JP5124748B2 - 分化したトリ細胞および多能性の維持に関与する遺伝子の調製方法。 - Google Patents

Description

本発明は、培養状態の幹細胞から分化したトリ細胞を調製する方法に関するものである。トリ幹細胞の多能性の維持に関与する遺伝子が同定されクローニングされた。幹細胞におけるこれらの遺伝子の発現を阻害することにより、これらの幹細胞はその多能性の特徴を失い、分化経路を開始する。インビトロで得られるこれらの分化細胞は、病原体、特にウイルスの宿主細胞として役立ち、かくして抗ウイルスワクチンの生産に利用することが可能である。

幹細胞は、自己複製能力を有する、胎児または成人に由来する多能性または複能性の細胞である。換言すると、幹細胞は、培養状態で無限に分裂する能力、ならびに由来元の母細胞と同じ増殖能および分化能を有する娘細胞を提供する能力を有し、かつ分化細胞を生じさせる能力を有する、非癌性の細胞である。

ニワトリの胚性幹細胞（Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓを略してＣＥＳＣ）は、ステージＸのニワトリの胚盤葉細胞を培養することにより単離されている（Ｐａｉｎら、１９９６年、仏国特許出願第９４／１２５９８号明細書）。これらのＣＥＳＣ細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）の全ての特徴を有する。これらのトリ細胞の多能性を維持することのできる培地が、国際公開第９６／１２７９３号パンフレットの特許出願の対象となっている。これらの細胞の特徴の大部分は、Ｌａｖｉａｌらによる刊行物（提出済）の中で記載されている。

幹細胞の特性の一つは、インビトロおよびインビボの両方で分化細胞を生じさせるその能力にある。一様な前駆体集団からのこれらの分化細胞の獲得は、培養条件の変更により実現される。実際、ＣＥＳＣ細胞は、成長因子、および不活性「フィーダー」のようなサイトカインが存在する、インビトロでの一定の培養条件下においてのみ、未分化の状態で増殖し続ける。培地が貧化すると直ちに増殖の平衡は変化し、細胞は分化を開始する。ＣＥＳＣ細胞からインビトロで分化細胞を得ることの利点の一つは、これらの細胞から生成され得る表現型の幅がきわめて広いことにある。実際、ＣＥＳＣ細胞は多能性の特性を有する。これらは、発生学的レベルで規定される全ての系、すなわち中胚葉、外胚葉または内胚葉由来のものに分化し得る。幹細胞に固有のこの多能性の特性は、すでに分化経路を開始している組織の初代細胞においては存在しない。この特性は、胚性幹細胞において最大であり、また、複能性である組織性の成熟幹細胞レベルでは、存在はするものの、より制限された形で存在する。後者の幹細胞は、唯一の同じ系に属する分化経路においてのみ分化可能である。

核のリプログラミングプロセスにより、分化した細胞は分化の可塑性をとり戻すことができる。これらのメカニズムは、アセチル化および脱アセチル化、メチル化および脱メチル化、リジンのユビキチン化、セリンのリン酸化、プロリンの異性化のプロセスによる、ＤＮＡおよび／またはヒストンなどのその構成要素のレベルで生じるエピジェネティックな修飾（ＣｐＧアイランド上でのメチル化）を特に理解することによって分子レベルで明らかにされ始めており、その結論の一つは、プロモーター上に結びつくことによりキー遺伝子の発現レベルを制御する、タンパク質複合体の数多くのｅの動員である。これらのアクターの直接的な翻訳後修飾もまた補足的な調節の要件である。

当業者に、インビトロでの多能性幹細胞から分化細胞への分化を誘導または制御するための様々なプロセスが既知である。

第一のアプローチは、細胞増殖の維持に必要なサイトカインおよび成長因子をほとんどまたは全く含有しない培地内に細胞を播種することから成る。特に、ｇｐ１３０ファミリーのサイトカイン（ＬＩＦ、ＩＬ−６、ＣＮＴＦ、ＧＰＡ、ＩＬ−１１・・・）が欠如しているかまたはその濃度が低い場合、増殖の減速および多能性のマーカーの漸進的な喪失が誘導される。

このプロセスに付された細胞の分化は一様ではない。すなわち、異なる細胞型が、細胞の密度、自己分泌、および傍分泌の条件、ならびにそれらの相互関係にしたがって、得られることになる。得られた細胞の多様性は、培養物全体における、例えば中胚葉系に特異的なＢｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子およびＧｏｏｓｅｃｏｉｄ遺伝子、神経外胚葉に特異的な一部のＰａｘ遺伝子およびＳｏｘ遺伝子、ならびに内胚葉系に特異的なＨｎｆ３といった、系の早期マーカーの大部分の検出により推定することができる。

第二のアプローチは、細胞培養のために処理されていないボックス内に細胞を播種することにより胚様体を実現することから成る。分離された細胞は、貧化され（例えば０．５〜５％といったより少ない血清、かつ特異的な成長因子およびサイトカインの不在）穏やかな撹拌に付された大量の培地内か、または懸滴法で利用される貧化された少量の培地内に懸濁される。様々な例が、米国特許第５４５６３５７号明細書、米国特許第５９１４２６８号明細書、および米国特許第６４５８５８９号明細書において示されている。もう一つの条件付けは、コニカルチューブ内において（Ｋｕｒｏｓａｗａら、２００３年）、特定の処理済みの表面上において（Ｋｏｎｎｏら、２００５年）、またはアルギン酸マイクロビーズへの封入により（Ｍａｇｙａｒら、２００１年）直接胚葉体を形成することである。かくして細胞の付着およびその基底外側の分極を妨げることにより、胚性幹細胞は増殖し、かつ、異なる胚葉を模倣する三次元構造をとる（Ｄａｎｇら、２００２年）。こうして得られた細胞型は極めて多様である。さらに、分化の様々な段階の獲得動態において多様性が見られる。

第三のアプローチは、分化用化学誘導剤の利用にある。化学誘導物質とは、天然由来のものであれ化学合成によるものであれ、成長因子またはサイトカインに類似していない全ての非ペプチド性の化学分子を意味する。

例えば、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は、誘導された複数の細胞型を伴う混合分化集団を得ることを可能にする一般的な誘導剤として利用される（Ｄｉｎｓｍｏｒｅら、１９９６年）。レチノイン酸は、非限定的ではあるが、単独で、または例えばｃＡＭＰと組み合わせた形で、精確な動態条件下での脂肪細胞の獲得（Ｄａｎｉら、１９９７年）、心筋細胞の獲得、収縮能および特異的ミオシンの存在を特徴とする様々な筋細胞（Ｒｏｈｗｅｄｅｌら、１９９４年；Ｄｒａｂら、１９９７年）の獲得を伴う、特に中胚葉由来のものへの幹細胞の分化を得ることを可能にする。

現在公表され、特にマウスの胚性幹細胞から特定の表現型を有する細胞を得ることを可能にする手順の大部分は、化学誘導剤と成長因子の結合性複合体とを結びつけている。誘導の動態における変動およびこれらの作用物質の投入により、得られる表現型を調節することができる。脂肪細胞（Ｄａｎｉら、１９９７年）、骨芽細胞（ＺｕｒＮｉｅｄｅｎら、２００３年；Ｐｈｉｌｉｐｓら、２００１年）、および異なる表現型を有する神経前駆細胞（Ｆｒａｉｃｈａｒｄら、１９９５年；Ｐｌａｃｈｔａら、２００４年；ＧｌａｓｅｒおよびＢｒｕｓｔｌｅ、２００５年）の獲得動態について例が示されている。

かかるアプローチの再現性は時として困難であり、特定のウイルスの複製または目的の分子の生産といった工業的利用に十分な大量の分化細胞を得ることを可能にするものではない。その上、これらのプロセスは非常に特殊な培地の利用が関与する数多くのステップ、および細胞操作のための数多くのステップを含んでいる。

前述のアプローチにより、幹細胞の分化を誘導することが可能になる。得られた集団は多様であることから、その後に、所望の表現型を有する細胞を選択し単離することが必要であるが、そのためのいくつかの技術が当業者に知られている。特異的表面抗体、枯渇、または磁気濃縮による標識の後の、表面選別機による選別を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。

もう一つのアプローチは、正の遺伝子選択プロセスを用いる濃縮手順を利用することから成る。このためには、薬物（ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゼオマイシン、プラスチシジン）の選択のための遺伝子、またはそれを発現する細胞の物理的選別を可能にする表現型マーカー（野生型ＧＦＰまたは修飾ＧＦＰといった蛍光タンパク質、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ）の発現は、組織特異的プロモーターに依存した状態に置かれる。利用されるプロモーターの中では、Ｍｙｏｓｉｎｅ鎖のプロモーター（Ｍｕｌｌｅｒら、２０００年）、筋形成の誘導遺伝子Ｍｙｆ５もしくはＭｙｏＤのプロモーター、Ｎｅｓｔｉｎｅのプロモーター（Ｋｅｙｏｕｎｇら、２００１年）や、Ｈｂ９のプロモーター（ＳｉｎｇｈＲｏｙら、２００５年）、ＧＦＡＰといった星状膠細胞の特異的プロモーター（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅら、２００５年）、またはＣＮＰ（環状３’ホスホジエステラーゼ）遺伝子を有するオリゴデンドロサイトといったその他のニューロンタイプのプロモーター（Ｇｌａｓｅｒら、２００５年；Ｓｃｈｍａｎｄｔら、２００５年）を挙げることができる。

もう一つのアプローチは、例えば、筋芽細胞系のｃＤＮＡ（Ｐａｘ３、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｍｙｏｇｎｅｎｉｎｅ、Ｍｆｔ−４などの遺伝子）を用いるなどによる、所与の系において分化を誘導し得る目的のｃＤＮＡの過剰発現から成る。この過剰発現は、ランダム挿入の過剰発現ベクターを用いて実施することができるが、アクチンの所与の遺伝子座または系の特異的遺伝子座へのノックイン戦略を用いて、さらにはウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターを用いても実施することができる。
仏国特許出願公開第９４／１２５９８号明細書 国際公開第９６／１２７６３号パンフレット

したがって、現在のところ、後の選択ステップを実施することなく、インビトロで分化した一様な細胞集団を得ることを可能にする方法は存在しない。このような理由から、本発明者は、補足的な選択ステップを必要としない、一様な形態学的、生化学的および機能的特徴を有する、分化した細胞集団を得ることを可能にする新規な技術を開発した。本発明に従うと、誘導されたクローン、つまり分化した細胞から成るクローンの８０〜１００％の細胞の形態、表現型、および分子の変化を得ることが可能である。

哺乳動物においては、幹細胞の多能性および増殖能力を制御する複数の遺伝子が同定されている。特に、Ｏｃｔ４遺伝子（Ｎｉｃｈｏｌｓら、１９９８年）は、インビボで多能性細胞においてのみ発現するキー遺伝子である。インビトロで、Ｏｃｔ４は、マウスおよび霊長類の胚性幹細胞、ならびに一部の腫瘍細胞系において発現する。マウスの胚性幹細胞におけるＯｃｔ４の発現レベルは、これらの幹細胞の将来を制御すると思われる（Ｎｉｗａら、２０００年）。

Ｏｃｔ４遺伝子は、ホメオドメイン転写因子のＰＯＵファミリーに属する。遺伝子から産生されるタンパク質は核局在化し、そのＤＮＡ固定ドメインを介して標的遺伝子の調節エレメント上に直接固定され得る。

系統発生学的観点から見ると、哺乳動物以外の種において同等の機能を有する遺伝子が存在する確率は低いものであった。鳥類においては、このような遺伝子は、先行する研究においては同定されなかった（Ｓｏｏｄｅｎ−ＫａｒａｍａｔｈおよびＧｉｂｂｉｎｓ、２００１年）。その上、ゲノムレベルでの相同性は全く報告されていない。

哺乳動物においては、Ｎａｎｏｇ遺伝子（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、２００３年；Ｍｉｔｓｕｉら、２００３年；Ｈａｒｔら、２００４年）およびＥｏｍｅｓ（Ｒｕｓｓら、２０００年；Ｇｉｎｉｓら、２００４年）遺伝子もまた、幹細胞の多能性の維持において主要な役割を果たすものとして同定されている。

本発明は、適切な培地内で培養されたトリ幹細胞から分化したトリ細胞の調製方法であって、１Ｐ０６遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、およびＥｏｍｅｓ遺伝子の中から選択された幹細胞において発現する遺伝子の発現または活性を阻害することによって前記幹細胞の分化を誘導するステップを含むことを特徴とする方法を提案するものである。

この方法の利点は、得られる分化細胞が一様であるという点にある。得られたクローンはもはや幹細胞のクローンに特徴的な形態を有さないが、分化した形態を有する。これらのクローンはまた、親細胞に特徴的な増殖も有さず、誘導後、細胞性は一定のままである。

幹細胞の分化のこの誘導は、急速であると同時に不可逆的である。

好ましくは、トリ細胞はキジ目に属するトリ、特にニワトリまたはウズラ、さらに好ましくはセキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）種に由来する。

「幹細胞」という語により、当業者は細胞が以下の特徴を有するものと理解する。
−文献において周知の成長因子の存在下で、長時間、インビトロにおいて自己複製で増殖する能力。
−形態学的観点から見ると、幹細胞は、５〜１０μｍの核を有する１０〜１５μｍの相対サイズである高い核細胞質比に特徴を有し、アルカリホスファターゼおよびテロメラーゼの固有の生化学的活性といったような様々な固有の生化学的活性を有し、仏国特許第９４／１２５９８号明細書および仏国特許第００／０６０２９号明細書に記載されているような様々な特異的抗体により認識される。トリ胚性幹細胞のもう一つの特殊性は、それらが増殖するときのその密な膜の接触にある。
−細胞は多能性であり、これはすなわち、該細胞が複数の細胞型を生じさせることができることを意味し、特に本発明のトリ幹細胞は、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する細胞へと分化可能である。

「分化細胞」という語により、当業者は、細胞が比較的わずかしか増殖しないかまたは全く増殖しないこと、細胞が、より低い核細胞質比と、形態がコンパクトでない、一般により大きなサイズ（１５〜２０μｍ超、また、破骨細胞、成熟脂肪細胞、分化筋細胞、一部のマクロファージなどといった一部の特殊な細胞型についてはそれ以上）とを有すること、そして、該細胞が、誘導されていない幹細胞の生化学マーカーを有さないことを理解する。

特に、幹細胞は、特異的なインテグリン、カドヘリン、一部のムチン、ケラチノサイトに対するサイトケラチン８、１８、および１９、またはケラチン１６といったマーカーの存在により特徴づけられる上皮細胞へと分化し得る。考慮対象の上皮細胞の由来に応じて、マーカーの様々な結びつきは、特に腫瘍過程において、上皮細胞の由来および分化度に特徴的なものである（Ｂａｒａｋら、２００４年）。

本発明のもう一つの態様に従うと、幹細胞は、ＣＤ（分化抗原群）分類によりマウスおよびヒトにおいて知られかつＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９８年）に公開されている総説においてＬａｉらが例示している膜マーカーの存在によりとりわけ特徴づけられる造血前駆細胞または分化造血細胞へと分化し得る。特に特異的転写因子といったその他の非膜マーカーも利用することができる。

「遺伝子の発現または活性の阻害」という記載により、当業者は、遺伝子の発現を制御することを可能にする通常の全ての手段、特に転写または翻訳の阻害剤の使用が利用可能であることを理解する。特に、干渉ＲＮＡを利用することにより、目的の遺伝子の発現を特異的に阻害することができる。

本発明の特定の態様に従うと、遺伝子の発現または活性の阻害は、条件付きで実現される。かくして、細胞の分化を当業者が望む時点で開始させることができる。

本発明の特定の態様に従うと、遺伝子の発現または活性の阻害は、少なくとも一つの干渉ＲＮＡを用いて実施される。

干渉ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を特異的にターゲティングするために利用される。干渉ＲＮＡはｍＲＮＡにハイブリダイズしようとし、その結果、単純な立体障害によって、またはｍＲＮＡの切断を促すことによって、対応するタンパク質の翻訳を阻害する。

遺伝子の発現の阻害というこの戦略は、インビトロとインビボの両方でマウスの胚性幹細胞に適用されている（Ｇｒａｂａｒｅｋら、２００３年；Ｋｕｎａｔｈら、２００３年；Ｌｉｃｋｅｒｔら、２００５年）。ニワトリにおけるインオボ（ｉｎ ｏｖｏ）でのｉＲＮＡの利用は、Ｎａｋａｍｕｒａら、２００４年において実証されている通り可能である。

干渉ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、「低分子干渉」ＲＮＡ、「短鎖ヘアピン」ＲＮＡ、またはリボソームＲＮＡといった、複数の形態の中から選択可能である。

「低分子干渉ＲＮＡ」つまり小サイズの干渉ＲＮＡの略であるｓｉＲＮＡは、約１５〜３０塩基対（ｂｐ）、好ましくは１９〜２５ｂｐの短い配列である。これらは、第一の鎖および標的遺伝子のＲＮＡのターゲティングされた領域と同一の相補鎖を含む。ｓｉＲＮＡは合成二本鎖ＲＮＡの形態を意味する。

「短鎖ヘアピンＲＮＡ」の略であるｓｈＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとｌｏｑｕａｃｉｏｕｓとの複合体による切断の後にヘアピン形状をとるＲＮＡ分子をコードする、発現ベクター内でクローニングされた配列により産生された二本鎖ＲＮＡである（Ｄｕら、２００５年）。

干渉ＲＮＡの設計および調製、ならびにインビボおよびインビトロでの細胞のトランスフェクションのためのその利用は周知であり、米国特許第６５０６５５９号明細書、米国特許出願公開第２００３／００５６２３５号明細書、国際公開第９９／３２６１９号パンフレット、国際公開第０１／７５１６４号パンフレット、国際公開第０２／４４３２１号パンフレット、米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号明細書、国際公開第００／４４８９５号パンフレット、国際公開第０２／０５５６９２号パンフレット、国際公開第０２／０５５６９３号パンフレット、国際公開第０３／０３３７００号パンフレット、国際公開第０３／０３５０８２号パンフレット、国際公開第０３／０３５０８３号パンフレット、国際公開第０３／０３５８６８号パンフレット、国際公開第０３／０３５８６９号パンフレット、国際公開第０３／０３５８７０号パンフレット、国際公開第０３／０３５８７６号パンフレット、国際公開第０１／６８８３６号パンフレット、米国特許出願公開第２００２／０１６２１２６号明細書、国際公開第０３／０２０９３１号パンフレット、国際公開第０３／００８５７３号パンフレット、国際公開第０１／７０９４９号パンフレット、国際公開第９９／４９０２９号パンフレット、米国特許第６５７３０９９号明細書、国際公開第２００５／００３２０号パンフレット、国際公開第２００４／０３５６１５号パンフレット、国際公開第２００４／０１９９７３号パンフレット、国際公開第２００４／０１５１０７号パンフレット、
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｕｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｒｎａｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍ、
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｎｙｌａｍ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐ、
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｏｃｏｌ−ｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ＿Ｔｏｏｌｓ／Ｏｎｌｉｎｅ＿Ｔｏｏｌｓ／ＳｉＲＮＡ＿Ｄｅｓｉｇｎ／、
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥＭＢＯＳＳ／Ａｐｐｓ／ｓｉｒｎａ．ｈｔｍｌ、
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｌａｂｈｅａｄｓ／ｔｕｓｃｈｌ／ｓｉｒｎａ．ｈｔｍｌ、
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｐｓｔａｔｅ．ｃｏｍ／ｂｒｏｗｓｅ／ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ／ｓｉＲＮＡ．ｑ．
といった数多くの刊行物において充分に記載されている。

ｓｉＲＮＡは、例えば以下のようなオンラインで利用可能なソフトウェアを用いることにより設計および調製可能である。
−「ｓｉＳｅａｒｃｈプログラム」ｈｔｔｐ：／／ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ．ｃｇｂ．ｋｉ．ｓｅ／ｓｉＳｅａｒｃｈ／ｓｉＳｅａｒｃｈ＿１．６．ｈｔｍｌ(「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ」、Ｃｈａｌｋ ＡＭ、Ｗａｈｌｅｓｄｅｌｔ Ｃ、およびＳｏｎｎｈａｍｍｅｒ ＥＬＬ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００４年)。
−「ＳｉＤｉｒｅｃｔ」ｈｔｔｐ：／／ｄｅｓｉｇｎ．ｒｎａｉ．ｊｐ／ｓｉｄｉｒｅｃｔ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ（Ｄｉｒｅｃｔ： ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ， ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、Ｙｕｋｉ Ｎａｉｔｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、第３２巻、Ｎｏ． Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ（著作権）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００４年)。
−ＭＩＴ附属ホワイトヘッド生物医学研究所の「ｓｉＲＮＡデザインツール」ｈｔｔｐ：／／ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｕｂｉｎｔ／ｈｔｔｐ：／／ｉｏｎａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／
−ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｓｉＲＮＡ ｗｉｚａｒｄ（商標）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｒｎａｗｉｚａｒｄ．ｃｏｍ／、
−Ａｍｂｉｏｎの「ｓｉＲＮＡターゲットファインダー」ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ、
−ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｓｓｌ−ｂｉｎ／ａｐｐ／ｒｎａｉ、
−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｓｉＲＮＡＤｅｓｉｇｎｅｒ／ｄｅｆａｕｌｔ．ｈｔｍ、
−ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｓｅｑａｎａｌ／ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ／ｓｉｒｎａ．ｈｔｍｌ、
−その他のプログラムは、
サイトｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍｍｃｍａｎｕｓ／ｗｗｗ／ｈｏｍｅ１．２ｆｉｌｅｓ／ｓｉＲＮＡｓ．ｈｔｍ上でｈｔｔｐ：／／ａｔｈｅｎａ．ｂｉｏｃ．ｕｖｉｃ．ｃａ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｅｍｂｏｓｓ．ｐｌ？＿ａｃｔｉｏｎ＝ｉｎｐｕｔ＆＿ａｐｐ＝ｓｉｒｎａとして参照できる。

ｓｉＲＮＡの調製および細胞のトランスフェクションのための手段は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）により市販されているｓｉＲＮＡベクターのように一般に入手可能である。

当業者により選択された干渉ＲＮＡの配列に従って、異なる阻害レベルを得ることができ、求められている阻害物質の効果を変化させることが可能である。好ましい方法は、干渉ＲＮＡは、細胞内の標的遺伝子の発現の少なくとも５０％、さらには少なくとも７５％、９０％、９５％、さらには９９％超の阻害を得るように調製され、そして選択される。当業者であれば、単純な日常的作業により、例えば幹細胞の分化を誘導するその能力を分析することによって、最も有効なｉＲＮＡを選択することができるものである（図１および３を参照のこと）。

本発明の好ましい実施形態に従うと、干渉ＲＮＡは１Ｐ０６遺伝子の発現を特異的に阻害する。

特に、干渉ＲＮＡをコードする核酸分子は、配列番号３という標題で配列表に示されているように配列を有し得る。

本発明の好ましいもう一つの実施形態に従うと、干渉ＲＮＡは、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を特異的に阻害する。

特に、干渉ＲＮＡをコードする核酸分子は、配列番号４または配列番号５の配列を有し得る。

本発明のもう一つの好ましい実施形態に従うと、干渉ＲＮＡは、Ｅｏｍｅｓ遺伝子の発現を特異的に阻害する。

特に、干渉ＲＮＡをコードする核酸分子は、配列番号６、７、８または９により表されているような配列の一つを有することができる。最高の発現阻害が得られる分子は、配列番号４の配列によりコードされる。

干渉ＲＮＡで遺伝子の発現を阻害するための一般的な技術は、二本鎖の干渉ＲＮＡを細胞内に導入することから成る。しかしながら、このｄｓＲＮＡは急速に分解されるため、遺伝子の阻害は時間的に制限されるものである。この制限のため、発明者は、標的細胞内で「要求に応じて」干渉ＲＮＡを産生できる系を追及するに至った。

本発明は、宿主細胞内での前記干渉ＲＮＡの発現を可能にするプロモーターの制御下に置かれた、干渉ＲＮＡをコードする核酸分子を含む発現ベクターに関するものである。宿主細胞は好ましくは、インビトロで培養状態に維持されたトリ幹細胞であるものとする。

前記ベクターは、好ましくはプロモーター、翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナル、ならびに適切な転写調節領域を含む。

本発明の特定の一態様に従うと、干渉ＲＮＡの発現を制御する発現ベクターのプロモーターは、誘導性プロモーターである。

誘導性発現系の利点は、干渉ＲＮＡの存在の持続時間、ひいては標的遺伝子の阻害の持続時間を制御することができるという点にある。実際、細胞の存続にとって不可欠な一部の遺伝子は、それが細胞死を誘導することになるという理由で、過度に長時間の阻害を受けることができない。その他の遺伝子は、阻害の効果を観察するためには長期間の阻害を受けなければならない。宿主細胞の内部での干渉ＲＮＡの発現を制御することにより、これら二つの制約条件を回避することができる。

当業者には、最初に同定され、そして分析されたラクトースオペロンのものといった、複数のタイプの誘導性転写プロモーターが既知である。同様に、大腸菌のテトラサイクリンに対する耐性オペロンに由来するプロモーターに基づくｔｅｔ ｏｆｆ／ｔｅｔ ｏｎ系を挙げることができる（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９２年）。

プロモーターの活性の誘導は、不活性プロモーターを活性化させることによって、または元々活性なプロモーターの重荷になる阻害をなくすことにより、実現可能である。転写の阻害因子または活性化因子は各々、それ自体、細胞環境に応じて誘導可能である。

例えば、プロモーターが転写阻害因子に対する固定ドメインを有する場合、阻害の除去はこれらの因子の捕捉によって行われ、これらの因子はプロモーターの調節配列上にもはや固定され得なくなる。このときプロモーターは、転写阻害因子から「解放」される。

もう一つの例によると、プロモーターは元々は活性であるが、その遺伝子座に挿入されたカセットの存在によって阻害されている。カセットは、プロモーターの調節エレメントが過度に離隔しているためにもはや互いに協働できないような形で置かれる。このとき阻害の除去は、特にカセットの各端部に置かれたリコンビナーゼによって認識される配列を用いて、カセットを切除することによって行われる。カセットは、立体障害を行うためのみに役立つ長い「緩衝」ＤＮＡ配列を含み得る（Ｔｉｓｃｏｒｎｉａら、２００４年）が、これは同様に、例えば抗生物質に対する耐性遺伝子などの「マーカー」遺伝子、またはＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などの蛍光遺伝子を含むこともできる。この選択カセットの存在は同様に、特に幹細胞内において、配列の「サイレンシング」のメカニズムを制限する活性なクロマチン立体配置に遺伝子座を維持することも可能にする。

カセットの切除を得るためには、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系およびＦＬＰ−ＦＲＴ系という二つの系が利用されることが多い。Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系は、ＤＮＡの適確な配列すなわちｌｏｘＰ配列の間にある全てのＤＮＡ断片を削除する、Ｃｒｅリコンビナーゼという酵素の能力に基づいている。ＦＬＰ−ＦＲＴ系は、二つのＦＲＴ配列の間にあるＤＮＡ断片を削除するＦＬＰリコンビナーゼの活性に基づいている。特にＫｉｌｂｙら、１９９３年；ＳａｕｅｒおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ、１９８８年；Ｇｕら、１９９４年；Ｃｏｈｅｎ−ＴａｎｎｏｕｄｊｉおよびＢａｂｉｎｅｔ、１９９８年；Ｓｈｉｂａｔａら、１９９７年；ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４年に記載されている、認識部位ＬｏｘＰおよびＦＲＴ並びに対応するＣｒｅおよびＦＬＰリコンビナーゼは、当業者に周知のものである。

特に、誘導可能なプロモーターは、その存在が該プロモーターの機能を阻害するチミジンキナーゼ（ＴＫ）−ネオマイシン^Ｒ−ｌｏｘのプロモーターであるｌｏｘカセットを含み得る（Ｃｏｕｍｏｕｌら、２００４年）。プロモーターは、ＣＲＥリコンビナーゼによるこのカセットの切除の後に初めて機能的なものとなる。利用されるＣＲＥリコンビナーゼはそれ自体、培地内のタモキシフェンの存在に左右される活性を有する（Ｍｅｔｚｇｅｒら、１９９９年）。かくして、細胞の培地内にタモキシフェンを添加することにより、リコンビナーゼは活性となり、プロモーターの阻害配列を切除し、かくしてプロモーターを機能的なものにし、かくして干渉ＲＮＡの発現を可能にする。

目的のプロモーターの中から、好ましくは、干渉ＲＮＡの発現におけるその利用が当業者には周知のものであるＵ６プロモーターまたはＨ１プロモーターといったｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーターが選ばれる。

本発明に従った発現ベクターは、宿主細胞、特にインビトロで培養状態に維持されたトリ細胞の中に組込むことができる。このとき、細胞は「形質転換された」と言われる。このためには、宿主細胞の内部で自己複製するベクターを利用するか、または宿主細胞のＤＮＡ内への外因性の核酸分子の組込みを可能にする組込みベクターを利用することができる。

自己複製系の中でも、好ましくは、プラスミドタイプまたはウイルスタイプの系が利用され、ウイルスベクターは、特にアデノウイルス（Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９２年）、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスまたはヘルペスウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎら、１９９２年）であり得る。当業者には、これらの系の各々について利用可能な技術が既知である。

宿主細胞の染色体の中への配列の組込みが望まれる場合には、例えばプラスミドタイプまたはウイルスタイプの系を利用することができる。かかるウイルスは、例えばレトロウイルス（Ｔｅｍｉｎ、１９８６年）またはＡＡＶ（Ｃａｒｔｅｒ、１９９３年）である。

非ウイルスベクターの中でも、ＶＩＣＡＬ社により開発された技術に従った裸のＤＮＡまたは裸のＲＮＡといったような裸のポリヌクレオチドが好ましい。

トリ細胞内では、好ましくは、レトロウイルス、トリアデノウイルス、ポックスウイルス、またはトランスフェクションもしくはエレクトロポレーションにより導入される裸のＤＮＡが利用されるものとする。

かかるベクターは、当業者によって一般的に利用される方法によって調製され、その結果得られるクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショック、膜の化学的透過化の後の形質転換、または細胞融合といったような標準的な方法により、宿主細胞内に導入可能である。

本発明のもう一つの態様に従うと、本方法は、前記細胞の特異的分化を得る目的で、特異的遺伝子の活性化または阻害のステップに細胞を少なくとも一回付すことを特徴としている。

特に、特定のプロモーターおよびコード相を利用することにより、規定の経路での細胞の最終分化をそれ自体が誘導する遺伝子の発現を制御することが可能となる。これらの遺伝子は特に転写因子をコードする。これらの遺伝子の中でも、Ｍｙｆ５、ＭｙｏＤ、Ｍｒｆ４といった筋原性系列の調節因子（「ＭＲＦ」）、ＰＰＡＲｇ遺伝子などといった脂肪細胞系統の決定論に関与しているもの、Ｓｏｘ１およびネスチンといったニューロンの決定論に関与しているもの、Ｇａｔａ２およびＧａｔａ３といった造血経路の決定論に関与しているものを挙げることができる。

これらの遺伝子の発現または活性の、活性化または阻害のステップは、１Ｐ０６、ＮａｎｏｇまたはＥｏｍｅｓの中から選ばれた遺伝子の阻害ステップと同時であってもよいし、または、時間的にずらされ、好ましくは、阻害の誘導の数時間後とすることもできる。このずれにより、細胞は逐次的に最終分化プログラムを開始し、かくしてインビボで観察される分化の動態をより良く再現することができる。

本発明のもう一つの態様に従うと、本発明のトリ幹細胞は、前記細胞の特異的分化を得るため、適切な条件で、特に一定の成長因子および誘導物質の存在下で培養される。

これらの因子の中でも、中胚葉および外胚葉経路の制御における非常に複雑な相対的役割がマウス、アフリカツメガエル、およびニワトリにおいて同時に記載され始めている、ＢＭＰファミリー、ＦＧＦファミリー、およびｗｎｔファミリーの成長因子を挙げることができる。好ましくは、この因子を、特にＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７について、およそ１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で利用するものとする。外胚葉および中胚葉経路の誘導には、他の多数の因子が介入する。

本発明に従ったプロセスは同様に、分化が誘導されていない細胞の選択および破壊のステップを含み得る。

誘導されていないクローンの消滅は、例えば以下で記載されるＥｎｓ１遺伝子または１Ｐ０６遺伝子のプロモーターといった、幹細胞においてのみ活性なプロモーターの制御下に置かれた毒性遺伝子（チミジンキナーゼ、ジフテリア毒素）を発現するベクターを用いた負の選択により、誘導に付随する形で実施可能である。かくして、幹細胞の特徴を有する細胞のみが消滅するものとする。

本発明は同様に、本発明に従った方法によって得られる可能性のある分化したトリ細胞にも関する。

本発明は同様に、ウイルスと、本発明に従った方法に付されたトリ幹細胞とを接触させるステップを含むことを特徴とする、抗ウイルスワクチンの調製方法にも関するものである。

幹細胞の分化の誘導から２４〜７２時間後に、細胞を、適切な培地において、目的のウイルスの存在下に置く。たとえ誘導された細胞が増殖中の細胞に比べてわずかしか分裂しないにせよ、細胞がその誘導段階にある間にこれらの細胞をウイルスと接触させることで、ウイルスの組込みおよびその産生を可能にする残りの分裂を有するようにすることが必要である。誘導の開始から９６時間を越えると分裂しない細胞を得るために、倍増時間は１２〜１５時間から２４〜３６時間超に移行する。感染に必要なｍ．ｏ．ｉ．は、誘導の開始から２４〜４８時間後に得られた細胞数について計算される。

幹細胞およびその分化誘導体は、特殊な向性に従った、異なるウイルスの複製を補助するものとして役立つ。この戦略は、幹細胞をその表現型の大きな柔軟性に照らして用いることでうまく進めることができる。実験用の一様な細胞基質（例えばＢＨＫ−２１系細胞、ＣＶ−１系細胞）に対する多くのウイルスの適応は、ウイルスの複製サイクルに影響を及ぼすことでそれらの産生効率を変化させる。これらの制約を制御するメカニズムが明らかにされ始めている（ＷａｎｇおよびＳｈｅｎｋ、２００５年）。

本発明のもう一つの目的は、本発明において先に定義した干渉ＲＮＡをコードする核酸分子である。

本発明は同様に、宿主細胞、好ましくはインビトロで培養状態に維持された、トリ細胞内における干渉ＲＮＡの発現を可能にするプロモーターの制御下に置かれた、本発明に従った前記干渉ＲＮＡをコードする核酸分子を含む発現ベクターにも関するものである。

本発明の好ましい態様に従うと、このプロモーターは誘導性プロモーターである。

本発明は、上述した発現ベクターで形質転換されたトリ幹細胞にも関するものである。

本発明はさらに、配列番号１（配列表参照）に従ったアミノ酸配列と少なくとも６８％の同一性を有するタンパク質配列のポリペプチドをコードする核酸配列にも関するものである。

なお本発明は同様に、配列番号１に従ったアミノ酸配列と少なくとも６８％の同一性を有するタンパク質配列のポリペプチドも含んでいる。

この新規なタンパク質配列をデータベースに掲載された既知の配列と比較するためには、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）ソフトウェアが用いられた。既知のあらゆるタンパク質のうち、最高の同一性レベルを有するものは、配列番号１の配列と６７％の同一性のタンパク質配列を有する。

本発明のもう一つの目的は、配列番号２と少なくとも９４％の同一性を有する核酸配列である。

タンパク質配列と同様に、配列番号２を、ＢＬＡＳＴソフトウェアに掲載されている既知の配列と比較した。最大の同一性百分率は９３％であった。

本発明は同様に、上述の配列のうちの一つを有する核酸分子が中に挿入されているクローニングベクターおよび／または発現ベクターにも関するものである。

本発明は同様に、Ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモーター領域に対応する、すなわちニワトリのＮａｎｏｇ遺伝子のコード配列を開始するＡＴＧコドンの前の１２１１２個の塩基対に対応する、配列番号１１に従ったヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列にも関するものである。

このＮａｎｏｇ遺伝子のプロモーター領域は、この遺伝子の調節エレメント、そしてより正確には、転写調節因子のための固定部位を含む。この遺伝子は幹細胞においてのみ発現することから、その発現を調節するメカニズムの研究は、幹細胞が未分化状態にとどまる条件を決定するために特に重要である。当業者であれば、このプロモーター配列上に固定され得る調節因子ならびにＤＮＡ上のそれらの正確な固定部位を、それらが既知のものであれ、または新たに同定されるものであれ、同定することができるものである。概説として、（ｖａｎ Ｓｔｅｅｎｓｅｌ Ｂ．、２００５年、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、（Ｓｉｇｇｉａ ＥＤ．、２００５年、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ）、および（Ｐａｖｅｓｉ Ｇ、Ｍａｕｒｉ Ｇ、Ｐｅｓｏｌｅ Ｇ、２００４年、Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ）を参照のこと。特に、既知の調節配列は、遺伝子発現の調節配列を掲載しているＴＲＡＮＳＦＡＣ、ＴＲＲＤ、およびＣＯＭＰＥＬデータベース上で検索を行うことにより同定可能である。これらのデータベースにはｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ＴＲＡＮＳＦＡＣまたはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｎｅｔ．ｎｓｃ．ｒｕ／ＴＲＲＤといったアドレスでアクセスできる。

本発明のもう一つの目的は、以上で定義された配列を有する核酸分子が中に挿入されているクローニングベクターおよび／または発現ベクターにある。

本発明は同様に、先に記載したようにクローニングベクターおよび／または発現ベクターを組込んだ原核細胞または真核細胞にも関するものである。

本発明のもう一つの目的は、多くとも約１％の血清を含む培地内での、幹細胞の、より特定的にはトリ幹細胞の培養方法にある。この方法は、Ｎａｎｏｇ遺伝子が過剰発現している幹細胞を培養することを特徴とする。この過剰発現は、当業者にとって既知のあらゆる手段、特に内因性Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を制御するいわゆる「強い」プロモーターでの細胞の変更によって、あるいはまた、Ｎａｎｏｇ遺伝子を過剰発現するベクターの導入によっても得ることができる。これは特に、ニワトリのＮａｎｏｇ遺伝子を過剰発現するベクターを幹細胞内に導入することによって実現される。この遺伝子は、実際には、血清中に含まれている成長因子に対する「独立性」を細胞に付与するという特性を有する。このように形質転換された細胞は、１％未満の血清を含有する培地中で、初期幹細胞と同じ位長く培養し継代培養することができる。

この方法は、広い工業的応用の分野を開くものである。すなわち、一方では、この方法は経済的であり（通常の１０％ではなくもはや１％の血清しか使用しない）、他方では、場合によって血清中に存在する成長因子の特異的効果を知りたい場合に、最小限の血清で細胞を培養できるという利点がある。

以下の例は、本発明の例示を可能にするが、制限的意味を有するものとみなされるべきものではない。

図面の説明
図１：特異的ｉＲＮＡによる１Ｐ０６遺伝子の発現の阻害は、ＣＥＳＣ細胞の増殖の大きな減少を誘導し、その分化を誘導する。この効果は、ヒドロキシ−タモキシフェンによりその分化が誘導されたクローンの形態で測定される。

図２：ｉＲＮＡ−１Ｐ０６−２による１Ｐ０６遺伝子の発現の阻害によって得られる分化したクローンの分子分析。分化したクローンまたは増殖クローンのトランスクリプトームの含有量がリアルタイムＰＣＲにより分析される。

図３：特異的ｉＲＮＡによるＮａｎｏｇ遺伝子の発現の阻害は、ＣＥＳＣ細胞の分化、ひいては細胞増殖の停止を誘導する。この効果は、ヒドロキシ−タモキシフェンにより分化が誘導されたクローンの形態で測定される。

図４：特異的干渉ＲＮＡによる１Ｐ０６遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子の発現の阻害。
Ａ−抗ＳＳＥＡ−１抗体による、分化で誘導された細胞の標識、
Ｂ−干渉ＲＮＡにより誘導された増殖の停止の動態、
Ｃ−分化の誘導後の細胞における分化の標識遺伝子の発現の、分子分析。

図５：セキショクヤケイの１Ｐ０６遺伝子のオルソログおよびパラログを含むＰＯＵマルチファミリーの異なるメンバーの系統樹。

図６：セキショクヤケイの１Ｐ０６遺伝子の、異なる種のそのオルソログとの相同性百分率。

図７：セキショクヤケイ種におけるＰＯＵファミリーのその他の因子との１Ｐ０６遺伝子の相同性百分率。

図８：増殖状態のＣＥＳＣ細胞内における融合タンパク質ＧＦＰ−１Ｐ０６の局在化（Ｎ：核、Ｃ：細胞質、Ｎ＋Ｃ：核および細胞質）。

図９：増殖状態のＣＥＳＣ細胞における融合タンパク質ＧＦＰ−１Ｐ０６の過剰発現の影響。クロマチンの構造化のレベルが決定される。

実施例１：干渉ＲＮＡを用いた１Ｐ０６遺伝子の阻害による、トリ幹細胞の分化の誘導
ａ） 干渉ＲＮＡをコードする発現ベクターの構築
プラスミドｐＦＬΔＮｅｏは、ｐＢＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位における、ＰＣＲにより増幅された２ｋｂのｍＵ６ΔｎｅｏＤ断片の挿入により得られる。このｍＵ６ΔｎｅｏＤ断片は、ＮＩＨ ＢｅｔｈｅｓｄａのＳｈｅｎｇ博士から提供された、かつ論文（Ｃｏｕｍｏｕｌら、２００４年）に記載されている、鋳型ｍＵ６Ｄ−Ｎｅｏ−ＤＡｐａＩＤＸｈｏＩからオリゴヌクレオチドプライマーｍ−Ｕ６−ｓｍａＩ−Ｓおよびｍ−Ｕ６−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡＳで増幅される。

サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｌｉｇｏ．ｃｏｍ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ上で提供されるソフトウェアを用いてひとたび設計したら、５分間９５℃で加熱することによる変性の後、１ｍＭのＭｇＣｌ_２の存在下で室温での緩やかな再生により、１００ｐＭの各ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをハイブリダイズして二本鎖断片を得た。得られた二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素およびＸｈｏＩ酵素での消化により調製された、ｐＦＬΔＮｅｏベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ部位に直接クローニングする。ＨｉｎｃＩＩ部位の消滅およびこれらの正のプラスミドの系統的な配列決定により、スクリーニングを確認する。各々の標的ＲＮＡ「Ｘ」について、かくして、ベクターｐＦＬΔＮｅｏＸ−ｉＲＮＡを得る。利用された異なるｉＲＮＡの配列は、配列表に示されている。トランスフェクションの前に、アンピシリン耐性遺伝子内に存在する固有の部位であるＡｈｄＩによりベクターを線状化させる。

リコンビナーゼの発現ベクターＣＲＥ−ＥＲＴ２−ｈｙｇｒｏは、複数のステップにより、市販のベクターｐＣＩ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から誘導される。ハイグロマイシン耐性カセットは、オリゴヌクレオチド対ＮｒｕＩ−ｈｙｇｒｏＳおよびＢａｍＨＩ−ｈｙｇｒｏＡＳを用いるＰＣＲ増幅により、市販のベクターｐＩＲＥＳ−Ｈｙｇｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から得られる。得られた断片は、ＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ消化により予めネオマイシン耐性カセットが除去されているｐＣＩ−Ｎｅｏベクター内のＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩにおいて直接クローニングされる。得られるプラスミドは、プラスミドｐＣＩ ＦＬＨｙｇｒｏである。リコンビナーゼＣＲＥ−ＥＲＴ２のコード相は、ストラスブールのＩＧＭＣのＰ．Ｃｈａｍｂｏｎ教授により提供された、かつＦｅｉｌら、１９９７年の刊行物において記載されている、プラスミドｐＣＲＥ−ＥＲＴ２から、オリゴヌクレオチド対ＣＲＥ−ＥＲＴ２−ＳａｌＩＳおよびＣＲＥ−ＥＲＴ２−ｓｍａＩＡＳを利用することにより増幅される。得られた増幅断片は、ＳａｌＩ−ＳｍａＩによる消化によって調製された受容ベクターｐＣＩ ＦＬ−Ｈｙｇｒｏに直接クローニングされる。クローニングは指向性であり、その結果としてベクターｐＣＲＥ−ＥＲＴ２−Ｈｙｇｒｏがもたらされる。コード相全体は、増幅の完全性を確認し、そしてリコンビナーゼの優れた活性を可能にするべく配列決定される。

ｂ） トリ幹細胞内への干渉ＲＮＡを含む発現ベクターの導入
ＣＥＳＣ細胞を、Ｐａｉｎら、１９９６年、および仏国特許出願公開第９４／１２５９８号明細書、仏国特許出願公開第００／０６０２９号明細書において先に記載されている通りに、インビトロで得、増幅させ維持した。トランスフェクションについては、異なる線状のベクターを２〜１０μｇ用いて、先に記載されている通り（Ｐａｉｎら、１９９９年、仏国特許出願公開第００／０６０２９号明細書および仏国特許出願公開第０１／１５１１１号明細書）、リポソーム（Ｆｕｇｅｎｅ ６、Ｒｏｃｈｅ）を用いて０．５〜１×１０^６個の細胞をトランスフェクトする。第一のステップは、発現ベクターｐＦＬΔＮｅｏＸ−ｉＲＮＡをトランスフェクトすることから成る。ネオマイシン（１００〜２５０μｇ／ｍｌ）での選択は、７日間行う。得られた耐性クローンを計数し、個別に採取、増幅し、冷凍して、後で増幅の後に利用できるようにすることができる。該耐性クローンは、ｉＲＮＡの発現ベクターが組込まれているものの、それを発現することはない。これらのクローンを次に解離させ、リコンビナーゼｐＣＲＥ−ＥＲＴ２−Ｈｙｇｒｏの発現ベクターによる新たなトランスフェクションに付す。ネオマイシン（５０〜２００μｇ／ｍｌ）での選択が常に存在する状態で、ハイグロマイシン（２５〜７５μｇ／ｍｌ）の存在下で細胞を選択する。７日後に、得られたクローンを新たに計数し、採取し、個別に増幅させる。

ｃ） 幹細胞における干渉ＲＮＡの条件つき発現
ベクターｐＦＬＤＮｅｏＸｉＲＮＡは、マウスプロモーターＵ６における、このプロモーターの機能を条件付きのものにする配列であるｌｏｘ−ＴＫ−Ｎｅｏ−ｌｏｘ配列の存在によって、ｉＲＮＡの発現を制御することを可能にする（Ｃｏｕｍｏｕｌら、２００４年）。プロモーターは、このインサートのリコンビナーゼＣＲＥによる切除の後に機能的になる。本発明者は、培地中のタモキシフェンの存在に依存する活性を有するリコンビナーゼＣＲＥ−ＥＲＴ２を特に利用した（Ｍｅｔｚｇｅｒら、１９９９年）。

記載した二つのトランスフェクションステップの後で得られたクローンについて、９６時間、培地に１μＭの４−ヒドロキシ−タモキシフェンを添加することにより、ｌｏｘＰ部位により囲まれたネオマイシン耐性カセットの切除が誘導され、標的ｉＲＮＡの産生が可能となる。

ｄ） 得られた分化細胞の形態学的特徴づけ
ＣＲＥリコンビナーゼの発現の４−ヒドロキシ−タモキシフェンによる誘導の後、得られた細胞の形態を、直接的な顕微鏡観察およびＣＣＤカメラＣｏｏｌＳＮＡＰ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｘ）を用いた記録により分析する。

クローンを４−ヒドロキシ−タモキシフェンによる誘導から４日（９６時間）後に計数する。得られた結果は図１に表されている。３つの独立した実験において得たクローンの合計数は、それぞれ、ｐＦＬΔＮｅｏ−０（空の対照ベクター）ではｎ＝４５、ｐＦＬΔＮｅｏ−１ではｎ＝５９、ｐＦＬΔＮｅｏ−２ではｎ＝６１、そしてｐＦＬΔＮｅｏ−４ではｎ＝７６である。

図１は、分化が誘導されたクローンの百分率および常に増殖状態にあるクローンの百分率を示す。ｉＲＮＡ−２のみにおいて、未分化クローンの数が示す通り、いかなる大きな表現型の変化も観察されていない空の対照ベクター並びにｉＲＮＡ−１および−４と逆の誘導現象が得られる。

かくして、未分化細胞の増殖に必要な成長因子およびサイトカインの存在下でさえ、ｉＲＮＡ−２を発現する細胞においては、クローンの細胞の形態の急速かつ大きな変化が見られる。これらのクローンの増殖能力は失われ、当該クローンは誘導されていないクローンと比較して比例的に小さくなる。誘導されていないこれらのクローンは、リコンビナーゼによるｌｏｘカセットの未切除、ひいてはｉＲＮＡの未発現の結果として生じる可能性がある。

誘導された細胞は、誘導されていない親細胞よりも大きなサイズを有する平担な形態を呈している。走査型顕微鏡での観察は同様に、誘導された細胞のさらに大きい展延をも示している。

ｅ） 誘導された細胞の分子的特徴づけ
分子レベルで特徴づけるために、分化および未分化クローンの１Ｐ０６遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡの発現により誘導されたクローンを採取し、分析した。得られた結果は図２に示されている。異なる標識遺伝子の発現レベルが表されている。レベル１は、空のベクターｐＦＬＤＮｅｏ−０を組込んだクローンにおいて観察されたものである。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアプローチによるこれらのクローンのトランスクリプトーム含有量の分析は、１Ｐ０６遺伝子の包括的な発現レベルが親細胞に比べてこれらのクローンにおいて低いことを示している（結果は示されていない）。Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｅｏｍｅｓ遺伝子、およびＧｃｎｆ遺伝子の発現レベルは減少する。逆に、Ｇａｔａ６遺伝子はその発現を増大させており、このことは、初期内胚葉と同等の分化経路での誘導を示唆している。

実施例２：干渉ＲＮＡを用いたＮＡＮＯＧ遺伝子の発現の阻害によるトリ幹細胞の分化の誘導
Ｎａｎｏｇ遺伝子に対するｉＲＮＡ発現ベクターを用いて、１Ｐ０６遺伝子について実施されたものと類似の実験を実施することにより、選択されたクローンの増殖の阻害および分化の誘導も観察する。

クローンを４−ヒドロキシ−タモキシフェンの添加によるリコンビナーゼＣＲＥの誘導から４日（９６時間）後に計数する。得たクローンの合計数は、それぞれ、ｐＦＬΔＮｅｏ−０（空の対照ベクター）ではｎ＝５、ｐＦＬΔＮｅｏ−ｎａｎ−１ではｎ＝２１、ｐＦＬΔＮｅｏ−ｎａｎ−３ではｎ＝３７、ｐＦＬΔＮｅｏ−ｎａｎ−５ではｎ＝１５である。得られた結果は、図３に示されている。

図３は、分化が誘導されたクローン（誘導されたまたは分化したクローン）の百分率、および常に増殖状態にあるクローンの百分率を示す。空のベクターとは逆に、ｉＲＮＡ−ｎａｎ１およびｉＲＮＡ−ｎａｎ３は大部分の細胞の分化を誘導する能力を有する。３０％未満のクローンが常に増殖中である。ｉＲＮＡ−ｎａｎ−５も、程度は低いものの同様にこの分化を誘導する。

実施例３：１Ｐ０６遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子の同時の阻害による分化の誘導
これらの実験において、利用されたｓｈＲＮＡは以下の通りであった。
１Ｐ０６の不活性化についてはｉＲＮＡ−２、Ｎａｎｏｇの不活性化についてはｉＲＮＡ−ｎａｎ１。

１Ｐ０６遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子の発現の阻害による誘導の後のトリ幹細胞の分化を以下の測定値により評価した。
−抗−ＳＳＥＡ−１抗体による標識において陽性の細胞の百分率（図４Ａ）、
−４８時間および９６時間にわたって得られるクローンの増殖百分率（図４Ｂ）、
−「マーカー」遺伝子：１Ｐ０６、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｇａｔａ４、Ｇａｔａ６の相対的発現（図４Ｃ）。

図４Ａは、得られた細胞の大部分が、幹細胞に特徴的な発現（空のベクターでトランスフェクションが実施された場合、１００％の細胞が陽性）を有するＳＳＥＡ−１抗原（Ｓｔａｇｅ−Ｓｐｅｃｆｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ−１）をもはや発現しないということを示している。

図４Ｂは、時間経過に従った事象、特にクローンの増殖の停止が急速に得られることを明らかにしている。

クローンは、先に記載した通り、４−ヒドロキシ−タモキシフェンによる誘導から４８および９６時間後に、直接的な顕微鏡観察により計数される。図は、その分化が誘導されたか、または常に増殖状態にあるクローンの相対的百分率を示している。すなわち、４８時間後には６０％のクローンのみがなお増殖中であり、これは、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を阻害することにより得られた最大の効果である。１Ｐ０６遺伝子の阻害から９６時間後には、増殖中のクローンはもはや４０％しか見られない。

図４Ｃは、１Ｐ０６およびＮａｎｏｇ遺伝子の発現の阻害により分化が誘導された細胞の分子的特徴づけを示す。

様々な「標識」遺伝子の発現は、空のベクターｐＦＬＤＮｅｏ−０を組込んだクローンにおいて見られる発現率に対して標準化される。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアプローチによるこれらのクローンのトランスクリプトーム含有量の分析は、１Ｐ０６遺伝子の包括的な発現レベルが分化後にさらに低いことを示している。Ｔｅｒｔ遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子の発現レベルは減少する。逆に、Ｇａｔａ−４遺伝子およびＧａｔａ−６遺伝子はその発現を増大させており、このことは、初期内胚葉と同等の分化経路での誘導を示唆している。

実施例４：１Ｐ０６遺伝子のクローニング
オリゴヌクレオチドと配列決定
全てのオリゴヌクレオチドは、プライマー３（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を用いて設計され、その後Ｐｒｏｌｉｇｏ社により合成される。テストされた様々な遺伝子の配列は、ＴＩＧＲインデックス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｉｇｒ−ｓｃｒｉｐｔｓ／ｔｇｉ／Ｔ＿ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝ｇ＿ｇａｌｌｕｓ）において同定されるか、またはニワトリゲノムのアセンブリ部位（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｇａｌｌｕｓ＿ｇａｌｌｕｓ／）上で直接検索されるか、または新たに同定された配列から直接得られた。

ＲＮＡの抽出
増殖中の未分化細胞または２日間胚葉体への分化が誘導されたＣＥＳＣ細胞の全ＲＮＡを、ＲＮＡＥａｓｙ ｍｉｎｉ（Ｑｕｉａｇｅｎ、参照番号７４１０４）キットを用いて抽出する。クローンの全ＲＮＡを、ＲＮＡ Ｅａｓｙ ｍｉｃｒｏ（Ｑｉａｇｅｎ、参照番号７４００４）キットを用いて抽出する。ＲＮＡの量および質をＢｉｏＡｎａｌｙｓｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定する。

液体サブトラクティブハイブリダイゼーション逆転写ステップの後、ｃＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ ３Ａによる消化に付し、ライゲーションにより付加されるプライマーのタイプに応じて二つの集団を構成する。一方の集団は、もう一方の集団内に存在するメッセンジャーを使い果たすために利用され、またその逆も行われる。これらのｃＤＮＡはこのとき、一方または他方の集団の相補的オリゴヌクレオチドの鋳型として利用され、各試料の代表性を保つ条件下で増幅される。増幅後、アンプリコンを、一方および他方の集団について１：４の比で混合する。二つのプライマーのうちの一方は５’にビオチン化エレメントを含む。混合の後、ＤＮＡをエタノール中で沈殿させ、遠心分離に付し、短い変性ステップ後２０時間にわたり生じる再生を容易にするように小さい反応体積内に再度取込む。ストレプトアビジンと結合したビーズを添加して、ＳＳＢタンパク質（一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）の添加により単離したテスターの一本鎖断片およびビオチン化した「ドライバー」ＤＮＡを除去する。再びＤＮＡを添加し、一本鎖ＤＮＡの富化サイクルを二回新たに反復する。これらのステップの終りに得たＤＮＡに対し、特異的オリゴヌクレオチドでのＰＣＲ反応を実施する。この反応により、異なった形で発現した標的の増幅が可能となる。得られた断片をＢａｍＨＩによる消化に付し、ｐＵＣ１８プラスミド内でサブクローニングする。形質転換および増幅の後、コロニーを個別に採取し、プラスミドＤＮＡを抽出し、ＡＢＩＰｒｉｓｍ３７３０シーケンサでＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットを用いて、ユニバーサルプライマーＭ１３ｒｅｖでの配列決定反応に付す。

ＴＩＧＲデータ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ；ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｉｇｒ／Ｔ＿ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝ｇ＿ｇａｌｌｕｓ）といったようなライブラリーデータと比較することによるこのインサートのクローニングおよび同定の手順の全体は、Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｘｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ／、Ｍｅｙｌａｎ）により実施した。

１Ｐ０６遺伝子のライブラリースクリーニングおよびクローニング
増殖状態の未分化ＣＥＳＣ細胞の全ＲＮＡを、ＥｃｏＲＩで開いておりＣＩＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）での処理により脱リン酸化され、仏国特許出願公開第００／０６００９号明細書、およびＡｃｌｏｑｎｅら、２００１年で先に記載されているλＺＡＰ−ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で、ｃＤＮＡライブラリーを構築するために用いる。１５０ｎｇのファージＤＮＡを、λＺａｐベクター中に存在するオリゴヌクレオチドＴ７またはＴ３とを結び付ける４０ｐＭの異なるオリゴヌクレオチド対と、１Ｐ０６Ｇ０１クローンに由来するオリゴヌクレオチドｐｏｕ（１Ｐ０６）Ｓまたはｐｏｕ（１Ｐ０６）ＡＳを用いることによって、ゲノムＰＣＲによってスクリーニングする。増幅条件は、９６℃で５分の変性、次に、９５℃で３０秒、５４℃で３０秒、および７２℃で１分から成るサイクルを１０回、そしてそれに続く、９６℃で３０秒、５４℃で３０秒、および７２℃で１分のサイクルを２０回である。最後の伸長ステップは７分間維持される。増幅産物を、アガロースゲル上での電気泳動に付し、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）キットにより精製し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でサブクローニングし、配列決定する。ｐＬ９−４クローンは、最初のクローン１Ｐ０６ｇ０１の終わりから４０ｂｐ後ろに停止コドンを含み、クローンｐＬ７−２では、配列の上流に３５０ｂｐを得ることが可能になる。

５’ＲＡＣＥキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、５’ＲＡＣＥ法を行う。１０ｐＭの１Ｐ０６Ｇ０１プライマー（ＲＡＡＳ２）を用いて４２℃で１時間、２μｇの全ＲＮＡを逆転写させる。産物がひとたび精製された時点で、３７℃で３０分間、ターミナルトランスフェラーゼＴｄＴの作用によりポリＡ尾部を付加する（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。２０ｐＭの１Ｐ０６プライマー（ＲＡＡＳ１）およびＡｎｃｈＰｒｉｍＳｅｑの存在下でのＰＣＲ反応において、鋳型として反応物の１／５を利用する。反応のパラメータは、９４℃で２分間の変性と、その後の、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のハイブリダイゼーション、および７２℃で２分の伸長段階から成るサイクルを３０回であるが、最後の反応は７分続く。Ｐ０６（ｐＬ７−２）ＡＳプライマーおよびＰＣＲｐｒｉｍｓｅｑプライマーを用いて、１００倍に希釈した５μｌの産物に対して二回目の全増幅を実施する。電気泳動による移動の後に最終産物を精製し、その後ｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター内でサブクローニングする。得られたクローンＲ１−８は、ＡＴＧが同相である状態でｐＬ７−２クローンの上流に３００ｂｐを含む。その結果、８８８ｂｐのオープンリーディングフレームが得られる。

ＲＴ−ＰＣＲ
ｏｌｉｇｏｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、４２℃で１時間、２μｇの全ＲＮＡを逆転写させる。ＭＸＰ ３０００Ｐ ＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でリアルタイムＰＣＲを実施する。１００倍に希釈した混合物２μｌを、１０ｐＭの各プライマー（Ｐｒｏｌｉｇｏ）の存在下で、２５μｌの最終体積で、１２．５μｌのＭｉｘ Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）と混合させる。各試料を９６ウェルプレート（参照番号４１００８８ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において三回テストする。パラメータは、９５℃で１５分の変性ステップと、それに続く、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒の再生、および７２℃で３０秒の伸長ステップから成るサイクル４０回である。遺伝子の発現レベルは、サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ−ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｉｎｆｏ上で利用可能な詳細な手順にしたがってΔΔＣｔ法により計算される。ＲＳ１７リボソーム遺伝子（Ｘ０７２５７）の発現レベルは、試料間の内部標準として用いられる。

様々なステップの結果、ライブラリーのスクリーニングのステップおよび５’ＲＡＣＥ法のステップの終わりに、ＰＯＵドメインを含む２２８ｂｐの第一の断片が、次に８８８ｂｐの配列（配列番号２）が同定される。この配列は、２９６個のアミノ酸のタンパク質（配列番号１）をコードする。かくして同定されたタンパク質のＰＯＵドメインは、９０番アミノ酸で始まり、１４９個のアミノ酸で構成されている。

ＰＯＵドメインを含む様々な種の遺伝子データのライブラリーにおいて同定された既知の配列を比較することにより、以下１Ｐ０６と呼ぶ、ニワトリにおいて同定された新たな遺伝子の系統発生学的位置づけを示すことができる。図５、６および７を参照のこと。

ＮＴｉＶｅｃｔｏｒソフトウェア（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、セキショクヤケイニワトリの１Ｐ０６遺伝子のコード相の８８８塩基対と、様々なＰｏｕ５ｆ１遺伝子の配列、特に、尾索類Ｏ．ｄｉｏｉｃａの１１５５ｂｐの配列（ＡＹ６１３８５６）、マウスＭ．ＭｕｓｃｕｌｕｓのＰｏｕ５ｆ１の１１３４ｂｐの配列（ＮＭ＿０１３６３３）、ウシＢ．ｔａｕｒｕｓの１６１５ｂｐ（ＮＭ＿１７４５８０）、ブタＳ．ｓｃｒｏｆａの１０８０ｂｐの配列（Ｑ９ＴＳＶ５）、サルＰ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓの１０８０ｂｐの配列（Ｑ７ＹＲ４９）、ヒトＨ．ｓａｐｉｅｎｓのｐｏｕ５ｆ１の１４１３ｂｐの配列（ＮＭ＿００２７０１）、ラットＲ．ｒａｔｔｕｓの１１４１ｂｐの配列（ＸＭ＿５７９２８２）、メキシコサンショウウオＡ．ｍｅｘｉｃａｎｕｍの３１１１ｂｐの配列（ＡＹ５４２３７６）、ゼブラフィッシュＤ．ｒｅｒｉｏの１４１８ｂｐの配列（ＮＭ＿１３１１１２）、有袋動物Ｔ．ｖｕｌｐｅｃｕｌａのＰＯＵドメインの５７０ｂｐの配列（ＡＹ３４５９７３）、アフリカツメガエルＸ．ｌａｅｖｉｓのＯｃｔ６０の２１１１ｂｐの配列（Ｍ６００７５）、アフリカツメガエルＸ．ＬａｅｖｉｓのＯｃｔ９１の２４１８ｂｐの配列（Ｍ６００７７）、およびアフリカツメガエルＸ．ＬａｅｖｉｓのＯｃｔ２５の１９９８ｂｐの配列（Ｍ６００７４）の遺伝子の配列とをアラインすることにより、同定された配列がＰＯＵドメインを含むパラログ遺伝子配列よりもこれらのＰｏｕ５ｆ１遺伝子の配列により近いことを理由として、１Ｐ０６が他の種のＰｏｕ５ｆ１遺伝子のオルソログであることを同定することができる（図４、５、および６）。

図６は、ニワトリの１Ｐ０６のｃＤＮＡが、ウシ、マウスおよびヒトのオルソログとそれぞれ５１、４６および５１％の相同性を有することを示している。３５〜３８％の相同性百分率が、ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルの様々なホモログのＳｐｇ遺伝子（Ｐｏｕ ２）で観察される。

図７は、ニワトリにおいて同定された様々な既知のパラログと１Ｐ０６のｃＤＮＡの配列との間に存在する相同性百分率を示している。１Ｐ０６は、Ｏｃｔ−１、Ｆａｃｔｏｒ Ｉ、Ｂｒｎ３．２およびＯｃｔ６のｃＤＮＡとそれぞれ１４、６０、６２、および６１％の相同性を有する（Ｂａｒｔｈら、１９９８年、Ｌｅｖａｖａｓｓｅｕｒら、１９９８年）。

実施例５：１Ｐ０６遺伝子から産生されたタンパク質の研究
融合タンパク質ＧＦＰ−１Ｐ０６は核タンパク質である
市販のベクターｐＥ−ＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、トランスフェクション後のその細胞局在化を視覚化するべく、ＧＦＰに適した様々なｃＤＮＡをクローニングした。

本発明者は、１Ｐ０６、Ｎａｎｏｇ、Ｇｃｎｆ、Ｓｏｘ２、Ｌｒｈ１、Ｓｆ１およびＧａｔａ４のｃＤＮＡのコード相を、このベクター内に導入した。

細胞の中に一時的にプラスミドｐＧＦＰ−１Ｐ０６、Ｎａｎｏｇ、Ｇｃｎｆを導入した。１ｃｍ^２あたり１５０００〜２００００個の細胞の平均密度でウェル内の無菌スライドグラス上にＣＥＳＣ細胞を播種した。数時間の接着の後、血清を有さない１００μｌの培地中に１μｇの線状ＤＮＡ、３μｇのＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を含むトランスフェクション混合物を調製し、室温で１０分間放置してから、細胞上に被着させ、これらの細胞を標準的な増殖条件下で一晩インキュベーター内に置く。２日目に、トランスフェクション混合物を取り出し、ＰＢＳで細胞を洗浄し、その後標準的な条件下で培養する。４８時間後に、細胞を洗浄し、次にＰＢＳ内において０．５％グルタルアルデヒド／１．５％ホルムアルデヒド混合物で４℃で１５分間固定する。洗浄後、Ｈｏｅｓｃｈｔ溶液（１０μＭ／ｍｌ）で細胞をインキュベートして光を避けた状態で核を視覚化させる。紫外線の通過を確実にする物質（Ｇｅｌ Ｍｏｎｔ ＢｉｏＭｅｄｉａ）の存在下でスライドグラスを取付け、融合タンパク質により発光された蛍光の観察を蛍光顕微鏡を用いて実施する。

計数された細胞数は、ｎ＝４９（対照としてのＧＦＰ−Ｔ）、ｎ＝７１（ＧＦＰ−１Ｐ０６）、およびｎ＝７４（ＧＦＰ−Ｇａｔａ４）である。図８は、ＧＦＰの蛍光の観察された局在化が、核内（Ｎ）、細胞質内（Ｃ）、または核および細胞質（Ｎ＋Ｃ）内にある細胞の百分率を示している。この図は、融合タンパク質１Ｐ０６−ＧＦＰが主として核タンパク質であることを示している。

ニワトリの胚線維芽細胞といったその他のトリ細胞型において、同様の結果が得られた（結果は図示せず）。

なお、「バンドシフト」技術による分析から、タンパク質１Ｐ０６が、ＤＮＡのコンセンサス配列Ｏｃｔ−４を認識し、その上に固定される能力を有し得ることを実証することが可能となった。

結論として、ニワトリのタンパク質１Ｐ０６は、ＤＮＡ上への固定活性を有する、核に局在するタンパク質である。

実施例６：１Ｐ０６遺伝子の過剰発現
ＣＥＳＣ細胞の生理における１Ｐ０６遺伝子の過剰発現の影響を評価するため、ｐＧＦＰ−１Ｐ０６構築物、およびＧＦＰ−ＳＯＸ２、ＧＦＰ−ＮＡＮＯＧ、ＧＦＰ−ＧＡＴＡ４といったようなその他の融合タンパク質でトランスフェクトした細胞を、形態学的見地から分析した。

図９は、得られた結果を示している。計数された細胞の合計数は、ｎ＝５１（対照ＧＦＰ−Ｔ）、ｎ＝９３（ＧＦＰ−１Ｐ０６）、およびｎ＝７７（ＧＦＰ−Ｇａｔａ４）である。

トランスフェクションを受けた細胞の大部分は、その形態において大きな変化を有するとは思われない。ｐＧＥＰ−１Ｐ０６構築物で一つの例外が見られ、これについては、約２０％のケースで、特に核の凝縮形態を伴う、改変された核の形態が高い割合で観察されている。分解されたクロマチンを有する細胞の百分率は、ＧＦＰ−１Ｐ０６構築物でのトランスフェクションを受けたこれらの細胞内ではるかに大きい。このことはアポトーシス現象を示し得る。トランスフェクションの時間は比較的短い（７２時間未満）ことから、これらの条件下でより大きな形態学的変化および表現型の変化を同定できる可能性がないことを想定することが可能である。

本発明者の仮説は、ＧＦＰ−１Ｐ０６構築物の過剰発現がＣＥＳＣ細胞にとって有毒であるということである。融合タンパク質の核局在化を条件付きにするために、ＧＦＰ−１Ｐ０６−ＥＲＴ２構築物を実現した。対照構築物ＧＦＰ−ＥＲＴ２の核局在化が、培地中の４−ヒドロキシータモキシフェンの存在に依存していると思われる場合、予想通り、４−ヒドロキシ−タモキシフェンの存在下または不存在下で、融合タンパク質ＧＦＰ−１Ｐ０６−ＥＲＴ２の局在化の大きな変化を検出することは不可能であった。ＧＦＰの存在は、条件の如何に関わらず、主として核内にとどまっている。１Ｐ０６産物の核局在化シグナルは強すぎて、４−ヒドロキシタモキシフェンの不存在下でＥＲＴ２部分に結合するシャペロン分子の存在だけではこのシグナルを平衡化させることはできないと考えるべきである。大きな細胞質シグナル伝達を得ることのできない推定上の局在化シグナルｎｌｓにその突然変異が影響を与える突然変異体１Ｐ０６ｍｕｔでも、同じことが観察された（Ｐａｉｎら、２００４年）。

実施例７：Ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモーターのクローニング
Ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモーターのクローニングにより、トリの胚性幹細胞および生殖幹細胞におけるこれらの遺伝子の発現を調節することのできる転写因子が固定される特異的部位の存在を実証することができる。

トランスフェクション実験においては、Ｎａｎｏｇプロモーター構築物で以下の結果が得られた。このプロモーターは、未分化の増殖細胞においてのみ排他的に活性である。かくして未分化のおよび分化誘導されたＣＥＳＣ細胞における一時的なトランスフェクションにより、未分化の細胞のみがこのプロモーターをトランス活性化する能力を有するということを示すことができる。かくして、ｐ２０００Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ構築物でトランスフェクトされた細胞は、４２％の細胞においてＧＦＰの発現を示し、かつ該細胞が４８時間１０^−７Ｍのレチノイン酸で処理されている場合には、７％の細胞のみにおいてこの発現を示す。

特異的ｉＲＮＡによる１Ｐ０６遺伝子の発現の阻害が、ＣＥＳＣ細胞の増殖の大きな減少を誘導し、その分化を誘導することを示すグラフ。 ｉＲＮＡ−１Ｐ０６−２による１Ｐ０６遺伝子の発現の阻害によって得られる分化したクローンの分子分析を示すグラフ。 特異的ｉＲＮＡによるＮａｎｏｇ遺伝子の発現の阻害が、ＣＥＳＣ細胞の分化、ひいては細胞増殖の停止を誘導することを示すグラフ。 特異的干渉ＲＮＡによる１Ｐ０６遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子の発現の阻害を示すグラフ。 セキショクヤケイの１Ｐ０６遺伝子のオルソログおよびパラログを含むＰＯＵマルチファミリーの異なるメンバーの系統樹。 セキショクヤケイの１Ｐ０６遺伝子の、異なる種のそのオルソログとの相同性百分率を示す表。 セキショクヤケイ種におけるＰＯＵファミリーのその他の因子との１Ｐ０６遺伝子の相同性百分率を示す表。 増殖状態のＣＥＳＣ細胞内における融合タンパク質ＧＦＰ−１Ｐ０６の局在化を示すグラフ。 増殖状態のＣＥＳＣ細胞における融合タンパク質ＧＦＰ−１Ｐ０６の過剰発現の影響を示すグラフ。

Claims (15)

1. 適切な培地内で培養されたトリ幹細胞から、分化したトリ細胞を調製する方法であって、配列番号２に対応する１Ｐ０６遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子の中から選択された幹細胞において発現する遺伝子の発現または活性を直接的に阻害することによって前記幹細胞の分化を誘導するステップを含むことを特徴とする方法。
2. 遺伝子の発現または活性の阻害が条件付きで実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 遺伝子の発現または活性の阻害が、少なくとも一つの干渉ＲＮＡを用いて実施されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 干渉ＲＮＡが、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、「低分子干渉」ＲＮＡ、「短鎖ヘアピン」ＲＮＡ、またはリボソームＲＮＡの中から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 干渉ＲＮＡが１Ｐ０６遺伝子の発現を特異的に阻害することを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
6. 干渉ＲＮＡをコードする核酸分子が配列番号３の配列を有することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 干渉ＲＮＡがＮａｎｏｇ遺伝子の発現を特異的に阻害することを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
8. 干渉ＲＮＡをコードする核酸分子が配列番号４の配列を有することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 干渉ＲＮＡをコードする核酸分子が配列番号５の配列を有することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
10. 干渉ＲＮＡをコードする核酸分子が、宿主細胞における前記干渉ＲＮＡの発現を可能にするプロモーターの制御下で発現ベクター内に組込まれていることを特徴とする、請求項３〜９のいずれか一つに記載の方法。
11. 干渉ＲＮＡの発現が誘導性プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項３〜１０のいずれか一つに記載の方法。
12. 干渉ＲＮＡをコードする核酸分子を含む発現ベクターが宿主細胞内に組込まれることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
13. 幹細胞が、前記細胞の特異的分化を得る目的で、特異的遺伝子の活性化または阻害の少なくとも一つのステップに付されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の方法。
14. 幹細胞が、前記細胞の特異的分化を得る目的で、適切な条件下で培養されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
15. 分化が誘導されていない細胞の選択および破壊のステップを含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一つに記載の方法。

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