JP5120849B2

JP5120849B2 - 新規細菌及びそれを用いた植物病害の防除方法

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Publication number: JP5120849B2
Application number: JP2008502889A
Authority: JP
Inventors: 剛伊沢; 美智子安田; 聰篠崎; 英雄仲下; 俊章工藤
Original assignee: Mayekawa Manufacturing Co; RIKEN
Current assignee: Mayekawa Manufacturing Co; RIKEN
Priority date: 2006-03-03
Filing date: 2007-03-02
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2027-03-02
Also published as: CA2638813C; EP1997882B1; US8728459B2; CA2638813A1; EP1997882A4; AU2007221590B2; AU2007221590A1; EP1997882A1; JPWO2007100162A1; WO2007100162A1; US20090155214A1

Description

本発明は、新規細菌エンドファイト、それを用いた植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害の防除方法、並びにこの方法により作出された植物に関する。

これまでの化学農薬を中心とした病害虫防除技術は、効率的な食糧確保に貢献してきた。ところが近年、栽培の効率性だけでなく、安心・安全といった領域を含めた無農薬、減農薬による環境保全型農業が望まれ、それに適合した病害虫防除技術（例えば微生物農薬）が必要とされている。

本発明は農業上有用な植物に、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する抵抗性を付与する手段を提供することを目的とする。
本発明は以下の発明を包含する。
（１）Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属又はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌を、植物に人為的に感染させる工程を含む、植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害の防除方法。
（２）前記細菌がＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９４）、及びＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９３）、並びにそれらの変異株からなる群から選択される少なくとも１種である、（１）記載の方法。
（３）前記植物がイネ科又はアブラナ科に属する植物である、（１）又は（２）記載の方法。
（４）細菌の植物への感染が植物の育苗期に行われる、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属又はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌を有効成分として含有する、植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害の防除剤。
（６）前記細菌がＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９４）、及びＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９３）、並びにそれらの変異株からなる群から選択される少なくとも１種である、（５）記載の防除剤。
（７）Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９４）又はその変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株。
（８）Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９３）又はその変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株。
（９）Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９４）、及びＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９３）、並びにこれらの変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株からなる群から選択される少なくとも１種が人為的に感染された、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を有する植物。
本明細書において「Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌」とは、実施例１で単離同定された、受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９４が付与されたＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属する細菌を指す。
本明細書において「Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌」とは、実施例２で単離同定された、受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９３が付与されたＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属する細菌を指す。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−５８４８３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

図１−１は、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌とＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓｐ．Ａｒｍ２−２株（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ５２１６５０）との１６ＳｒＤＮＡの比較結果を示す（図１−２に続く）。
図１−２は、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌とＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓｐ．Ａｒｍ２−２株（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ５２１６５０）との１６ＳｒＤＮＡの比較結果を示す（図１−３に続く）。
図１−３は、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌とＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓｐ．Ａｒｍ２−２株（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ５２１６５０）との１６ＳｒＤＮＡの比較結果を示す。
図２−１は、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌とＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｉｓｂａｌｂｉｃａｎｓ（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ１３７５０８）との１６ＳｒＤＮＡの比較結果との１６ＳｒＤＮＡの比較結果を示す（図２−２に続く）。
図２−２は、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌とＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｉｓｂａｌｂｉｃａｎｓ（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ１３７５０８）との１６ＳｒＤＮＡの比較結果との１６ＳｒＤＮＡの比較結果を示す（図２−３に続く）。
図２−３は、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌とＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｉｓｂａｌｂｉｃａｎｓ（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ１３７５０８）との１６ＳｒＤＮＡの比較結果との１６ＳｒＤＮＡの比較結果を示す。
図３は、ＩＴＳ領域とｎｅｓｔｅｄＰＣＲプライマーとの位置関係を示す。
図４は、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌によるシロイヌナズナにおける細菌性病害の防除効果を示す写真である。
図５は、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌及びＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌によるシロイヌナズナにおける細菌性病害の防除効果を示す写真である。

本発明の細菌の感染により、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性が付与される植物としては、イネ科植物又はアブラナ科植物が挙げられる。イネ科植物としては、特にイネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ライコムギ、ハトムギ、ソルガム、エンバク、トウモロコシ、サトウキビ、アワ、ヒエなどの穀類が挙げられる。イネ科植物としてはさらに、シバ、バッファローグラス、バミューダグラス、ウィーピンググラス、センチピードグラス、カーペットグラス、ダリスグラス、キクユグラス、セントオーガスチングラスなどの飼料または牧草が挙げられる。アブラナ科植物としては、特にアブラナ、カブ、チンゲンサイ、ノザワナ、カラシナ、タカナ、コブタカナ、水菜、コールラビー、ルッコラ、クレソン、タアサイ、カリフラワー、キャベツ、ケール、ハクサイ、コマツナ、ダイコン、ハツカダイコン、ブロッコリー、メキャベツ、ワサビ、セイヨウワサビが挙げられる。
本発明はまた、本発明の細菌が人為的に感染された、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を有する上記植物に関する。
本発明により防除され得る病原性糸状菌による植物病害としては、イネいもち病（病原糸状菌：Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ）、イネゴマ葉枯病（病原糸状菌：Ｂｉｐｏｌａｒｉｓｌｅｅｒｓｉａｅ）、イネばか苗病（病原糸状菌：Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、イネ紋枯病（病原糸状菌：Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓｃｕｃｕｍｕｒｉｓ）、イネ黄化萎縮病菌（病原糸状菌：Ｓｓｃｌｅｒｏｐｈｔｈｏｒａｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）、イネ疑似紋枯病（病原糸状菌：Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）、コムギ麦角病（病原糸状菌：Ｃｌａｖｉｃｅｐｓｐｕｒｐｕｒｅａ）、コムギ裸黒穂病（病原糸状菌：Ｕｓｔｉｌａｇｏｔｒｉｔｉｃｉ）、オオムギ裸黒穂病（病原糸状菌：Ｕｓｔｉｌａｇｏｎｕｄａ）、ライムギ雪腐褐色小粒菌核病（病原糸状菌：Ｔｙｐｈｕｌａｉｎｃａｒｎａｔａ）、ライムギ斑点病（病原糸状菌：Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓｓａｔｉｖｕｓ）イネ、エンバク、コムギ、オオムギ、ライムギの立枯病（病原糸状菌：Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ）、トウモロコシすす紋病（病原糸状菌：Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａｔｕｒｃｉｃａ）、アブラナ科野菜根こぶ病（病原糸状菌：Ｐｌａｍｏｄｉｏｐｈｏｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ）、アブラナ科野菜立枯病（病原糸状菌：Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓｃｕｃｕｍｅｒｉｓ）、ハクサイ黄化病（病原糸状菌：Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ）、ダイコン萎黄病（病原糸状菌：Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．Ｒａｐｈａｎｉ）、ダイコン白さび病（病原糸状菌：Ａｌｂｕｇｏｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）、コマツナ白さび病（病原糸状菌：Ａｌｂｕｇｏｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）が挙げられる。
本発明により防除され得る病原性細菌による植物病害としては、イネ白葉枯れ病（病原細菌：Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）、イネもみ枯細菌病（病原細菌：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｇｌｕｍａｅ）ハクサイ、アブラナ科野菜に重大な被害をもたらす野菜類軟腐病（病原細菌：Ｅｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、キャベツ黒腐病（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、が挙げられる。
本明細書に開示する実施例では、本発明に係る細菌が、病原性糸状菌による植物病害の防除に有効であること、並びに病原性細菌による植物病害の防除に有効であることが示されている。このことから、本発明に係る細菌は、宿主植物自身の病害抵抗性を高めていることがわかる。よって、本発明に係る細菌は、病原性糸状菌又は病原性細菌による植物病害の防除に有効であるだけでなく、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる植物病害の防除においても有効である。
本発明により防除され得る病原性ウイルスによる植物病害としては、イネ萎縮病Ｒｉｃｅｄｗａｒｆｒｅｏｖｉｒｕｓ、イネ縞葉枯病Ｒｉｃｅｓｔｒｉｐｅｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ、イネ黒すじ萎縮病Ｒｉｃｅｂｌａｃｈ−ｓｔｒｅａｋｅｄｄｗａｒｆｒｅｏｖｉｒｕｓ、イネえそモザイク病Ｒｉｃｅｎｅｃｒｏｓｉｓｍｏｓａｉｃｐｏｔｙｖｉｒｕｓ、イネわい化病Ｒｉｃｅｗａｉｋａｖｉｒｕｓ、コムギ縞萎縮病Ｗｈｅａｔｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ、オオムギ縞萎縮病Ｂａｒｌｅｙｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ、オオムギ斑葉モザイクウイルスＢａｒｌｅｙｓｔｒｉｐｅｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ、ダイコン、カブ、コマツナのウイルス病としてキュウリモザイクウイルス、カブモザイクポティウイルス、ダイコンひだ葉モザイクコモウイルス、ソラマメウイルトファバウイルスが挙げられる。
本発明に用いることができる細菌としては、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属又はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌であれば特に限定されない。具体例を挙げれば、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９４）、及びＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９３）が挙げられる。また、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９４）、又はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９３）と同等の能力を有する細菌、例えば、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属し、実施例１に示すＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌と同一の炭素源の資化能力を有する細菌や、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属し、配列番号１に示す塩基配列を少なくとも一部分に含む１６ＳｒＤＮＡを有する細菌や、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属し、実施例２に示すＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌と同一の炭素源の資化能力を有する細菌や、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属し、配列番号２に示す塩基配列を少なくとも一部分に含む１６ＳｒＤＮＡを有する細菌が挙げられるがこれらには限定されない。更にまた、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９４）、又はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９３）が変異誘発処理されて作出された変異株であって、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株もまた、本発明に好適に使用することができる。このような変異株のなかでも、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属し、実施例１に示すＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌と同一の炭素源の資化能力を有する細菌や、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属し、配列番号１に示す塩基配列を少なくとも一部分に含む１６ＳｒＤＮＡを有する細菌や、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属し、実施例２に示すＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌と同一の炭素源の資化能力を有する細菌や、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属し、配列番号２に示す塩基配列を少なくとも一部分に含む１６ＳｒＤＮＡを有する細菌が好ましい。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで、「変異原」なる語は広義の意味を有し、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原もまた使用され得る。
本発明に用いられる細菌は、振とう培養等の通常の培養法により、通常の条件下で培養されうる。培養に用いる培地としては炭素源としてグルコース、シュークロース、デンプン、デキストリンなどの糖類を、窒素源として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩等の無機窒素源、または、酵母エキス、コーン・スティープ・リーカー、肉エキス、小麦胚芽、ポリペプトン、サトウキビ絞り粕（バカス）、ビールカス、大豆粉、米糠、魚粉等の有機窒素源を、無機塩としてリン酸一カリ、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄等の、リン、カリウム、マンガン、マグネシウム、鉄等を含む塩類を、それぞれ含有する合成または天然の培地が挙げられる。
本発明はまた、本発明の細菌を有効成分として含有する、植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害の防除剤に関する。当該植物病害防除剤としては、本発明の細菌の培養液をそのまま使用することができるが、細菌の培養液を膜分離、遠心分離、濾過分離等の方法により分離した、本発明の細菌の高濃度物を用いることもできる。
本発明の植物病害防除剤としてはまた、本発明の細菌の培養液を乾燥させたものを使用することができる。また、本発明の細菌の培養液を活性炭粉末、珪藻土、タルク等の多孔吸着体に吸着させ乾燥させたものを使用することができる。乾燥方法は通常の方法でよく、例えば凍結乾燥、減圧乾燥でよい。これらの乾燥物は乾燥後さらにボールミル等の粉砕手段で粉砕されてもよい。
本発明の細菌は上述の培養液、高濃度物または乾燥物としてそれ自体単独で本発明に用いることができるが、更なる他の任意成分と組み合わせて通常の微生物製剤と同様の形態（例えば粉剤、水和剤、乳剤、液剤、フロアブル剤、塗布剤等の形態）に製剤化して、植物病害防除用組成物として提供されてもよい。組み合わせて使用することができる任意成分としては例えば固体担体、補助剤のような植物への適用が許容される材料が挙げられる。
本発明の細菌の植物への感染は、植物の栄養成長期に行われることが好ましい。
本発明の細菌またはそれを含有する組成物の植物への施用方法としては、噴霧、潅注、どぶ漬け、植物体への塗布、人為的に付けた傷への接触、シリンジによる注入、土壌への混合、水耕液への混入、砂等へ混合してサンドブラストのように吹きつける方法などが考えられる。本発明の細菌を懸濁してなる懸濁液を植物に潅注処理する場合には、懸濁液中の本発明の細菌の濃度は１０^４〜１０^１２ＣＦＵ／ｍｌが好ましい。

Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌の単離と同定
栽培イネ日本晴（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）の茎を３ｃｍ程とり、７０％エタノールと１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面殺菌した。それを滅菌した乳鉢で、滅菌した０．８５％食塩水と海砂を加えながら磨砕した。窒素固定菌が窒素固定活性を発現可能な、Ｒｅｎｎｉｅ培地が知られている（Ｒｅｎｎｉｅ，Ｒ．Ｊ．１９８１．Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．２７：８−１４）。磨砕液の上清を、試験管のＲｅｎｎｉｅ半流動培地に接種し培養した。アセチレン還元活性のあった試験管から、ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地に植菌して、シングルコロニーを単離した。
単離したシングルコロニーの菌株を栽培イネに接種し、いもち病に対する抵抗性評価試験を実施した。その結果、イネに病害抵抗性を付与する細菌の菌株を選抜した。
当該菌株をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈで培養し、菌体からゲノムＤＮＡを単離した。単離したＤＮＡを鋳型に、１６ＳｒＤＮＡ領域のほぼ全長の塩基配列をｄｙｅプライマー法で決定した（配列番号１）。相同性検索プログラムＦＡＳＴＡを利用し、決定した塩基配列と、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ国際塩基配列データベースとの相同性検索を行った。
当該菌株はＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓｐ．Ａｒｍ２−２株（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ５２１６５０）と、９８．５％相同であった（図１）。当該菌株の１６ＳｒＤＮＡは既存の種の１６ＳｒＤＮＡと一致しなかった。
当該菌株の基質資化能を検討したところ、表１に示す結果が確認された。
以上の結果から、選抜された菌株はＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属する細菌の新規株であると結論づけた。
本発明者らは、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌を独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２００６年２月１０日付で受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９４として寄託した。

Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌の単離と同定
日本に保存されている野生イネ（ＯｒｙｚａｂａｒｔｈｉｉＷ１４０７）の葉身を３ｃｍ程とり、７０％エタノールと１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面殺菌した。それを滅菌した乳鉢で、滅菌した０．８５％食塩水と海砂を加えながら磨砕した。窒素固定菌が窒素固定活性を発現可能な、Ｒｅｎｎｉｅ培地が知られている（Ｒｅｎｎｉｅ，Ｒ．Ｊ．１９８１．Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．２７：８−１４）。磨砕液の上清を、試験管のＲｅｎｎｉｅ半流動培地に接種し培養した。アセチレン還元活性のあった試験管から、ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地に植菌して、シングルコロニーを単離した。
単離したシングルコロニーの菌株を栽培イネに接種し、いもち病に対する抵抗性評価試験を実施した。その結果、イネに病害抵抗性を付与する細菌の菌株を選抜した。
当該菌株をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈで培養し、菌体からゲノムＤＮＡを単離した。単離したＤＮＡを鋳型に、１６ＳｒＤＮＡ領域のほぼ全長の塩基配列をｄｙｅプライマー法で決定した（配列番号２）。相同性検索プログラムＦＡＳＴＡを利用し、決定した塩基配列と、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ国際塩基配列データベースとの相同性検索を行った。
当該菌株はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｉｓｂａｌｂｉｃａｎｓ（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ１３７５０８）と９９．６％相同であった（図２）。当該菌株の１６ＳｒＤＮＡは既存の種の１６ＳｒＤＮＡと一致しなかった。
当該菌株の基質資化能を検討した。１６ＳｒＤＮＡ塩基配列の相同性検索において相同製が高かった、ＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｉｓｂａｌｂｉｃａｎｓのＡＴＣＣ１９３０８株と基質資化能を比較した。比較結果を表２に示す。表中丸印は資化可能であったことを示し、バツ印は資化不能であったことを示す。
また選抜された菌株はＬ−ラムノース以外にもケトグルタル酸ナトリウム、ｍ−エリスリトール、セバシン酸２アンモニウムを資化する能力を有することがわかった。
また選抜された菌株は表に示した基質以外にもグルコン酸カリウム、ｎ−カプリン酸、アジピン酸、ＤＬ−リンゴ酸、クエン酸ナトリウム、酢酸フェニル、白糖を資化することができなかった。
以上の結果から、選抜された菌株はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属する細菌の新規株であると結論づけた。
本発明者らはＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌を、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２００６年２月１０日付で受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１９３として寄託した。

Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法を用いたＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌及びＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌の検出
Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌又はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌が感染しているか否かが不明の植物において、これらの菌の感染の有無を検出する方法を検討した。そして、以下に示す通り、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法が有効であることが明らかとなった。
Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌及びＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌で、１６ＳｒＤＮＡと２３ＳｒＤＮＡ間のＩＴＳ領域の塩基配列を決定した。Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌のＩＴＳ領域の塩基配列を配列番号３に、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌のＩＴＳ領域の塩基配列を配列番号４にそれぞれ示す。
各菌株のＩＴＳ領域の塩基配列と、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎｅＢａｎｋ国際塩基配列データベースに登録されている近縁及び遠縁の６〜７細菌のＩＴＳ領域塩基配列とを多重整列プログラムＣｌａｓｔａｌＷを利用して比較し、ＩＴＳ領域を増幅させるプライマー２セットを、他の細菌と相同性の低い領域で作製した（図３、表３）。
Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌接種植物、又はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌接種植物の、成長点付近を取り、生理食塩水を加え、乳鉢、又はビーズによる細胞破砕装置で出来る限り細かく破砕した。その破砕液からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ溶液を鋳型とし表４及び５に示した条件で、プライマーセット１によるＰＣＲ（第１のＰＣＲ）、次にそのＰＣＲ溶液を鋳型とした、更に内側のプライマーセット２によるＰＣＲ（第２のＰＣＲ）を行い、目的ＤＮＡ断片の検出を検討した。
Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌接種植物では、プライマーセット１によるＰＣＲ増幅断片のサイズは４８４ｂｐであり、プライマーセット２によるＰＣＲ増幅断片のサイズは２９８ｂｐであった。Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌接種植物では、プライマーセット１によるＰＣＲ増幅断片のサイズは３５６ｂｐであり、プライマーセット２によるＰＣＲ増幅断片のサイズは２４１ｂｐであった。
以上の結果から、検査対象の植物体からの試料に対して表３に示すプライマーセットを用いたＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法を行い上記サイズの増幅断片が得られた場合に、増幅断片サイズに対応するエンドファイト（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌又はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌）が感染していると結論づけることができることが明らかとなった。

ＥＬＩＳＡ法を用いたＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌及びＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌の検出
実施例３に示す方法の外に、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌又はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌が感染しているか否かが不明の植物において、これらの菌の感染の有無を検出する方法を検討した。そして、以下に示す通り、ＥＬＩＳＡ法が有効であることが明らかとなった。
ＥＬＩＳＡ法のためにＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌に対するポリクローナル抗体を以下の方法で作製した。Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌及びＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌をホルマリン処理し、抗原菌体液を調製した。それぞれウサギ背部に３〜４Ｘ１０^８細胞ずつ免疫した。エマルジョン作製は、初回はフロイントコンプリートアジュバント、２回目からはフロイントインコンプリートアジュバントを使用し２週間間隔で免役した。６回免疫後に全採血し、ウサギ抗Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌血清、ウサギ抗Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌血清を調製した。
Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌又はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌を接種した植物体に生理食塩水を加え、乳鉢、又はビーズによる細胞破砕装置で出来る限り細かく破砕した。破砕液を弱く遠心し、大きな植物残さを除き、上記ポリクローナル抗体を用い常法のＥＬＩＳＡに供試した。
植物破砕液をマイクロタイタープレートに注入し、菌体を壁に吸着させ、洗浄後に、１０万倍希釈した上記ポリクローナル抗体を反応させた。コントロールとして、無接種植物の破砕液、既知量の菌体を同時に供試した。洗浄後、パーオキシデース標識された二次抗体（抗ウサギ抗体）を反応させ、パーオキシデースによる色素生成反応後に吸光度を測定した。
その結果、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌又はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌接種植物サンプルでは無接種植物サンプルより吸光度が上昇し、接種菌（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌又はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌）が感染していると結論づけることができることが明らかとなった。また、コントロールと比較することにより植物中の定着菌数の推定が可能であった。

イネにおける、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌及びＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌のイネいもち病に対する病害抵抗性誘導効果
（目的）
本実施例ではＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌又はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌（以下両菌株の総称として「エンドファイト」ということがある）に感染したイネ（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ）を用いてイネいもち病（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａｒａｃｅ００７）に対する病害抵抗性誘導効果について検証した。イネは単子葉植物のモデル植物である。
（実験方法）
１．イネは３葉期にセルシート（１区画２ｃｍｘ２ｃｍにイネ幼苗５株）から１％肥料溶液中での水耕栽培に移植した。３．５葉に生育したイネに２種類のエンドファイト調製液をそれぞれ１０^５〜１０^９ＣＦＵ／ｍｌになるように潅注処理した。エンドファイト処理５日後にいもち病菌の胞子懸濁液（０．２％Ｔｗｅｅｎ２０添加）を噴霧接種し、暗黒下、湿度１００％の条件下に２４時間静置した後、２５℃、湿度６０％の温室でさらに４日間栽培した。いもち病菌接種５日後に、第４葉に出現したいもち病の病斑数を計測した。各処理区における病斑数を比較し、いもち病抵抗性を評価した。
２．上記の方法を用いて、処理期間を５日と１０日に設定し、エンドファイトの処理期間がいもち病抵抗性に及ぼす影響について解析した。
なお、表７に示したＢｅｎｚｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｅ（ＢＩＴ）は抗イネいもち病農薬プロベナゾールの活性代謝物である。ＢＩＴ０．５ｍｇ／ｐｏｔを処理したイネは強いイネいもち病抵抗性を誘導する。本実験ではエンドファイト処理区のいもち病抵抗性誘導効果を比較するポジティブコントロールとしてＢＩＴ処理区を設けた。
３．栄養条件がエンドファイト誘導性の病害抵抗性に及ぼす影響について検討するために、肥料濃度を０．５％、０．７５％、１％の３段階設定し、３葉期のイネを移植した。２日後にエンドファイト懸濁液を処理し、５日後にいもち病菌を接種し、いもち病抵抗性を評価した。
（結果）
Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌及びＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌の１０^８ＣＦＵ／ｍｌ処理区においていもち病菌に対する防除価はそれぞれ約５２％、５５％であった（表６）。また、いもち病抵抗性誘導効果にはエンドファイトの処理期間（５日と１０日）による差は認められなかった（表７）。０．５％肥料溶液の処理区では、エンドファイトが誘導する病害抵抗性が認められなかったが、栄養が十分に存在する０．７５％と１％肥料溶液の条件では、エンドファイトの耐病性付与効果が認められた（表８）。

シロイヌナズナにおける、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌又はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌の細菌性病害に対する病害抵抗性誘導効果
（目的）
本実施例ではエンドファイトに感染したシロイヌナズナ（ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＣｏｌ−０）を用いてシロイヌナズナに罹病性の病原性バクテリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｔｏｍａｔｏＤＣ３０００）に対する病害抵抗性誘導効果について検証した。シロイヌナズナは双子葉植物のモデル植物である。
（実験方法）
シロイヌナズナの種子を７０％エタノールで２０秒間、１％次亜塩素酸水溶液で５分間処理して滅菌後、滅菌した蒸留水で２０分、３回洗浄した。オートクレーブ滅菌（１２１℃、４０分）した園芸培土（Ｋｕｒｅｈａ）を入れたプラスチック容器（５ｘ５ｘ５ｃｍ）に滅菌した種子を約２０粒ずつ播種し、人工気象器内で、温度２１℃、湿度６０％、１６時間明／８時間暗の条件下で栽培した。
１）エンドファイト処理濃度が病害抵抗性誘導効果に及ぼす影響
播種後４週間目のシロイヌナズナにＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌調製液を１０^６〜１０^８ＣＦＵ／ｍｌになるように潅注処理した。エンドファイト処理５日後にＰｓｔＤＣ３０００（１×１０^７ＣＦＵ／ｍｌ）を接種し、５日後に葉の病徴をコントロールと比較した。
２）エンドファイト処理期間が病害抵抗性誘導効果に及ぼす影響
播種後３週間目のシロイヌナズナにＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌とＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌の菌懸濁液をそれぞれ１０^７ＣＦＵ／ｍｌになるように潅注処理した。エンドファイト処理１０日後と１５日後にＰｓｔＤＣ３０００（１×１０^７ＣＦＵ／ｍｌ）を接種し、５日後に葉の病徴をコントロールと比較した。
３）エンドファイト処理がＰｓｔＤＣ３０００の増殖に及ぼす影響
播種後３週間目のシロイヌナズナに上と同じように菌懸濁液をそれぞれ１０^７又は１０^８ＣＦＵ／ｍｌになるように潅注処理した。処理後１５日後にＰｓｔＤＣ３０００（２×１０^５ＣＦＵ／ｍｌ）を接種し、３日後の葉を回収し、１０ｍＭＭｇＣｌ_２中で磨砕した。磨砕液を三段階に希釈し、ＮＢ平板培地（ｒｉｆａｎｐｉｃｉｎ５０ｍｇ／ｌ）に塗布した。２８度で二晩培養後、コロニーをカウントして植物体内での菌の増殖率を数値化した。
（結果）
１）Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌を１０^６から１０^８ＣＦＵ／ｍｌで処理した結果、エンドファイト処理濃度が高いほどＰｓｔＤＣ３０００の病徴を抑制する傾向が認められた（図４）。
２）Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌処理区では処理期間が長い方がＰｓｔＤＣ３０００の病徴抑制効果が高い傾向が観察された。
Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌処理区では処理期間が異なっていてもＰｓｔＤＣ３０００の病徴抑制効果に差はほとんど認められなかった（図５）。
３）植物体内におけるＰｓｔＤＣ３０００の増殖を測定したところ、コントロールに比べてエンドファイト処理区でＰｓｔＤＣ３０００の増殖が抑制された。処理したエンドファイトは１０^８ＣＦＵ／ｍｌより１０^７ＣＦＵ／ｍｌの方が病原菌増殖抑制効果が強かった（表９）。

コマツナにおける、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌の糸状菌性病害に対する病害抵抗性誘導効果
（目的）
エンドファイトに感染したコマツナを用いて、糸状菌（Ａｌｂｕｇｏｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）が引き起こす白さび病に対する病害抵抗性誘導効果について検証した。
（実験方法）
（１）エンドファイトの培養及び菌懸濁液調製方法
Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌は、５００ｍｌ三角フラスコに入れたＮＢ液体培地１００ｍｌに接種し、２８度で３０時間振とう培養した。遠心分離して菌体を回収し、１０ｍＭＭｇＣｌ_２溶液に懸濁させた後、菌濃度を１ｘ１０^９ＣＦＵ／ｍｌになるように調製した。
（２）コマツナ幼苗の栽培とエンドファイト処理
コマツナ（品種：夏楽天（タキイ種苗））を２００穴のセルトレイ（用土はｃｌａｙｓｏｉｌ、量は２０ｍＬ／穴）に１株ずつ植えて温室内で栽培した。播種４日後の苗の根本にエンドファイト菌液を終濃度が５ｘ１０^７ＣＦＵ／ｍｌになるように処理した。温室内で２週間栽培を継続した後、屋外の圃場に定植（株間５ｃｍ、条間１５ｃｍ）した。
（３）白さび病の発病と調査
定植後２週間後から白さび病の発病が観察され、定植後６週間後に発病程度を調査した。発病度は、甚（５）、多（４）、中（３）、小（２）、極微（１）の５段階で評価し、統計処理後発病度（％）を算出した。
（結果）
エンドフィト無処理区の発病度２１．８に対して、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌処理区では１８．８であり有意に低下していた。したがって、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属新規細菌処理はコマツナに白さび病抵抗性を誘導することが示された。

本発明により、宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌、該細菌を用いた、植物における病害の防除方法、並びに、該方法により作出された病害耐性を有する植物が提供される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］

Claims

Azospirillum属又はHerbaspirillum属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、又は病原性細菌による病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌を、植物に人為的に感染させる工程を含む、植物における病原性糸状菌、又は病原性細菌による病害の防除方法であって、
前記細菌がAzospirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP-194）、及びHerbaspirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP-193）、並びにそれらの変異株からなる群から選択される少なくとも１種である、防除方法。
前記植物がイネ科又はアブラナ科に属する植物である、請求項１記載の方法。
細菌の植物への感染が植物の栄養成長期に行われる、請求項１又は２記載の方法。
Azospirillum属又はHerbaspirillum属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、又は病原性細菌による病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌を有効成分として含有する、植物における病原性糸状菌、又は病原性細菌による病害の防除剤であって、
前記細菌がAzospirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP-194）、及びHerbaspirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP-193）、並びにそれらの変異株からなる群から選択される少なくとも１種である、防除剤。
Azospirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP-194）又はその変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、又は病原性細菌による病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株。
Herbaspirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP-193）又はその変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、又は病原性細菌による病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株。
Azospirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP-194）、及びHerbaspirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP-193）、並びにこれらの変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、又は病原性細菌による病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株からなる群から選択される少なくとも１種が人為的に感染された、病原性糸状菌、又は病原性細菌による病害に対する耐性を有する植物。