエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで、クマリン６を内包したラベル微粒子を生成させた。
遠心分離によってこのラベル化微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としてのラベル化微粒子を得た。ラベル化微粒子の平均粒子径は２３０ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
実施例２と同様にしてピーナッツレクチンをラベル化微粒子の表面に結合させ、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた状態で、本発明の診断用マーカー７を得た。
〔比較例１〕
フルオレセイン化ピーナッツレクチン（ｐｅａｎｕｔ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，フナコシ社製）１．０ｍｇをＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）１ｍＬに溶解した溶液を比較診断用マーカー１とした。
フルオレセイン化ピーナッツレクチン（ｐｅａｎｕｔ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，フナコシ社製）１．０ｍｇをＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）１ｍＬに溶解した溶液を比較診断用マーカー１とした。
〔比較例２〕
上記で得られたマクロモノマーＢ１．０ｇ、スチレン０．７５ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬとエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。
遠心分離によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は３００ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子を、実施例２と同様にしてラベル化し、実施例５と同様にしてピーナッツレクチンをラベル化微粒子の表面に結合させ、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた状態で、比較診断用マーカー２を得た。
上記で得られたマクロモノマーＢ１．０ｇ、スチレン０．７５ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬとエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。
遠心分離によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は３００ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子を、実施例２と同様にしてラベル化し、実施例５と同様にしてピーナッツレクチンをラベル化微粒子の表面に結合させ、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた状態で、比較診断用マーカー２を得た。
〔比較例３〕
実施例３で得られたラベル化微粒子（ピーナッツレクチンを結合させる前のもの）をＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させ、比較診断用マーカー３とした。
実施例３で得られたラベル化微粒子（ピーナッツレクチンを結合させる前のもの）をＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させ、比較診断用マーカー３とした。
〔評価試験〕
実施例１〜７で得られた本発明の診断用マーカー１〜７及び比較例１〜３で得られた比較診断用マーカー１〜３について、以下の評価試験を行った。結果を表１に示す。
実施例１〜７で得られた本発明の診断用マーカー１〜７及び比較例１〜３で得られた比較診断用マーカー１〜３について、以下の評価試験を行った。結果を表１に示す。
〔微粒子表面組成の分析〕
微粒子表面組成の分析をＸ線光電子分光法（ＫＲＡＴＯＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製のＡＸＩＳ−ＵＬＴＡを使用し、帯電中和電子銃を使用し、モノクロ化ＡＩ線源を用いて測定した。）により行った。測定深度が約１０ｎｍとなるように設定した。本分析で得られる結果は、本発明において微粒子表面の元素組成を反映している。
Ｃ１ｓ，Ｏ１ｓ，Ｎ１ｓのピーク面積の積分値から求められた、Ｎ原子の含有質量％を基に、−ＣＨ2 −ＣＨ（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ3 ）−基の含有率（質量％）を求めた。
微粒子表面組成の分析をＸ線光電子分光法（ＫＲＡＴＯＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製のＡＸＩＳ−ＵＬＴＡを使用し、帯電中和電子銃を使用し、モノクロ化ＡＩ線源を用いて測定した。）により行った。測定深度が約１０ｎｍとなるように設定した。本分析で得られる結果は、本発明において微粒子表面の元素組成を反映している。
Ｃ１ｓ，Ｏ１ｓ，Ｎ１ｓのピーク面積の積分値から求められた、Ｎ原子の含有質量％を基に、−ＣＨ2 −ＣＨ（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ3 ）−基の含有率（質量％）を求めた。
〔ピーナッツレクチン固定化量〕
診断用マーカー及び比較診断用マーカーの各１ｇ当たりに結合（又は吸着）したピーナッツレクチンの質量を測定した。測定方法はニンヒドリン法によった。
診断用マーカー及び比較診断用マーカーの各１ｇ当たりに結合（又は吸着）したピーナッツレクチンの質量を測定した。測定方法はニンヒドリン法によった。
〔ＴＦ抗原への特異的結合性評価試験〕
大腸癌の粘膜表面に現れるＴｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ）抗原はその表面に、β−ガラクトシル−（１，３）−α−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を高密度に有している。このモデル表面としてシアリダーゼ処理赤血球を用いた。
シアリダーゼ処理赤血球は、表面にβ−ガラクトシル−（１，３）−α−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基をやはり高密度に有しており、これに対する各診断用マーカー及び比較診断用マーカーの特異的結合性を測定することとした。具体的には以下の通りである。
ウサギ保存血液３ｍＬをＰＢＳで５倍希釈し、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、上澄みを捨ててさらにこれをＰＢＳで５倍希釈する。この操作を３回繰り返して赤血球分画を取り出した。
赤血球分画と等量のシアリダーゼ（由来：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ、Ｒｏｃｈｅ社製）１Ｕ／ｍＬを加えて、３７℃で１時間静かに震蕩した。これをＰＢＳで４倍に希釈して、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた。その後、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させる操作を３回繰り返して、シアリダーゼ処理赤血球分画を得た。
これをＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に対して２ｖ／ｖ％溶液としてシアリダーゼ処理赤血球浮遊液とした。９６穴のタイタープレート（Ｕ底）に各ウェルの２列目以降に５０μＬずつＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）を分注する。固定化されたピーナッツレクチン量を基に、ピーナッツレクチン濃度が同じになるように調製した試料溶液（各診断用マーカー及び比較診断用マーカー）１００μＬを１列目に入れて２倍希釈列を作った。
各ウェルにシアリダーゼ処理赤血球浮遊液を５０μＬずつ分注し、室温で６０分間放置する。各ウェルの底部への沈殿状態（凝集の有無）により結合性を判定した。底部に丸く固まって沈殿したものは強く凝集しており、診断用マーカーとの結合性が低い（陰性）。底部に広がって沈殿したものは診断用マーカーとの結合性が強い（陽性）。ここで、陽性であった赤血球浮遊液混合後の最も薄い濃度を最低結合活性濃度（ピーナッツレクチン濃度）とした。この評価法では、最低結合活性濃度が低いほど、ＴＦ抗原への特異的結合性が高いと評価できる。
大腸癌の粘膜表面に現れるＴｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ）抗原はその表面に、β−ガラクトシル−（１，３）−α−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を高密度に有している。このモデル表面としてシアリダーゼ処理赤血球を用いた。
シアリダーゼ処理赤血球は、表面にβ−ガラクトシル−（１，３）−α−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基をやはり高密度に有しており、これに対する各診断用マーカー及び比較診断用マーカーの特異的結合性を測定することとした。具体的には以下の通りである。
ウサギ保存血液３ｍＬをＰＢＳで５倍希釈し、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、上澄みを捨ててさらにこれをＰＢＳで５倍希釈する。この操作を３回繰り返して赤血球分画を取り出した。
赤血球分画と等量のシアリダーゼ（由来：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ、Ｒｏｃｈｅ社製）１Ｕ／ｍＬを加えて、３７℃で１時間静かに震蕩した。これをＰＢＳで４倍に希釈して、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させた。その後、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させる操作を３回繰り返して、シアリダーゼ処理赤血球分画を得た。
これをＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に対して２ｖ／ｖ％溶液としてシアリダーゼ処理赤血球浮遊液とした。９６穴のタイタープレート（Ｕ底）に各ウェルの２列目以降に５０μＬずつＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）を分注する。固定化されたピーナッツレクチン量を基に、ピーナッツレクチン濃度が同じになるように調製した試料溶液（各診断用マーカー及び比較診断用マーカー）１００μＬを１列目に入れて２倍希釈列を作った。
各ウェルにシアリダーゼ処理赤血球浮遊液を５０μＬずつ分注し、室温で６０分間放置する。各ウェルの底部への沈殿状態（凝集の有無）により結合性を判定した。底部に丸く固まって沈殿したものは強く凝集しており、診断用マーカーとの結合性が低い（陰性）。底部に広がって沈殿したものは診断用マーカーとの結合性が強い（陽性）。ここで、陽性であった赤血球浮遊液混合後の最も薄い濃度を最低結合活性濃度（ピーナッツレクチン濃度）とした。この評価法では、最低結合活性濃度が低いほど、ＴＦ抗原への特異的結合性が高いと評価できる。
〔消化器粘膜への結合性評価試験〕
正常な粘膜や細胞表面には多様な糖鎖を表面に有していることから、同様に多様な糖鎖を表面に有している赤血球を用いて同じく凝集活性評価試験を行うことで、各診断用マーカー及び比較診断用マーカーの消化器粘膜への結合性を評価した。具体的には以下の通りである。
ウサギ保存血液３ｍＬをＰＢＳで５倍希釈し、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、上澄みを捨ててさらにこれをＰＢＳで５倍希釈する。この操作を３回繰り返して赤血球分画を取り出した。これをＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に対して２ｖ／ｖ％溶液として赤血球浮遊液とした。９６穴のタイタープレート（Ｕ底）に各ウェルの２列目以降に５０μＬずつＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）を分注する。固定化されたピーナッツレクチン量を基に、ピーナッツレクチン濃度が同じになるように調製した試料溶液（各診断用マーカー及び比較診断用マーカー）１００μＬを１列目にいれて２倍希釈列を作った。
各ウェルに赤血球浮遊液を５０μＬずつ分注し、室温で６０分間放置する。各ウェルの底部への沈殿状態（凝集の有無）により結合性を判定した。底部に丸く固まって沈殿したものは強く凝集しており、診断用マーカーとの結合性が低い（陰性）。底部に広がって沈殿したものは診断用マーカーとの結合性が強い（陽性）。ここで、陽性であった赤血球浮遊液混合後の最も薄い濃度を最低結合活性濃度（ピーナッツレクチン濃度）とした。この評価法では、最低結合活性濃度が高いほど、消化器粘膜への結合性が低いと評価できる。
正常な粘膜や細胞表面には多様な糖鎖を表面に有していることから、同様に多様な糖鎖を表面に有している赤血球を用いて同じく凝集活性評価試験を行うことで、各診断用マーカー及び比較診断用マーカーの消化器粘膜への結合性を評価した。具体的には以下の通りである。
ウサギ保存血液３ｍＬをＰＢＳで５倍希釈し、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、上澄みを捨ててさらにこれをＰＢＳで５倍希釈する。この操作を３回繰り返して赤血球分画を取り出した。これをＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に対して２ｖ／ｖ％溶液として赤血球浮遊液とした。９６穴のタイタープレート（Ｕ底）に各ウェルの２列目以降に５０μＬずつＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）を分注する。固定化されたピーナッツレクチン量を基に、ピーナッツレクチン濃度が同じになるように調製した試料溶液（各診断用マーカー及び比較診断用マーカー）１００μＬを１列目にいれて２倍希釈列を作った。
各ウェルに赤血球浮遊液を５０μＬずつ分注し、室温で６０分間放置する。各ウェルの底部への沈殿状態（凝集の有無）により結合性を判定した。底部に丸く固まって沈殿したものは強く凝集しており、診断用マーカーとの結合性が低い（陰性）。底部に広がって沈殿したものは診断用マーカーとの結合性が強い（陽性）。ここで、陽性であった赤血球浮遊液混合後の最も薄い濃度を最低結合活性濃度（ピーナッツレクチン濃度）とした。この評価法では、最低結合活性濃度が高いほど、消化器粘膜への結合性が低いと評価できる。
〔蛍光顕微鏡による識別性の評価〕
上記のＴＦ抗原への特異的結合性評価試験及び消化器粘膜への結合性評価試験で使用した、各シアリダーゼ処理赤血球浮遊液及び赤血球浮遊液を１：１（容量）混合した液を試料として、無蛍光スライドガラス上へキャストした。波長４７５ｎｍを励起光にして共焦点レーザー蛍光顕微鏡（ＬＳＭ５Ｐａｓｃａｌ，カールツァイス社製）で観察した。評価基準は以下の通りである。
〔コントラスト〕
○：蛍光を発している血球と蛍光を発していない血球が容易に区別できる。
×：蛍光を発している血球と蛍光を発していない血球の区別ができないか、又は容易でない。
〔蛍光強度〕
○：蛍光発光箇所が粒子状で明確に認識できる。
×：蛍光発光はブロードで、血球全体が発光している。
上記のＴＦ抗原への特異的結合性評価試験及び消化器粘膜への結合性評価試験で使用した、各シアリダーゼ処理赤血球浮遊液及び赤血球浮遊液を１：１（容量）混合した液を試料として、無蛍光スライドガラス上へキャストした。波長４７５ｎｍを励起光にして共焦点レーザー蛍光顕微鏡（ＬＳＭ５Ｐａｓｃａｌ，カールツァイス社製）で観察した。評価基準は以下の通りである。
〔コントラスト〕
○：蛍光を発している血球と蛍光を発していない血球が容易に区別できる。
×：蛍光を発している血球と蛍光を発していない血球の区別ができないか、又は容易でない。
〔蛍光強度〕
○：蛍光発光箇所が粒子状で明確に認識できる。
×：蛍光発光はブロードで、血球全体が発光している。
本発明の効果は、癌組織と正常組織のコントラストを高くすることが可能で、消化器癌の内視鏡による早期発見／治療に有益な診断用マーカー、及びその製造方法を提供したことにある。
Claims (3)
- 粒子径１ｎｍ〜１００μｍの粒子であって、その粒子の表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位を有し、且つ上記粒子中に識別性物質を有する、当該粒子を含有し、
上記粒子が、下記式（３）で表される構造を有するポリマーを主成分とするものであることを特徴とする、診断用マーカー。
- 上記識別性物質が、蛍光発光性物質である、請求項１記載の診断用マーカー。
- 下記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は下記式（５）で表されるマクロモノマーと、下記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させてポリマー微粒子を得、得られたポリマー微粒子に蛍光発光性物質を含有させるか、あるいは、下記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は下記式（５）で表されるマクロモノマーと、下記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させるに際して、重合系内に蛍光発光性物質を存在させることによって、ポリマー微粒子を得ると同時に該ポリマー微粒子内に蛍光発光性物質を含有させ、次いでこのポリマー微粒子の表面に抗体及び／又はレクチンを結合又は吸着させることを特徴とする、診断用マーカーの製造方法。
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