JP5116485B2 - ストレス判定方法、ストレス判定用マーカー、ストレス判定用診断薬及びストレス判断システム - Google Patents

Description

本発明は、ストレス判定方法、ストレス判定用マーカー、ストレス判定用診断薬及びストレス判断システムに関する。

近年、精神的ストレスによる疾患が社会問題となっており、ヒト及び非ヒト動物の精神状態を簡易かつ客観的に診断する方法の開発が求められている。また、このようなストレス社会では、抗疲労及び抗ストレスに効果のある機能性食品の開発が求められている。

現状では、信頼性の高いストレス判定用マーカー及び簡易かつ客観的なストレス判定方法がないため、ストレスの判定は精神科の医師による複雑な検査を必要としている。また、機能性食品の開発は、上記の理由からストレス低減食品が特定保健用食品として認可されないため、停滞しているのが現状である。

そこで、このような現状を打破するため、ストレス判定用マーカーの探索が行われている。このようなマーカーとして、心拍数及び血圧並びに血液中の副腎皮質ホルモン及び神経伝達物質の濃度が知られているが、最近では、唾液中のコルチゾール、クロモグラニンＡ、ＩｇＡ、アミラーゼがストレス判定用マーカーとして利用できることが提案されている。

特開２０００−２７５２４８号公報 特開平１１−３２６３１８号公報

しかしながら、心拍数及び血圧は一過性の現象であるためにストレスを測定するタイミングの影響を受け、血液中の成分は、採血時に注射針を刺すことによって生じるストレスの影響を受けることが明白である。また、唾液中の成分に関しては、コルチゾールはストレスに対する応答が遅く、フィードバック機構の影響を受けることが知られており、クロモグラニンＡ、ＩｇＡ及びアミラーゼは、ストレスを正確に反映していないことが次第に明らかになってきている。

そこで、本発明の目的は、ストレスを簡易かつ客観的に判定可能な方法を提供することにある。本発明の目的はまた、このような方法に適用可能な、ストレス判定用マーカー、ストレス判定用診断薬及びストレス判断システムを提供することにある。

本発明のストレス判定方法は、被検動物の体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を指標にストレスを判定することを特徴とする。

本発明の方法は、被検動物の体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を指標にしているため、被検動物が受けたストレスの程度を感度よく検出でき、簡易かつ客観的にストレスを判定することができる。また、その簡易性から家庭内で実施も十分可能であり、抗疲労及び抗ストレスに効果のある機能性食品の開発のための情報収集にも有用である。

上記方法において、Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の上昇及び低下を、それぞれストレスの上昇及び低下と判定することができる。すなわち、ストレスを調べたい作業の前後における被検動物の体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を測定し、この濃度が上昇した場合にストレスが上昇したと判断し、この濃度が低下した場合にストレスが低下したと判断することができる。

本発明のストレス判定方法は、被検動物の体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を測定する測定工程と、上記測定工程で得られたＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度と安静時における体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度とを比較する比較工程と、上記測定工程で得られたＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度が上記安静時における体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度よりも高い場合にストレスが生じたと判断する判断工程とを備えることを特徴とする。

被検動物の安静時における体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を基準値として一度測定しておけば、ストレスを判定したい時に体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を測定し、上記基準値と比較することで被検動物が受けたストレスの程度を簡易かつ客観的に判定できる。

上記体液は、非侵襲的に採取した体液であることが好ましく、体液としては唾液が特に好ましい。

上記のストレス判定方法は、被検動物の血液を使って判定できるが、採血行為は医師等の有資格者のみしかすることができず、また、注射針を刺す行為のみでもストレスが生じるため、唾液、汗、涙等の非侵襲的に採取した体液を用いてストレスの判定をすることが好ましい。Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度は、上記の非侵襲的に採取した体液中においても、被検動物が受けたストレスの程度に応じて上昇するため、このような体液を用いればストレスの程度を簡易かつ客観的に判定できる。

非侵襲的に採取した体液として唾液を用いることにより、採取時期を選ばずに必要量を容易に採取できる。したがって、被検動物が受けたストレスの程度をより簡易かつ客観的に判定できる。

本発明のストレス判定用マーカーは、Ｚｎ−α２−糖タンパク質からなることを特徴とする。

被検動物の体液中に存在するＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度は、ストレスを受けると数分以内に感度よく上昇するため、ストレス判定用マーカーとして利用できる。

本発明のストレス判定用診断薬は、抗Ｚｎ−α２−糖タンパク質抗体を含むことを特徴とする。

ストレス判定用診断薬に含まれる抗Ｚｎ−α２−糖タンパク質抗体は、被検動物の体液中に存在するＺｎ−α２−糖タンパク質と特異的に結合し、体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質を定量できるため、この診断薬は、被検動物が受けたストレスの程度を簡易かつ客観的に判定するために使用できる。

また本発明は、端末から送信された、被検動物の体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度の情報を受信する受信手段と、その受信手段により受信されたＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度の情報を格納するストレス情報格納手段と、そのストレス情報格納手段により格納されたＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度の情報を指標にストレスを判定するストレス判定手段と、そのストレス判定手段で判定された判定結果を端末に送信する判定結果送信手段とを備えるストレス判断システムを提供する。

上記ストレス判断システムを、端末と医療関連情報提供システムとが接続可能とされている電気通信網に接続可能とし、この医療関連情報提供システムが、受信した判定情報に基づいて被検動物の健康状態に関する医療関連情報を決定する手段と、この医療関連情報を端末に送信する手段とを備えていれば、被検動物の体液のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度の情報を上記ストレス判断システムに送信することで、ストレスを解消するのに役立つ情報を、持ち運び可能な端末や外部設置されている端末から必要なときに入手できる。これにより、さらなるストレスが蓄積することを予防したり、ストレスの程度に応じて睡眠時間をコントロールしたりすることができる。さらに、医療関連情報提供システムが被験者に提供する情報を工夫すれば、最適な食事、飲料、薬等のより詳細な情報を提供することもできる。

本発明のストレス判定方法により、ストレスを簡易かつ客観的に判定することが可能になる。また、既知のストレス判定用マーカーであるコルチゾール及びクロモグラニンＡを用いたストレス判定方法と比較して、個体間のばらつきが少なく、ストレスの程度を感度よく判定できる。

本発明のストレス判定方法は、被検動物の血液のみでなく、唾液等の非侵襲的に採取した体液を用いることができ、被検動物が受けたストレスの程度を家庭内で簡易かつ客観的に判定できる。

本発明のストレス判定用マーカー及びストレス判定用診断薬は、被検動物が受けたストレスの程度を簡易かつ客観的に判定するために使用できる。

本発明のストレス判断システムは、ストレスを解消するのに役立つ情報を、持ち運び可能な端末や外部設置されている端末から必要なときに入手できる。これにより、さらなるストレスが蓄積することを予防したり、ストレスの程度に応じて睡眠時間をコントロールしたりすることができる。

実施形態に係るストレス判断システムを説明するためのブロック図である。 ストレス負荷試験として採用したクレペリンテストの時間と唾液サンプルの採取時期を示した図である。 ストレス負荷試験（クレペリン作業）の前後における被験者１の唾液中Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の変化を示した図である。 ストレス負荷試験（クレペリン作業）の前後における被験者２の唾液中Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の変化を示した図である。 ストレス負荷試験（クレペリン作業）の前後における被験者３の唾液中Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の変化を示した図である。 ストレス負荷試験（クレペリン作業）の前後における被験者４の唾液中Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の変化を示した図である。 ストレス負荷試験（クレペリン作業）の前後における被験者５の唾液中Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の変化を示した図である。 ストレス負荷試験（クレペリン作業）の前後における被験者６の唾液中Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の変化を示した図である。 ストレス負荷試験（クレペリン作業）の前後における被験者７の唾液中Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の変化を示した図である。 ストレス負荷試験（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＴｒａｉｌＭａｋｉｎｇ Ｔｅｓｔ；ＡＴＭＴ）の前後における被験者８の唾液中Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の変化を示した図である。 ストレス負荷試験（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＴｒａｉｌＭａｋｉｎｇ Ｔｅｓｔ；ＡＴＭＴ）の前後における被験者９の唾液中Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の変化を示した図である。 ストレス負荷試験（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＴｒａｉｌＭａｋｉｎｇ Ｔｅｓｔ；ＡＴＭＴ）の前後における被験者１０の唾液中Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の変化を示した図である。

符号の説明

１０・・・ストレス判断システム、１２・・・受信手段、１４・・・ストレス情報格納手段、１６・・・ストレス判定手段、１８・・・判定結果送信手段、２０・・・ネットワーク、３０・・・端末、４０・・・医療関連情報提供システム、４２・・・受信手段、４４・・・判定情報格納手段、４６・・・医療情報決定手段、４８・・・決定結果送信手段。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。

（ストレス判定方法）
本発明における「ストレス」とは、何らかの刺激（ストレッサー）によって体に示される歪みや変調をいう。「ストレス」には、重圧、圧迫、圧力、歪み、緊張が含まれ、このような刺激や状況は、精神的・肉体的に負担となる。

「ストレッサー」は、１）温度、騒音等の刺激に代表される物理的ストレッサー、２）酸素の欠乏・過多、薬害、栄養不足等に代表される化学的ストレッサー、３）病原菌等が引き起こす病気に代表される生物的ストレッサー、４）人間関係のトラブル、精神的な苦痛、怒り、不安、憎しみ、緊張等に代表される精神的ストレッサー、の４つに分けることができる。なお、「ストレスがたまる」と感じさせて人を悩ませている原因のほとんどは、４）の精神的ストレッサーによるものであるといわれている。

「被検動物」としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、ヒト並びに愛玩動物及び家畜が好ましく、例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、トリ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ウサギが例示できる。

「体液」には、血液、リンパ液、組織液、脳脊髄液、滑液、粘液、ホルモン、消化液、唾液、涙、眼房水、汗、尿等が含まれるが、本発明のストレス判定方法に使用する体液としては、血液、唾液、涙、眼房水、汗、尿が好ましく、唾液がより好ましい。

また、「非侵襲的に採取した体液」とは、被検動物に疼痛や出血を伴わずに採取した体液を意味し、注射針等を被検動物に刺して採取する体液は含まれない。従って、上記体液のうち、唾液、涙、眼房水、汗、尿等が該当する。

「Ｚｎ−α２−糖タンパク質」とは、血液から見つけられた血漿タンパク質の一種であり、従来その機能は不明とされていたが、本発明によりストレス判定用マーカーとしての機能が明らかとなった。ヒトのＺｎ−α２−糖タンパク質は、２９８個のアミノ酸からなり、３箇所のＮ結合糖鎖を有する糖タンパク質であり（配列番号１；アクセッション番号ＡＡＨ３３８３０）、この遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋに登録されている（配列番号２；アクセッション番号ＢＣ０３３８３０）。Ｚｎ−α２−糖タンパク質は、その立体構造がＭＨＣクラスＩタンパク質に類似し、亜鉛イオンが添加されると容易に沈殿する性質とＲＮａｓｅ活性を有することが知られている。なお、Ｚｎ−α２−糖タンパク質は、当業者の間では、ＺＡＧと略して使用される。

次に、本発明の第一実施形態に係るストレス判定方法について説明する。

第一実施形態に係るストレス判定方法は、ストレスを調べたい作業の前後における被検動物の体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を測定し、この濃度が上昇した場合にストレスが上昇したと判断し、この濃度が低下した場合にストレスが低下したと判断する方法である。

ここで、「ストレスを調べたい作業」とは、精神的又は肉体的に負担となる作業を意味し、例えば、仕事、勉強、スポーツ及びその一部を構成する作業並びに高温、低温及び騒音下での作業、痛みを伴う作業等が該当する。

ストレスの判定は、ストレスを調べたい作業の前後における被検動物の体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を比較して、作業後の濃度が上昇した場合にストレスが上昇したと判断するが、ストレスの程度については別途基準を設けて判定できる。例えば、Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度が２倍未満の場合は低度のストレス、２倍以上３倍未満の場合は中度のストレス、３倍以上の場合は高度のストレスと判定できる。

次に、本発明の第二実施形態に係るストレス判定方法について説明する。

第二実施形態に係るストレス判定方法は、被検動物の体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を測定する測定工程と、上記測定工程で得られたＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度と安静時における体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度とを比較する比較工程と、上記測定工程で得られたＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度が上記安静時における体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度よりも高い場合にストレスが生じたと判断する判断工程とを備える方法である。

ここで、「安静時」とは、被検動物にストレスが生じていない時をいい、通常、寝ている時が最も安静であるが、体液の採取が困難であることの理由より、覚醒直後（起きてすぐ）が好ましい。しかしながら、ストレスの程度は相対的に判定できるため、ストレスが生じていないと考えられる任意の時点を、安静時として決定することもできる。

測定工程では、ストレスを判定したい時に体液を採取し、この体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を測定するが、その測定方法は、目的とする標的タンパク質を定量できればいずれの方法を用いてもよい。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、二次元電気泳動で分画したタンパク質を染色して得られる染色領域（スポット）の画像解析、プロテインチップによる解析、アフィニティークロマトグラフィーによる定量分析等が挙げられるが、ＥＬＩＳＡ法及びプロテインチップによる解析が好ましい。

比較工程では、測定工程で測定したＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度と、安静時における体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度とを比較する。例えば、測定工程において得られたＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度と安静時のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度との差を求めたり、一方の濃度を他方で除した値を検討することが挙げられる。上記濃度は、ＥＬＩＳＡ法、プロテインチップによる解析、アフィニティークロマトグラフィーによる定量分析等によって得ることができる。また、二次元電気泳動で分画したタンパク質を染色して得られる染色領域（スポット）を画像化し、その単位面積当たりの染色度合いを数値化して（例えば、ピクセル強度（ｐｉｘｅｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ））、この数値をＺｎ−α２−糖タンパク質のスポット全体について合計することで、Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度（但し、単位はない）とすることができる。

判断工程では、測定工程で得られたＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度が安静時における体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度よりも高い場合にストレスが生じたと判断するが、ストレスの程度については別途基準を設けて判定できる。例えば、Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度が２倍未満の場合は低度のストレス、２倍以上３倍未満の場合は中度のストレス、３倍以上の場合は高度のストレスと判定できる。

（ストレス判定用マーカー）
本発明のストレス判定用マーカーは、Ｚｎ−α２−糖タンパク質からなるものであるが、ここで、「ストレス判定用マーカー」とは、ストレスを判定するための指標をいい、ストレスが生じた場合に変動して、その程度を表示し得るものであればストレス判定用マーカーに該当する。ストレス判定用マーカーとしては、従来、被検動物の心拍数、血圧、コルチゾール等の副腎皮質ホルモン、アドレナリン及びノルアドレナリン等の神経伝達物質、クロモグラニンＡ、ＩｇＡ、アミラーゼ等が知られていたが、Ｚｎ−α２−糖タンパク質については、従来、機能が不明であったため「ストレス判定用マーカー」としての使用できるかといったことは全く知られていなかった。

このＺｎ−α２−糖タンパク質は、被検動物の体液中に存在し、抗Ｚｎ−α２−糖タンパク質抗体を用いた各種免疫学的手法により定量できる。例えば、唾液又は血液に含まれるＺｎ−α２−糖タンパク質は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、プロテインチップによる解析、アフィニティークロマトグラフィーによる定量分析等の手法を用いて定量できるが、ＥＬＩＳＡ法及びプロテインチップによる解析が好ましい。

（ストレス判定用診断薬）
抗Ｚｎ−α２−糖タンパク質抗体を含有させることにより、ストレス判定用診断薬が提供可能となる。

「ストレス判定用診断薬」とは、ストレスを判定するための診断薬をいい、上記したストレス判定用マーカーを特異的かつ定量的に検出できるタンパク質、核酸及び低分子化合物等を含む診断薬が該当する。

本発明のストレス判定用診断薬は、抗Ｚｎ−α２−糖タンパク質抗体を含むが、この抗体の抗原を特異的に認識する作用を阻害するものでなければ、他に緩衝液、プロテアーゼ阻害剤、ＳＨ基保護剤等を含んでいてもよい。抗Ｚｎ−α２−糖タンパク質抗体は、被検動物のＺｎ−α２−糖タンパク質を特異的に認識する抗体であればよく、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体は、被検動物のＺｎ−α２−糖タンパク質又はその合成ペプチドをウサギに免疫することにより調製でき、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法により調製できる。

本発明のストレス判定用診断薬は、被検動物から採取した体液に含まれるＺｎ−α２−糖タンパク質の検出や定量に用いることができる。定量は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、プロテインチップによる解析等で可能であり、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法及びプロテインチップによる解析が好ましい。

（ストレス判定方法、ストレス判定用マーカー及びストレス判定用診断薬の適用）
本発明のストレス判定用マーカーやストレス判定用診断薬を用いることで、本発明のストレス判定方法を実現するためのストレス判定（判断）システムが提供できる。

図１は実施形態に係るストレス判断システム１０を説明するためのブロック図である。ストレス判断システム１０は、物理的には、ＣＰＵ（中央処理装置）、メモリ、マウスやキーボードといった入力装置、ディスプレイといった表示装置、ハードディスクといった格納装置などを備えたコンピュータシステム（例えばワークステーション、パーソナルコンピュータ）として構成されている。ストレス判断システム１０は機能的な要素として、Ｚｎ−α２−糖タンパク質濃度に関する情報等（以下「ストレス情報」という。）を受信する受信手段１２（受信部）と、このストレス情報を格納するストレス情報格納手段１４（ストレス情報格納部）と、格納したストレス情報に基づいてストレスの程度を判定するストレス判定手段１６（ストレス判断部）と、この判定結果を送信する判定結果送信手段１８（判定結果送信部）とを備えて構成されている。

ストレス判断システム１０は、ネットワーク２０（例えば、インターネット等の電気通信網）と接続可能とされ、ネットワーク２０には、更に、端末３０と、医療関連情報提供システム４０とが接続可能とされている。

ここで、端末３０は被検動物の飼い主又は被験者の端末として用いられ、医療関連情報提供システム４０は、ストレス判断システム１０の判定結果送信手段１８から送信された判定情報を受信する受信手段４２（受信部）と、この判定情報を格納する判定情報格納手段４４（判定格納部）と、格納した判定情報に基づいて、健康状態を改善するのにふさわしい医療関連情報を決定する医療情報決定手段４６（医療情報決定部）と、この医療情報を端末３０に送信する決定結果送信手段４８（決定結果送信部）とを備えて構成されている。

被検動物の飼い主又は被験者（以下「被験者等」という。）の端末３０から送信された、被験者等の体液のＺｎ−α２−糖タンパク質濃度の情報（ストレス情報）は、ネットワーク２０を経由して、ストレス判断システム１０の受信手段１２（受信部）で受信され、それがストレス情報格納手段１４（ストレス情報格納部）に格納されるとともに、その情報をもとにストレス判定手段１６（ストレス判断部）によりストレス状態の判定が行われる。

この判定結果は、判定結果送信手段１８（判定結果送信部）により送信され、ネットワーク２０を経由して、医療関連情報提供システム４０の受信手段４２（受信部）で受信され、それが判定情報格納手段４４（判定格納部）に格納される。医療情報決定手段４６（医療情報決定部）は、判定情報格納手段４４（判定格納部）に格納された判定情報を参酌し、健康状態を改善するのにふさわしい薬品、食品、飲料等の医療関連情報を決定する。そして、決定された医療関連情報は決定結果送信手段４８（決定結果送信部）により送信され、ネットワーク２０を経由して、被験者等の端末３０に届けられる。

ストレス判断システム１０は診断機関で実施されるとよく、医療関連情報提供システム４０は医療機関、健康食品関連企業、製薬企業、飲食品店、コンビニエンスストア等の健康情報提供機関で実施されるとよい。また、被験者等に提供される情報の質を向上させるために、端末３０から送信される情報には、ストレス情報のみならず、体液の提供者の年齢や性別等の情報を含むようにすることが好ましい。医療関連情報提供システム４０が被験者等に提供する情報には、最適な食事や不適な食事等の情報や、食品、飲料及び製薬メーカー等との契約の上で紹介するコマーシャル等も含まれるようにすることができる。

本発明を以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）ストレス負荷試験及び唾液採取：
ストレス負荷試験として、クレペリンテストとＡｄｖａｎｃｅｄ ＴｒａｉｌＭａｋｉｎｇ Ｔｅｓｔ（以下、ＡＴＭＴ）を行なった。

クレペリンテストは、精神的ストレスを与えるストレス負荷試験として一般的であり、一桁の数値の足し算の暗算（クレペリン作業）を被験者に連続して行わせる筆記試験である。図２は、ストレス負荷試験として採用したクレペリンテストの時間と唾液サンプルの採取時期を示した図である。ストレス前唾液サンプルはクレペリン作業を行う前に採取し、ストレス後唾液サンプルはクレペリン作業を１５分間行った後に採取した。なお、クレペリン作業は、その後も引き続き１５分間行った。ストレス後唾液サンプルの採取をクレペリン作業の１５分経過時とした理由は、クレペリン作業を３０分間行った後では、唾液中でのコルチゾールの蓄積にフィードバック作用がかかって唾液中のコルチゾールの濃度が減少する場合があるからである。さらに、クレペリン作業の終了時には、被験者がほっとすることによってストレスが軽減される可能性があるからである。

一方、ＡＴＭＴは、脳の老化現象などを評価する試験として一般的であり、パソコン画面に不規則に散らばる数字を小さい番号順にできるだけ早く押させる試験である（梶尾著、新薬と臨床、２０００年、４９巻、４号、ｐ．１０４）。具体的には、まず、被験者にパソコン画面上に不規則に散らばる１〜２５の数字を小さい番号順に押させ、引き続き、数字を押すごとに数字の位置がランダムに変化する１〜２５の数字を小さい番号順に押させ、この作業を連続して１５セット行わせてストレスを与える作業である。ストレス前唾液サンプルはＡＴＭＴを行う前に採取し、ストレス後唾液サンプルはＡＴＭＴを行った後すぐに採取した。

（実施例２）二次元電気泳動、画像解析及びＰｅｐｔｉｄｅ Ｍａｓｓ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ解析：
上記の各唾液サンプルは、３０００回転で１０分間遠心分離することにより固形分を取り除き、プロテインアッセイキット（バイオラッド社）でタンパク質濃度を測定した。その後、タンパク質０．１ｍｇ相当量の各唾液サンプルをマイクロチューブに移し、等量のアセトンを加えることによりタンパク質を沈殿させ、遠心分離後、得られた沈殿に可溶化液（９Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、１％ＤＴＴ、０．３％（ｖ／ｖ）ＢｉｏＬｙｔｅ ３−１０）を加えて溶解した。可溶化した各唾液サンプルは、ＩＰＧ ＲｅａｄｙＳｔｒｉｐゲル（１７ｃｍ、ｐＨ３−１０ＮＬ；バイオラッド社）に添加し、ｓｔｒｉｐを１２時間膨潤させた後、一次元目の等電点電気泳動を行い、引き続き、１０−１６％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで、二次元目の電気泳動を行った。

電気泳動後、ゲルはＳＹＰＲＯ ＲＵＢＹ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｌ ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）で染色することにより画像解析を行い、ストレス前（クレペリン作業前）唾液サンプルとストレス後（クレペリン作業後）唾液サンプルの間で発現量が異なる染色領域（スポット）を探索した。ストレス後唾液サンプルでタンパク質の発現量が亢進したスポットは、ゲルから切り出し、プロテアーゼで処理した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより断片ペプチドの精密質量を測定し、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｓｓ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ（ＰＭＦ）解析を行った。

その結果、ストレスの前後で発現量が顕著に亢進したタンパク質は、Ｚｎ−α２−糖タンパク質であった。

（実施例３）ストレス判定用マーカータンパク質の濃度測定：
クレペリン作業の前後で採取した各唾液サンプルは、３０００回転で１０分間遠心分離することにより固形分を取り除き、その上清をストレス判定用マーカータンパク質の濃度測定に用いた。唾液中のコルチゾールの濃度は、コルチゾール ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、唾液中のクロモグラニンＡの濃度は、クロモグラニンＡ ＥＬＩＳＡキット（矢内原研究所）を用いて測定した。

唾液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度は、二次元電気泳動後のゲルを染色し、画像解析することによって、Ｚｎ−α２−糖タンパク質のスポットの染色度合いを数値化して求めた。具体的には、まず、上記の各唾液サンプルを、上記の条件で二次元電気泳動して分画し、電気泳動後のゲル中のタンパク質をＳＹＰＲＯ ＲＵＢＹ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｌ ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）で染色した。その後、染色されたゲルの画像をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸ（バイオラッド社）に取り込み、画像解析ソフトＭｅｌａｎｉｅ３（バイオラッド社）で単位面積当たりの染色度合いを数値化し（ピクセル強度（ｐｉｘｅｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ））、この数値をＺｎ−α２−糖タンパク質のスポット全体について合計して、Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度（但し、単位はない）とした。

（実施例４）ストレス負荷試験の前後における唾液中のコルチゾール、クロモグラニンＡ及びＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度の比較：
健常人４名を任意に選出して上記のストレス負荷試験（クレペリンテスト）を行い、ストレス前（クレペリン作業前）唾液サンプルとストレス後（クレペリン作業後）唾液サンプルのコルチゾール、クロモグラニンＡ及びＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を上記濃度測定方法により測定した。測定結果を表１に示す。

この結果、被験者１のストレス後の唾液中のコルチゾールの濃度は、ストレス前と比較して顕著に増加する傾向が認められたが、被験者２では約１．３倍の増加で、被験者３及び４では極わずかな増加に止まった。ストレス後の唾液中のクロモグラニンＡの濃度については、被験者１〜４のいずれにおいても、ストレス前と比較して増加する傾向は認められたが、約１．１倍〜１．６倍程度であった。

図３〜６は、それぞれ、ストレス負荷試験（クレペリン作業）の前後における被験者１〜４の唾液中Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の変化を、被験者ごとに示した図である。この結果、ストレス後の唾液中Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度については、ストレス前と比較して、被験者１で約３．１倍（図３）、被験者２で約２．４倍（図４）であり、いずれも２倍以上の上昇を示した。被験者３では約１．３倍（図５）、被験者４では約１．１倍（図６）であったものの、唾液中のＺｎ−α２−糖タンパク質は、コルチゾール及びクロモグラニンＡと比較して発現量が多く、検出及び判定を容易に行うことができた。

以上より、Ｚｎ−α２−糖タンパク質は、ストレス判定用マーカーとして知られているコルチゾール及びクロモグラニンＡよりもストレスに反応して顕著に上昇し、コルチゾール及びクロモグラニンＡを指標にした場合に判定が困難な場合であっても（被験者３及び４）、ストレスの判定が可能であることがわかった。

（実施例５）クレペリン作業及びＡＴＭＴの前後における唾液中のＺｎ−α２−糖タンパク質濃度のＥＬＩＳＡ法による比較：
ヒトＺｎ−α２−糖タンパク質を特異的に認識するポリクローナル抗体（以下、抗ＺＡＧ抗体）を用いたＥＬＩＳＡの系で、クレペリン作業及びＡＴＭＴの前後における唾液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を比較した。

配列表の配列番号１に示されるヒトＺｎ−α２−糖タンパク質を特異的に認識する抗ＺＡＧ抗体は、新生化学実験講座 第１２巻（日本生化学会編、１９９２年、ｐ．１−１２）に記載された方法に従って作成した。また、クレペリン作業及びＡＴＭＴの前後で採取した各唾液サンプルは、３０００回転で１０分間遠心分離することにより固形分を取り除き、その上清を用いた。

抗ＺＡＧ抗体を用いたＥＬＩＳＡによるＺｎ−α２−糖タンパク質の定量は、以下の手順で行なった。まず、２５μｇ／ｍＬに調製した抗ＺＡＧ抗体を９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で一晩静置することにより固相した。その後、各ウェルを洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、ブロッキング溶液（１％ ＢＳＡ、１５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３）を各ウェルに加えて２時間インキュベートし、再度、洗浄バッファーで各ウェルを５回洗浄した。その後、クレペリン作業及びＡＴＭＴの前後で採取した各唾液サンプル及び予め濃度がわかっているＺｎ−α２−糖タンパク質の標品を、それぞれ１００μＬずつ各ウェルに添加して抗ＺＡＧ抗体と２時間反応させ、洗浄バッファーで５回洗浄した後に、二次抗体としてペルオキシダーゼを結合させた抗ＺＡＧ抗体（１００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、室温で２時間反応させた。その後、各ウェルを洗浄バッファーで５回洗浄し、基質溶液（Ｓｕｒｅ Ｂｌｕｅ； ＫＰＬ社）を１００μＬずつ加えて発色させた。発色が十分進行した後に１Ｍ塩酸を各ウェルに１００μＬずつ加えて反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。Ｚｎ−α２−糖タンパク質の標品の吸光度から標準曲線を作成し、この標準曲線から各唾液サンプルに含まれるＺｎ−α２−糖タンパク質の量を定量した。

図７〜９は、それぞれ、クレペリン作業の前後における被験者５〜７の唾液中Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の変化を、被験者ごとに示した図である。

図１０〜１２は、それぞれ、ＡＴＭＴの前後における被験者８〜１０の唾液中Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の変化を、被験者ごとに示した図である。

以上より、唾液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度は、クレペリン作業及びＡＴＭＴの後に顕著に上昇することが判明し、唾液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を調べることにより、被験者が受けたストレスの程度を感度よく判定できることが示唆された。

本発明のストレス判定方法により、ストレスを簡易かつ客観的に判定することが可能になる。また、既知のストレス判定用マーカーであるコルチゾール及びクロモグラニンＡを用いたストレス判定方法と比較して、個体間のばらつきが少なく、ストレスの程度を感度よく判定できる。

また、本発明のストレス判定方法は、被検動物の血液のみでなく、唾液等の非侵襲的に採取した体液を用いることができ、被検動物が受けたストレスの程度を家庭内で簡易かつ客観的に判定できる。

Claims (8)

1. 被検動物のストレス判定方法であって、
   前記被検動物の体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を指標にストレスを判定する、ストレス判定方法。
2. 前記Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の上昇及び低下を、それぞれストレスの上昇及び低下と判定する、
   請求項１記載のストレス判定方法。
3. 被検動物の体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度を測定する測定工程と、
   前記測定工程で得られたＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度と安静時における体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度とを比較する比較工程と、
   前記測定工程で得られたＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度が前記安静時における体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度よりも高い場合にストレスが生じたと判断する判断工程と、
   を備える、ストレス判定方法。
4. 前記体液が非侵襲的に採取した体液である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のストレス判定方法。
5. 前記体液が唾液である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のストレス判定方法。
6. Ｚｎ−α２−糖タンパク質からなる、ストレス判定用マーカー。
7. 抗Ｚｎ−α２−糖タンパク質抗体を含む、ストレス判定用診断薬。
8. 端末から送信された、被検動物の体液中のＺｎ−α２−糖タンパク質の濃度の情報を受信する受信手段と、
   前記受信手段により受信された前記Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の情報を格納するストレス情報格納手段と、
   前記ストレス情報格納手段により格納された前記Ｚｎ−α２−糖タンパク質の濃度の情報を指標にストレスを判定するストレス判定手段と、
   前記ストレス判定手段で判定された判定結果を前記端末に送信する判定結果送信手段と、
   を備えるストレス判断システム。

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