JP5118025B2 - センスｒｎａ合成のための方法およびキット - Google Patents

Description

関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、完全に本明細書に援用される、２００５年６月１０日出願の米国特許出願第１１／１５０，７９４号に優先権を請求する。
配列表
コンピュータ読取り可能型の配列表は、その全体が本明細書に援用される。
技術分野
本発明は、一般的に、核酸分子を合成するための組成物および方法に関する。

背景技術
マイクロアレイ技術は、遺伝子発現プロフィールを生成し、そして分析するための強力なツールとなってきている。しかし、マイクロアレイ発現分析は、多量のＲＮＡを要求し、これはしばしば入手不能である（Ｗａｎｇら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３４：３９４−４００（２００３）を参照されたい）。この問題を克服するため、いくつかのＲＮＡ増幅技術が開発されてきている。しかし、これらの技術は、一般的に、増幅バイアス（例えば、米国特許第６，５８２，９０６号を参照されたい）として知られる現象に苦しむ。これらの場合、ＲＮＡ分子の増幅集団は、元来の試料に存在するＲＮＡ分子の集団に比例的に対応しない。

例えば、Ｅｂｅｒｗｉｎｅおよび同僚らによって開示された方法において（例えば、米国特許第５，５４５，５２２号；第５，７１６，７８５号；第５，８９１，６３６号；第５，９５８，６８８号；および第６，２９１，１７０号を参照されたい）、複合オリゴヌクレオチド（compound oligonucleotide）が増幅に利用され、ここで複合オリゴヌクレオチドは、Ｔ７プロモーターおよびプライマーの両方を含めて提供される。複合オリゴヌクレオチドを用いて、最初のｍＲＮＡ転写物のｃＤＮＡコピーが生成され、二本鎖であるｃＤＮＡを生成する、第二鎖合成が続く。ＲＮＡ増幅は、複合オリゴヌクレオチドのプロモーター部分を介して行われ、ｃＤＮＡの第二鎖から離れて転写が進行する。第二鎖が転写に用いられるため、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ法は、最初のｍＲＮＡ配列に対してアンチセンスである増幅ＲＮＡを産生する。

しかし、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ法は、利用する酵素の不完全な進行性（すなわち、酵素が核酸分子に付着したままであることが不可能であること）、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの配置のため、工程各々の間ずっと、３’バイアスを導入する（例えば、米国特許第６，５８２，９０６号および米国特許公報第ＵＳ２００３／０１０４４３２号を参照されたい）。例えば、第一鎖ｃＤＮＡを生じるために用いる複合オリゴヌクレオチドは、プロモーターをｃＤＮＡの５’端に置き、これはメッセージの３’端に対応する。このことは、ＲＮＡポリメラーゼがいくつかのテンプレートの転写を完了することが不可能である（おそらく、ポリＡテール領域が長いためか、またはテンプレート中の二次および三次構造による干渉のため）ことと組み合わされて、増幅されたアンチセンスＲＮＡ集団に３’バイアスを生じうる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼによる第二鎖ｃＤＮＡ合成が不完全であれば、これらのｃＤＮＡは機能するプロモーターを欠き、増幅された集団において、元来のＲＮＡ分子の提示の減少（またはおそらく完全な非存在）を生じるであろう。

その全体が本明細書に明確に援用される、本出願者らの同時係属米国特許出願第１０／９７９，０５２号は、ＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能である一本鎖プロモーター・テンプレートを、ｃＤＮＡ分子の３’端に付着させるための方法を開示する。ＤＮＡポリメラーゼを用いて、プロモーター・テンプレートを二本鎖プロモーターに酵素的に変換した後、ＲＮＡポリメラーゼを添加することによってｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を開始して、元来のＲＮＡ分子と同じ配向を有するセンスＲＮＡ（ｓＲＮＡ）分子の合成を生じる。該ｓＲＮＡ分子を逆転写し、そして第二周期のｃＤＮＡ分子にプロモーター・テンプレートを再付着させ、続いて二本鎖プロモーターに酵素的に変換した後、ＲＮＡポリメラーゼで第二周期のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行うことによって、さらなる周期のｓＲＮＡ合成を行ってもよい。

プロモーター・テンプレートの再付着およびそれに続く二本鎖プロモーターへの酵素的変換後のｃＤＮＡ合成の一連の各周期の必要を伴わずに、米国特許出願第１０／９７９，０５２号に開示するようなｓＲＮＡ合成のさらなる周期を行うための方法を提供することが望ましいであろう。

発明の概要
本出願者らは、多様な核酸テンプレートから、ｓＲＮＡ分子を合成するための方法およびキットであって、第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列および少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能な一本鎖プロモーター・テンプレートを、第一周期のｃＤＮＡ分子の３’端に付着させる、前記方法およびキットを発明した。本出願者らは、こうしたプロモーター・テンプレートの使用によって、一本鎖プロモーター・テンプレートの再付着およびそれに続く二本鎖プロモーターへの酵素的変換後のｃＤＮＡ合成の一連の各周期に関連する複雑な一連の工程を反復する必要を伴わずに、多数周期のｓＲＮＡ合成が可能になることを発見した。第二以降の周期の逆転写中に、または逆転写直後にプロモーター配列相補体を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを付加することによってのいずれかで、二本鎖プロモーター配列（単数または複数）を再生する。非特異的アーチファクト数の付随する増加を伴わずに、特異的ＲＮＡ増幅が、先の方法より１００〜１０００倍増加する。

したがって、本発明の１つの側面は、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を合成するための方法であって：５’端および３’端を有する少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子を提供し；前記ｃＤＮＡ分子の３’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ；前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレートをアニーリングさせ、ここで前記一本鎖プロモーター・テンプレートはＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能である；前記一本鎖ＲＮＡプロモーター・テンプレートが、第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、および前記の第一のプロモーターの３’側の少なくとも第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールを伸長させ；そして、前記の第一または第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写を開始して、それによって、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を合成する、前記方法に関する。

本発明の別の側面は、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うための方法であって：５’端および３’端を有する少なくとも１つの第一周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を提供し；前記の第一周期ｃＤＮＡ分子の３’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ；前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレートをアニーリングさせ、ここで前記一本鎖プロモーター・テンプレートはＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能である；前記一本鎖プロモーター・テンプレートが、第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、および前記の第一のプロモーターの３’側の少なくとも第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールを伸長させ；前記の第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写の第一の周期を開始して、少なくとも１つの第一周期ｓＲＮＡ分子を産生し；前記の第一周期ｓＲＮＡ分子から、少なくとも１つの第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を合成し、前記の第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子は５’端および３’端を有し；第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターが形成されるように、前記の第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ；そして前記の第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写の第二周期を開始して、少なくとも１つの第二周期ｓＲＮＡ分子を産生し、それによって、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行う工程を含む、前記方法に関する。

本発明の別の側面は、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うための方法であって：５’端および３’端を有する少なくとも１つの第一周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を提供し；前記の第一周期ｃＤＮＡ分子の３’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ；前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレートをアニーリングさせ、ここで前記一本鎖プロモーター・テンプレートはＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能である；前記一本鎖プロモーター・テンプレートが、第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、および前記の第一のプロモーターの３’側の少なくとも第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールを伸長させ；前記の第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写の第一の周期を開始して、少なくとも１つの第一周期ｓＲＮＡ分子を産生し；前記の第一周期ｓＲＮＡ分子から、少なくとも１つの第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を合成し、前記の第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子は５’端および３’端を有し；前記の第一周期ｓＲＮＡ分子を分解し；前記の第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子の３’端に、過剰な一本鎖プロモーター・テンプレートをアニーリングさせ；前記の過剰なプロモーター・テンプレートが、第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、および前記の第一のプロモーターの３’側の少なくとも第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記の第二周期ｃＤＮＡの３’端を伸長させ；そして前記の第一または第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写の第二周期を開始して、少なくとも１つの第二周期ｓＲＮＡ分子を産生し、それによって、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行い、そして多数のｓＲＮＡコピーを産生する工程を含む、前記方法に関する。

いくつかの態様において、生じたｓＲＮＡ分子にポリＡテールを付加して、ｓＲＮＡ分子を使用可能な下流アッセイの数および種類を増加させる。好ましくは、ｓＲＮＡ分子は、下流アッセイに使用するため、ｃＤＮＡ分子に逆転写される。

逆転写酵素の存在下で、ＲＮＡ分子とプライマーを接触させることによって、一本鎖ｃＤＮＡ分子を提供してもよい。こうした逆転写プライマーには、オリゴｄＴプライマー、ランダム・プライマー、またはその組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、逆転写プライマーは、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含む。他の態様において、逆転写プライマーの３’末端ヌクレオチドは、末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼの基質ではないが、逆転写酵素によって伸長可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である。好ましい態様において、逆転写プライマーは、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含み、ここで逆転写プライマーの３’末端ヌクレオチドはリボヌクレオチドである。

本発明の別の側面は、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を合成するためのキットであって：第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレート、ここで前記一本鎖プロモーター・テンプレートは、ＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能である；および前記プロモーター・テンプレートを用いて、ｓＲＮＡ分子を合成するための使用説明資料を含む、前記キットに関する。

本発明の別の側面は、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うためのキットであって：第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレート、ここで前記一本鎖プロモーター・テンプレートは、ＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能である；前記の第二のＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチド；ならびに前記プロモーター・テンプレートおよびプロモーター・オリゴヌクレオチドを用いて、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うための使用説明資料を含む、前記キットに関する。

いくつかの態様において、キットは、逆転写酵素；ＤＮＡ分子上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させるための酵素；プロモーター・テンプレートを１以上のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換するための酵素；および１以上のＲＮＡポリメラーゼをさらに含む。

発明を実施するための最適な様式
本発明は、ｓＲＮＡ分子の合成のための方法およびキットに関する。用語「ｓＲＮＡ分子」、「ＲＮＡ分子」、「ＤＮＡ分子」、「ｃＤＮＡ分子」および「核酸分子」は、各々、単一の分子、単一種の複数の分子、および異なる種の多数の分子を含むよう意図される。該方法は、一般的に、少なくとも１つの第一周期一本鎖ｃＤＮＡ分子の３’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ；該オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレートをアニーリングさせ、ここで前記一本鎖プロモーター・テンプレートはＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能である；該一本鎖プロモーター・テンプレートが、第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、および該第一のプロモーターの３’側の少なくとも第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、該オリゴデオキシヌクレオチド・テールを伸長させ；該第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写の第一の周期を開始して、少なくとも１つの第一周期ｓＲＮＡ分子を産生し；該第一周期ｓＲＮＡ分子から、５’端および３’端を有する少なくとも１つの第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を合成し；該第一周期ｓＲＮＡ分子を分解し；第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターが形成されるように、第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ；そして第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写の第二周期を開始して、少なくとも１つの第二周期ｓＲＮＡ分子を産生する工程を含む。こうした頑強な線形増幅法は、少数の細胞を伴う発現分析を改善するとともに、非特異的増幅から生じるアーチファクトの数を減少させると期待される（Ｐｌａｙｅｒら， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｄｉａｇｎ． ４：８３１（２００４）を参照されたい）。

本発明の方法は、分子生物学の分野でルーチンの技術を利用する。一般的な分子生物学法を開示する基本的な教科書には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）が含まれる。

第一鎖ｃＤＮＡ分子の合成のための多くの方法および商業的キットが当該技術分野に周知である。例には、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ二本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）、Ａｒｒａｙ ５０^ＴＭ、Ａｒｒａｙ ３５０^ＴＭおよびＡｒｒａｙ ９００^ＴＭ検出キット（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ、ペンシルバニア州ハットフィールド）、およびＣｙＳｃｒｉｂｅ^ＴＭ標識後キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が含まれる。図１を参照すると、関心対象の供給源由来のＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、非コードＲＮＡ）が、逆転写反応のテンプレートとして用いられる（図１ａを参照されたい）。いかなる生物学的試料または環境試料で見られるビリオン、原核、および真核供給源も含めて、いかなる組織または細胞供給源から、ＲＮＡを得てもよい。好ましくは、供給源は真核組織であり、より好ましくは哺乳動物組織、最も好ましくはヒト組織である。本発明の方法は、例えばマイクロマニピュレーション、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）およびレーザー・マイクロダイセクション技術（Ｐｌａｙｅｒら， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｄｉａｇｎ． ４：８３１（２００４）を参照されたい）を用いて、複雑な細胞試料から精製可能な、単一細胞を含む、少数の細胞からＲＮＡを増幅するのに特に適している。

最初の逆転写反応には、いかなる逆転写酵素を用いてもよく、これには、熱安定性のＲＮアーゼＨ^＋およびＲＮアーゼＨ⁻逆転写酵素が含まれる。好ましくは、ＲＮアーゼＨ⁻逆転写酵素を用いる。

第一鎖ｃＤＮＡ合成用のプライマーを商業的に得るかまたは合成して、そして当該技術分野に周知の技術を用いて精製してもよい。第一鎖ｃＤＮＡ合成用のプライマーには、３’ポリＡテールを含有するＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）にアニーリングする、一般的に、長さ約１０〜約３０ヌクレオチド、好ましくは長さ約１７〜約２４ヌクレオチドの範囲の、３’端にオリゴｄＴテールを含む一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドが含まれる。関心対象のＲＮＡが天然には３’ポリＡテールを含有しない場合（例えばｍｉＲＮＡ）、ＡＴＰの存在下で、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）を用いて、ポリＡテールをＲＮＡ分子に付着させてもよい。ポリＡテール付加キットは、商業的に入手可能であり、そしてこうしたキットには、例えば、ポリ（Ａ）テール付加キット（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースティン）が含まれる。例えばウシ腸アルカリホスファターゼまたはＲＮアーゼ３を用いて、３’ブロッキングされたＲＮＡを酵素的に処理して、テール付加を可能にしてもよい。

あるいは、元来のｍＲＮＡ転写物各々の全長に沿った多様な位置にアニーリングする、一般的に、長さ約４〜約２０ヌクレオチド、好ましくは長さ約６〜約９ヌクレオチドの範囲のランダム・プライマーを用いて、逆転写反応を開始してもよい。当業者は、ランダム・プライマーを使用すると、オリゴｄＴプライマーを用いて産生したものよりも、最終的に、元来のｍＲＮＡ転写物各々の全長をよりよく表す、ｓＲＮＡ分子の産生を生じうることを認識するであろう。さらに、開示する方法の最初の工程でｃＤＮＡを生成するためにランダム・プライマーを使用することは、分解されたＲＮＡまたは細菌由来のＲＮＡなどの、通常は増幅から除かれているであろうＲＮＡを用いて、増幅ｓＲＮＡ分子を産生することも可能であることを意味する。

いくつかの態様において、逆転写プライマー（オリゴｄＴプライマー、ランダム・プライマー、または両方）は、一般的に、長さ約６〜約５０ヌクレオチド、好ましくは長さ約１０〜約２０ヌクレオチドの範囲の、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含む（図２ａを参照されたい）。図２ｅに示すように、この５’特異的ヌクレオチド配列を第二周期ｃＤＮＡ合成のための開始部位として用いてもよい。

他の態様において、逆転写プライマー（オリゴｄＴプライマー、ランダム・プライマー、または両方）の３’末端ヌクレオチドは、リボヌクレオチドのように、末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼの基質ではないが、逆転写酵素によって伸長可能な、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である。こうしたプライマーは、末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）で伸長不能であり、そしてしたがって、図１ｃ〜１ｆに示す工程ではテール付加されず、そして増幅されないであろう。好ましい態様において、逆転写プライマーは、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含み、ここで逆転写プライマーの３’末端ヌクレオチドはリボヌクレオチドである。

第一鎖ｃＤＮＡ合成後、一般的に、生じた第一周期ｃＤＮＡ分子を精製する（図１ｂを参照されたい）。ｃＤＮＡ精製前に、ＲＮＡを分解しないことが好ましいが、ＲＮＡ分解後に精製されているｃＤＮＡは、本発明の方法において、等しくよく働く。ＲＮＡを分解するいかなる方法も用いてもよく、例えばＮａＯＨまたはＲＮアーゼＨでの処理がある（ＲＮアーゼＨ^＋逆転写酵素の形で、または別個の酵素として供給してもよい）。あるいは、第一周期ｃＤＮＡ分子をＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重鎖から精製しつつ、ＲＮＡを損なわれないまま（ｉｎｔａｃｔ）放置してもよい。ＤＮＡ分子を精製するための多くの方法およびキットが存在し、これらには、例えばＭｉｎＥｌｕｔｅ^ＴＭ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）が含まれる。第一鎖ｃＤＮＡ合成のために、３’末端ヌクレオチドがリボヌクレオチドである、逆転写プライマーを用いる場合、ＤＮＡ精製を省いてもよい。これは、試料の損失を減少させ、そして増幅収率を増加させることも可能であり、これは、少数の細胞由来のＲＮＡを操作する際に、特に重要である。

第一周期ｃＤＮＡ精製後、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド・テールを、ｃＤＮＡ分子の３’端に付着させる（図１ｂを参照されたい）。こうしたオリゴデオキシヌクレオチド・テールを使用すると、特定の配列のみではなく、核酸分子の全集団が増幅可能になる。ＤＮＡにデオキシヌクレオチドを付着させるいかなる手段によっても、オリゴデオキシヌクレオチド・テールを取り込むことができる。好ましくは、適切なデオキシヌクレオチドの存在下で、末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ、または他の適切な酵素を用いて、オリゴデオキシヌクレオチド・テールをｃＤＮＡに付着させる。好ましくは、オリゴデオキシヌクレオチド・テールは、ホモポリマー・テール（すなわちポリｄＡ、ポリｄＧ、ポリｄＣ、またはポリｄＴ）である。好ましくは、オリゴデオキシヌクレオチド・テールは、一般的に、長さ約３〜５００を超えるヌクレオチド、好ましくは長さ約２０〜約１００ヌクレオチドの範囲のポリｄＡテールである。本出願者らは、ポリｄＡテールを用いると、非特異的増幅から生じるアーチファクトの数が減少することを見出した。

第一周期ｃＤＮＡ分子の３’端への一本鎖オリゴヌクレオチド・テールの付着後、一本鎖プロモーター・テンプレートを３’オリゴデオキシヌクレオチド・テールに付着させる（図１ｂを参照されたい）。これは、３’オリゴデオキシヌクレオチド・テールおよび一本鎖プロモーター・テンプレートの３’端に存在する相補的な一連のデオキシヌクレオチドの間の相補的塩基対形成を通じて達成される。例えば、オリゴヌクレオチド・テールがポリｄＡテールであるならば、プロモーター・テンプレートは、その３’端に、一般的に、長さ約３〜５０を超えるヌクレオチド、好ましくは長さ約１０〜約３０ヌクレオチドの範囲の、一連のチミジン塩基を含有するであろう。配列が互いに相補的であると見なされるためには、３’プロモーター・テンプレート配列の特定のヌクレオチド配列が、３’オリゴデオキシヌクレオチド・テールの特定のヌクレオチド配列に完全に相補的である必要はないし、また、３’プロモーター・テンプレート配列の長さが、３’オリゴデオキシヌクレオチド・テールの長さに正確にマッチする必要もない。必要なことは、プロモーター・テンプレートが、ｃＤＮＡ分子の３’端のオリゴデオキシヌクレオチド・テールにアニーリング可能であるように、２つの配列間に十分な相補性があることであると、当業者は認識するであろう。

一本鎖プロモーター・テンプレートは、５’端に第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列を、そして第一の認識配列の３’側に少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含有する（すなわち、「タンデム・プロモーター・テンプレート」）。用語「ＲＮＡポリメラーゼ認識配列」は、一本鎖および二本鎖両方のヌクレオチド配列を含むことが意図される。一本鎖型では、ヌクレオチド配列は、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの非テンプレート鎖に対応する。二本鎖型では、ヌクレオチド配列は、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターのテンプレートおよび非テンプレート鎖両方に対応する。ＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される限り、いかなるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を用いてもよい。好ましくは、用いるＲＮＡポリメラーゼ認識配列は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼなどのバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって認識される。典型的なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列は、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号１）である。典型的なＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列は、ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ（配列番号２）である。典型的なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列は、ＡＡＴＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ（配列番号３）である。

一本鎖プロモーター・テンプレートはまた、ＤＮＡポリメラーゼで伸長不能であるように、３’端でブロッキングされている。こうしたものとして、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウＤＮＡポリメラーゼ）およびｄＮＴＰの添加は、一本鎖オリゴヌクレオチド・テールを伸長させ、そして一本鎖プロモーター・テンプレートを、第一の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターおよび少なくとも第二の異なる二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換するが、第二鎖ｃＤＮＡの合成を触媒しない（図１ｃを参照されたい）。合成中または合成後のいずれかに付着される末端ブロッキング基、化合物、または部分を含むことによるなど、ＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能にする、いかなる手段によって、プロモーター・テンプレートをブロッキングしてもよい。好ましくは、プロモーター・テンプレートは、３’アミノ修飾因子、３’デオキシターミネーター、または３’ジデオキシターミネーターでブロッキングされる。適切なブロッカーは、本明細書に記載するもののいずれかに制限されず、そしてＤＮＡポリメラーゼがプロモーター・テンプレートの３’末端を伸長させるのを妨げるであろう、いかなる部分を含んでもよい。

いくつかの態様において、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、一本鎖プロモーター・テンプレートを二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換するのではなく、ＤＮＡ連結によって、テンプレート鎖および非テンプレート鎖を有する二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを、第一周期ｃＤＮＡ分子の３’端に付着させる（その全体が本明細書に明確に援用される、本出願者らの同時係属国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４３２５号を参照されたい）。二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターは、その５’端（非テンプレート鎖に比較して）に、第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列を、そして第一の認識配列の３’側に第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含有する。プロモーターの付着は、ｃＤＮＡ分子の３’オリゴデオキシヌクレオチド・テール（例えばポリｄＡテール）、および相補的な一連のヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの非テンプレート鎖の３’端のオーバーハング配列（すなわちポリｄＴオーバーハング）の間の、相補的塩基対形成によって促進される。適切に配置されると、オリゴデオキシヌクレオチド・テールの３’端に、プロモーターのテンプレート鎖の５’端を連結させることによって、二本鎖プロモーターはｃＤＮＡ分子に付着する。連結反応において、いかなるＤＮＡリガーゼを用いてもよい。好ましくは、ＤＮＡリガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼである。

本発明の方法は、好ましくは、第二鎖ｃＤＮＡ合成の非存在下で行われるが、当業者は、ランダム・プライマーを用いることによって、一本鎖プロモーター・テンプレートを二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換する間に、場合によって第二鎖ｃＤＮＡを合成してもよいことを認識するであろう。ランダム・プライマーは、第一鎖ｃＤＮＡに沿った多様な位置でアニーリングし、そしてプロモーター合成中に、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるであろう。場合によって、多様な第二鎖ｃＤＮＡ断片を一緒に連結して、単一の第二鎖ｃＤＮＡ分子を形成してもよい。こうした第二鎖ｃＤＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写中に第一鎖ｃＤＮＡを安定化させ（すなわち二次および三次構造を取り除き）、より高い収率のｓＲＮＡ分子を生じることも可能である。

一本鎖プロモーター・テンプレートの二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターへの変換後、リボヌクレオチド、および第一のプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼの添加によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を開始する（図１ｄを参照されたい）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行うための方法およびキットが当該技術分野に周知であり、そしてこれには、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ）およびＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ^ＴＭ高収率転写キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィスコンシン州マディソン）が含まれる。

まず、上述のように、ｓＲＮＡ分子を第一鎖ｃＤＮＡ分子に逆転写することによって、生じた第一周期ｓＲＮＡ分子を第二周期の合成に供してもよい（図１ｅを参照されたい）。例えば、オリゴｄＴにプライミングされた第一鎖ｃＤＮＡから産生されたｓＲＮＡ分子（すなわち第一周期ｓＲＮＡ分子）は、３’端にポリＡテールを再生するであろうし、これが第二周期のオリゴｄＴにプライミングされた第一鎖ｃＤＮＡ合成のプライミング部位として働くことも可能である。さらに、そしてランダム・プライミングされた第一鎖ｃＤＮＡから産生された第一周期ｓＲＮＡ分子に関しては、オリゴｄＴにプライミングされた第一鎖ｃＤＮＡ合成のため、３’ポリＡテールをｓＲＮＡ分子に付加してもよいし、また、再びランダム・プライマーが仲介する逆転写を行って、第二周期ｃＤＮＡを産生してもよい。第二周期ｃＤＮＡ合成に、オリゴｄＴおよびランダム・プライマーの組み合わせおよび混合物もまた、用いてもよい。

図２ａで用いる第一の逆転写プライマーが、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含む場合、第一周期ｓＲＮＡ分子は、その３’端に、定義した相補的ヌクレオチド配列を含有するであろう。この定義したヌクレオチド配列（すなわち５’伸長の特定のヌクレオチド配列に「対応する」）に相補的なヌクレオチド配列を含む、第二の逆転写プライマーを用いて、逆転写を開始してもよい（図２ｅを参照されたい）。定義したヌクレオチド配列を含有する第一周期ｓＲＮＡ分子のみが逆転写されて、より少数の非特異的アーチファクトが生じるであろう。あるいは、第一周期ｃＤＮＡ合成に用いたオリゴｄＴプライマーおよび／またはランダム・プライマー（または別の適切なプライマー）を用いて、第二周期の逆転写を開始してもよい。

第二周期のｃＤＮＡ合成後、第一鎖ｃＤＮＡ分子の場合による精製前に、ＮａＯＨまたは好ましくはＲＮアーゼＨを用いて、ＲＮＡを分解する（図１ｆを参照されたい）。同様に、ＭＭＬＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）などのＲＮアーゼＨ^＋逆転写酵素を用いてもよい。

ＲＮＡ分解後、第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチドを、相補的塩基対形成を通じて、第二周期ｃＤＮＡ分子にアニーリングさせる（図１ｆを参照されたい）。この塩基対形成は、第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを形成し、ここから、リボヌクレオチド、および第二のプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼの添加によって、第二周期のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（すなわち第二周期ｓＲＮＡ分子）を開始する（図１ｇを参照されたい）。プロモーター・テンプレート内に、さらなる異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を組み入れることによって、さらなる周期のｓＲＮＡ合成を、記載するように行ってもよい（例えば第三周期ｓＲＮＡ分子など）。さらに、工程間またはＲＮＡポリメラーゼの添加前に、当業者によく知られる方法を用いて、すべての酵素を熱不活化することによって、指数関数的でなく、線形の増幅を維持してもよい。こうした線形増幅は、遺伝子発現研究などの多様な下流適用によりよく適合する。別に明記されない限り、すべての酵素活性は、次の酵素操作前またはＲＮＡポリメラーゼを添加する前のいずれかで、終了されていることが理解されるべきである。

いくつかの態様において、第二周期のｃＤＮＡ合成後に逆転写酵素を不活化し、そして第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチドをアニーリングさせるのではなく、ＲＮアーゼＨを用いてＲＮＡ構成要素を分解し、そして過剰な一本鎖プロモーター・テンプレートの、第二周期のｃＤＮＡ分子の３’端への結合、ならびにまだ活性である逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によって、第一の二本鎖プロモーターを再生する（図３ｆを参照されたい）。次いで、第一または第二のプロモーターのいずれかを認識するＲＮＡポリメラーゼを添加することによって、第二周期のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を開始してもよい（図３ｇを参照されたい）。再び、逆転写酵素は、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼを添加する直前に熱不活化されて、増幅の線形を維持する。当業者は、この態様における一本鎖プロモーター・テンプレートが、２つのＲＮＡポリメラーゼ認識配列をタンデムに含有する必要がないことを認識するであろう。むしろ、プロモーター・テンプレートは、図３ｃおよび図３ｆのタンデム・プロモーター・テンプレートの代わりに使用可能な、単一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列（その全体が本明細書に明確に援用される、本出願者らの同時係属米国特許出願第１０／９７９，０５２号）を含有して、第一および第二周期のｓＲＮＡ合成用のテンプレートを産生してもよい。

典型的にはｍＲＮＡが用いられる任意の目的のために、本発明の方法によって産生されるｓＲＮＡ分子を直接用いてもよく、こうした目的には、遺伝子発現研究、遺伝子クローニング、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション、および当業者によく知られる他の技術が含まれる。好ましくは、ｓＲＮＡ分子を、ランダム・プライマー、オリゴｄＴプライマー、またはその組み合わせを用いて、ｃＤＮＡ分子に逆転写する。蛍光標識ヌクレオチドなどの、検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下で、直接、逆転写反応を行ってもよい。こうしたヌクレオチドには、Ｃｙ３およびＣｙ５で標識されたヌクレオチドが含まれる。

あるいは、ｃＤＮＡ分子は、間接的に標識される。例えば、ビオチン化またはアミノアリルヌクレオチド（例えばアミノアリルＵＴＰ）の存在下で、逆転写反応を行って、その後、ＮＨＳエステル標識（例えばＣｙ色素）にカップリングしてもよい。好ましくは、３ＤＮＡ^ＴＭデンドリマー技術（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ、ペンシルバニア州ハットフィールド）を用いて、ｃＤＮＡ分子を間接的に標識する。樹状試薬は、各々、その全体が本明細書に明確に援用される、Ｎｉｌｓｅｎら， Ｊ． Ｔｈｅｏｒ． Ｂｉｏｌ．， １８７：２７３（１９９７）；Ｓｔｅａｒｓら， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ３：９３（２０００）；ならびに、米国特許第５，１７５，２７０号；第５，４８４，９０４号；第５，４８７，９７３号；第６，０７２，０４３号；第６，１１０，６８７号；および第６，１１７，６３１号などの多様な米国特許にさらに記載される。

また、ｓＲＮＡ分子をｃＲＮＡ増幅法で用いて、標識アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）分子を産生してもよい。例えば、Ｅｂｅｒｗｉｎｅらの方法を用いて（例えば、各々、その全体が本明細書に明確に援用される、Ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：１６６３（１９９０）；米国特許第５，５４５，５２２号；第５，７１６，７８５号；第５，８９１，６３６号；第５，９５８，６８８号；および第６，２９１，１７０号を参照されたい）を用い、Ｔ７プロモーター・プライマーを用いて、ｓＲＮＡ分子を逆転写してもよい。第二鎖ｃＤＮＡ合成後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写を開始し、増幅ａｓＲＮＡ分子を産生する。標識ヌクレオチド（例えばＣｙ標識ヌクレオチド）を取り込むことによって、合成中に、こうしたａｓＲＮＡ分子を直接標識してもよいし、あるいは例えばビオチン化またはアミノアリルヌクレオチド（例えばアミノアリルＵＴＰ）を取り込み、その後、ＮＨＳエステル標識（例えばＣｙ色素）にカップリングすることによって、間接的に標識してもよい。

本発明のｓＲＮＡ分子から産生された標識一本鎖ｃＤＮＡおよびａｓＲＮＡ分子は、遺伝子発現研究用の試薬として有用である。標識ｃＤＮＡおよびａｓＲＮＡ分子を、相補的ポリヌクレオチドを含有する核酸マイクロアレイ（例えばプローブ）にアニーリングさせてもよい。本明細書において、「マイクロアレイ」は、スライド、チップ、膜、ビーズ、およびマイクロタイタープレートを含む、核酸プローブを含有する任意の固体支持体を含むよう意図される。商業的に入手可能なマイクロアレイの例には、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）、ＣｏｄｅＬｉｎｋ^ＴＭマイクロアレイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（カリフォルニア州パロアルト）オリゴ・マイクロアレイ、およびＯｃｉＣｈｉｐ^ＴＭマイクロアレイ（Ｏｃｉｍｕｍ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、インディアナ州インディアナポリス）が含まれる。

本発明の方法および組成物を、キットの形で好適にパッケージング可能である。こうしたキットを多様な研究および診断適用で用いてもよい。例えば、本発明の方法およびキットを用いて、異なる細胞または組織、同じ細胞または組織の異なる下位集団、同じ細胞または組織の異なる生理学的状態、同じ細胞または組織の異なる発生段階、あるいは同じ組織の異なる細胞集団における１以上の遺伝子の発現の比較分析を容易にすることも可能である。こうした分析は、遺伝子発現のレベルにおける統計的に有意な相違も明らかにすることも可能であり、次いで、これを用いて、分析する細胞または組織に応じて、多様な疾患状態の診断を容易にすることも可能である。

本発明にしたがって、非常に多様なキットを調製してもよい。例えば、キットには、第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および該第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能な一本鎖プロモーター・テンプレート；ならびにプロモーター・テンプレートを用いて、ｓＲＮＡ分子を合成するための使用説明資料が含まれてもよい。さらなる周期のｓＲＮＡ合成を行うため、キットにはさらに、プロモーター・テンプレートの第二のＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチド、および適切な使用説明資料が含まれてもよい。使用説明資料は、典型的には、書かれたかまたは印刷された資料を含むが、こうしたものに限定されない。こうした使用説明を保存し、そしてこれらをエンドユーザーに伝えることが可能ないかなる媒体も、本発明によって意図される。こうした媒体には、限定されるわけではないが、電子記憶媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤ ＲＯＭ）等が含まれる。こうした媒体には、こうした使用説明資料を提供するインターネットサイトへのアドレスが含まれてもよい。

本発明のキットには、以下の構成要素または試薬の１以上がさらに含まれてもよい：逆転写酵素；ＲＮアーゼ阻害剤；ＤＮＡ分子上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させるための酵素（例えば末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ）；ＲＮＡ分子上にオリゴリボヌクレオチド・テールを付着させるための酵素（例えばポリＡポリメラーゼ）；プロモーター・テンプレートを１以上のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換するための酵素（例えばクレノウ酵素）；および１以上のＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮアーゼＨ^＋、ＲＮアーゼＨ⁻または両方）。さらに、キットには、本発明の方法にしたがったｓＲＮＡ分子の合成と適合する、緩衝剤、プライマー（例えばオリゴｄＴプライマー、ランダム・プライマー）、ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、ＲＮアーゼ不含水、容器、バイアル、反応試験管等が含まれてもよい。構成要素および試薬を、適切な保存媒体を満たした容器中で提供してもよい。

ここで、本発明の方法にしたがった特定の態様が、以下の実施例中で記載されるであろう。実施例は、例示のみであり、そしていかなる点でも残りの開示を限定するように意図されない。

実施例
実施例１
第一鎖ｃＤＮＡ合成
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて精製した各ＲＮＡ試料に関して、以下のＲＮＡ／プライマー・ミックスを氷上で調製した：
１〜８μｌの総ＲＮＡ（２ｎｇを超えない）
２μｌの第一周期オリゴｄＴ配列特異的ＲＴプライマー（５０ｎｇ／μｌ）（５’−ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ Ｖ−３’、ここでＶ＝Ｃ、ＧまたはＡデオキシリボヌクレオチド；配列番号４）
１μｌの第一周期ランダム配列特異的ＲＴプライマー（ＲＮＡ質量にして２ｘ）（５’−ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ−３、ここでＮ＝ランダムに、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴデオキシリボヌクレオチド；配列番号５）
ＲＮアーゼ不含水で１１μｌに
第一周期ＲＴプライマーは、第二周期ＲＴプライマーの結合部位として働く、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含む（図２ａを参照されたい）。ＲＮＡ／プライマー混合物を、８０℃で１０分間加熱して、そして直ちに氷上で１〜２分間冷却した。次いで、混合物を９μｌのマスター混合物溶液と混合し、１ｘＲＴ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、各０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１０Ｕ Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ^ＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ）、および２００Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する最終体積２０μｌにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして４２℃で２時間インキュベーションした。簡単に遠心分離した後、１ｘＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて、反応を調整して１００μｌにした。

ｃＤＮＡ精製
製造者のプロトコルにしたがって、ＭｉｎＥｌｕｔｅ^ＴＭ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、反応を精製した。簡潔には、製造者によって提供されるＰＢ緩衝液で、ｃＤＮＡ反応を６００μｌに調整した。ｃＤＮＡ反応をＭｉｎＥｌｕｔｅ^ＴＭカラムに適用し、そして１分間微量遠心分離した。収集試験管中のフロースルーを廃棄し、そして製造者に提供されたＰＥ緩衝液７５０μｌでカラムを洗浄した。収集試験管中のフロースルーを廃棄し、そしてカラムを５００μｌの８０％エタノールで洗浄した。収集試験管中のフロースルーを廃棄し、そしてふたを開けたままカラムを５分間微量遠心分離して樹脂を乾燥させた。カラムを清浄な１．５ｍｌの微量遠心管に入れ、そして製造者によって提供されたＥＢ緩衝液１０μｌとカラム膜を室温で２分間インキュベーションした。２分間の微量遠心分離によって、第一鎖ｃＤＮＡ分子を溶出させた。

第一鎖ｃＤＮＡのテール付加
第一鎖ｃＤＮＡ分子を８０℃で１０分間加熱し、そして直ちに氷上で１〜２分間冷却した。次いで、１０μｌ中のｃＤＮＡ分子を１０μｌのマスター混合物溶液と混合して、１ｘテール付加緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、０．０４ｍＭ ｄＡＴＰ、および１５Ｕ末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、インディアナ州インディアナポリス）を含有する最終体積２０μｌにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして３７℃で２分間インキュベーションした。８０℃で１０分間加熱することによって、反応を停止し、そして室温で１〜２分間冷却した。

Ｔ７／Ｔ３プロモーター合成
３’アミノ修飾因子を含有する２μｌのＴ７Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレート（５０ｎｇ／μｌ）（５’−ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＡＣ ＣＣＴ ＣＡＣ ＴＡＡ ＡＧＧ ＧＡＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ Ｔ−３’；配列番号６）をオリゴｄＴテール付加ｃＤＮＡ分子に添加し、そして混合物を３７℃で１０分間インキュベーションして、鎖をアニーリングさせた。このテンプレートはＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能であり、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列、およびＴ７配列のすぐ３’側のＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含有する。次いで、テール付加ｃＤＮＡ／プロモーター・テンプレート混合物を３μｌのマスター混合物溶液と混合して、１ｘポリメラーゼ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、各０．４ｍＭ ｄＮＴＰ、および２ＵのラージＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ酵素）（Ｒｏｃｈｅ）を含有する最終体積２５μｌにした。混合物を簡単に遠心分離し、そして室温で３０分間インキュベーションした。６５℃で１０分間加熱することによって、反応を停止し、そして氷上に置いた。

Ｔ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
プロモーター合成反応の半分（１２．５μｌ）を３７℃で１０〜１５分間加熱して、Ｔ７Ｔ３プロモーター鎖を再アニーリングさせて、そして次いで、マスター混合物溶液１２．５μｌと混合して、１ｘ反応緩衝液、各７．５ｍＭのｒＮＴＰ、および２μｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ転写キット、Ａｍｂｉｏｎ）を含有する最終体積２５μｌにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして加熱されたふたを備えたサーモサイクラー中で、３７℃で４〜１６時間インキュベーションした。あるいは、３７℃の熱ブロック中で混合物を１５分間インキュベーションし、その後、熱風ハイブリダイゼーション・オーブン中、３７℃で４〜１６時間インキュベーションした。この工程中、反応の蒸発および濃縮を回避することが必須である。

ｓＲＮＡの逆転写
２５μｌのｓＲＮＡを、１μｌの第二周期配列特異的ＲＴプライマー（５００ｎｇ／μｌ）（５’−ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＴＴ−３’；配列番号７）と混合して、そして８０℃で１０分間加熱した。第二周期プライマーは、第一周期ＲＴプライマーの５’伸長の特定のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を含有する（図２ｅを参照されたい）。反応を直ちに２分間氷冷し、簡単に遠心分離し、そして氷上に戻した。１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）および１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）を添加し、そしてＲＴ反応を４２℃で１時間インキュベーションした。１μｌのＲＮアーゼＨ（２Ｕ／μｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、そして反応を３７℃で２０分間インキュベーションした。反応を６５℃でインキュベーションして、酵素活性を停止させた。

Ｔ３プロモーター形成
２μｌのＴ３プロモーター・オリゴヌクレオチド（５０ｎｇ／μｌ）（５’−ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＡＣ ＣＣＴ ＣＡＣ ＴＡＡ ＡＧＧ Ｇ−３’；配列番号８）を第二周期ｃＤＮＡ反応に添加した。Ｔ３オリゴヌクレオチドは、最初のＴ７Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートのＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的である。反応を３７℃で１０分間インキュベーションして、鎖をアニーリングさせた。

Ｔ３ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
プロモーター合成反応を１９μｌのマスター混合物溶液と混合して、１ｘ反応緩衝液、各７．５ｍＭのｒＮＴＰ、および２μｌのＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ転写キット、Ａｍｂｉｏｎ）を含有する最終体積２５μｌにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして加熱されたふたを備えたサーモサイクラー中で、３７℃で４〜１６時間インキュベーションした。あるいは、３７℃の熱ブロック中で混合物を１５分間インキュベーションし、その後、熱風ハイブリダイゼーション・オーブン中、３７℃で４〜１６時間インキュベーションした。この工程中、反応の蒸発および濃縮を回避することが必須である。

ｓＲＮＡ精製および定量化
ＲＮＡ清浄化のための製造者のプロトコルにしたがって、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、第二周期ｓＲＮＡ分子を精製した。５０μｌ ＲＮアーゼ不含水中、精製ｓＲＮＡ分子を２回溶出させて、そして０．１ｘＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０中、２６０／２８０の波長比で、ＵＶ分光光度法によって定量化した。

１ｎｇの総ＲＮＡまたは水のみ（陰性対照）から出発して、複製物増幅を行った。１ｎｇの総ＲＮＡを増幅した後、平均して、２５μｇの増幅ｓＲＮＡが回収され、これに対して、ＲＮＡの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、０．５〜４μｇの非特異的増幅産物が回収された。

実施例２
第一周期ｃＤＮＡ合成のため、オリゴｄＴ配列特異的プライマーのみを用いたことを除いて、実施例１に記載するように、各ＲＮＡ試料を増幅した。氷上で、以下のＲＮＡ／プライマー・ミックスを調製した：
１〜８μｌの総ＲＮＡ（２ｎｇを超えない）
２μｌの第一周期オリゴｄＴ配列特異的ＲＴプライマー（５０ｎｇ／μｌ）（５’−ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ Ｖ−３’、ここでＶ＝Ｃ、ＧまたはＡ；配列番号４）
ＲＮアーゼ不含水で１１μｌに
１ｎｇの総ＲＮＡまたは水のみ（陰性対照）から出発して、複製物増幅を行った。１ｎｇの総ＲＮＡを増幅した後、平均して、８〜１０μｇの増幅ｓＲＮＡが回収され、これに対して、ＲＮＡの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、０．５〜４μｇの非特異的増幅産物が回収された。

実施例３
第一周期ｃＤＮＡ合成のため、ランダム配列特異的プライマーのみを用いたことを除いて、実施例１に記載するように、各ＲＮＡ試料を増幅した。氷上で、以下のＲＮＡ／プライマー・ミックスを調製した：
１〜８μｌの総ＲＮＡ（２ｎｇを超えない）
１μｌの第一周期ランダム配列特異的ＲＴプライマー（ＲＮＡ質量にして２ｘ）（５’−ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ−３、ここでＮ＝ランダムに、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ；配列番号５）
ＲＮアーゼ不含水で１１μｌに
１ｎｇの総ＲＮＡまたは水のみ（陰性対照）から出発して、複製物増幅を行った。１ｎｇの総ＲＮＡを増幅した後、平均して、２０〜２５μｇの増幅ｓＲＮＡが回収され、これに対して、ＲＮＡの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、０．５〜４μｇの非特異的増幅産物が回収された。

実施例４
ＴｄＴを用いたｃＤＮＡテール付加工程において、ｄＴＴＰをｄＡＴＰの代わりに用い、そして用いた対応する３’アミノ修飾Ｔ７Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートが５’−ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＡＣ ＣＣＴ ＣＡＣ ＴＡＡ ＡＧＧ ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ Ａ−３’（配列番号９）であったことを除いて、実施例１に記載するように、各ＲＮＡ試料を増幅した。

１ｎｇの総ＲＮＡまたは水のみ（陰性対照）から出発して、複製物増幅を行った。１ｎｇの総ＲＮＡを増幅した後、平均して、６０〜７０μｇの増幅ｓＲＮＡが回収され、これに対して、ＲＮＡの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、２〜８μｇの非特異的増幅産物が回収された。より多くの非特異的増幅産物を有することはより望ましくないが、サブトラクティブ・クローニングおよび当業者にはよく知られる他のものなどの特定の適用は、非特異的産物によって負に影響を受けず、そして実際、産物の両端が同じ伸長（ポリｄＡ）であるため、実行がより容易でありうる。

実施例５
第一周期ｃＤＮＡ合成のため、もっぱらデオキシリボヌクレオチドからなるプライマーの代わりに、３’末端リボヌクレオチド配列特異的プライマーを用いたことを除いて、実施例１に記載するように、各ＲＮＡ試料を増幅した。氷上で、以下のＲＮＡ／プライマー・ミックスを調製した：
１〜８μｌの総ＲＮＡ（２ｎｇを超えない）
２μｌの第一周期オリゴｄＴ配列特異的ＲＴプライマー（５０ｎｇ／μｌ）（５’−ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ Ｖ−３’、ここでＶ＝Ｃ、ＧまたはＡリボヌクレオチド；配列番号１０）
１μｌの第一周期ランダム配列特異的ＲＴプライマー（ＲＮＡ質量にして２ｘ）（５’−ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ−３、ここで、最初の８つのＮ＝ランダムに、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴデオキシリボヌクレオチド、および最後のＮ＝ランダムに、Ａ、Ｇ、ＣまたはＵリボヌクレオチド；配列番号１１）
ＲＮアーゼ不含水で１１μｌに
１ｎｇの総ＲＮＡまたは水のみ（陰性対照）から出発して、複製物増幅を行った。１ｎｇの総ＲＮＡを増幅した後、平均して、２０μｇの増幅ｓＲＮＡが回収され、これに対して、ＲＮＡの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、０．２〜０．５μｇの非特異的増幅産物が回収された。

実施例６
ＭｉｎＥｌｕｔｅ^ＴＭ ＰＣＲ精製キットの代わりに、ＹＭ１００微量濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビラーリカ）を用いて、第一周期ｃＤＮＡ精製を行ったことを除いて、実施例５に記載するように、各ＲＮＡ試料を増幅した。１００μｌの希釈した逆転写反応を試料貯蔵容器に適用した。試験管のふたをしっかり閉じ、そして装置を１３，０００ｘｇで６分間遠心分離した。２００μｌの１ｘＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０を、膜に触れずに試料貯蔵容器に添加した。上下に５回ピペッティングすることによって、液体を穏やかに混合した。ふたをしっかり閉じ、そして装置を１３，０００ｘｇで６分間遠心分離した。収集試験管から試料貯蔵容器を分離し、そしてフロースルーを廃棄した。ＹＭ−１００カラムを同じ収集試験管内に入れ、そして２００μｌの１ｘＴＥ緩衝液を、膜に触れずに試料貯蔵容器に添加した。上下に５回ピペッティングすることによって、液体を穏やかに混合した。ふたをしっかり閉じ、そして装置を１３，０００ｘｇで６分間遠心分離した。収集試験管から試料貯蔵容器を分離し、そしてフロースルーを廃棄した。ＹＭ−１００カラムを同じ収集試験管内に入れ、そして５μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を、膜に触れずに試料貯蔵容器に添加した。貯蔵容器側面を穏やかに叩いて液体を混合した。新たな収集試験管中に、試料貯蔵容器をさかさまに入れ、そしてすべての集合物を１３，０００ｘｇで３分間遠心分離した。試験管の底に収集されたｃＤＮＡの体積は約５μｌであり、そしてこれをＲＮアーゼ不含水で１０μｌに希釈した。

１ｎｇの総ＲＮＡまたは水のみ（陰性対照）から出発して、複製物増幅を行った。１ｎｇの総ＲＮＡを増幅した後、平均して、４０〜５０μｇの増幅ｓＲＮＡが回収され、これに対して、ＲＮＡの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、０．２〜０．５μｇの非特異的増幅産物が回収された。

実施例７
ｃＤＮＡ精製工程を省き、こうしてプロセスにおけるさらなるｃＤＮＡの損失を回避したことを除いて、実施例５に記載するように、各ＲＮＡ試料を増幅した。逆転写プライマーの３’端上の末端リボヌクレオチドは、末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼで酵素的に伸長不能であるため、ｃＤＮＡ精製工程を省いてもよい。新たに合成されたｃＤＮＡの３’端のみが、ＴｄＴで伸長される。氷上で、以下のＲＮＡ／プライマー・ミックスを調製した：
１〜３μｌの総ＲＮＡ（２ｎｇを超えない）
２μｌの第一周期オリゴｄＴ配列特異的ＲＴプライマー（５０ｎｇ／μｌ）（５’−ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ Ｖ−３’、ここでＶ＝Ｃ、ＧまたはＡリボヌクレオチド；配列番号１０）
１μｌの第一周期ランダム配列特異的ＲＴプライマー（ＲＮＡ質量にして２ｘ）（５’−ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ−３、ここで、最初の８つのＮ＝ランダムに、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴデオキシリボヌクレオチド、および最後のＮ＝ランダムに、Ａ、Ｇ、ＣまたはＵリボヌクレオチド；配列番号１１）
ＲＮアーゼ不含水で５μｌに
ＲＮＡ／プライマー混合物を８０℃で１０分間加熱し、そして直ちに氷上で１〜２分間冷却した。次いで、混合物を５．５μｌのマスター混合物溶液と混合して、１ｘＲＴ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、各０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１０Ｕ Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ^ＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ）、および２００Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する最終体積１０．５μｌにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして４２℃で２時間インキュベーションした。次いで、第一鎖ｃＤＮＡ分子にテール付加して、そして実施例１に記載するように、さらにプロセシングした。

１ｎｇの総ＲＮＡまたは水のみ（陰性対照）から出発して、複製物増幅を行った。１ｎｇの総ＲＮＡを増幅した後、平均して、５５〜６０μｇの増幅ｓＲＮＡが回収され、これに対して、ＲＮＡの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、０．２〜０．５μｇの非特異的増幅産物が回収された。

実施例８
第二周期ｃＤＮＡ合成後に逆転写酵素を熱不活化せず、そしてＴ３プロモーター・オリゴヌクレオチドを第二周期ｃＤＮＡ反応に添加しなかったことを除いて、実施例７に記載するように、各ＲＮＡ試料を増幅した。むしろ、第一周期のプロモーター合成反応由来の過剰なＴ７Ｔ３プロモーター・テンプレートが、第二周期ｃＤＮＡ分子の３’端に結合し、なお活性である逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性が、Ｔ３配列に隣接する二本鎖Ｔ７プロモーターを再生するのを可能にする（図３ｆを参照されたい）。

実施例１に記載するような第一周期ｓＲＮＡ合成後、２５μｌのｓＲＮＡを１μｌの第二周期配列特異的ＲＴプライマー（５００ｎｇ／μｌ）（５’−ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＴＴ−３’；配列番号７）と混合して、そして８０℃で１０分間加熱した。反応を直ちに２分間氷冷し、簡単に遠心分離し、そして氷上に戻した。１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）および１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）を添加し、そしてＲＴ反応を４２℃で１時間インキュベーションした。１μｌのＲＮアーゼＨ（２Ｕ／μｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、そして反応を３７℃で３０分間インキュベーションした。反応を６５℃でインキュベーションして、酵素活性を停止させた。次いで、実施例１に記載するように、Ｔ７ポリメラーゼでのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ならびにｓＲＮＡ精製および定量化を行った。

１ｎｇの総ＲＮＡまたは水のみ（陰性対照）から出発して、複製物増幅を行った。１ｎｇの総ＲＮＡを増幅した後、平均して、９０〜１００μｇの増幅ｓＲＮＡが回収され、これに対して、ＲＮＡの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、０．２〜０．５μｇの非特異的増幅産物が回収された。

実施例９
大部分のスポッティングされたマイクロアレイで、そして他の遺伝子発現アッセイ（例えばｑＲＴ−ＰＣＲ）において用いられる標準的標識法で使用するため、テール付加法１を設計する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイ、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＣｏｄｅＬｉｎｋ^ＴＭマイクロアレイ、Ａｇｉｌｅｎｔオリゴ・マイクロアレイ、およびＯｃｉＣｈｉｐ^ＴＭマイクロアレイに関して推奨されるものなどの、下流Ｔ７増幅／標識法で使用するため、テール付加法２を設計する。

ポリＡテール付加法１
精製された第二周期ｓＲＮＡ分子の所望の体積を、ヌクレアーゼ不含水で１５．５μｌに調整した。各テール付加反応に関して、反応中、ｓＲＮＡ各１μｇに対して１０ｍＭ ＡＴＰを１ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中で１：５０に希釈した。ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）（２Ｕ／μｌ）を１ｘＰＡＰ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中で１：５に希釈し、そして使用するまで氷上に置いた。ｓＲＮＡ溶液を９．５μｌのマスター混合物溶液と混合して、１ｘＰＡＰ緩衝液、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ、０．２ｍＭ ＡＴＰ（ｓＲＮＡ １μｇあたり）、および０．４ＵポリＡポリメラーゼを含有する最終体積２５μｌにした。混合物を穏やかに混合し、遠心分離して、そして３７℃の熱ブロック中で１５分間インキュベーションした。３μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加することによって、反応を停止した。ＲＮＡ清浄化に関する製造者のプロトコルにしたがって、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ^ＴＭキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、テール付加したｓＲＮＡ分子を精製し、そして１４μｌのＲＮアーゼ不含水中に溶出した。回収した体積はおよそ１２μｌであった。

ポリＡテール付加法２
理想的には、このポリＡテール付加法には、２５０〜５００ｎｇの第二周期ｓＲＮＡを用いる。しかし、非常に少量の試料サイズ由来のｓＲＮＡを定量化することは常に可能であるわけではない。したがって、以下の表を用いて、ポリＡテール付加反応中で用いるべき精製ｓＲＮＡの量を決定してもよい：

^＊ＯＤ ２６０／２８０測定を介して濃度を確認するためには、十分な量のｓＲＮＡが入手可能でなければならない。
適切な体積の精製第二周期ｓＲＮＡ分子を、ヌクレアーゼ不含水で１５．５μｌに調整した。各テール付加反応に関して、１０ｍＭ ＡＴＰを１ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中で１：１００に希釈した。ＰＡＰ（１マイクロリットルあたり２単位）を１ｘＰＡＰ緩衝液中で１：５に希釈し、そして使用するまで氷上に置いた。ｓＲＮＡ溶液を９．５μｌのマスター混合物溶液と混合して、１ｘＰＡＰ緩衝液、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ、０．２ｍＭ ＡＴＰ（ｓＲＮＡ １μｇあたり）、および０．４ＵポリＡポリメラーゼを含有する最終体積２５μｌにした。混合物を穏やかに混合し、遠心分離して、そして３７℃の熱ブロック中で１５分間インキュベーションした。３μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加することによって、反応を停止した。ＲＮＡ清浄化に関する製造者のプロトコルにしたがって、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ^ＴＭキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、テール付加したｓＲＮＡ分子を精製し、そして１４μｌのＲＮアーゼ不含水中に溶出した。回収した体積はおよそ１２μｌであった。

実施例１０
多数周期のｓＲＮＡ合成を行うためのキットを、以下の構成要素で組み立てた：
第一周期オリゴｄＴ配列特異的ＲＴプライマー（５０ｎｇ／μｌ）；
第一周期ランダム配列特異的ＲＴプライマー（２５０ｎｇ／μｌ）；
ｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）；
Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ^ＴＭ ＲＮアーゼ阻害剤（Ａｍｂｉｏｎ）；
１０ｍＭ ｄＡＴＰ；
１０ｘ反応緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）；
末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（７．５Ｕ／μｌ）；
Ｔ７Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレート（５０ｎｇ／μｌ）；
クレノウ酵素（２Ｕ／μｌ）；
ｒＮＴＰミックス（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、およびＵＴＰ）（各７５ｍＭ）；
１０ｘＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）；
Ｔ７酵素ミックス（Ａｍｂｉｏｎ）；
第二周期配列特異的ＲＴプライマー（５００ｎｇ／μｌ）；
Ｔ３プロモーター・オリゴヌクレオチド（５０ｎｇ／μｌ）；および
Ｔ３酵素ミックス（Ａｍｂｉｏｎ）。

キット構成要素を用いた多数周期のｓＲＮＡ合成に関する、印刷した使用説明マニュアルとともに、番号をふったバイアル中に構成要素を入れ、そして容器中に入れた。
特許刊行物および非特許刊行物両方の、本明細書に引用するすべての刊行物は、本発明が属する当該技術分野における当業者の技術レベルの指標である。これらの刊行物はすべて、個々の刊行物が具体的に、そして個々に、本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いに、本明細書に完全に援用される。

本明細書記載の本発明は、特定の態様に関連して記載されてきているが、これらの態様は本発明の原理および適用の単なる例示であることを理解するものとする。したがって、例示態様に対して多くの修飾を行ってもよく、そして請求項によって定義されるような、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、他のアレンジを考案してもよいことが理解されるものとする。

図１ａ〜ｇは、本発明の方法にしたがった態様を示す模式図である。 図１ａ〜ｇは、本発明の方法にしたがった態様を示す模式図である。 図２ａ〜ｇは、本発明の方法にしたがった第二の態様を示す模式図である。 図２ａ〜ｇは、本発明の方法にしたがった第二の態様を示す模式図である。 図３ａ〜ｇは、本発明の方法にしたがった第三の態様を示す模式図である。 図３ａ〜ｇは、本発明の方法にしたがった第三の態様を示す模式図である。

Claims (23)

1. 少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うための方法であって：
   ａ）５’端および３’端を有する少なくとも１つの第一周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を提供し；
   ｂ）前記の第一周期ｃＤＮＡ分子の３’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ；
   ｃ）前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレートをアニーリングさせ、ここで前記一本鎖プロモーター・テンプレートはＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能である；
   ｄ）前記一本鎖プロモーター・テンプレートが、第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、および前記の第一のプロモーターの３’側の少なくとも第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールを伸長させ；
   ｅ）前記の第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写の第一の周期を開始して、少なくとも１つの第一周期ｓＲＮＡ分子を産生し；
   ｆ）前記の第一周期ｓＲＮＡ分子から、少なくとも１つの第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を合成し、前記の第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子は５’端および３’端を有し；
   ｇ）前記の第一周期ｓＲＮＡ分子を分解し；
   ｈ）第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターが形成されるように、前記の第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ；そして
   ｉ）前記の第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写の第二周期を開始して、少なくとも１つの第二周期ｓＲＮＡ分子を産生し、
   それによって、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行い、そして多数のｓＲＮＡコピーを産生する
   工程を含む、前記方法。
2. ａ）が、５’端および３’端を有するＲＮＡ分子を提供し；そして前記ＲＮＡ分子から一本鎖ｃＤＮＡ分子を合成する工程を含む、請求項１の方法。
3. 一本鎖ｃＤＮＡ分子の合成が、逆転写酵素の存在下で、ＲＮＡ分子とプライマーを接触させる工程を含む、請求項２の方法。
4. プライマーが、オリゴｄＴプライマー、ランダム・プライマー、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項３の方法。
5. プライマーが、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含む、請求項４の方法。
6. プライマーの３’末端ヌクレオチドが、末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼの基質ではないが、逆転写酵素によって伸長可能である、請求項４の方法。
7. プライマーの３’末端ヌクレオチドがリボヌクレオチドである、請求項６の方法。
8. プライマーが、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含み、前記プライマーの３’末端ヌクレオチドがリボヌクレオチドである、請求項４の方法。
9. 一本鎖プロモーター・テンプレートが、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列からなる群より選択される第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列からなる群より選択される第二のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、ならびに場合によって、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列からなる群より選択される第三のＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含み、前記の第一、第二および場合による第三のＲＮＡポリメラーゼ認識配列が異なる、請求項１の方法。
10. ｆ）が、逆転写酵素の存在下で、第一周期ｓＲＮＡ分子とプライマーを接触させる工程を含む、請求項１の方法。
11. 逆転写酵素がＲＮアーゼＨ⁻である、請求項１０の方法。
12. 逆転写酵素がＲＮアーゼＨ^＋であり、そしてＲＮアーゼＨ^＋活性が、ｇ）において第一周期ｓＲＮＡ分子を分解する、請求項１０の方法。
13. ｆ）における逆転写酵素活性が、ｉ）における第二周期ＲＮＡ転写の開始前に不活化される、請求項１０の方法。
14. プライマーが、オリゴｄＴプライマー、ランダム・プライマー、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１０の方法。
15. ｆ）が、逆転写酵素の存在下で、ｓＲＮＡ分子と第二のプライマーを接触させることを含み、前記の第二のプライマーが、第一のプライマーの５’伸長中に含有される特定のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項５の方法。
16. プライマーが、オリゴｄＴプライマー、ランダム・プライマー、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項５の方法。
17. 生じた多数のｓＲＮＡコピーを逆転写し、それによって、多数の一本鎖ｃＤＮＡ分子を産生する工程をさらに含む、請求項１の方法。
18. 生じた多数のｓＲＮＡコピーにポリＡテールを付加する工程をさらに含む、請求項１の方法。
19. 少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うための方法であって：
    ａ）５’端および３’端を有する少なくとも１つの第一周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を提供し；
    ｂ）前記の第一周期一本鎖ｃＤＮＡ分子の３’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ；
    ｃ）前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレートをアニーリングさせ、ここで前記一本鎖プロモーター・テンプレートはＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能である；
    ｄ）前記一本鎖プロモーター・テンプレートが、第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、および前記の第一のプロモーターの３’側の少なくとも第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールを伸長させ；
    ｅ）前記の第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写の第一の周期を開始して、少なくとも１つの第一周期ｓＲＮＡ分子を産生し；
    ｆ）前記の第一周期ｓＲＮＡ分子から、少なくとも１つの第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を合成し、前記の第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子は５’端および３’端を有し；
    ｇ）前記の第一周期ｓＲＮＡ分子を分解し；
    ｈ）前記の第二周期ｃＤＮＡ分子の３’端に、工程ｃ）由来の過剰な一本鎖プロモーター・テンプレートをアニーリングさせ；
    ｉ）前記の過剰な一本鎖プロモーター・テンプレートが、第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、および前記の第一のプロモーターの３’側の少なくとも第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記の第二周期のｃＤＮＡ分子の３’端を伸長させ；そして
    ｊ）前記の第一または第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写の第二周期を開始して、少なくとも１つの第二周期ｓＲＮＡ分子を産生し、
    それによって、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行い、そして多数のｓＲＮＡコピーを産生する
    工程を含む、前記方法。
20. ｉ）における酵素活性が、ｊ）における第二周期のＲＮＡ転写開始前に不活化される、請求項１９の方法。
21. 少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うためのキットであって：第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレート、ここで前記一本鎖プロモーター・テンプレートに含まれる第一および第二のＲＮＡポリメラーゼ認識配列はそれぞれ、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列からなる群より選択され、そして、該一本鎖プロモーター・テンプレートは、ＤＮＡポリメラーゼでは伸張不能であるように、３’末端が３’アミノ修飾因子、３’デオキシターミネーター、または３’ジデオキシターミネーターでブロッキングされている；前記の第二のＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチド；ならびに前記プロモーター・テンプレートおよびプロモーター・オリゴヌクレオチドを用いて、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うための使用説明資料を含む、前記キット。
22. 逆転写酵素；ＤＮＡポリメラーゼ；末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ；および１以上のＲＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項２１のキット。
23. 少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うためのキットであって、以下の構成要素および試薬：
    第一周期オリゴｄＴ配列特異的ＲＴプライマー；
    第一周期ランダム配列特異的ＲＴプライマー；
    ｄＮＴＰミックス；
    ＲＮアーゼ阻害剤；
    ｄＡＴＰ；
    １０ｘ反応緩衝液；
    末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ；
    Ｔ７Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレート；
    クレノウ酵素；
    Ｔ７ポリメラーゼ；
    Ｔ３ポリメラーゼ；
    ヌクレアーゼ不含水；ならびに
    前記キットの構成要素および試薬を用いて、ｓＲＮＡ分子を産生するための使用説明資料を含む、前記キット。