JP5117064B2 - 含リン化合物及び抗腫瘍剤 - Google Patents

Description

本発明は、含リン化合物及びそれを含有する抗腫瘍剤に関する。

糖のヘテロ原子誘導体であるアミノ糖やチオ糖は天然物として自然界に存在し、抗菌活性、血糖濃度増加作用等の生理活性を有している。これに対して糖のヘミアセタール環内にリン原子を有する糖のヘテロ原子誘導体（リン糖）は天然には存在せず、また合成上の困難性から、いくつかの合成例と除草剤としての報告（例えば、特許文献１〜４参照）が知られているのみである。
一方、炭素原子−リン原子結合を有する化合物として、抗ウイルス活性を有するホスホマイシン、抗腫瘍性活性を有するシクロホスファミド等が知られている。また、炭素原子−リン原子結合を有する糖化合物としては、５−デオキシ−１，５−Ｃ−（エチルホスフィニリデン）−β−Ｄ−グルコース誘導体が弱いながらも抗ガン作用を有することが知られている。
特開平３−１１０８９号公報 特開平５−３３９２８１号公報 特開平９−２４１２８２号公報 特開２００４−９１４３５号公報

特許文献１には、リン糖には抗ガン作用等の重要な生理活性を示すものの存在が期待されると記載されているが、生理活性を示す具体的な化合物の構造及びその生理活性については記載も示唆もされていない。
本発明は、新規な含リン化合物と、抗腫瘍活性を有する含リン化合物を含む抗腫瘍剤を提供することを目的とし、該目的の達成を課題とする。

前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
すなわち、本発明は下記一般式（Ｉ）で表される含リン化合物である。

式中、Ｒ^１は、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表し、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれハロゲン原子を表し、Ｒ^４及びＲ^６は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基を表し、Ｒ^５は、ハロゲン原子を表す。

前記一般式（Ｉ）におけるＲ^１は、アリール基であることが好ましい。また、前記一般式（Ｉ）におけるＲ^２及びＲ^３は、臭素原子であることが好ましい。

下記一般式（II）又は（III）で表される含リン化合物を含む抗腫瘍剤である。

式中、Ｒ^１１は、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表し、Ｒ^１２及びＲ^１３は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシロキシ基、ヒドロキシアルキル基又はアミノ基を表し、Ｒ^１４及びＲ^１６は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基を表し、Ｒ^１５は、ハロゲン原子を表す。

前記一般式（II）又は（III）における、Ｒ^１１はアリール基であることが好ましい。また、前記一般式（II）又は（III）における、Ｒ^１２及びＲ^１３が、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子又はヒドロキシ基であることが好ましい。

本発明によれば、新規な含リン化合物と、抗腫瘍活性を有する含リン化合物を含む抗腫瘍剤を提供することができる。

本発明含リン化合物は、下記一般式（Ｉ）で表されるリン糖化合物である。本発明において、リン糖とは、糖のリン誘導体、特に糖のヘミアセタール環内にリン原子を含む化合物を意味する。

式中、Ｒ^１は、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表し、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれハロゲン原子を表し、Ｒ^４及びＲ^６は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基を表し、Ｒ^５は、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基を表す。

Ｒ^１は、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表すが、該アルキル基、アリール基、アルコキシ基及びアリールオキシ基は、更に置換基を有していてもよい。
該置換基としては、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、アミド基、アジド基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシ基、アシロキシ基、アルキルチオ基等を挙げることができる。
本発明において、Ｒ^１は抗腫瘍活性の観点から、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数６〜１２のアリール基、炭素数１〜１２のアルコキシ基又は炭素数６〜１２のアリールオキシ基であることが好ましく、炭素数１〜１２アルキル基又は炭素数６〜１２のアリール基であることがより好ましく、炭素数６〜１２のアリール基であることが更に好ましい。

Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立にハロゲン原子を表す。本発明においては、抗腫瘍活性の観点から、該ハロゲン原子はフッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子であることが好ましく、塩素原子又は臭素原子であることがより好ましく、臭素原子であることが更に好ましい。Ｒ^２及びＲ^３はそれぞれ異なるハロゲン原子であってもよいが、同一のハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ^２及びＲ^３が共に臭素原子であることがより好ましい。
本発明において、Ｒ^２及びＲ^３の立体配置は特に制限はなく、いずれの立体配置であってもよい。

Ｒ^４及びＲ^６は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基を表すが、該アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、アリール基、アシロキシ基及びアミノ基は更に置換基を有していてもよい。該置換基としてはＲ^１の説明において挙げた置換基を挙げることができる。
本発明においては、Ｒ^４及びＲ^６は水素原子、炭素数１〜１２のアルキル基又は炭素数６〜１２のアリール基であることが好ましく、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であることがより好ましい。

Ｒ^５は、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基を表すが、該アルキル基、アルコキシ基、アリール基、アシロキシ基及びアミノ基は更に置換基を有していてもよい。該置換基としてはＲ^１の説明において挙げた置換基を挙げることができる。
本発明においては、Ｒ^５は水素原子、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子）、炭素数１〜１２のアルキル基又は炭素数６〜１２のアリール基であることが好ましく、水素原子、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子又は臭素原子）又は炭素数１〜３のアルキル基であることがより好ましく、水素原子又はハロゲン原子（塩素原子又は臭素原子）であることがより好ましい。

本発明においては、Ｒ^１がアルキル基又はアリール基であって、Ｒ^２及びＲ^３が塩素原子又は臭素原子であって、Ｒ^４及びＲ^６が、それぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基であって、Ｒ^５が水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ^１がアリール基であって、Ｒ^２及びＲ^３が塩素原子又は臭素原子であって、Ｒ^４及びＲ^６が、それぞれ独立に水素原子又はアルキル基であって、Ｒ^５が水素原子又はハロゲン原子であることがより好ましい。

本発明において、一般式（Ｉ）で表されるリン糖化合物は、例えば、以下のようにして合成することができる。
特開平５−３３９２８１号公報に記載の方法又はそれを適宜変更した方法によって、下記一般式（IV）で表される二重結合を有するリン糖化合物を得ることができる。一般式（IV）で表される二重結合を有するリン糖化合物に対して、公知の方法でハロゲン分子を付加することによって、一般式（Ｉ）で表されるリン糖化合物を合成することができる。

式中、Ｒ^２１は、水素原子、水酸基、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、またはアリールオキシ基を表し、Ｒ^２２及びＲ^２３はそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基を表し、Ｒ^２４は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基を表し、Ｒ^２５は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基を表す。

以下に、本発明の一般式（Ｉ）で表されるリン糖化合物の具体例として、リン糖化合物（Ｉ−１）〜（Ｉ−２０）を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。

一般式（Ｉ）で表されるリン糖化合物は、例えば、後述するように特異的な抗腫瘍活性を有することから、例えば、ガンの治療剤として有用である。

本発明の抗腫瘍剤は、下記一般式（II）又は（III）で表されるリン糖化合物を含むことを特徴としている。本発明の抗腫瘍剤は前記リン糖化合物に加えて、界面活性剤や賦形剤等の公知の添加剤を含んでなることができる。

式中、Ｒ^１１は、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表し、Ｒ^１２及びＲ^１３は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシロキシ基、ヒドロキシアルキル基又はアミノ基を表し、Ｒ^１４及びＲ^１６は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基を表し、Ｒ^１５は、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基を表す。

Ｒ^１１は、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表すが、該アルキル基、アリール基、アルコキシ基及びアリールオキシ基は、更に置換基を有していてもよい。該置換基としてはＲ^１の説明において挙げた置換基を挙げることができる。
本発明において、Ｒ^１１は抗腫瘍活性の観点から、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数６〜１２のアリール基、炭素数１〜１２のアルコキシ基又は炭素数６〜１２のアリールオキシ基であることが好ましく、炭素数１〜１２のアルキル基又は炭素数６〜１２のアリール基であることがより好ましく、炭素数６〜１２のアリール基であることが更に好ましい。

Ｒ^１２及びＲ^１３は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシロキシ基、ヒドロキシアルキル基又はアミノ基を表すが、水素原子、ハロゲン原子又はヒドロキシ基であることが好ましい。
また本発明においては、Ｒ^１２及びＲ^１３のうち少なくとも１つはハロゲン原子であることが好ましい。
Ｒ^１２及びＲ^１３におけるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が挙げられるが、抗腫瘍活性の観点から、フッ素原子、塩素原子又は臭素原子であることが好ましく、塩素原子又は臭素原子であることがより好ましく、臭素原子であることが更に好ましい。
本発明において、Ｒ^１２及びＲ^１３の立体配置は特に制限はなく、いずれの立体配置であってもよい。

Ｒ^１４及びＲ^１６は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基を表すが、該アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基は更に置換基を有していてもよい。該置換基としてはＲ^１の説明において挙げた置換基を挙げることができる。
本発明においては、Ｒ^１４及びＲ^１６は水素原子、炭素数１〜１２のアルキル基又は炭素数６〜１２のアリール基であることが好ましく、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であることがより好ましい。中でもＲ^１４が炭素数１〜３のアルキル基であることが特に好ましい。

Ｒ^１５は、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基又はアリール基を表すが、該アルキル基及びアリール基は更に置換基を有していてもよい。該置換基としてはＲ^１の説明において挙げた置換基を挙げることができる。
本発明においては、Ｒ^１５は水素原子、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子）、炭素数１〜１２のアルキル基又は炭素数６〜１２のアリール基であることが好ましく、水素原子、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子又は臭素原子）又は炭素数１〜３のアルキル基であることがより好ましく、水素原子又はハロゲン原子（塩素原子又は臭素原子）であることがより好ましい。

本発明においては、一般式（II）で表されるリン糖化合物は、Ｒ^１１がアリール基であって、Ｒ^１２及びＲ^１３がそれぞれ独立にハロゲン原子又はヒドロキシ基であって、Ｒ^１４及びＲ^１６が、それぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基であって、Ｒ^１５が水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ^１１がアリール基であって、Ｒ^１２及びＲ^１３がそれぞれ独立にハロゲン原子（塩素原子もしくは臭素原子）又はヒドロキシ基であって、Ｒ^１４が炭素数１〜３のアルキル基であって、Ｒ^１６が水素原子又はアルキル基であって、Ｒ^１５が水素原子又はハロゲン原子（塩素原子もしくは臭素原子）であることがより好ましい。

また、一般式（III）で表されるリン糖化合物は、Ｒ^１１がアリール基であって、Ｒ^１２が水素原子であって、Ｒ^１４及びＲ^１６が、それぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基であって、Ｒ^１５が水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ^１１がアリール基であって、Ｒ^１２が水素原子であって、Ｒ^１４が炭素数１〜３のアルキル基であって、Ｒ^１６が水素原子又はアルキル基であって、Ｒ^１５が水素原子又はハロゲン原子（塩素原子もしくは臭素原子）であることがより好ましい。

以下に、本発明における一般式（II）又は（III）で表されるリン糖化合物の具体例としては、前記リン糖化合物（Ｉ−１）〜（Ｉ−２０）、及び、下記リン糖化合物（II-１）〜（II−１２）、（III−１）〜（III−８）を挙げることができるが、本発明はこれらに限定されるものではない。

本発明における一般式（II）又は（III）で表されるリン糖化合物は、例えば、上記一般式（IV）で表されるリン糖化合物を中間体として、公知の方法により合成することができる。

本発明における一般式（II）又は（III）で表されるリン糖化合物は、腫瘍細胞にのみ作用し、正常細胞には作用を及ぼさないという極めて高い選択性を有している。それゆえ、一般式（II）又は（III）で表されるリン糖化合物を抗腫瘍剤として用いた場合には副作用は極めて低いことが期待される。例えば、ヒト慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２に対しては、低濃度で致死作用を示すのに対して、健常人から採取した白血球に対しては、高濃度であっても致死作用を示すことはない。したがって、前記リン糖化合物を含む抗腫瘍剤は極めて高い選択性を有している。また、ヒト急性単球性白血病細胞Ｕ９３７に対しても低濃度で有効に作用する。したがって、極めて高い抗腫瘍活性とスペクトルの広い薬剤であり、ガンの治療薬として極めて有用である。

前記リン糖化合物の腫瘍細胞に対する作用機序は、未だ明確にはなっていないが、例えば以下のように推察される。すなわち、前記リン糖化合物は、一種の分子標的化合物であり、腫瘍細胞の細胞周期調節機構に作用して、腫瘍細胞に致死作用を及ぼすものと考えられる。

本発明の抗腫瘍剤は、慢性骨髄性白血病、成人急性骨髄性白血病等の各種の白血球のガンの他、消化器、神経、筋肉、肺、皮膚等の固形ガンにも有効である。本発明の抗腫瘍剤は、上述の高い活性と選択性とに加えて、副作用が抑制され、かつ、広いスペクトルを有する新しいタイプの抗腫瘍剤である。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」はモル基準である。

（実施例１）
２，３，４−トリブロモ−３−メチル−１−フェニルホスホラン １−オキシドの合成

アルゴン雰囲気下に、３−メチル−１−フェニル−２−ホスホレン １−オキシド ２．４ｍｍｏｌをクロロホルム ２５ｍｌに溶解し、Ｎ−ブロモスクシンイミド （ＮＢＳ）２．２ｍｍｏｌとα，α’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．２０ｍｍｏｌを加え、７０℃で６時間還流攪拌した。放冷後、クロロホルムにて希釈し、析出したスクシンイミドをろ過にて取り除いた。濾液を１０％亜硫酸ナトリウム水溶液、水、食塩水にて順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧下溶媒を留去して、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール ２０／１）にて精製し、４−ブロモ−１−フェニル-２-ホスホレン １−オキシドを半固形物として６０％の収率で得た。
上記で得られた４−ブロモ−１−フェニル−２−ホスホレン １−オキシド ２．０ｍｍｏｌを四塩化炭素 １５ｍｌに溶解し、７５℃以上に加熱した。そこへ臭素２．０ｍｍｏｌを四塩化炭素に溶解したものを加えた。８０℃で８時間加熱した後、クロロホルム ３０ｍｌにて希釈し、１０％亜硫酸ナトリウム水溶液、水、食塩水にて順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧下溶媒を留去して、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール ２５／１）にて精製し、２，３，４−トリブロモ−１−フェニル-２-ホスホラン １−オキシドを固形物として６９％の収率で得た。
融点１４２〜１４４℃
^１Ｈ−ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)：δ２．１４(ｓ，３Ｈ，ＣＨ₃)，２．７８−３．１４(ｍ，２Ｈ，Ｈ−５)，４．２６(ｄ，Ｊ_ＰＨ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ，２−Ｈ)，４．６７−４．７８（ｍ，１Ｈ，４−Ｈ）,７．５７−７．７８（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）:δ２３．６０，２５．０６，３８．８６，５４．６５，５６．５０，１２９．０５，１３０．０９，１３１．６５，１３６．６７
^３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３; Ｈ_３ＰＯ_４）:δ３０．５５
ＭＳ（ｍ／ｚ）:４３１．８６（Ｍ^＋，＋Ｈ）

（実施例２）
２，３−ジブロモ−１−フェニルホスホラン １−オキシドの合成

１−フェニル−２−ホスホレン １−オキシド０．１２ｇを水／ＴＨＦの混合溶媒（水＝１２．０ｍＬ、ＴＨＦ＝３．０ｍＬ）に溶解させ、氷浴上で臭素０．２ｍＬ（過剰量）を加え室温で２日間撹拌した。次に、飽和亜硫酸ナトリウム水溶液１０ｍＬを加えて、しばらく撹拌し臭素の色が消失したのを確認した。その後、分液して水層をクロロホルム３×１０ｍＬで抽出し、続いて有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｍＬ、飽和塩化ナトリウム水溶液２０ｍＬの順で洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ減圧下溶媒を留去後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製した。
これにより、目的化合物である油状化合物２,３−ジブロモ−３−ヒドロキシ-1-フェニルホスホラン １−オキシド（０．１４ｇ，０．４２ｍｍｏｌ，ｙ.６４％）を得た。
融点１３９．９４℃、沸点１９７．４８℃、
Ｒｆ＝０．５６（ＣＨＣｌ_３:ＭｅＯＨ＝２０:１），
ＭＳ ｍ／ｚ ３３８．３８（ＭＨ^＋）:
ＩＲ（ＫＢｒ）:１１８７ｃｍ^−１（Ｐ＝Ｏ），７４８ｃｍ^−１，１２４１ｃｍ^−１（Ｃ−Ｂｒ）
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，３００ＭＨｚ）:δ（ｐｐｍ）;２．３０−２．８２（ｍ，４Ｈ，Ｈ−４，５），４．２８−４．３１（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２，３），７．５０−７．８８（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）
また、副生成物として白色結晶の２−ブロモ−３−ヒドロキシ−１−フェニルホスホラン １−オキシド（０．０１ｇ，２．２５×１０^−３ｍｍｏl，ｙ．３．５％）を得た。
融点１５０．３１−１７１．１７℃,
Ｒｆ＝０．１６（ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ＝２０：１）,
ＭＳｍ／ｚ ２７６．４７（ＭＨ^＋）
ＩＲ（ＫＢｒ）：１０６４ｃｍ^−１（Ｐ＝Ｏ），７３２ｃｍ^−１，１１９５ｃｍ^−１（Ｃ−Ｂｒ），３２３９ｃｍ^−１（ＯＨ）
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）；１．７０(s，１Ｈ，ＯＨ），２．２４−２．３５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５），２．５３−３．０２ （ｍ，２Ｈ，Ｈ−４），４．０９（ｄ，１Ｈ，Ｈ−２，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．６０−４．６４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），７．５４−７．８８（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）

（実施例３）
２，３−ジブロモ−３−メチル−１−フェニルホスホラン １−オキシドの合成

３−メチル−１−フェニル−２−ホスホレン １−オキシド０．６６ｇを水・クロロホルム混合溶媒（水＝２０．０ｍＬ、クロロホルム＝５．０ｍＬ）に溶解させ、氷浴上で臭素１．０ｍＬ（過剰量）を加え室温で２日間撹拌した。次に、飽和亜硫酸ナトリウム水溶液１０ｍＬを加え、しばらく撹拌し臭素の色が消失したのを確認した。その後、分液して水層をクロロホルム４×１５ｍＬで抽出し、続いて有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２５ｍＬ、飽和塩化ナトリウム水溶液２５ｍＬの順で洗浄した後、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ減圧下溶媒を留去後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製した。
これにより、油状化合物として２，３−ジブロモ−３−メチル−１−フェニルホスホラン １−オキシドを０．３４ｇ（ｙ．２９％）得た。
また、白色結晶として２−ブロモ−３−メチル−３−ヒドロキシ−１−フェニルホスホラン １−オキシドを０．４０ｇ（ｙ．４１％）を得た。

＜２−ブロモ−３−メチル−３−ヒドロキシ−１−フェニルホスホラン １−オキシド＞
融点１５９．６３℃,
Ｒｆ＝０．２８（ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ＝２０：１）,
ＭＳ ｍ／ｚ ２８９．３６（ＭＨ^＋）
ＩＲ（ＫＢｒ）：１０６４ｃｍ^−１（Ｐ＝Ｏ），７４８ｃｍ^−１，１２６５ｃｍ^−１（Ｃ−Ｂｒ），３２３２ｃｍ^−１（ＯＨ）
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ１．６６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_３），２．１２−２．３３（ｍ，２Ｈ，Ｈ−４），２．３９−２．５４（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５），４．１９（ｓ，１Ｈ，Ｃ−２），５．８７（ｓ，１Ｈ，ＯＨ），７．２６−７．８３（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）
＜２，３−ジブロモ−３−メチル−１−フェニルホスホラン １−オキシド＞
融点１８９．２０℃，沸点２８０．２４℃，
Ｒｆ＝０．４２（ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ＝２０：１），
ＭＳ ｍ／ｚ ３５３．２０（ＭＨ^＋）
ＩＲ（ＫＢｒ）：１１２６ｃｍ^−１（Ｐ＝Ｏ），７４８ｃｍ^−１，１３９６ｃｍ^−１（Ｃ−Ｂｒ）
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ１．６７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_３），２．３６−２．４６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−４），２．９７−３．０２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５），４．０９−４．３１（ｄｄｓ，１Ｈ，Ｃ−２），７．５１−７．７０（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）

（参考例）
２，３−エポキシ−３−メチル−１−フェニルホスホラン １−オキシドの合成

２−ブロモ−３−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニルホスホラン １−オキシド３．８８ｇをクロロホルム３．０ｍＬに溶解させた後に、水酸化カリウム水溶液（０．５ｍｏｌ／Ｌ）２０ｍＬを加えて、４０℃で１時間撹拌した。反応後、溶液をクロロホルム３×１５ｍＬで抽出し、続いて有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２５ｍＬ、飽和塩化ナトリウム水溶液２５ｍＬの順で洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下溶媒を留去後シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール＝２０／１）により精製した。これによりerythro−２，３−エポキシ−３−メチル−１−フェニルホスホラン １−オキシドを２．６７ｇ（ｙ．４８％）と、threo−２，３−エポキシ−３−メチル−１−フェニルホスホラン １−オキシドを０．６６ｇ（ｙ．１１％）得た。

＜erythro体＞
Ｒｆ＝０．４３（ＡｃＯＥｔ：ＭｅＯＨ＝２０：１）,
ＭＳ ｍ／ｚ ２０９．４７（ＭＨ^＋）
ＩＲ（ＫＢｒ）：１１８０ｃｍ^−１（Ｐ＝Ｏ），１０６４ｃｍ^−１，１２５７ｃｍ^−１（Ｃ−Ｏ−Ｃ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ１．９４−２．１１（ｍ，２Ｈ，Ｈ−４），２．５４−２．５８（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５），３．３８−３．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ２，Ｐ＝２９．１Ｈｚ，Ｊ２，３＝３．０Ｈｚ，Ｈ−２），３．８３−３．８５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），７．５１−７．７５（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）
＜threo体＞
Ｒｆ＝０．４３（ＡｃＯＥｔ：ＭｅＯＨ＝２０：１）,
ＭＳ ｍ／ｚ ２０９．４７（ＭＨ^＋）
ＩＲ（ＫＢｒ）：１１８０ｃｍ^−１（Ｐ＝Ｏ），１０６４ｃｍ^−１，１２５７ｃｍ^−１（Ｃ−Ｏ−Ｃ）
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）；１．９４−２．１１（ｍ，２Ｈ，Ｈ−４），２．５４−２．５８（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５），３．３９−３．４９（ｄ，１Ｈ，Ｈ−２，Ｊ＝２８．８Ｈｚ）７．５１−７．８０（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）

−抗腫瘍活性−
（ＭＴＴアッセイ）
以下のような手順で、ＭＴＴ法を用いてリン糖化合物の抗腫瘍活性を評価した。
リン糖化合物として下記に示す化合物（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｅ−１）〜（Ｅ−４）を用い、リン糖化合物をＤＭＳＯに溶解して、アッセイ試料溶液を調製し、次の抗腫瘍活性プロトコールに従ってＭＴＴ法によるin vitro評価を行った。

１．対数増殖期にある細胞を５０００個／ウェルの濃度になるよう計数し、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに５０μｌずつ播いた。
２．炭酸ガスインキュベータ内で２４時間前培養した。
３．アッセイ試料溶液を培養液にて目的の濃度に調製して、各ウェルに５０μｌずつ添加した。
４．炭酸ガスインキュベータ内で４８時間培養した。
５．ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
６．炭酸ガスインキュベータ内で１〜４時間呈色反応を行った。
７．マイクロプレートリーダーを用い、５５０ｎｍの吸光度を測定した。

ＭＴＴ法による吸光度は生細胞数に依存することから、抗腫瘍活性の測定においては、吸光度が小さいほど腫瘍細胞が死滅し、よって抗腫瘍活性が強いことを意味する。

図１には、ヒト慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２を用いて、横軸に添加したリン糖化合物の濃度をとり、縦軸に抗腫瘍活性度を表す生細胞数に相当する吸光度をとったグラフを示す。
また、図２（Ａ）には急性骨髄性白血病ＡＭＬ患者から採取した血液（腫瘍細胞が４０％の割合で認められる）を用いた結果を示し、図２（Ｂ）には健常人から採取した血液を用いた結果を示す。

次に、実施例３において合成した２，３−ジブロモ−３−メチル−１−フェニルホスホラン １−オキシド（ジブロモ体、上記Ｅ−１）を、高速液体クロマトグラフ（カラム：ワコーシル５ＳＩＬ、φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）に付し、溶離液としてクロロホルム：メタノール＝４０：１を用いて分離精製したところ、保持時間（リテンションタイム、ＲＴ）が異なる４つの立体異性体が得られた。各立体異性体についての核磁気共鳴スペクトルのデータを下記表１に示す。また、各立体異性体についての抗腫瘍活性をＭＴＴ法によって評価した。結果を図３に示す。

図３（Ａ）には、ジブロモ体の立体異性体混合物として、ヒト慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２及びヒト急性単球性白血病細胞Ｕ９３７に対して、投与した結果を示す。また図３（Ｂ）には、ジブロモ体の立体異性体混合物（Ｃｏｍｐｌｅｘ）及び異なる保持時間を示す立体異性体（保持時間（分）：８．２、９．１、９．９、１１．５）をそれぞれ投与した結果を示す。

次に、実施例１で合成した２，３，４−トリブロモ−３−メチル−１−フェニルホスホラン １−オキシド（トリブロモ体、上記Ｅ−４）の抗腫瘍活性について、ＭＴＴ法を用いて、ジブロモ体並びに抗腫瘍剤ＡＭＮ１０７（イマニチブ誘導体）と比較した。結果をぞれぞれ図４及び図５に示す。
図４は、ヒト慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２に対するジブロモ体（Ｅ−１）とトリブロモ体（Ｅ−４）の抗腫瘍活性を示すグラフである。
また、図５（Ａ）はヒト慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２に対するトリブロモ体（Ｅ−４）とＡＭＮ１０７（イマニチブ誘導体）の抗腫瘍活性を示すグラフであり、図５（Ｂ）はヒト急性単球性白血病細胞Ｕ９３７に対するトリブロモ体（Ｅ−４）とＡＭＮ１０７（イマニチブ誘導体）の抗腫瘍活性を示すグラフであり、図５（Ｃ）はヒト前骨髄球性白血病細胞ＨＬ６０に対するトリブロモ体（Ｅ−４）とＡＭＮ１０７（イマニチブ誘導体）の抗腫瘍活性を示すグラフである。

（細胞周期解析）
細胞周期解析は、ＤＮＡ結合性色素（ヨウ化プロピジウム；ＰＩ）で染色後、個々の細胞内のＤＮＡ含有量を測定することで行うことができる。細胞周期解析において、細胞は二倍体（２ｎ）のＤＮＡを有するＧ０／Ｇ１期の細胞、四倍体（４ｎ）のＤＮＡを有するＧ２＋Ｍ期の細胞、及びそれらの中間のＳ期の細胞に分類される。また、アポトーシス細胞はＧ０／Ｇ１期の細胞よりもＤＮＡ含有量が少ない細胞として検出することができる。

細胞周期分析は、ヒト慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２を用い、上記リン糖化合物（Ｅ−１）を５０μＭ、ＡＭＮ１０７（イマニチブ誘導体）を５０μＭの濃度として４８時間インキュベートした後、下記手順に従って、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＸＬ、ベックマンコールター社製）を用いて行った。
１．細胞数１×１０^６個の細胞をＰＢＳで洗浄後、１．５ｍｌチューブに移し、遠心機で２５００回転、５分間遠心した。
２．上清を除去し、冷エタノール５００μｌを加えて４℃で４時間以上固定した。
３．２５００回転、５分間遠心し、上清を除去した。
４．ＰＢＳを２００μｌ加えて、再び２５００回転、５分間遠心しエタノールを除去した。
５．上清を除去し、細胞ペレットを４０μｌのリン酸−クエン酸緩衝液に浮遊させて、時々攪拌しながら室温で３０分以上置き、断片化したＤＮＡを抽出した。
６．２５００回転、５分間遠心して、上清を除去した。細胞ペレットをＰＢＳ１００μｌに再浮遊させ、ＲＮａｓｅ Ａ溶液１μｌを加えて、３７℃、３０分間インキュベートした。
７．２５００回転、５分間遠心し、上清を除去した。
８．細胞ペレットをＰＢＳ１ｍｌに浮遊させ、ＰＩ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを加えて混和し、暗所にて、３０分間染色した。
９．ナイロンメッシュ（５０μｍ）を通した後、フローサイトメトリーにより各細胞のＤＮＡ量を測定し、細胞周期解析プログラムを用いてヒストグラム解析を行った。
結果を図６に示す。

（腫瘍細胞を用いた評価）
ヒト由来胃ガン細胞ＭＫＮ４５及びヒトメラニン欠乏性黒色腫瘍細胞Ｃ３２ＴＧを用いて、以下の手順に従って、リン糖化合物の抗腫瘍活性を評価した。
１．対数増殖期にある腫瘍細胞を１００００個／ウェルの濃度になるように計数し、２４ウェルプレートの各ウェルに５００μｌずつ播いた。
２．炭酸ガスインキュベータ中で、約１２時間培養し、各ウェルに腫瘍細胞を定着させた。
３．各ウェルから培養液を取り除き、所望のリン糖化合物濃度を有する培養液を５００μｌ加えた。所望のリン糖化合物濃度を有する培養液は、評価対象化合物を予めＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解しておき、これを用いて調製した。
４．炭酸ガスインキュベータ中で、所定の時間（１〜４８時間）培養し、腫瘍細胞の形態変化を光学顕微鏡で観察した。光学顕微鏡による観察は、無染色で位相差レンズを用いて１００倍または２００倍の倍率で、腫瘍細胞が生きた状態で行った。
図７にヒト由来胃ガン細胞ＭＫＮ４５を用いた結果を示し、図８にはヒトメラニン欠乏性黒色腫瘍細胞Ｃ３２ＴＧを用いた結果を示す。

図７左はコントロールとしてＤＭＳＯを用いて４８時間培養した後の顕微鏡写真であり、図７右はリン糖化合物として上記ジブロモ体（Ｅ−１）を２００μＭの濃度で加えて４８時間培養した後の顕微鏡写真である。
また、図８（Ａ）はコントロールとしてＤＭＳＯを用いて２４時間培養した後の顕微鏡写真であり、図８（Ｂ）はリン糖化合物として上記トリブロモ体（Ｅ−４）を１００μＭの濃度で加えて２４時間培養した後の顕微鏡写真である。尚、倍率は１００倍である。

図１から、上記一般式（II）又は（III）で表されるリン糖化合物は良好な抗腫瘍活性を示すことがわかる。また図２から、上記一般式（II）又は（III）で表されるリン糖化合物は腫瘍細胞に選択的に作用することがわかる。
図３から、ジブロモ体は良好な抗腫瘍活性を示すことがわかる。また特定の立体構造を有するジブロモ体の抗腫瘍活性が特に強いことが分かる。

図４から、トリブロモ体（Ｅ−４）はジブロモ体（Ｅ−１）よりも、強い抗腫瘍活性を有していることが分かる。
図５から、ヒト慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２に対してトリブロモ体（Ｅ−４）はＡＭＮ１０７（イマニチブ誘導体）と同等程度の強い抗腫瘍活性を示すことが分かる。また、ヒト急性単球性白血病細胞Ｕ９３７やヒト前骨髄球性白血病細胞ＨＬ６０に対しては、ＡＭＮ１０７（イマニチブ誘導体）よりも遥かに強い抗腫瘍活性を示すことが分かる。

図６から、上記一般式（II）又は（III）で表されるリン糖化合物はアポトーシスあるいは、細胞周期を止めることにより、抗ガン作用を発揮することが推定される。
図７から、コントロールは胃ガン細胞が活発に細胞分裂を行っているため、サンプル表面全体に細胞がひしめき合っているのが分かる。これに対してリン糖化合物投与後のサンプルは胃ガン細胞が死滅しているため、死滅した細胞が縮小し減少しているのが分かる。
図８から、コントロールはヒトメラニン欠乏性黒色腫瘍細胞Ｃ３２ＴＧが活発に細胞分裂を行っているため、サンプル表面全体に細胞がひしめき合っているのが分かる。これに対してリン糖化合物投与後のサンプルはヒトメラニン欠乏性黒色腫瘍細胞Ｃ３２ＴＧが死滅しているため、死滅した細胞が縮小し減少しているのが分かる。

以上から、上記一般式（II）又は（III）で表されるリン糖化合物によれば、選択的で良好な抗腫瘍活性を有する抗腫瘍剤を提供することができる。

リン糖化合物の抗腫瘍活性を示すグラフである。 リン糖化合物の特異的な抗腫瘍活性を示すグラフである。 ジブロモ体の抗腫瘍活性を示すグラフである。 トリブロモ体とジブロモ体とを比較した抗腫瘍活性を示すグラフである。 トリブロモ体とＡＭＮ１０７（イマニチブ誘導体）とを比較したＫ５６２、Ｕ９３７及びＨＬ６０に対する抗腫瘍活性を示すグラフである。 細胞周期分析の結果を示すグラフである。 ジブロモ体の胃ガン細胞ＭＫＮ４５に対する抗腫瘍活性を示す顕微鏡写真である。 トリブロモ体のヒトメラニン欠乏性黒色腫瘍細胞Ｃ３２ＴＧに対する抗腫瘍活性を示す顕微鏡写真である。

Claims (5)

1. 下記一般式（Ｉ）で表される含リン化合物。
   
   ［式中、Ｒ^１は、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表し、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれハロゲン原子を表し、Ｒ^４及びＲ^６は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基を表し、Ｒ^５は、ハロゲン原子を表す。］
2. 前記一般式（Ｉ）におけるＲ^１がアリール基であって、Ｒ^２及びＲ^３が臭素原子であることを特徴とする請求項１に記載の含リン化合物。
3. 下記一般式（II）又は（III）で表される含リン化合物を含む抗腫瘍剤。
   
   ［式中、Ｒ^１１は、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表し、Ｒ^１２及びＲ^１３は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシロキシ基、ヒドロキシアルキル基又はアミノ基を表し、Ｒ^１４及びＲ^１６は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、アリール基、アシロキシ基又はアミノ基を表し、Ｒ^１５は、ハロゲン原子を表す。］
4. 前記一般式（II）又は（III）における、Ｒ^１１がアリール基であることを特徴とする請求項３に記載の抗腫瘍剤。
5. 前記一般式（II）又は（III）における、Ｒ^１２及びＲ^１３が、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子又はヒドロキシ基であることを特徴とする請求項３又は請求項４に記載の抗腫瘍剤。