JP5129927B2 - 顆粒球−コロニー刺激因子を含む安定な薬剤組成物 - Google Patents

Description

本発明は、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を含む安定な薬剤組成物に関する。

ヒトＧ−ＣＳＦは、好中球の形成に決定的な役割を有する造血成長因子に属する。Ｇ−ＣＳＦは、血液学及び腫瘍学の分野における医薬品に使用される。現在、臨床用Ｇ−ＣＳＦの２つの形式、すなわち、グリコシル化され、哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞系中で産生されるレノグラスチム（Ｈｏｌｌｏｗａｙ ＣＪ （１９９４） Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３０Ａ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ２−Ｓ６；欧州特許第１６９５６６号）と非グリコシル化され、細菌Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生されるフィルグラスチム（欧州特許第２３７５４５号）が市販されている。

特にＧ−ＣＳＦの非グリコシル化体は、ＣＨＯ細胞から得られるＧ−ＣＳＦのグリコシル化体よりもインビトロで特に不安定であることが文献から知られている（Ｏｈ−ｅｄａ ｅｔ ａｌ（１９９０） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５（２０）：１１４３２−３５）。グリコシル化と非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦの安定性が異なるために、薬剤として許容される安定なＧ−ＣＳＦを調製する従来技術手法はグリコシル化の存在／非存在によって異なる。特に、疎水性タンパク質である非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦの場合には、より長い保存期間、医学的応用に対して薬剤タンパク質の安定性を支える、薬剤として許容される安定な組成物の調製は困難な課題であり、特別な難題であり、特別に選択された対策を必要とする。

非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦの安定化組成物は、欧州特許第３７３６７９号に記載されており、低伝導率で２．７５から４．０の範囲の酸性ｐＨ値でＧ−ＣＳＦ安定性を有利にもたらす本質的な特徴を有する。しかし、Ｇ−ＣＳＦ安定性を向上させるためにさまざまな糖又は糖アルコール、アミノ酸、ポリマー及び洗浄剤を添加することができる。特に、その組成物のｐＨは、凝集体形成を抑制し、Ｇ−ＣＳＦ安定性を高めるために４未満とすべきであることが強調される。欧州特許第３７３６７９号に記載された凝集体形成及びＧ−ＣＳＦを含む薬剤組成物の４．０を超えるｐＨにおける安定性低下は、従来技術文献から得られた結果と一致する（Ｋｕｚｎｉａｒ ｅｔ ａｌ （２００１） Ｐｈａｒｍ Ｄｅｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ ６（３）：４４１−７； Ｂａｒｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ （２００２） Ｊ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ ２１（３）： １３７−４３； Ｎａｒｈｉ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｊ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ １０（４）： ３５９−３６７； Ｗａｎｇ Ｗ （１９９９） Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ １８５： １２９−１８８。

Ｇ−ＣＳＦを安定化するさまざまな手法が他の特許及び科学文献に記載されている。欧州特許第１１２９７２０号は、５から８の範囲のｐＨを有し、濃度約０．０１Ｍから約１．０Ｍの硫酸イオンを含む塩を含む非グリコシル化ウシＧ−ＣＳＦの安定な水系組成物を開示する。

欧州特許第６０７１５６号においては、注入及び注射用のＧ−ＣＳＦを含む薬剤組成物が開示される。Ｇ−ＣＳＦの安定化は、Ｇ−ＣＳＦに有利な酸性ｐＨ値を設定し、さまざまな防腐剤、異なるアミノ酸及び安定剤としての界面活性剤の混合物を添加することによって達成される。Ｇ−ＣＳＦのグリコシル化体又は非グリコシル化体のどちらが使用されたかは記述からは不明である。

欧州特許第６７４５２５号は、クエン酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩とクエン酸塩の混合物及びアルギニンの塩からなる群から選択される緩衝剤中で安定化されたＧ−ＣＳＦの水系薬剤組成物を開示する。また、少なくとも１個の界面活性剤がＧ−ＣＳＦを安定化するために添加される。Ｇ−ＣＳＦのグリコシル化体又は非グリコシル化体のどちらが使用されたかは記述では不明である。

英国特許第２１９３６２１号は、７から７．５の範囲のｐＨを有し、薬剤として許容される界面活性剤、糖類、タンパク質及び高分子量化合物からなる群から選択される少なくとも１個の物質を含むグリコシル化Ｇ−ＣＳＦの組成物を開示する。適切な高分子量化合物としては、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。特に、界面活性剤を含む組成物が有利である。

欧州特許第１０６０７４６号においては、ｐＨ約６．５を有するグリコシル化Ｇ−ＣＳＦを含む薬剤組成物が、薬剤として許容される少なくとも１個の界面活性剤の存在下で記載されている。この明細書は、ｐＨに応じた脱シアル酸Ｇ−ＣＳＦの安定性の測定を開示する。その結果、約５．０から約７．０の範囲のｐＨにおける脱シアル酸Ｇ−ＣＳＦの安定性がきわめて低いことが示された。

欧州特許第０９８８８６１号は、Ｇ−ＣＳＦ安定性が、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、ＴＲＩＣＩＮＥなどの安定化緩衝剤を濃度約１Ｍで添加することによって得られる、Ｇ−ＣＳＦ、特にウシＧ−ＣＳＦの薬剤組成物を開示する。

マルトース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、ラフィノース、トレハロース又はアミノ糖の添加によって安定化されるＧ−ＣＳＦの凍結乾燥薬剤組成物が欧州特許第０６７４５２４号に記載されている。

ｐＨ約６．５で１個以上のアミノ酸を含むグリコシル化Ｇ−ＣＳＦ組成物が欧州特許第１１９７２２１号、欧州特許第１２６０２３０号及び欧州特許第１３２９２２４号に記載されており、アミノ酸で安定化された凍結乾燥組成物が欧州特許第０９７５３３５号に記載されている。

界面活性剤がＧ−ＣＳＦ水溶性溶液中に存在することを特徴とするＧ−ＣＳＦの薬理効果期間を延長する方法が日本国特許第２００２３７１００９号に記載されている。

欧州特許第０４５９７９５号に記載されたＧ−ＣＳＦの経口剤形は、界面活性剤、脂肪酸及び腸溶性材料を用いた安定化に基づく。メチオニンの添加によって長期間安定化された組成物はＷＯ５１６２９に記載されている。

低イオン強度はＧ−ＣＳＦの薬剤組成物に優先的なものであるが、特許及び科学文献のほぼすべての場合において、包装材料表面でのＧ−ＣＳＦの凝集及び変性を防止するために非イオン性、陰イオン性又は天然界面活性剤のさまざまな界面活性剤が添加される。しかし、Ｇ−ＣＳＦ組成物中の界面活性剤は、医学的観点からは好ましくは回避されるべきである。というのは、界面活性剤は、局所的刺激を生じる恐れがあり、きわめて慎重に制御されなければならない毒性不純物を含むことがあり、さらに、どのように代謝され、排泄されるかが必ずしも明確でないからである。また、自動酸化し易いある種の界面活性剤はタンパク質を損なう恐れがある。

本発明の目的は、界面活性剤並びにヒト及び／又は動物起源に由来する添加剤を添加することなしに、薬剤としてのＧ−ＣＳＦの適切な使用を可能にすることができる非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦの安定な液状薬剤組成物を提供することである。特に、本発明の薬剤組成物は、品質保持期間が長く、生理学的に忍容性が良好であり、使用が簡単であり、正確に投与することができる。

本発明の目的は、Ｇ−ＣＳＦを有利に安定化することができる非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦの薬剤組成物を提供することである。

本発明は、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦの新しい安定な薬剤組成物を提供する。好ましい実施態様はサブクレームに記載されている。本発明は、請求項１７に記載のプロセス並びに請求項１８及び１９に記載の使用も提供する。

本発明の薬剤組成物は、４．０を超えるｐＨで好ましくは処方される。Ｇ−ＣＳＦの安定化は酸の存在下で達成される一方で、本発明の組成物は、好ましくは、界面活性剤を含まず、Ｇ−ＣＳＦ以外のヒト及び／又は動物起源に由来する添加剤（例えば、血清タンパク質）を含まない。

本薬剤組成物は、ポリオール及び／又はｐＨ緩衝系及び／又は１個以上の薬剤として許容される賦形剤を場合によってはさらに含んでいてもよい。本発明の薬剤組成物は、ヒト及び獣医学における使用に適切であり、特に非経口用、例えば、筋肉内、皮下及び／又は静脈内用に適切な投与剤形で薬剤として許容される。特に好ましい実施態様においては、本発明の薬剤組成物は液体であり、より好ましくは水溶液の形である。

界面活性剤を含まず、好ましくは４．０を超えるｐＨである薬剤組成物中に非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦを有利に安定化できることが驚くべきことに見出された。

本発明は、
（ａ）Ｇ−ＣＳＦの治療有効量と、
（ｂ）酸と
を含む、Ｇ−ＣＳＦの薬剤組成物を提供し、
好ましくは界面活性剤を含まない。

本発明の組成物は、４．０を超えるｐＨで好ましくは調製される。

本発明は、成分（ａ）−（ｂ）に加えて、
（ｃ）ポリオール及び／又は
（ｄ）ｐＨ緩衝系及び／又は
（ｅ）１個以上の薬剤として許容される賦形剤
を場合によってはさらに含んでいてもよいＧ−ＣＳＦの薬剤組成物も提供する。

本明細書では「顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）という用語は、造血性前駆細胞の分化及び増殖並びに造血系の成熟細胞の活性化を促進することができ、ヒトＧ−ＣＳＦ並びに以下に定義される誘導体及びアナログを含む群から選択されるＧ−ＣＳＦを指す。Ｇ−ＣＳＦは、Ｅ．コリ中での発現によって得られる組換えヒトＧ−ＣＳＦに関係することが好ましい。

本明細書では「Ｇ−ＣＳＦの治療有効量」という用語は、Ｇ−ＣＳＦの治療効果を可能にするＧ−ＣＳＦ量を指す。

本明細書では「ポリオール」という用語は、任意の多価アルコール、すなわち１分子当たり２個以上のヒドロキシル基を含む化学物質を指す。

本明細書では「界面活性剤」という用語は、臨界ミセル濃度として知られるある濃度で生じる両親媒性（界面活性剤）分子のコロイド状凝集体を指す。ミセル中の凝集分子の典型的な数（凝集数）は５０から１００である。

本明細書では「界面活性剤を含まない」という用語は、界面活性剤が組成物中に存在しない状態又は検出限界未満の量で存在する状態を指す。

本明細書では「Ｇ−ＣＳＦ安定剤」という用語は、Ｇ−ＣＳＦに対して安定化効果を有し、薬剤として許容される賦形剤を指す。

本明細書では「Ｇ−ＣＳＦ安定性」という用語は、Ｇ−ＣＳＦ含有量の維持及びＧ−ＣＳＦ生物活性の維持を指す。Ｇ−ＣＳＦ安定性は、以下のプロセス、すなわち、容器壁へのＧ−ＣＳＦの吸着、Ｇ−ＣＳＦの変性又は分解並びに例えばＧ−ＣＳＦ２量体及び／又はＧ−ＣＳＦ多量体及び／又はより高分子量の類似の分子の凝集体形成によってとりわけ影響を受けることがある。これらのプロセスは、異なる条件、例えば、高温、不適当な容器、誤ったＧ−ＣＳＦ安定剤の使用、日光、不適当な保存方法、解凍／凍結及び／又は不適当な単離手順に試料を曝したために起こる。

本明細書では「ヒト及び／又は動物起源に由来する添加剤を含まない」という用語は、ゼラチン、人血清アルブミン又はウシ血清アルブミンのような血清タンパク質などのヒト及び／又は動物から生じＧ−ＣＳＦとは異なる添加剤が組成物に意図的に添加されない状態を指す。

本発明の薬剤組成物中でＧ−ＣＳＦを処方することによって、冷蔵庫温度（例えば、２から８℃）を超える温度で、かつ室温（すなわち２５℃未満）でも、さらにはそれより高温（例えば、約４０℃）でその安定性が改善されることが驚くべきことに見出された。これは、本組成物が、冷蔵庫よりも高い温度で長期間及び／又はより高温で一定の期間、多量の活性を失わず、かつさほど分解せずに保存できることを意味する。

従来技術文献に記載された薬剤組成物においては、非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦは、低伝導率及び低酸性値で又は異なる安定剤の存在下で、４．０未満のｐＨで優先的に安定化される。一方、４．０を超えるｐＨ値で安定化される従来技術Ｇ−ＣＳＦ組成物のすべては、異なる安定剤を含み、とりわけ界面活性剤が最も好ましい。また、従来技術文献からは、グリコシル化Ｇ−ＣＳＦ又は非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦのどちらがＧ−ＣＳＦ安定性試験に使用されたかが不明なことが多い。４．０を超えるｐＨ値におけるＧ−ＣＳＦ安定性の従来技術試験は、低伝導率で、界面活性剤を添加せずに実施され、凝集体が形成された。従来技術文献において４．０を超えるｐＨ値におけるＧ−ＣＳＦを安定化する他の手法は、界面活性剤又はさまざまな他の賦形剤の添加を含む。

従来技術文献に記載された手法及び結果にもかかわらず、４．０を超えるｐＨ値においてでも界面活性剤を添加せずにＧ−ＣＳＦ安定性が得られることが本発明で驚くべきことに示された。また、本発明のＧ−ＣＳＦ安定性は、Ｇ−ＣＳＦを有利に安定化するのに適切な環境を提供する唯一の賦形剤として酸を用いて得ることができる。したがって、このような方法に限定されるものではないが、Ｇ−ＣＳＦ安定剤、例えば、薬剤として許容される賦形剤が、本発明のＧ−ＣＳＦを安定化するのにそれ以上は不要となり得る。薬剤組成物中の薬剤として許容される賦形剤は、毒性不純物を回避するために厳格に制御されなければならないので、これは有利である。不純物は、ヒト又は動物の体において制御が困難な物質の投与を回避するために除去する必要がある。一方、副作用を回避するためにやはり考慮する必要がある、薬剤として許容される賦形剤が体内でいかに代謝及び排泄されるかは不明である。

従来技術から知られる一部の薬剤組成物においては、非イオン性洗浄剤、例えば、ポリソルベートのような界面活性剤が使用される。Ｇ−ＣＳＦ組成物に自動酸化しやすい界面活性剤を使用することは問題が多いと考えられ、タンパク質を損ない得るＯＨ基をそれは形成し得るので好ましくは回避されるべきである。界面活性剤の添加は、投与部位において局所的刺激も生じることがある。界面活性剤は、不純物、例えば、ＳＥＣ（分析）法によって求められる凝集体の測定も妨害することがある。したがって、Ｇ−ＣＳＦの薬剤組成物が界面活性剤を含まず、できるだけ簡単であり、追加の賦形剤の使用を回避し、組成物のｐＨを患者への投与に適切に維持することが有利である。

界面活性剤を好ましくは含まない本発明のＧ−ＣＳＦ組成物は、経済的観点からも優れている。本組成物がより容易に実施されるほど、経費はより安く、本組成物はより時間がかからず、患者は組織体中により少ない添加剤を受け入れることになる。皮下投与は、使用されるｐＨ値が低過ぎるために患者において局所的不耐性をもたらし得るので、４．０を超えるｐＨ値は４未満のｐＨ値よりも良好である。

したがって、このような方法に限定されるものではないが、本発明の薬剤組成物は、好ましくは、上述の構成要素ａ．−ｂ．のみからなり、場合によってはａ．−ｃ．、ａ．−ｃ．＋ｅ、ａ．−ｄ．、ａ．−ｄ．＋ｅ．、ａ．−ｂ．＋ｅ．又はａ．−ｂ．＋ｄ．−ｅ．からなることができる。

本発明の薬剤組成物は、好ましくは、長期保存においてＧ−ＣＳＦ活性を維持する液体、特に水系薬剤組成物である。かかる液体組成物は、Ｇ−ＣＳＦ生物活性を低下させ、さらには失わせ得る再構成、希釈又は追加の調製段階なしに、皮下、静脈内、筋肉内用などの非経口用途に直接使用することができ、適用時に発生するさらなる技術的問題を回避するのに寄与することもできる。したがって、液状薬剤組成物の使用は、凍結乾燥組成物の使用としてより実用的である。Ｇ−ＣＳＦの液体、特に水系組成物は、Ｇ−ＣＳＦの臨床組成物を調製するのに凍結乾燥組成物よりも一般に好ましい。というのは、凍結乾燥組成物の再構成プロセスは時間がかかり、タンパク質組成物を不適当に取扱うリスクがあり、又は不適当に再構成される恐れがあり、薬物の十分な活性を保持するために安定剤などのある種の添加剤が通常は必要とされるからである。

本発明の薬剤組成物は、Ｇ−ＣＳＦ安定剤として血清アルブミン、精製ゼラチンなどのヒト及び／又は動物起源に由来する添加剤を実質的に含まないことが好ましい。

本発明の薬剤組成物に使用されるＧ−ＣＳＦは、任意の非グリコシル化高純度ヒトＧ−ＣＳＦとすることができる。具体的には、それは、哺乳動物、特にヒトのＧ−ＣＳＦのそれと実質的に同じ生物活性を有する限り、自然源に由来することができ、又は遺伝子改変することができる。遺伝子改変Ｇ−ＣＳＦは、未変性Ｇ−ＣＳＦ又は１個以上のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を含むことができるそのアナログと同じアミノ酸配列を有することができる。同じ又は改善された生物活性を示すＰＥＧなどで化学修飾されたＧ−ＣＳＦも含まれる。本発明の薬剤組成物に使用されるＧ−ＣＳＦは、任意のプロセスによって調製することができる。例えば、それは、Ｅ．コリなどの細菌細胞の培養物から、また、遺伝子改変酵母又は他の適切な生物中の細胞内で、さまざまな技術によって抽出し、単離し、精製することができる。

本発明の薬剤組成物に使用されるＧ−ＣＳＦは、Ｅ．コリ中での発現によって最も好ましく産生され、好ましくは非グリコシル化される。

本発明の薬剤組成物は、Ｇ−ＣＳＦの治療量を含むことができる。市販Ｇ−ＣＳＦの現行治療量は０．３から０．９６ｍｇ／ｍｌであるが、これは本発明のＧ−ＣＳＦ組成物の制約にはならない。

本発明のＧ−ＣＳＦ組成物のｐＨ値は４．０を超え、約４．０から約５．０の範囲が好ましく、約４．２から約４．８がより好ましく、約４．４のｐＨ値が最も好ましい。

好ましいｐＨ値範囲は、好ましくは、酢酸を使用することによって得られる。４．０を超える所望のｐＨ値を得て維持するために適切な他の酸としては、ＨＣｌ、メタンスルホン酸、マレイン酸、クエン酸、グルタミン酸、マロン酸、乳酸、硫酸、リン酸、他の薬剤として許容される酸又はこれらの混合物などが挙げられるが、これらだけに限定されない。本組成物中の酸濃度は、該組成物の所望のｐＨ値によって決まる。

別の実施態様においては、所望のｐＨ値は、酢酸 クエン酸、リン酸及び他の適切な酸を含む群から選択される異なる酸を用いることによって得ることができる。ここで、最終ｐＨ値の微調整は、ＮａＯＨ、ＴＲＩＳ又は任意の他の適切な塩基を含む群から選択されるｐＨ調節剤を添加することによってなされる。上述の酸及び塩基を添加することによって、適切なｐＨ緩衝系、例えば、酢酸／酢酸塩、クエン酸／クエン酸塩、グルタミン酸／グルタミン酸塩、リン酸／リン酸塩又は任意の他の適切なｐＨ緩衝系が得られる。とりわけ、最も好ましいｐＨ緩衝系は酢酸／酢酸塩であり、適切には、約０．１５ｍＭから約１５ｍＭの酢酸濃度、最も好ましくは１．５ｍＭから１０ｍＭの濃度範囲で使用される。

本発明の薬剤組成物は、ソルビトール、マンニトール、イノシトール及びグリセリンを含む群から選択されるポリオールを場合によってはさらに含んでいてもよい。とりわけ、ソルビトールが特に好ましく、適切には、濃度約１％から約１０％（ｍ／ｖ）で使用され、大部分は濃度３％から８％（ｍ／ｖ）が好ましい。

本発明の薬剤組成物は、１個以上の薬剤として許容される賦形剤を場合によってはさらに含んでいてもよい。薬剤として許容される適切な賦形剤は、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロース−β−シクロデキストリン、ポロクサマー、スクロース、トレハロースなどの糖、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、マクロゴールエステル及びエーテル、グリコールエステル、グリセリンエステル及び／又はさまざまなアミノ酸を含む群から選択することができる。

本発明の薬剤組成物は、アンプル、注射シリンジ、補充注射シリンジ、複数回投与カートリッジ及びバイアルに充填することができる。これらは、これだけに限定されないが０．２から２ｍｌ／回の範囲とすることができる適切な範囲の体積での適用を可能にする。

本発明の薬剤組成物中で安定化された生物活性Ｇ−ＣＳＦは、好中球減少及び好中球減少に関係する臨床の続発症、化学療法後の熱性好中球減少による入院の減少、ドナー白血球注入の代替としての造血性前駆細胞の動員、慢性好中球減少、好中球減少及び非好中球減少感染、移植レシピエント、慢性炎症性症状、敗血症及び敗血症ショック、好中球減少及び非好中球減少感染におけるリスト（ｒｉｓｔ）、罹患率、死亡率、入院日数の減少、好中球減少及び非好中球減少患者における感染及び感染関連合併症の予防、院内感染の予防並びに院内感染の死亡率及び度数率を抑制すること、新生児における経腸投与、新生児における免疫系の増強、集中治療室患者及び危篤患者における臨床結果の改善、創傷／皮膚潰よう／火傷治癒及び治療、化学療法及び／又は放射線治療の強化、汎血球減少症、抗炎症性サイトカインの増加、フィルグラスチムの予防的使用による高用量化学療法間隔の短縮、光線力学的治療の抗腫よう効果の増強、異なる大脳機能不全に起因する疾病の予防及び治療、血栓性疾病及びその合併症の治療、並びに赤血球形成の照射後回復を含む群から選択される疾患の治療に使用することができる。

それは、Ｇ−ＣＳＦに対して示される他のすべての疾病の治療にも使用することができる。

以下の実施例は本発明を説明するものであるが、それを限定するものではない。
実施例
分析方法
以下の分析方法が本発明の薬剤組成物の分析に使用された：サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＵＶ検出による融点温度（Ｔｍ）測定、等電点電気泳動（ＩＥＦ）及びインビトロ生物活性アッセイ。

ＳＥ−ＨＰＬＣ
ＳＥ−ＨＰＬＣは、Ｇ−ＣＳＦ凝集体、特に２量体及び２量体を超える凝集体の濃度を測定するために使用された。２量体及び２量体を超える凝集体の検出限界は０．０１％である。

高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）システムは以下のとおりであった：ＵＶ検出器、オンライン脱気装置、バイナリーポンプモジュール及び恒温自動試料採取装置（例えば、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍｓ）。分析は以下の条件で実施された。
クロマトグラフィー条件：
カラム：ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷ、１０μｍ、３００×７．５ｍｍ ＩＤ
カラム温度：３０℃
移動相：リン酸緩衝液ｐＨ７．０（５ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ）
流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、無勾配モード
検出：ＵＶ検出器、波長２１５ｎｍ
注入体積：２０μｌ（タンパク質注入量は６から１２μｇである）
自動試料採取装置温度：＋２から＋８℃
運転時間：２０分間

ＲＰ−ＨＰＬＣ
ＲＰ−ＨＰＬＣは、Ｇ−ＣＳＦ含有量を測定し、その疎水性によって分離された不純物を定量するために使用された。

高速液体クロマトグラフシステムは以下のとおり使用された：オンライン脱気装置を備えたＵＶ検出器、バイナリーポンプモジュール、恒温自動試料採取装置及び恒温カラム部（例えば、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍｓ）。分析は以下の条件で実施された。
クロマトグラフィー条件：
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ、２００Å、球状、３μｍ、１５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．
カラム温度：６５℃
移動相：Ａ相：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）の水溶液
Ｂ相：ＨＰＬＣ用０．１％ＴＦＡ及び９５％ＡＣＮの水溶液
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、以下のスキームによる勾配モード：

ＵＶ検出によるＴｍ測定
Ｔｍは、タンパク質高次構造安定性を推定するために使用された。高いＴｍは、ある組成物においてタンパク質安定性が高いことを示す。Ｇ−ＣＳＦ安定性は、ある種の賦形剤を添加することによって一般に改善される。

ペルチェ冷却加熱システム（ＤＢＳ、ＰＴＰ−１）を備えたＵＶ分光光度計：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ ＢＩＯ ４０分光光度計が使用された。分析は以下の条件で実施された。

温度範囲：５０−７０℃
温度速度：１℃／ｍｉｎ
検出：波長２８０ｎｍ．
試料体積：１．０ｍＬ（タンパク質濃度：０．３−０．６ｍｇ／ｍｌ）
自動試料採取装置温度：＋２から＋８℃

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質２量体及び他の凝集体（３量体及びそれ以上の高分子量体）の出現を視覚的に検出するために使用された。

添加試料は、還元剤を含まないローディングバッファー中で調製された。垂直ＳＤＳ−ＰＡＧＥが使用された：ゲルＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ １２％、８×８ｃｍ、厚さ１．０ｍｍ、ＭＯＰＳ ＳＤＳ電気泳動緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１５レーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。電気泳動は、２００Ｖの定電圧で運転された。試料は、Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ（０．１％Ｐｈａｓｔ Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ Ｒ ３５０の３０％メタノール溶液）で染色することによって分析された。

インビトロＧ−ＣＳＦ生物活性アッセイ
Ｇ−ＣＳＦの生物活性は、公知の方法（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ Ｕ ｅｔ ａｌ（１９９５） Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ １３：９−２０）を用い、国際標準のヒト組換えＧ−ＣＳＦ（８８／５０２、誘導酵母細胞（ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ）；ＮＩＢＳＣ Ｐｏｔｔｅｒｓ Ｂａｒ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）；（Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ ＡＲ ｅｔ ａｌ（１９９５） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７９，１１７−１２６）を使用して、細胞増殖（ＮＦＳ−６０細胞）の刺激に基づく方法によって求められた。

ｐＨ値測定
ｐＨ値は、ＭＡ ５７４１（Ｉｓｋｒａ）ｐＨメータ及びＢｉｏｔｒｏｄｅ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）電極を用いて測定された。ｐＨメータは、適切な新しい較正緩衝剤を用いてｐＨ３．０からｐＨ５．０の範囲のｐＨ値に較正された。ｐＨは２５℃で測定された。ｐＨ測定値の標準偏差は、ｐＨ値の０．００３（０．３％）である。

薬剤組成物中のＧ−ＣＳＦ安定性を試験する条件
４℃：冷蔵庫に冷蔵庫温度（＋４℃から＋６℃の範囲）で保存
４０℃：４０℃±２℃で保存
２５℃：Ｖｉｂｒｏｍｉｘ ３１４ＥＶＴ振とう機上で７５ＲＰＭで振とうすることによって１ｍＬ補充シリンジ中で２５℃から３０℃の範囲の室温で保存

安定性試験
以下のＧ−ＣＳＦの薬剤組成物が調製された。

Ｓ１８：１．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、ｐＨは酢酸によって４．４に調節された
Ｂ１ａ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨはＮａＯＨ希釈溶液を用いて４．２に調節された
Ｂ１ｂ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨはＮａＯＨ希釈溶液を用いて４．４に調節された
Ｂ１ｃ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨはＮａＯＨ希釈溶液を用いて４．６に調節された
Ｂ１ｄ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨはＮａＯＨ希釈溶液を用いて４．８に調節された
Ｂ１ｅ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、０．１３ｍＭ酢酸、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ４．４
Ｂ−１ｅ−３（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、０．１３ｍＭクエン酸、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ４．４
Ｂ−１ｅ−４（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、０．１３ｍＭマレイン酸、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ４．４
Ｂ１ｆ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨはＴＲＩＳを用いて４．４に調節された
Ｂ１ｂ（０．６）：０．６ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、８％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨはＮａＯＨ希釈溶液を用いて４．４に調節された
Ｂ−１ｅ（０．６）：０．６ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、０．１３ｍＭ酢酸、８％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ４．４
Ｂ−１ｅ−２（０．６）：０．６ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、８％（ｗ／ｖ）ソルビトール、０．００４％Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨはＮａＯＨ希釈溶液を用いて４．４に調節された
Ｂ−１ｅ−３（０．６）：０．６ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、０．１３ｍＭクエン酸、８％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ４．４
Ｂ−１ｅ−４（０．６）：０．６ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、０．１３ｍＭマレイン酸、８％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ４．４
Ｂ−１ｇ（０．６）：０．６ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、０．０４ｍＭ ＨＣｌ、８％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ４．４
Ｂ２ａ（０．３）：０．３ｍｇ ｍＬ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、３％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨはＮａＯＨ希釈溶液を用いて４．２に調節された
Ｂ２ｂ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、３％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨはＮａＯＨ希釈溶液を用いて４．４に調節された
Ｂ−３ｂ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、０．０４ｍＭメタンスルホン酸、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ４．４
Ｂ−４ａ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、５％（ｗ／ｖ）グリセリン、ｐＨ４．４
Ｂ−４ｃ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、５％（ｗ／ｖ）グリセリン、０．１％Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８、ｐＨ４．４
Ｂ−５ａ（０．６）：０．６ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、８％（ｗ／ｖ）ソルビトール、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨはＮａＯＨ希釈溶液を用いて４．４に調節された
Ｂ−６ａ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、０．０５％Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８、ｐＨ４．４
Ｂ−６ｂ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、０．１％Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８、ｐＨ４．４
Ｂ−６ｄ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、１．０％Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８、ｐＨ４．４
Ｄ２ａ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、０．０４ｍＭメタンスルホン酸、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、０．１％Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８、ｐＨ４．４
Ｄ２ｂ（０．３）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１０ｍＭメタンスルホン酸、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、０．１％Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８、ｐＨはＮａＯＨ希釈溶液を用いて４．４に調節された
Ｓ１２：１．０ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１０ｍＭ酢酸、５％（ｍ／ｖ）ソルビトール、ｐＨはＮａＯＨを用いて４．０に調節された
基準組成物
Ａ（Ｓ１６−１０ＡＣＴ）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１０ｍＭ酢酸、５％（ｍ／ｖ）ソルビトール、０．００４％Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨはＮａＯＨを用いて４．０に調節された（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ様）
Ｂ（Ｓ１６−１０ＡＣＴ）：０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１．５ｍＭ酢酸、５％（ｍ／ｖ）ソルビトール、０．００４％Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨはＨＣｌを用いて３．８に調節された
Ｎ：市場で入手可能なＮｅｕｐｏｇｅｎ組成物（Ｇ−ＣＳＦ濃度０．６ｍｇ／ｍｌ）
それぞれのＧ−ＣＳＦ含有量が１．５ｍｇ／ｍｌである試料Ｓ１８は、４℃で３ヵ月間保存された。試料はＳＥ−ＨＰＬＣによって分析された；Ｇ−ＣＳＦ１２μｇがカラムに充填された。図１に結果を示す（ＡＵ＝吸収単位）。

それぞれのＧ−ＣＳＦ含有量が０．３ｍｇ／ｍｌである試料は、４０℃で１ヵ月間保存された。試料はＳＥ−ＨＰＬＣによって分析された；Ｇ−ＣＳＦ６μｇがカラムに充填された。図２に選択された結果を示す（ＡＵ＝吸収単位）。

図２の凡例：
Ｈ^＋ Ｂ−１ｅ（０．３）
Ｎａ^＋ Ｂ−１ｂ（０．３）
ＴＲＩＳ^＋ Ｂ−１ｆ（０．３）

図３に、それぞれのＧ−ＣＳＦ含有量が０．６ｍｇ／ｍｌであり、４０℃で１ヵ月間保存された一部の試料のＳＥ−ＨＰＬＣを示す。Ｇ−ＣＳＦ １２μｇがカラムに充填された。（ＡＵ＝吸収単位）
図３の凡例：
Ｈ^＋ Ｂ−１ｅ（０．６）の２量体を超える凝集体
Ｎａ^＋ Ｂ−１ｂ（０．６）の２量体を超える凝集体
Ｔｗｅｅｎ ８０ Ｂ−１ｅ−２（０．６）の２量体を超える凝集体
Ｔｗｅｅｎ ２０ Ｂ−５ａ（０．６）の２量体を超える凝集体
Ａ ２量体を超える凝集体
Ｂ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むプラセボの応答
Ｃ ２量体
Ｄ Ｇ−ＣＳＦモノマー
Ｅ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むプラセボの応答

図４に、それぞれのＧ−ＣＳＦ含有量が０．６ｍｇ／ｍｌであり、４０℃で１ヵ月間保存された本発明の試料及び基準試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。基準対照として使用されたＮ（０．３ｍｇ／ｍｌ）は、同じ条件で保存された。各ラインに１μｌが充填された。
図４の凡例：
レーン１：低分子量タンパク質標準（０．７９μｇ）
レーン２：Ｎ（１μｇ）
レーン３：Ｂ−１ｅ（０．６）
レーン４：Ｂ−１ｂ（０．６）
レーン５：Ｂ−１ｅ−２（０．６）
レーン６：Ｂ−５ａ（０．６）

図５に、それぞれのＧ−ＣＳＦ含有量が０．３ｍｇ／ｍｌであり、４０℃（±２℃）で１ヵ月間（４０）保存された一部の試料のＳＥ−ＨＰＬＣを示す。１２μｇがカラムに充填された。
図５の凡例：
Ｈ^＋ Ｂ−１ｅ（０．３）の２量体を超える凝集体
Ｎａ^＋ Ｂ−１ｂ（０．３）の２量体を超える凝集体
Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ Ｂ−６ｂ（０．３）の２量体を超える凝集体

安定性試験結果：
４℃で２ヵ月及び３ヵ月保存された試料Ｓ１８のＳＥ−ＨＰＬＣ分析によれば、２量体及び２量体を超える凝集体は検出されず、又は少量しか検出されない（表１、図１）。

これらの結果は、市場で入手可能なＧ−ＣＳＦ組成物（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｇ−ＣＳＦ＝０．３ｍｇ／ｍｌ）、非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦ）と同一であるＧ−ＣＳＦ組成物（ＡＳ１６−１０ＡＣＴ）中のＧ−ＣＳＦ安定性と類似している（表１）。

試料Ｓ１８のＴｍはＡＳ１６−１０ＡＣＴのＴｍと類似しており、Ｓ１８中のＧ−ＣＳＦ安定性がＡＳ１６−１０ＡＣＴ中のＧ−ＣＳＦ安定性と類似していると予想できることを示している。これは、＋４℃における安定性試験によって確認される（表１）。

また、Ｇ−ＣＳＦ安定性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によっても確認された（結果示さず）。また、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、保存期間後の不純物又はタンパク質含有量の大きな変化を示さなかった（結果示さず）。本発明の組成物に使用されるＧ−ＣＳＦのインビトロでの生物活性は、国際標準（Ｃａｔ． Ｎｏ． ８８／５０２；ＮＩＢＳＣ，ＵＫ）のレベルであった。数ヵ月保存後、組成物Ｓ１８中で保存されたＧ−ＣＳＦの生物活性は変わらなかった。

これらの結果によれば、適切な条件で数ヵ月保存後（長期安定性試験の初期の部分）、試料Ｓ１８中での完全なＧ−ＣＳＦ安定性が得られる。Ｓ１８中でのＧ−ＣＳＦ安定性は試料ＡＳ１６−１０ＡＣＴよりも良好か同等であるが、Ｓ１８では追加のＧ−ＣＳＦ安定剤（例えば、界面活性剤）が添加されず、Ｇ−ＣＳＦ濃度は５倍高く、保存期間がより長く、ｐＨ値は４．０を十分超える（４．４）。

異なる緩衝系の影響は、異なる塩基（ＮａＯＨ、ＴＲＩＳ）によってｐＨ値が４．４に調節された１．５ｍＭ酢酸を含む一連の組成物及びｐＨ値４．４が酢酸のみで得られた組成物において試験された。分析結果を表２及び図２に示す。

結果は、さまざまな陽イオンが使用されたときのＴｍ及び２量体を超える凝集体含有量の差を示す。純粋な酸を含む組成物のＴｍは、Ｎａ^＋及びＴＲＩＳ^＋陽イオンを含む組成物よりも高い。それと一致して、凝集体含有量は、Ｎａ^＋及びＴＲＩＳ^＋陽イオンを含む組成物よりも純粋な酸を含む組成物において最低である。また、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、保存期間後の不純物の含有量及び概要の大きな変化を示さない（結果示さず）。これらの結果は、純粋な酸（Ｈ^＋）がＴＲＩＳ^＋及びＮａ^＋よりもＧ−ＣＳＦ安定性に優先されることを示している。

Ｇ−ＣＳＦ安定性に対するｐＨの影響は、１．５ｍＭ酢酸／酢酸塩緩衝系を含む一連の組成物においてｐＨ値４．２、４．４、４．６及び４．８で試験された。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析結果を表３に示す。

４．２から４．８のｐＨ範囲において、２量体出現率の基本的差は４０℃で検出されない。

Ｇ−ＣＳＦ安定性に対するポリソルベート（界面活性剤）の影響は、０．６ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦを含む組成物を用いて試験された。結果を表４並びに図３及び４に示す。

表４の結果によれば、界面活性剤ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）又はポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）の添加によってＧ−ＣＳＦ安定性は改善されない。この結果によれば、Ｇ−ＣＳＦ安定性は、界面活性剤を添加せずに達成される。また、タンパク質含有量のＲＰ−ＨＰＬＣ分析によれば、ポリソルベートを含む組成物においてタンパク質含有量はより低い。

Ｇ−ＣＳＦ安定性に対するポロクサマー（ブロック共重合体）の影響は、０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦを含む組成物を用いて試験された。結果を表５及び６並びに図５に示す。

表５の結果によれば、ポロクサマー１８８の添加によってＴｍは減少する。

表６の結果によれば、ブロック共重合体ポロクサマー１８８の添加によって、Ｇ−ＣＳＦ安定性は改善されない。

表４、５及び６の結果によれば、ポリソルベート及びポロクサマーは、Ｇ−ＣＳＦ薬剤組成物中のＧ−ＣＳＦ安定性を維持するのに適切な賦形剤ではない。

Ｇ−ＣＳＦ安定性に対する異なる酸の影響は、酢酸、マレイン酸、クエン酸及びメタンスルホン酸を含む一連の組成物において試験された。結果を表７に示す。

使用されたさまざまな酸を含む組成物の結果は類似しており、酢酸がわずかに優れたＧ−ＣＳＦ安定性を示す。

Ｇ−ＣＳＦ安定性に対するポリオール選択及びその濃度の影響は、ソルビトール及びグリセリンを含む一連の組成物において試験された。結果を表８に示す。

表８の結果によれば、ソルビトールもグリセリンも効率的Ｇ−ＣＳＦ安定性のために使用することができる。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果は、表８の組成物間では大差ない（結果示さず）。

本発明のＧ−ＣＳＦ薬剤組成物の組成
本発明の薬剤組成物の組成を表９に示す。

バルク濃縮物の調製
Ｇ−ＣＳＦのバルク濃縮物の調製に使用されるＧ−ＣＳＦの出発材料は、Ｅ．コリ中での発現によって産生された（非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦ）。

Ｇ−ＣＳＦのバルク濃縮物は、ｐＨ値４．４、Ｇ−ＣＳＦ濃度１．５ｍｇ／ｍｌで純粋な酸（酢酸又はＨＣｌ）の溶液中で調製された。バルク濃縮物のＳＥ−ＨＰＬＣ分析によれば、２量体及び２量体を超える凝集体の含有量は検出限界以下であった。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析において観察された不純物の含有量は２から４％の範囲であった。（新しいＮｅｕｐｏｇｅｎ試料の分析は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析において観察された不純物の類似又はより高いレベルを示した。）

賦形剤の品質：
酢酸：ｐＨ Ｅｕｒ品質；ＨＣｌ：Ｍｅｒｃｋ 分析用３２％；マレイン酸：ＵＳＰ品質；クエン酸：Ｍｅｒｃｋ、分析用；メタンスルホン酸；Ｆｌｕｋａ；ＮａＯＨ：ｐＨ Ｅｕｒ品質；ソルビトール：ｐＨ Ｅｕｒ品質；グリセリン：Ｍｅｒｃｋ；分析用；Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８：ＢＡＳＦ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、ＮＦグレード；Ｔｗｅｅｎ ２０：Ｓｉｇｍａ、低パーオキシド、低カルボニル、酸化防止剤としてＢＨＴを含む；Ｔｗｅｅｎ ８０（Ｓｉｇｍａ、低パーオキシド、酸化防止剤としてＢＨＴを含む）；注射用水：ｐＨ Ｅｕｒ品質；分析用水（水）：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）

基準薬剤組成物の調製：
Ａ（Ｓ１６−１０ＡＣＴ）：Ｇ−ＣＳＦのバルク濃縮物（１．５ｍｇ／ｍｌ）は、ＮａＯＨ希釈溶液を用いてｐＨ４．０に調節された１２．５ｍＭ酢酸、６．２５％ソルビトール及び０．００５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ８０を含む緩衝剤で５倍希釈された。最終組成物のｐＨ値は４．０±０．１であった。
Ａ（Ｓ１６−１．５ＡＣＴ）：Ｇ−ＣＳＦのバルク濃縮物は、ＮａＯＨ希釈溶液を用いてｐＨ４．０に調節された１．８７５ｍＭ酢酸、６．２５％（ｗ／ｖ）ソルビトール及び０．００５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ８０を含む緩衝剤で５倍希釈された。最終組成物のｐＨは４．０±０．１であった。

本発明の薬剤組成物の調製：
一般に：
本発明の薬剤組成物は、０．２ ＰＥＳ／Ｎａｌｇｅｎｅフィルターに通してあらかじめろ過された適切な無菌緩衝液を用いてＧ−ＣＳＦの無菌バルク濃縮物を希釈することによって調製された。Ｇ−ＣＳＦの最終濃度はそれぞれ０．３ｍｇ／ｍｌ又は０．６ｍｇ／ｍｌであった。ろ過溶液は、２ｍＬバイアル（無色管状ガラス加水分解１型のバイアル）に充填され、洗浄され、滅菌され、臭化ブチル（ｂｒｏｍｂｕｔｙｌ）ゴム製弾性蓋で閉じられ、アルミニウムキャップで密閉された。

Ｓ１８：最後の精製段階後、タンパク質溶液は、酢酸で酸性化された水（ｐＨ４．４）に対して限外ろ過された。３個のＰｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ Ｕｌｔｒａｃｅｌｌ−５ＰＬＣＣＣ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを備えた実験室規模のＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅが使用された。Ｇ−ＣＳＦ溶液の限外ろ過は、０．２ ＰＥＳ／Ｎａｌｇｅｎｅに通してあらかじめろ過された酸性水１０体積に対して実施された。伝導率及びｐＨが測定された。最終Ｇ−ＣＳＦ濃度は１．５ｍｇ／ｍｌであった。無菌０．２２μｍ ＰＶＤＦフィルターによるタンパク質溶液の無菌ろ過はその後に実施された。

Ｂ−１ｅ（０．３）：Ｇ−ＣＳＦのバルク濃縮物は、０．１６ｍＭ酢酸、６．２５％（ｗ／ｖ）ソルビトールを含有する溶液で５倍希釈された。組成物Ｂ−１ｅ−４（０．３）、Ｂ−１ｅ−３（０．３）、Ｂ−３ｂ（０．３）において、類似の組成物においてｐＨ４．４を達成するために他の酸、例えば、クエン酸、マレイン酸 メタンスルホン酸の適切な量が使用された。最終組成物のｐＨは４．４±０．１であった。

Ｂ−１ａ（０．３）、Ｂ−１ｂ（０．３）、Ｂ−１ｃ（０．３）、Ｂ−１ｄ（０．３）：Ｇ−ＣＳＦのバルク濃縮物は、ＮａＯＨ希釈溶液を用いてｐＨ４．２（４．４、４．６、４．８）に調節された１．８７５ｍＭ酢酸及び６．２５％（ｗ／ｖ）ソルビトールを含む緩衝剤を用いて５倍希釈された。最終組成物のｐＨは、４．２±０．１（それぞれ４．４±０．１；４．６±０．１；４．８±０．１）であった。

Ｂ−１ｂ（０．６）：Ｇ−ＣＳＦのバルク濃縮物（１．５ｍｇ／ｍｌ）は、ＮａＯＨ希釈溶液を用いてｐＨ４．４に調節された２．５ｍＭ酢酸及び１３．３％（ｗ／ｖ）ソルビトールで２．５倍希釈された。最終組成物のｐＨは４．４±０．１であった。

Ｂ−１ｅ（０．６）、Ｂ−１ｅ−３（０．６）、Ｂ−１ｅ−４（０．６）、Ｂ−１ｇ（０．６）：Ｇ−ＣＳＦのバルク濃縮物（１．５ｍｇ／ｍｌ）は、０．２２ｍＭ酢酸、１３．３％（ｗ／ｖ）ソルビトールを含有する溶液で２．５倍希釈された。他の場合においては、類似の組成物においてｐＨ４．４を達成するために、他の酸、例えば、クエン酸又はマレイン酸の適切な量が使用された。最終組成物のｐＨは４．４±０．１であった。

Ｂ−２ａ（０．３）、Ｂ−２ｂ（０．３）：Ｇ−ＣＳＦのバルク濃縮物は、ＮａＯＨ希釈溶液を用いてｐＨ４．２又は４．４に調節された１．８７５ｍＭ酢酸及び３．７５％（ｗ／ｖ）ソルビトールを含む緩衝剤で５倍希釈された。最終組成物のｐＨはそれぞれ４．２±０．１又は４．４±０．１であった。

Ｂ−４ａ（０．３）：Ｇ−ＣＳＦのバルク濃縮物は、ＮａＯＨ希釈溶液を用いてｐＨ４．４に調節された１．８７５ｍＭ酢酸及び６．２５％（ｗ／ｖ）グリセリンを含む緩衝剤で５倍希釈された。最終組成物のｐＨは４．４±０．１であった。

４℃で３ヵ月間保存された後のＧ−ＣＳＦを含む本発明の試料のＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示すグラフである。 ４０℃で１ヵ月間保存された後のＧ−ＣＳＦを含む本発明の試料及び基準試料のＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示すグラフである。 ４０℃で１ヵ月間保存された後のＧ−ＣＳＦを含む本発明の試料及び基準試料のＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示すグラフである。 ４０℃で１ヵ月間保存された後のＧ−ＣＳＦを含む本発明の試料及び基準試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 ４０℃で１ヵ月間保存された後のＧ−ＣＳＦを含む本発明の試料及び基準試料のＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示すグラフである。

Claims (14)

1. ４．２〜４．８の範囲のｐＨ値を有し；
   Ｇ−ＣＳＦの治療有効量と、
   酢酸、マレイン酸、グルタミン酸、クエン酸、マロン酸、および乳酸からなる群から選択される酸とを含み；
   界面活性剤を含まない；
   顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の安定な薬剤組成物。
2. 前記組成物のｐＨが４．４である、請求項１に記載の組成物。
3. ａ．ポリオール及び／又は
   ｂ．ｐＨ緩衝系及び／又は
   ｃ．１種以上の薬剤として許容される賦形剤
   をさらに含む、請求項１又は２に記載の組成物。
4. Ｇ−ＣＳＦが非グリコシル化されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記組成物が水溶液である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記酸が酢酸である、請求項１に記載の組成物。
7. 前記ポリオールが、ソルビトール、グリセリン、イノシトール及びマンニトールからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
8. 選択された前記ポリオールがソルビトールである、請求項７に記載の組成物。
9. ソルビトールが１％〜１０％の範囲で含まれている、請求項８に記載の組成物。
10. ソルビトールが３％〜８％の範囲で含まれている、請求項８に記載の組成物。
11. 前記ｐＨ緩衝系が酢酸／酢酸塩である、請求項３に記載の組成物。
12. 酢酸濃度が０．１５ｍＭ〜１５ｍＭの範囲で含まれている、請求項１１に記載の組成物。
13. 酢酸濃度が１．５ｍＭ〜１０ｍＭの範囲で含まれている、請求項１２に記載の組成物。
14. 請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物が調製される、Ｇ−ＣＳＦを含む組成物を調製する方法。

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