JP5124601B2 - オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法、同定方法及びキット - Google Patents

Description

本発明は、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法、同定方法及びキットに関する。

細菌による感染症の予防や治療のためにβ−ラクタム系抗菌薬をはじめ数多くの抗菌薬が開発され、実用化されてきた。一方、臨床における抗菌薬の使用量の増加に伴い、これら抗菌薬に対する耐性菌の出現が顕著になり、感染症治療における重大な問題となっている（例えば、非特許文献１を参照）。

グラム陰性菌にはβ−ラクタマーゼを産生して薬剤耐性を獲得しているものが多い。β−ラクタマーゼは、β−ラクタム系抗菌薬の分子内β−ラクタム環を加水分解する一群の酵素であり、酵素タンパクのアミノ酸配列の相同性に基づいてＡ〜Ｄの４つのクラスに分類されている（例えば、特許文献１を参照）。ここで、クラスＡ、Ｂ、Ｃに属するβ−ラクタマーゼに対しては、特異的な検出法が存在する。例えば、クラスＢに属するβ−ラクタマーゼはＥＤＴＡで阻害されることから判定可能である。また、クラスＡに属するβ−ラクタマーゼはクラブラン酸で阻害されることから判定可能である。しかしながら、クラスＤに属するβ−ラクタマーゼに対しては特異的な検出方法が存在しないのが現状である。

クラスＤに属するβ−ラクタマーゼは、β−ラクタム系抗生物質の１種である、オキサシリンを良く分解することから、オキサ型β−ラクタマーゼ又はオキサシリナーゼとも呼ばれている。日本では、未だオキサ型β−ラクタマーゼを産生する感染菌による感染症は問題になっていない。しかしながら、イタリア、イギリス、中国、韓国などで重大な感染症が起きていることから、いつ日本で重大な感染症が起こってもおかしくない状況である。感染症が起きた場合、正確な治療方針を定めるためには感染菌を検出する必要があり、また、感染経路を特定して対策を講じるためには、感染菌又は感染菌のタイプを同定する必要がある。そこで、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出又は同定する方法の開発が求められている。

特開２００４−１６６６９４号公報

Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ２９、３０６−３１０、２００７

感染菌が産生するオキサ型β−ラクタマーゼは、約１００種類報告されており、その数はさらに増えると考えられる。これら全てのオキサ型β−ラクタマーゼについて、臨床検査を行うことは非常に困難である。臨床検査で使用可能な方法は、手間やコストなどにより限られており、ラテックスビーズなどの担体の凝集を検出する方法（以下、凝集アッセイという。）や、イムノクロマト法であれば臨床検査で使用可能である。しかしながら、ＰＣＲ法やウエスタンブロット法は、臨床検査での使用が難しい。

本発明は、臨床検査においても使用することができる、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出又はオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプの同定方法を提供することを目的とする。本発明のもう１つの目的は、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出又はオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプの同定のためのキットを提供することである。

発明者らは、ＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１、ＯＸＡ−５４及びＯＸＡ−５８の５種類、又はＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１及びＯＸＡ−５８の４種類のオキサ型β−ラクタマーゼの産生菌を検出又は同定することにより、現在までに知られている約１００種類のオキサ型β−ラクタマーゼ全てについて検出又は同定しなくても、感染症の原因菌として問題を起こす可能性が高い感染菌を、ほぼ全て検出又は同定可能であることを見出した。

感染菌サンプルとしては、例えば、感染症患者検体から分離された、細菌の培養物や破砕物などを用いることができる。感染症患者検体から分離された細菌は、例えば平板培地上でのコロニー形成によりクローニングされていることが好ましい。

１つの態様において、本発明は、感染菌サンプル中の、以下の（ａ）〜（ｅ）のタンパク質：（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び（ｅ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；の存在を検出する、検出ステップと、検出ステップにおいて、上記の（ａ）〜（ｅ）のタンパク質のうち、いずれか１つ以上のタンパク質が検出された場合に、前記感染菌サンプル中にオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌が存在すると判定する、判定ステップとを含む、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法を提供する。

ここで、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出とは、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の存在又は不在を判定することを意味し、いずれのオキサ型β−ラクタマーゼを産生する感染菌であるか（オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプ）を特定することは要しない。

上記の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はＯＸＡ−２３であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はＯＸＡ−４０であり、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はＯＸＡ−５１であり、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はＯＸＡ−５４であり、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質はＯＸＡ−５８である。

感染菌サンプル中の、これら５種類のオキサ型β−ラクタマーゼを検出することによって、現在知られている約１００種類のオキサ型β−ラクタマーゼを全て検出することなく、感染症の原因菌として問題を起こす可能性が高い感染菌をほぼ全て検出することが可能である。このため、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出又は同定に要する手間やコストが大幅に軽減される。

別の態様において、本発明は、感染菌サンプル中の、以下の（ａ）〜（ｅ）のタンパク質：（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び（ｅ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；の存在を検出する、検出ステップと、検出ステップにおいて、上記の（ａ）〜（ｅ）の各タンパク質の発現の有無に基づいて前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定する、同定ステップとを含む、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプの同定方法を提供する。

ここで、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプとは、いずれのオキサ型β−ラクタマーゼを産生する感染菌であるかを指標とした、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の分類を意味する。また、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプの同定（場合により、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の同定という。）とは、いずれのオキサ型β−ラクタマーゼを産生する感染菌であるかを特定することを意味する。

感染菌サンプル中の、これら５種類のオキサ型β−ラクタマーゼそれぞれの発現の有無を検出することによって、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定することが可能である。これにより、現在知られている約１００種類のオキサ型β−ラクタマーゼを全て検出することなく、感染症が起きた場合に正確な治療方針を定めたり、感染経路の特定に有用な情報を得ることができる。

上記の検出ステップは、以下の（ａ）〜（ｅ）のタンパク質：（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び（ｅ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；に対する抗体の抗原抗体反応により行われることが好ましい。臨床検査において、遺伝子レベルでの検査を行うことは困難な場合があるが、抗体を用いた検査であれば、臨床検査で行うことが可能である。

別の態様において、本発明は、上記の方法によって、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出又はオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定するためのキットであって、以下の（ａ）〜（ｅ）のタンパク質：（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び（ｅ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；に対する抗体を含む、キットを提供する。

上記のキットは凝集アッセイ用であってもよいし、イムノクロマト用であってもよい。このような形態のキットであれば、検査が簡便であるため、臨床検査においても使用することが可能である。

別の態様において、本発明は、感染菌サンプル中の、以下の（ａ）〜（ｄ）のタンパク質：（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；の存在を検出する、検出ステップと、検出ステップにおいて、前記（ａ）〜（ｄ）のタンパク質のうち、いずれか１つ以上のタンパク質が検出された場合に、前記感染菌サンプル中にオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌が存在すると判定する、判定ステップとを含む、前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法を提供する。

配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるＯＸＡ−５４を産生する感染菌は、現在大きな問題となっていない。そこで、ＯＸＡ−５４を除いた、ＯＸＡ−２３（配列番号１）、ＯＸＡ−４０（配列番号２）、ＯＸＡ−５１（配列番号３）及びＯＸＡ−５８（配列番号５）の４種類のオキサ型β−ラクタマーゼの産生菌を検出することによって、現在知られている約１００種類のオキサ型β−ラクタマーゼを全て検出することなく、感染症の原因菌として問題を起こす可能性が高い感染菌をほぼ全て検出することが可能である。このため、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出又は同定に要する手間やコストを更に軽減することができる。

別の態様において、本発明は、感染菌サンプル中の、以下の（ａ）〜（ｄ）のタンパク質：（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；の存在を検出する、検出ステップと、検出ステップにおいて、前記（ａ）〜（ｄ）の各タンパク質の発現の有無に基づいて前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定する、同定ステップとを含む、前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプの同定方法を提供する。

感染菌サンプル中の、これら４種類のオキサ型β−ラクタマーゼそれぞれの発現の有無を検出することによって、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定することが可能である。これにより、現在知られている約１００種類のオキサ型β−ラクタマーゼを全て検出することなく、感染症が起きた場合に正確な治療方針を定めたり、感染経路の特定に有用な情報を得ることができる。

上記の検出ステップは、以下の（ａ）〜（ｄ）のタンパク質：（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；に対する抗体の抗原抗体反応により行われることが好ましい。臨床検査において、遺伝子レベルでの検査を行うことは困難な場合があるが、抗体を用いた検査であれば、臨床検査で行うことが可能である。

別の態様において、本発明は、上記の方法によって、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出又はオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定するためのキットであって、以下の（ａ）〜（ｄ）のタンパク質：（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；に対する抗体を含む、キットを提供する。

上記のキットは凝集アッセイ用であってもよいし、イムノクロマト用であってもよい。このような形態のキットであれば、検査が簡便であるため、臨床検査においても使用することが可能である。

本発明により、臨床検査においても使用することができる、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプの同定方法及びこれらの方法のためのキットが提供される。これにより、現在知られている約１００種類のオキサ型β−ラクタマーゼを全て検出することなく、わずか５種類又は４種類のオキサ型β−ラクタマーゼを検出することによって、感染症の原因菌として問題を起こす可能性が高い感染菌をほぼ全て検出することが可能である。したがって、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌による感染症が起こった場合にも、その原因菌を検出又はその原因菌のタイプを同定し、適切に対応することが可能となる。

凝集アッセイ用キットの１実施形態を示す図である。 凝集アッセイ用キットの１実施形態を示す図である。 イムノクロマト用キットの１実施形態を示す図である。 イムノクロマト用キットの１実施形態を示す図である。 マルチプレックスＰＣＲの結果を示す写真である。Ｍ：分子量マーカー。 ＩＳＡｂａ／オキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子のＰＣＲの結果を示す写真である。Ｍ：分子量マーカー。 ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。 イムノクロマト法による検出の結果を示す写真である。数字はサンプルに用いたＯＸＡ−２３の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、矢印は、検出領域の位置を示す。 オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出又は同定するためのイムノクロマト法によるキットの写真である。（ａ）は金コロイドで標識された抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体であり、（ｂ）はイムノクロマト用テストプレート（イムノクロマト用ストリップ）であり、（ｃ）は懸濁用希釈液である。 オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のイムノクロマト法による検出の結果を示す写真である。（ａ）はＯＸＡ−２３又はＯＸＡ−４０の産生菌を検出した結果を示し、（ｂ）はＯＸＡ−５１の産生菌を検出した結果を示し、（ｃ）はＯＸＡ−５８の産生菌を検出した結果を示す。 ＰＣＲ法による検出の結果を示す写真である。Ｍ：マーカー。

オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の分野において、臨床研究の研究者は、オキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列決定までを行うことが技術常識であった。そのため、これまでオキサ型β−ラクタマーゼに対する抗体は作製されなかった。また、基礎研究の研究者は、オキサ型β−ラクタマーゼのカイネティックパラメーターを解析することが技術常識であった。そのため、これまでオキサ型β−ラクタマーゼに対する抗体は作製されなかった。さらに、オキサ型β−ラクタマーゼは、精製が困難なタンパクであるため、これまで抗体が作製されなかった。実際、本発明者らは、ＯＸＡ−２３についてはＨｉｓタグを付けずにタンパクを精製することに成功したが、これ以外のオキサ型β−ラクタマーゼについてはＨｉｓタグを付けることによって、初めて、タンパクを精製することに成功した。しかしながら、Ｈｉｓタグなどのタグを付けてタンパクを発現させると、本来のタンパクの立体構造と大きく異なる立体構造を持ったタンパクになる場合があり、抗体作製などの点で好ましくない場合がある。

感染菌サンプル中の、ＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１、ＯＸＡ−５４及びＯＸＡ−５８の５種類、又はＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１及びＯＸＡ−５８の４種類のオキサ型β−ラクタマーゼを検出又は同定すれば、感染症の原因菌として問題を起こす可能性が高いオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌をほぼ全て検出又は同定可能である。ここで、「ほぼ全て」とは、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌による感染症の患者由来の感染菌サンプルを用いて検査したときに、８０％以上、好ましくは９０％以上の場合において、感染症の原因であるオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出又は同定可能であることを意味する。

本明細書において、「９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、２つのアミノ酸配列を、可能な限り多数のアミノ酸が相互に一致するように並列させて比較した場合に、９０％以上のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列を意味する。ここで、アミノ酸配列を並列させる際には、最大の相同性を与えるようにギャップを含んでもよい。

オキサ型β−ラクタマーゼを検出又は同定する方法としては、ＰＣＲなどを利用した遺伝子レベルでの方法や、抗体やアプタマーなどを用いたタンパクレベルでの方法が使用できるが、臨床検査においても使用可能である点で、抗体の抗原抗体反応による方法が好ましい。感染菌サンプルとしては、例えば、感染症患者検体から分離された、細菌の培養物や破砕物などを用いることができる。感染症患者検体から分離された細菌は、例えば平板培地上でのコロニー形成によりクローニングされていることが好ましい。

オキサ型β−ラクタマーゼであるＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１、ＯＸＡ−５４及びＯＸＡ−５８に対する抗体は、これらのタンパク全長を抗原として作製してもよいし、タンパクの一部分を抗原として作製してもよい。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、さらに抗体断片であってもよい。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、ｓｃＦｖなどが挙げられる。抗体作製において、免疫動物としては、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ロバ、マウス、ラットなどが使用できる。また、免疫動物を使わずに、ファージ・ディスプレイ・ライブラリから抗体をスクリーニングしてもよい。

抗体の精製が必要とされる場合は、プロテインＡやプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの方法を適宜選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製することができる。

上記のようにして得られた抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体の抗原抗体反応により、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼを検出又は同定することが可能である。オキサ型β−ラクタマーゼの検出又は同定は、イムノブロット法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、凝集アッセイ、イムノクロマト法などの当業者に知られたいずれの方法によっても行うことが可能であるが、臨床検査においても使用可能である点で、凝集アッセイ又はイムノクロマト法によって行うことが、より好ましい。

凝集アッセイでは、抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体を結合させた担体を用いてオキサ型β−ラクタマーゼを検出することができる。担体としては、例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球、金コロイド粒子、セレニウムコロイド粒子などを使用することができる。

抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体を担体に結合させる方法は、特に限定されない。例えば抗体を担体に物理吸着させてもよいし、化学的に結合させてもよい。例えば、抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体と担体とを混和した後、３０〜３７℃で１〜２時間振とうすることにより、担体に物理吸着させることができる。担体に結合させる抗体の量は、使用する担体の粒径などに応じて適宜設定することができる。抗体を担体に結合させた後、担体表面上の抗体が結合していない部分を、スキムミルクやウシ血清アルブミンなどを含んだブロッキング溶液を用いてブロッキングすることが好ましい。このように調製した抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体結合担体を、感染菌サンプルと反応させ、凝集の有無や凝集の程度を目視で観察し、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼを検出することができる。

イムノクロマト法では、感染菌サンプル中にオキサ型β−ラクタマーゼが存在した場合に、メンブレンの一端に滴下した感染菌サンプル溶液が、毛細管現象により他端に向かって移動する際に、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼと、金コロイドなどの色素で標識した抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体と、メンブレン上の特定領域に固定した抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体の３者により抗原抗体反応複合体が形成されることにより、色素標識抗体の色素を目視で確認することができる。

酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）においては、抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体又は抗体断片を、マイクロプレート、樹脂ビーズ、磁性化ビーズなどの担体に物理吸着や化学結合により固相化する。固相化量は特に限定されないが、担体がマイクロプレートの場合、１ウェル当たり数ｎｇから数十μｇが好ましい。固相化は固相化すべき抗体を適切なバッファーに溶解し、担体と接触させて行うことができる。例えば、マイクロタイタープレートを用いる場合、抗体溶液をマイクロタイタープレートのウェルに分注し、一定時間静置することにより固相化することができる。抗体を固相化した後は、アッセイ中の非特異的結合を防ぐために、スキムミルクやウシ血清アルブミン等を含んだブロッキング溶液を用いてブロッキングを行うことが好ましい。続いて、固相化担体と感染菌サンプルを反応させ、洗浄後、標識した抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体を反応させる。あるいは、標識した２次抗体を更に反応させてもよい。抗体の標識は、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素を用いて行うことができる。続いて、標識した酵素に応じた基質を用いて発色、発光、蛍光などを発生させて検出する。

感染菌サンプル中の、ＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１、ＯＸＡ−５４及びＯＸＡ−５８のいずれかのオキサ型β−ラクタマーゼの検出を目的とする場合においては、これらのオキサ型β−ラクタマーゼに対する抗体を混合して調製した抗体混合物を用いて上記の方法を行うことができる。これにより、感染菌サンプル中にいずれかのオキサ型β−ラクタマーゼが存在すれば、１度の反応で検出することが可能となる。検出感度の低下などの問題により、１度に混合可能な抗体の数が限られる場合においても、抗体を混合することによって、オキサ型β−ラクタマーゼの検出に要する反応の数を減らすことが可能である。

抗体混合物の抗原抗体反応によりオキサ型β−ラクタマーゼの検出を行った結果、感染菌サンプル中にいずれかのオキサ型β−ラクタマーゼが存在することが明らかとなった場合、その抗体混合物を構成する１種類づつの抗体を用いて個別の反応を行うことにより、感染菌サンプル中に、いずれのオキサ型β−ラクタマーゼが存在するかを特定することができる。ここで、１種類の抗体とは、１種類の抗原に対する抗体であることを意味し、モノクローナル抗体である場合もあればポリクローナル抗体である場合もある。

本発明の１つの態様において、感染菌サンプル中の、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出又はオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプの同定を可能にするキットが提供される。このキットは凝集アッセイ用であってもよいし、イムノクロマト用であってもよい。

以下、図面を参照しながら、好適なキットの実施形態を説明する。なお、図面の説明において同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面は理解を容易にするため一部を誇張して描いており、寸法比率は説明のものとは必ずしも一致しない。また、以下に説明するキットの態様は単なる例示であり、当業者には、様々な変形例が明らかである。本発明に係るキットは、以下に説明する態様に限定されるものではなく、各種の変形例も包含する。

本発明に係るキットは、ＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１、ＯＸＡ−５４及びＯＸＡ−５８の５種類のタンパク質を抗原とする、抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体の組み合わせ、又はＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１及びＯＸＡ−５８の４種類のタンパク質を抗原とする、抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体の組み合わせを含む。凝集アッセイ用のキットにおいては、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。ここで、キットがオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌検出用である場合、図１に例示するように、複数の抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体の混合物が担体に結合していてもよいし、図２に例示するように、それぞれ単独の抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体が結合した担体が、複数種類混合されていてもよい。図１において、担体１の表面には、抗体１１、抗体１２及び抗体１３の３種類の抗体からなる抗体混合物が結合され、抗体結合担体１００を形成している。そして、抗体結合担体１００は、オキサ型β−ラクタマーゼを検出するための凝集アッセイに使用される。図２（ａ）において、担体１の表面には、抗体１１が結合され、抗体結合担体２００を形成している。図２（ｂ）において、担体１の表面には、抗体１２が結合され、抗体結合担体３００を形成している。図２（ｃ）において、担体１の表面には、抗体１３が結合され、抗体結合担体４００を形成している。そして、抗体結合担体２００、３００及び４００は混合されて、オキサ型β−ラクタマーゼを検出するための凝集アッセイに使用される。

凝集アッセイによる、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプの同定用のキットには、図２（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に例示するように、それぞれ単独の抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体が結合した担体が含まれる。この場合には、抗体結合担体２００、３００及び４００は混合されず、それぞれ個別に、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定するための凝集アッセイに使用され、感染菌サンプル中の各オキサ型β−ラクタマーゼの存在又は不在が検査される。

イムノクロマト用のキットも、凝集アッセイ用のキットと同様に、少なくともＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１、ＯＸＡ−５４及びＯＸＡ−５８の５種類のタンパク質を抗原とする、抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体の組み合わせ、又はＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１及びＯＸＡ−５８の４種類のタンパク質を抗原とする、抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体の組み合わせを含む。オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌検出用のキットには、図３に例示するように、複数の抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体の混合物が、メンブレン２０上の検出領域２３に固定されていてもよい。図３において、イムノクロマト用ストリップ５００は、メンブレン２０上に形成された、感染菌サンプル滴下領域２１と、色素標識抗体搭載領域２２と、検出領域２３と、コントロール領域２４とを持つ。ここで、複数の抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体の混合物が、メンブレン上の検出領域２３に固定されている。また、検出領域２３に固定された抗体混合物と同じ抗原を認識する、色素標識抗体の混合物が、色素標識抗体搭載領域２２に搭載されている。さらに、色素標識抗体を認識する抗体が、コントロール領域２４に固定されている。感染菌サンプル滴下領域２１に滴下された感染菌サンプルは、毛細管現象によって、メンブレン２０の他端に向かって移動する。この過程で、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼが、色素標識抗体搭載領域２２に搭載された色素標識抗体と結合し、複合体を形成する。この複合体はさらに移動し、検出領域２３に固定された抗体混合物と更に結合して複合体を形成する。ここで、色素標識抗体の色素が検出領域２３に集中してバンドを形成することにより、目視で識別が可能となる。感染菌サンプルはさらに移動し、サンプル中に含まれていた、未反応の色素標識抗体が、コントロール領域２４に固定された色素標識抗体を認識する抗体と結合する。コントロール領域２４に現れるバンドは、検査が正しく行われたことを示す陽性コントロールである。

イムノクロマト法による、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプの同定用のキットにおいては、上記の検出用のキットにおける抗体混合物の代わりに、１種類の抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体が、図３におけるメンブレン２０上の検出領域２３に固定されている。そして、検出領域２３に固定された抗体と同じ抗原を認識する、１種類の色素標識抗体が、色素標識抗体搭載領域２２に搭載されている。この態様のイムノクロマト用ストリップ５００を用いて検査を行うことにより、１つのイムノクロマト用ストリップ５００で１種類のオキサ型β−ラクタマーゼの存在又は不在を検出することができる。

イムノクロマト法による、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプの同定用のキットの別の態様を図４に例示する。図４において、イムノクロマト用ストリップ６００は、図３のイムノクロマト用ストリップ５００における検出領域２３の代わりに、複数の検出領域３１、３２、３３、３４及び３５を持つ。ここで、各検出領域３１〜３５には、それぞれ１種類ずつの抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体が固定されている。また、色素標識抗体搭載領域２２には、検出領域３１〜３５に固定された各抗体と同じ抗原を認識する、色素標識抗体の混合物が搭載されている。感染菌サンプル滴下領域２１に滴下された感染菌サンプルは、毛細管現象によって、メンブレン２０の他端に向かって移動する。この過程で、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼが、色素標識抗体搭載領域２２に搭載された色素標識抗体と結合し、複合体を形成する。この複合体はさらに移動し、検出領域３１〜３５に固定された各抗体と更に結合して複合体を形成する。色素標識抗体の色素が検出領域３１〜３５のいずれかに集中してバンドを形成することにより、目視で識別が可能となる。ここで、感染菌サンプル中に含まれていたオキサ型β−ラクタマーゼを認識する抗体が、固定されていた領域に、バンドが形成される。出現したバンドの位置により、感染菌サンプル中の各オキサ型β−ラクタマーゼの存在又は不在が判定できる。感染菌サンプルはさらに移動し、サンプル中に含まれていた、未反応の色素標識抗体が、コントロール領域２４に固定された色素標識抗体を認識する抗体と結合する。コントロール領域２４に現れるバンドは、検査が正しく行われたことを示す陽性コントロールである。

以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。

（マルチプレックスＰＣＲ）
抗原に用いるＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１、ＯＸＡ−５４及びＯＸＡ−５８タンパクの入手は困難であった。まず、発明者らが所有していたアシネトバクター菌株及び世界中の研究者に分与を依頼して入手したアシネトバクター菌株の中から、ＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１、ＯＸＡ−５４及びＯＸＡ−５８の遺伝子をゲノム中に持つアシネトバクター菌株を探索した。

表１に示すように、ＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１、ＯＸＡ−５４及びＯＸＡ−５８をコードする塩基配列の一部を増幅する、センス方向及びアンチセンス方向のプライマーを作製した。

表２に示す割合で試薬を混合し、マルチプレックスＰＣＲを行い、アシネトバクター菌株のゲノム上にＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１及びＯＸＡ−５８が存在するか否かを検討した。鋳型としては、アシネトバクター菌株などの懸濁液を１００℃で５分熱処理し、１００００ｒｐｍにて５分間遠心分離して得られた上清液を用いた。水としては、ミリＱ水（ミリポア社の超純水装置で精製された水）を用いた。Ｔａｑポリメラーゼとしては、ＥｘＴａｑ（登録商標）（タカラバイオ株式会社）を用い、バッファーはＥｘＴａｑ（登録商標）に添付のものを用いた。ＰＣＲのプログラムは、９４℃５分を１サイクル；９４℃２５秒、５２℃４０秒、７２℃５０秒を３０サイクル；７２℃６分を１サイクル；４℃で保温であった。ＰＣＲ後、サンプルをアガロースゲル電気泳動により解析した。

典型的な結果を図５に示す。図５（ａ）において、３５３ｂｐの増幅バンドが検出されたサンプルは、そのゲノム上にＯＸＡ−５１をコードする遺伝子を持つことを示す。同様に、５０１ｂｐの増幅バンドが検出されたサンプルは、そのゲノム上にＯＸＡ−２３をコードする遺伝子を持つことを示す。図５（ｂ）において、５９９ｂｐの増幅バンドが検出されたサンプルは、そのゲノム上にＯＸＡ−５８をコードする遺伝子を持つことを示す。図５（ａ）のレーン７及び８に見られるように、複数のオキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子をゲノム上に持つ菌株も検出された。ＯＸＡ−５４遺伝子を持つアシネトバクター菌株についても、上記と同様の手法によって探索した。

（ＩＳＡｂａ／オキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子のＰＣＲ）
アシネトバクターのゲノム上にオキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子が存在するだけでは、オキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子は発現しない。そして、オキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子が発現するためには、遺伝子組換えによりオキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子の上流にＩＳＡｂａ配列が隣接する必要があることが明らかにされている（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．２５８：７２−７７，２００６）。そこで、マルチプレックスＰＣＲによってオキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子の存在が確認された菌株について、ＩＳＡｂａ配列とオキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子が隣接しているか否かをＰＣＲによって検討した。

表３に示すように、ＩＳＡｂａ配列を増幅する、センス方向及びアンチセンス方向のプライマーを作製した。

表４に示す割合で試薬を混合してＰＣＲを行い、アシネトバクター菌株のゲノム上において、ＩＳＡｂａ配列とＯＸＡ遺伝子が隣接しているか否かを検討した。ＰＣＲ反応のプログラムは、９４℃５分を１サイクル；９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル；７２℃７分を１サイクル；４℃で保温であった。ＰＣＲ反応後、サンプルをアガロースゲル電気泳動により解析した。

表４に示す、プライマー１及びプライマー２の組み合わせは表５の通りであった。

典型的な結果を図６（ａ）〜（ｃ）に示す。ゲノム上に、ＩＳＡｂａ配列と隣接したオキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子を持つ、アシネトバクター菌株を鋳型としたサンプルから、ＰＣＲ増幅バンドが検出された。これらのアシネトバクター菌株は、オキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子を発現すると考えられる。図中の数字は各アシネトバクター菌株の識別番号を示す。

（ＯＸＡ遺伝子発現ベクターの構築）
ＩＳＡｂａ配列と隣接したオキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子を持つアシネトバクター菌株から、オキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子をクローニングし、発現ベクターを構築した。

表６に示すように、ＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１、ＯＸＡ−５４及びＯＸＡ−５８の発現ベクター構築用の、センス方向及びアンチセンス方向のプライマーを作製した。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、シグナルペプチドを含まない形でオキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子を増幅することができる。

表７に示す割合で試薬を混合してＰＣＲを行い、ＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１、ＯＸＡ−５４及びＯＸＡ−５８遺伝子断片を増幅した。鋳型には、各ＯＸＡ遺伝子をＩＳＡｂａ配列と隣接した状態で持つアシネトバクター菌株の培養液を用いた。Ｔａｑポリメラーゼとしては、インビトロジェン社のＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（商品名）を用い、ＭｇＣｌ_２溶液は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（商品名）に付属のものを用いた。ＰＣＲ反応のプログラムは、９４℃５分を１サイクル；９４℃６０秒、５５℃６０秒、７２℃６０秒を３０サイクル；７２℃１０分を１サイクル；４℃で保温であった。

表７に示す、プライマー３及びプライマー４の組み合わせは表８の通りであった。

ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、ｐＣＲ２．１ベクター（商品名、インビトロジェン社）にクローニングし、塩基配列を確認した。配列番号３５にＯＸＡ−２３遺伝子、配列番号３６にＯＸＡ−４０遺伝子、配列番号３７にＯＸＡ−５１遺伝子、配列番号３８にＯＸＡ−５４遺伝子、配列番号３９にＯＸＡ−５８遺伝子の確認した塩基配列をそれぞれ示す。続いて、ｐＣＲ２．１ベクターから、オキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子断片を、制限酵素を用いて切り出し、発現ベクターにクローニングした。

ＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０及びＯＸＡ−５４遺伝子断片は、発現ベクターｐＥＴ２８（ノバジェン社）にクローニングした。クローニングには、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを用いた。このクローニングにより、Ｃ末端側にＨｉｓタグが付加された。ＯＸＡ−５１及びＯＸＡ−５８遺伝子断片は、ｐＥＴ２８ではうまく発現しなかったため、ｐＣｏｌｄ１ベクター（タカラバイオ株式会社）にクローニングした。クローニングには制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを用いた。このクローニングにより、Ｎ末端側にＨｉｓタグが付加された。ＯＸＡ−４８遺伝子についても、上記と同様の手法によって発現ベクターにクローニングすることが可能である。

（タンパク発現、精製及び抗体の作製）
構築した発現ベクターを大腸菌株ＢＬ２１ＤＥ３（タカラバイオ社）に導入して発現させた。具体的には、培養液のＯＤ_６００が０．４〜０．５に到達するまで培養を行った後、ｐＥＴ２８を用いた場合は終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを培養液に添加し、ｐＣｏｌｄ１ベクターを用いた場合は培養温度を１５度にシフトして、さらに約１８時間培養した。培養液を８０００ｇで遠心し、大腸菌ペレットを回収した。続いて大腸菌ペレットをＯＸＡ−４０の場合は０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ ７．０）、ＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−５１、ＯＸＡ−５４及びＯＸＡ−５８の場合は０．０２Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕した後、４００００ｇで遠心して上清を回収した。超音波破砕装置にはＳｏｎｉｆｉｅｒ１５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社、米国）を使用した。続いて回収した上清を０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）中で透析し、ＡＫＴＡシステム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、発現させたオキサ型β−ラクタマーゼタンパクを精製した。

精製した各オキサ型β−ラクタマーゼタンパクを用いてウサギを免疫し、ポリクローナル抗体を作製した。

（ウエスタンブロッティング）
各アシネトバクター菌株１コロニーを、ＬＢ培地４ｍＬに釣菌し、一晩培養した。続いて培養液をエッペンドルフチューブに移し、室温にて６５００ｇで１５分遠心した後、上清を捨て、ペレットをリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）に懸濁した。続いて菌液を３０秒で５回の処理で超音波破砕し、４℃にて４００００ｇで３０分遠心した後、上清を回収し、これを電気泳動用のサンプルとした。各サンプル１０μＬにＳＤＳサンプルバッファーを１０μＬずつ加え、１００℃にて５分間加熱後、１０μＬずつウェルにアプライし、３０ｍＡで８０分電気泳動した。分子量マーカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）及びコントロールサンプルも同時に電気泳動した。コントロールサンプルとしては、大腸菌で発現させて精製したＯＸＡ−２３及びＯＸＡ−４０タンパクを用いた。ポリアクリルアミドゲルにはｅ・パジェル（登録商標）（アトー株式会社、Ｅ−Ｒ１０Ｌ）を用いた。

電気泳動後、ブロッティング装置（アトー株式会社、ＢＥ３００）を用いて２ｍＡ／ｃｍ^２で９０分通電し、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社、ＧＶＨＰ３０４Ｆ０）にブロッティングした。

ブロッティング後のＰＶＤＦ膜を、ブロッキングバッファー（１％スキムミルク、ＢＤ社、００３２−１７−３）中で振とうし、９０分ブロッキングした。続いて、ブロッキングバッファーで１０００倍希釈した抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体と、１時間反応させた。続いて、ＰＶＤＦ膜をブロッキングバッファーで洗浄し、ブロッキングバッファーで１０００倍希釈した２次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ標識抗体、バイオラッド社、１７２−１０１９）と１時間反応させた。続いて、ＰＶＤＦ膜をブロッキングバッファーで洗浄し、基質液（３，３’−５，５’テトラメチルベンジジン、和光純薬株式会社）を加えて発色させた。図７に結果を示す。図７（ａ）はポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルをＣＢＢ染色した結果である。図７（ｂ）は（ａ）のゲルをＰＶＤＦ膜にブロッティングし、抗ＯＸＡ−２３抗体を反応させて発色させた結果である。図７（ｃ）及び（ｄ）はそれぞれ抗ＯＸＡ−２３抗体及び抗ＯＸＡ−４０抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果である。

（イムノクロマト法を用いたＯＸＡ−２３産生菌の検出）
ＯＸＡ−２３を産生するアシネトバクター菌株を、平板培地上で培養した。続いて、培地表面の菌体を掻き取り、１ｍＬの懸濁用希釈液に懸濁した。菌体が均一に分散するようにボルテックスミキサーで撹拌し、エッペンドルフチューブに１００μＬ分取し、感染菌サンプルとした。懸濁用希釈液には０．０１容量％の界面活性剤が含有されており、菌体内のＯＸＡ−２３が抽出された。なお、この界面活性剤は、抗体によるオキサ型β−ラクタマーゼの検出に悪影響を与えないことが分かっている。この感染菌サンプルに、金コロイドで標識した、抗ＯＸＡ−２３抗体及び抗ＯＸＡ−４０抗体の抗体混合物１０μＬを添加してよく混合した。この溶液をイムノクロマト用テストプレートの感染菌サンプル滴下領域に全量滴下し、２０分間静置した。この過程で、滴下した金コロイド標識抗体混合物と感染菌サンプル中のＯＸＡ−２３が複合体を形成し、毛細管現象によりテストプレートの他端に向かって移動し、テストプレートの途中に位置する検出領域に固定された抗ＯＸＡ−２３抗体及び抗ＯＸＡ−４０抗体の抗体混合物に結合し、目視で識別が可能なバンドを形成した。

（精製したＯＸＡ−２３のイムノクロマト法による検出）
０、１０、２０、５０及び５００ｎｇ／ｍＬ濃度の精製したＯＸＡ−２３溶液各１００μＬに、金コロイドで標識した、抗ＯＸＡ−２３抗体及び抗ＯＸＡ−４０抗体の抗体混合物１０μＬを添加してよく混合した。この溶液をイムノクロマト用テストプレートの感染菌サンプル滴下領域に全量滴下し、２０分間静置した。結果を図８に示す。１０、２０、５０及び５００ｎｇ／ｍＬ濃度のＯＸＡ−２３溶液を滴下したテストプレートの検出領域に目視で識別が可能なバンドが形成された。

（オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出又は同定するためのキット）
感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出又はオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定するためのイムノクロマト法によるキットを作製した。図９にキットの写真を示す。図９において、（ａ）は金コロイドで標識された抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体であり、（ｂ）はイムノクロマト用テストプレート（イムノクロマト用ストリップ）であり、（ｃ）は懸濁用希釈液である。金コロイドで標識された抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体としては、抗ＯＸＡ−２３抗体、抗ＯＸＡ−４０抗体、抗ＯＸＡ−５１抗体及びＯＸＡ−５８抗体の４種類を使用した。また、検出感度の観点から、抗ＯＸＡ−２３抗体及び抗ＯＸＡ−４０抗体は、混合して抗ＯＸＡ−２３／４０抗体として使用した。抗ＯＸＡ−５１抗体及び抗ＯＸＡ−５８抗体は、それぞれ単独で使用した。なお、ＯＸＡ−５４の産生菌は、臨床検査において、現在のところ大きな問題となっていないため、本実施例においては、抗ＯＸＡ−５４抗体は使用しなかった。

（オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のイムノクロマト法による検出）
上述のキットを用いてオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出した。まず、感染菌サンプル（被検菌株）を静置培養法により培養した。続いて、培地表面の菌体を掻き取り、１ｍＬの懸濁用希釈液に懸濁し、菌体懸濁液を調製した。続いて、菌体懸濁液を１００μＬ分取し、金コロイドで標識された抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体１０μＬと混合し、抗体反応液を調製した。続いて、抗体反応液の全量をテストプレートの感染菌サンプル滴下領域に滴下した。続いて、３０分間静置後、検出領域におけるバンドの有無を目視により判定した。

図１０に、抗ＯＸＡ−２３／４０抗体、抗ＯＸＡ−５１抗体及び抗ＯＸＡ−５８抗体を用いて、それぞれＯＸＡ−２３又はＯＸＡ−４０の産生菌（ａ）、ＯＸＡ−５１の産生菌（ｂ）及びＯＸＡ−５８の産生菌（ｃ）を検出した代表的な結果を示す。このキットを用いて、ＯＸＡ−２３又はＯＸＡ−４０の産生菌、ＯＸＡ−５１の産生菌及びＯＸＡ−５８の産生菌を簡便に検出することができた。

（ＰＣＲ法及びイムノクロマト法によるオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出）
日本全国の医療施設において、ＰＣＲ法によりオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出した。その結果、ＯＸＡ−２３の産生菌６株、ＯＸＡ−４０の産生菌１株、ＯＸＡ−５１の産生菌１５株及びＯＸＡ−５８の産生菌５株の合計２７株のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌が検出された。結果を表９に示す。ＯＸＡ−２３陽性株はいずれもＯＸＡ−５１陽性であった。

続いて、ＰＣＲ法による検出でＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１又はＯＸＡ−５８の産生菌と判断された２７株の菌株をサンプルとして、上述のイムノクロマト法によるキットを用いたオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出を行った。結果を表９に示す。ＰＣＲ法による検出においては、ＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１又はＯＸＡ−５８の産生菌を別々に検出したが、上述のように、イムノクロマト法においては、ＯＸＡ−２３及びＯＸＡ−２４の産生菌は、混合した抗体を用いて同時に検出した。ＰＣＲ法とイムノクロマト法による検出結果は非常によく一致し、ＰＣＲ法によりＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１又はＯＸＡ−５８の産生菌と判断された２７株の菌株のうち、２６株がイムノクロマト法によりＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−５１又はＯＸＡ−５８の産生菌として検出された。ＰＣＲ法でＯＸＡ−５８の産生菌と判断された菌株のうち１株のみについて、イムノクロマト法で陰性と判断された。ＰＣＲ法とイムノクロマト法による検出結果の一致率は、下記計算式（１）から９６．３％と計算された。
２６サンプル／２７サンプル×１００＝９６．３（％）・・・（１）
以上の結果は、検査が簡便で、臨床検査においても使用することが可能なイムノクロマト法による検査により、より正確なＰＣＲ法による検出結果と非常によく一致した検出結果が得られることを示す。

（イムノクロマト法で検出されたオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の抗菌薬感受性）
上記のイムノクロマト法によるキットを用いた検査により、入院中の患者由来の感染菌サンプルからオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出した。この結果、ＯＸＡ−２３及びＯＸＡ−５１の両方を産生する産生菌が３株検出された。

これらの３株のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌について、表１０に示す抗菌薬の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。具体的には、段階希釈した抗菌薬を含む培地をマイクロプレート上に調製し、これに上記のＯＸＡ−２３及びＯＸＡ−５１の両方を産生する産生菌を接種して一夜培養後、培地の濁度あるいは沈殿の目視によって、菌株の発育が阻止される抗菌薬の最小濃度を求めた。

代表的な結果を表１０に示す。３株とも同様な結果を示した。この結果は、例えばこの菌株の培養液に、抗菌薬としてアンピシリンを添加した場合、３２μｇ／ｍＬの濃度のアンピシリンを添加しても菌体の発育を阻止できないことを示す。この結果から明らかなように、これらの菌株に有効な抗菌薬はミノサイクリンのみであり、その他の抗菌薬には耐性を有していた。この結果は、多くの抗菌薬に対する耐性を有し、感染症治療において重大な問題となりうるオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を、上記のイムノクロマト法によるキットで検出することが可能であることを示す。

（イムノクロマト法及びＰＣＲ法による、オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出結果の比較）
続いて、イムノクロマト法によるキットにより検出された、上述のＯＸＡ−２３及びＯＸＡ−５１の両方を産生する３株の産生菌それぞれをサンプルとして、ＰＣＲ法により、ＯＸＡ−２３及びＯＸＡ−５１の産生菌であるか否かを検討した。

図１１にＰＣＲ増幅した各サンプルのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。図１１において、レーン１〜４、５〜８及び９〜１２は、それぞれ別の菌株サンプルのＰＣＲ増幅の結果を示し、Ｍは分子量マーカーを示す。ＰＣＲ反応の鋳型として、各菌株の懸濁液を１００℃で５分間熱処理後、１００００ｒｐｍにて５分間遠心分離して得られた上清液を用いた。図１１において、レーン１、５及び９は、菌株のゲノム上のＯＸＡ−２３遺伝子の存在を検出したものである。また、レーン２、６及び１０は、遺伝子組換えによりＯＸＡ−２３遺伝子の上流にＩＳＡｂａ配列が隣接し、ＯＸＡ−２３が発現可能な状態になっているか否かを検出したものである。また、レーン３、７及び１１は、菌株のゲノム上のＯＸＡ−５１遺伝子の存在を検出したものである。また、レーン４、８及び１２は、遺伝子組換えによりＯＸＡ−５１遺伝子の上流にＩＳＡｂａ配列が隣接し、ＯＸＡ−５１が発現可能な状態になっているか否かを検出したものである。レーン１、５及び９におけるサンプルのＰＣＲ反応には、プライマーＯＸＡ２３Ｆｗ（配列番号６）及びＯＸＡ２３Ｒｖ（配列番号７）を用いた。レーン２、６及び１０におけるサンプルのＰＣＲ反応には、プライマーＩｓａｂａ１Ｆｗ（配列番号１６）及びＯＸＡ２３Ｒｖ（配列番号７）を用いた。レーン３、７及び１１におけるサンプルのＰＣＲ反応には、プライマーＯＸＡ５１Ｆｗ（配列番号１０）及びＯＸＡ５１Ｒｖ（配列番号１１）を用いた。レーン４、８及び１２におけるサンプルのＰＣＲ反応には、プライマーＩｓａｂａ１Ｆｗ（配列番号１６）及びＯＸＡ５１Ｒｖ（配列番号１１）を用いた。

その結果、レーン１〜１２の全てに増幅バンドが検出された。この結果は、これらの３株の菌株が、いずれもＯＸＡ−２３遺伝子をゲノム上に持っており、このＯＸＡ−２３遺伝子は発現可能な状態であり、さらに、ＯＸＡ−５１遺伝子をゲノム上に持っており、このＯＸＡ−５１遺伝子は発現可能な状態であることを示す。

以上の結果はまた、イムノクロマト法によるオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出結果とＰＣＲ法によるオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出結果が良好に一致したことを示す。

１…担体、１１，１２，１３…抗体、２０…メンブレン、２１…感染菌サンプル滴下領域、２２…色素標識抗体搭載領域、２３，３１，３２，３３，３４，３５…検出領域、２４…コントロール領域、１００，２００，３００，４００…抗体結合担体、５００，６００…イムノクロマト用ストリップ。

Claims (10)

1. 日本国内で採取された感染菌サンプル中の、以下の（ａ）〜（ｅ）のタンパク質：
   （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び
   （ｅ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   の存在を検出する、検出ステップと、
   検出ステップにおいて、前記（ａ）〜（ｅ）のタンパク質のうち、いずれか１つ以上のタンパク質が検出された場合に、前記感染菌サンプル中にオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌が存在すると判定する、判定ステップと
   を含む、前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法。
2. 日本国内で採取された感染菌サンプル中の、以下の（ａ）〜（ｅ）のタンパク質：
   （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び
   （ｅ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   の存在を検出する、検出ステップと、
   検出ステップにおいて、前記（ａ）〜（ｅ）の各タンパク質の発現の有無に基づいて前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定する、同定ステップと
   を含む、前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプの同定方法。
3. 前記検出ステップが、以下の（ａ）〜（ｅ）のタンパク質：
   （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び
   （ｅ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   に対する抗体の抗原抗体反応により行われる、請求項１又は２に記載の方法。
4. 請求項１又は２に記載の方法によって、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出又はオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定するためのキットであって、以下の（ａ）〜（ｅ）のタンパク質：
   （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び
   （ｅ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   に対する抗体を含む、キット。
5. 日本国内で採取された感染菌サンプル中の、以下の（ａ）〜（ｄ）のタンパク質：
   （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び
   （ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   の存在を検出する、検出ステップと、
   検出ステップにおいて、前記（ａ）〜（ｄ）のタンパク質のうち、いずれか１つ以上のタンパク質が検出された場合に、前記感染菌サンプル中にオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌が存在すると判定する、判定ステップと
   を含む、前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法。
6. 日本国内で採取された感染菌サンプル中の、以下の（ａ）〜（ｄ）のタンパク質：
   （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び
   （ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   の存在を検出する、検出ステップと、
   検出ステップにおいて、前記（ａ）〜（ｄ）の各タンパク質の発現の有無に基づいて前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定する、同定ステップと
   を含む、前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプの同定方法。
7. 前記検出ステップが、以下の（ａ）〜（ｄ）のタンパク質：
   （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び
   （ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   に対する抗体の抗原抗体反応により行われる、請求項５又は６に記載の方法。
8. 請求項５又は６に記載の方法によって、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出又はオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定するためのキットであって、以下の（ａ）〜（ｄ）のタンパク質：
   （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   （ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；及び
   （ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質；
   に対する抗体を含む、キット。
9. 凝集アッセイ用である、請求項４又は８に記載のキット。
10. イムノクロマト用である、請求項４又は８に記載のキット。