JP5161471B2

JP5161471B2 - バイオセンサ及び被検知体の検知方法

Info

Publication number: JP5161471B2
Application number: JP2007082735A
Authority: JP
Inventors: 隆杉野; 秀充青木; 千春木村; 信明藤原; 昭彦増井
Original assignee: Watanabe Shoko KK
Current assignee: Watanabe Shoko KK
Priority date: 2007-03-27
Filing date: 2007-03-27
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2027-03-27
Also published as: JP2008241473A

Description

本発明は、バイオセンサ及び被検知体の検知方法に係る。

食は人の生活の根幹であるが、その安全性や信頼性を脅かす出来事が依然として起きている。食品の安全性を確保するためには、企業における安全管理体制の確立や検査体制の強化が望まれる。
それとともに細菌数、食中毒菌の特定を迅速に、高感度に、かつ簡易に測定、検出できる技術が望まれる。
現行の検査は、公定法である平板培養によるのが一般的である。しかし、この方法では検知に２−３日を必要とする。そのために、検知と商品出荷との間に時間差が生じてしまう。

現在行われている迅速測定としては、生物発光や蛍光染色による方法がある。
生物発光による方法では、生きた細菌に含まれているATPを測定して菌数を算出する。ATPは生菌に一定の割合で含まれているが、細菌が死滅すると細胞内の分解酵素の作用により急激に分解される。従って、ATP濃度の測定により生菌数の推定が可能である。
蛍光染色による方法では、生／死菌を染色試薬αを用いて染色し、紫外励起光を当てることによって生／死菌が発光する。同様に、死菌を染色試薬βを用いて染色し、緑の波長を持つ励起光を当てることで死菌が蛍光を発する。それぞれの蛍光の波長は異なるので、生／死菌の数を識別して計測を行う。
生物発光、蛍光染色による方法はともに迅速測定方法である。しかし、検知時間が短縮化されたとは言え、前処理などに数時間を必要とする。また、測定装置がおおがかりなものとなる。さらに、日々の検査を滞りなく行うためには、簡易に測定できることが重要であるが、上記方法は、簡易性に欠ける。

迅速測定法の開発は以前から積極的に行われており、一部は商品化されているが、微少菌数の段階で測定する方法は実用化に至っていない。
また、菌種の同定も必要であるが、これらについては既に研究では汎用化しているＰＣＲ、イムノアッセイやＤＮＡチップなど分子生物学的手法の流用が期待できるが、日常的な検査業務に使うには未完成である。

飲料品中の細菌数の測定は、一般に化学法発光法によるものが多く、あらかじめ細菌を平板培養して検知するため、長時間（数時間以上）を要する問題点がある。また、細菌数が少ない場合は濃縮操作も必要となる。更に、細菌中のＤＮＡを分析する場合は、細胞壁を溶解し、検知対象以外の物質を分離するために、多段階の前処理や処理装置を必要とする。更に、１種類のイオン交換膜のみでは、被検知物質以外の外乱要因が多く、選択的に目的物質を検知することが困難である。

本発明は、濃縮操作を行う必要がなく、総菌数および特定の食中毒菌を迅速、高感度に、しかも簡単に測定できる新しいバイオセンサを提供することを目的とする。

請求項１に係る発明は、陰イオン交換膜と、陰イオン交換膜と、前記陰イオン交換膜に対して、さらに積層された陽イオン交換膜と、前記陽イオン交換膜のインピーダンスの変化を検知するための手段とで構成されたことを特徴とするバイオセンサである。
請求項２に係る発明は、前記バイオセンサに、さらに相補性ＤＮＡ検知膜を積層したことを特徴とする請求項１記載のバイオセンサである。
請求項３に係る発明は、陰イオン交換膜と、前記バイオセンサに、さらに酵素を有する陽イオン交換膜を積層したことを特徴とする請求項１または２記載のバイオセンサである。
請求項４に係る発明は、前記陰イオン交換膜および陽イオン交換膜は、繊維状のイオン交換体を束ねて構成されていることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項記載のバイオセンサである。
請求項５に係る発明は、前記繊維状のイオン交換体の直径は、１０μｍ〜３０μｍであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項記載のバイオセンサである。
請求項６に係る発明は、被検知体を導入できるようにした陰イオン交換膜と、該陰イオン交換膜の両側に、プラス電荷を有する物質を電気泳動させて補足するイオン交換膜と、マイナス電荷を有する物質を電気泳動させて補足するイオン交換膜とをそれぞれフィルタを介して設け、少なくとも前記プラス電荷を有する物質を電気泳動させて補足するイオン交換膜、あるいは前記マイナス電荷を有する物質を電気泳動させて補足するイオン交換膜のいずれかの膜のインピーダンスの変化を検知するための手段を設けたことを特徴とするバイオセンサである。
請求項７に係る発明は、陰イオン交換膜により被検知体の一部を溶解し、前記陰イオン交換膜に対して、さらに陽イオン交換膜を積層し、前記陽イオン交換膜のインピーダンスの変化を検知することを特徴とする被検知体の検知方法である。
請求項８に係る発明は、陰イオン交換膜により被検知体の一部を溶解し、前記陰イオン交換膜に対して、さらに陽イオン交換膜を積層し、相補性ＤＮＡ検知膜を配置し、前記相補性ＤＮＡ検知膜のインピーダンスの変化を検知することを特徴とする被検知体の検知方法である。
請求項９に係る発明は、陰イオン交換膜により被検知体の一部を溶解し、前記陰イオン交換膜に対して、さらに陽イオン交換膜を積層し、前記陽イオン交換膜に対して、さらに酵素付き陽イオン交換膜を積層し、検出用の陰イオン膜を配置し、前記検出用の陰イオン膜のインピーダンスの変化を検知することを特徴とする被検知体の検知方法である。
請求項１０に係る発明は、陰イオン交換膜との反応により被検知体からプラスイオン物質ないしマイナスイオン物質を生成せしめ、該プラスイオン物質ないしマイナスイオン物質を電気泳動させて、他のイオン交換膜において補足し、該他のイオン交換膜のインピーダンスの変化を検知することを特徴とする被検知体の検知方法である。
請求項１１に係る発明は、前記被検知体は、微生物であることを特徴とする請求項７ないし１０のいずれか１項記載の被検知体の検知方法である。
請求項１２に係る発明は、前記被検知体の内部のイオン物質が検知されることを特徴とする請求項７ないし１０のいずれか１項記載の被検知体の検知方法である。

本発明は、異なる種類のイオン交換繊維膜を組み合わせることによって、濃縮、細胞壁溶解、選択性を得ることができる簡易バイオセンサに関するものである。また、選択性を高める上で、電気泳動法を用いて分離精度を向上する構造についても提案する。したがって、従来のように培養に時間を要したり、高額な分析機器を必要とせず、携帯できるサイズのセンサを提供できる。

こうした背景から、新しいイオン交換膜と電気化学的な検知システムを組み合わせ、さらに分子生物学的手法を応用することにより、本発明は、迅速で高感度、選択性を有する小型安価な携帯型のバイオセンサを提供することを目的とする。
検知部に３次元的なセンサ構造を有するイオン交換繊維膜を用い、細菌数、イオン濃度、タンパク質（ＤＮＡ含む）、環境ホルモンによってインピーダンスや誘電率変化、電気泳動法によるノイズイオンの分離技術を併用して、簡易に生体物質をセンシングすることができる。

食品中の細菌検査、飲料水中の環境ホルモン検査等において、従来のような濃縮操作、培養作業なしに迅速簡便な高感度センサを提供できる。従って、小売現場や家庭で飲料水、食品に対する品質管理が容易にでき、スーパーやコンビニでの食品の大量廃棄の削減も可能となる。更に、発展途上国においては食料に対する衛生問題が深刻であり、期限切れの食料を飲食することは日常である。ゆえに、簡易的に細菌数を検知する装置の開発が急がれ、安全で衛生的な社会を維持していく上では社会的ニーズの必要性、緊急性は高い。

本発明の原理は、イオン交換膜におけるプロトン伝導が、生体関連物質が膜に吸着することによって阻害され、膜全体のインピーダンスが変化する現象を利用している。本発明では、陰イオン交換膜に吸着する物質、陽イオン交換膜に吸着する物質、いずれにも吸着しない物質を実験から明らかにし、これらの膜を組み合わせることで、選択的に所望の成分を検知することを可能とした。また、本発明で用いているイオン交換膜は、繊維状になっており、繊維間の空間部が数μｍ〜数十μｍあるため、細菌が膜内部まで侵入し反応することができる。特に、細菌は、陰イオン交換膜（強塩基性）に接触することで、その細胞壁は溶解し内部のＤＮＡやイオン成分が溶出して検知を可能としている。

更に、膜へ通水する被検知液の量を増加することで、膜内に検知対象物質を蓄積する濃縮操作も兼ね備えている。以上から、細胞壁を溶解する操作や濃縮する操作が必要なくなる。

膜の母体は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはジビニルベンゼン共重合体であり、表面および内部にアニオン系（アンモニウム基）、カチオン系（スルホン基など）が官能基として付いている。イオン交換繊維の直径は製法によって変化させることができ、０．１μｍ〜１μｍ程度のもの数μｍ〜３０μｍ程度のものがある。その表面積の大きさから、従来の樹脂、膜などのイオン交換体と比べて、格段に迅速な応答速度でかつ顕著なイオン種間の特性値の違いを示すことができる。
なお、陰イオン膜の交換基は、例えば４級アンモニウム基またはアミノ基が一般的である。

以下、添付の図面を参照して発明の実施の形態を説明する。１０μｍ〜３０μｍ程度の直径のイオン交換繊維膜を用いたもので、陰イオン交換膜の場合はアミノ基を、陽イオン交換膜の場合はスルホン酸基を導入している。実験においては、Ｐｔ電極を膜の両側に接触させ、膜に交流を印加してインピーダンスを測定した。被測定溶液は、ヒーターで２５℃に制御し、チューブポンプにて膜に送入した。誘電体インピーダンス測定システム（ソーラトロン社製）の測定周波数範囲は０．１Ｈｚ〜１０ＭＨｚで、印加交流電圧は振幅１０ｍＶのサイン波に固定した。

複数の膜の積層は例えば、次のようにして行えばよい。
一例としては、それぞれのイオン交換膜の間に、半透性のセロハン膜を挿入して分離する。もちろん、セロハン膜の孔サイズによって、目的物質の通過状態が異なるが、すでに細胞壁が溶解しているので、内容物のみが通過できる孔サイズでよい。
各膜は周辺のフレーム（枠）で固定する。フレームと膜とは接着剤などで接着すればよい。

細菌（枯草菌の１種である納豆菌）を用いて実験した。細菌をイオン交換膜に導入した場合、陰イオン交換膜は大きく膜のインピーダンスＺが上昇することから、細菌と何らかの物質と反応している可能性がある。

ＳＥＭにて観察した結果、Ｚが上昇した陰イオン交換膜には細菌が吸着した形跡が見られず、逆に高濃度の細菌を導入すると陽イオン交換膜には、吸着している細菌が見られた。このことから、陰イオン交換膜表面の強塩基が、細胞壁を溶解し、細菌内部のイオン物質（タンパク質、ＤＮＡ含む）を検知している可能性がある。この裏付けとして、図１に示すように、細胞壁のみリゾチームで溶解した溶液でもＺの上昇が見られ、また、強塩基溶液（ＫＯＨ）に細菌を接触させた場合に細菌数が激減することも確認した。ここで、細菌数は、細菌を含む溶液のＵＶ吸収の光度から検量線を作成して相関関係を別途調査した。

以上の実験結果から、陰イオン交換膜には細胞壁を溶解し、内部のイオン成分を溶出させて交換基と反応検知できる作用があることが明らかになった。
この実験から、図２に示すような検知構造が提案できる。図２のＴｙｐｅ−１は陰イオン交換膜１１の一層構造である。
Ｔｙｐｅ−２は陰イオン交換膜１１と陽イオン交換膜１５との組み合わせである。両膜を積層してなる。
Ｔｙｐｅ−３は、更に相補性ＤＮＡ１７を補足した検知膜（イオン交換膜）１６を積層した構造である。
図に示す位置に電極１３を介してそれぞれ、交流を印加して膜のインピーダンスの変化を交流インピーダンスアナライザー１４により調べる。

図３に、図２のＴｙｐｅ−１（単層で（１１）膜厚は１０ｍｍ）及びＴｙｐｅ−２（二層構造で（１５）の膜厚は３ｍｍ）についての細菌数に対するインピーダンスの依存性を示す。
Ｔｙｐｅ−１（単層）では、インピーダンスの変化が少ない。すなわち、少ない細菌数の検知は困難である。
一方、Ｔｙｐｅ−２（二層）にすることで、インピーダンスの変化は顕著になる。従って、少ない細菌数であっても検知可能になる。
Ｔｙｐｅ−３に関しても同様にＤＮＡのみの検知感度を高めることができる。

血液中のグルコースの検知を例に実験した。膜の酵素（グルコースオキシターゼ）の検知について実験した結果を図４に示す。初期値と比較して、グルコースのみでは膜のインピーダンスは変化が見られなかったことから、イオン交換膜にグルコースは吸着しないことがわかる。

次に、酵素（グルコースオキシターゼ）のみを導入した場合は、陽イオン膜、陰イオン膜ともにインピーダンスが同じ程度上昇した。すなわち、酵素はいずれの膜にも吸着することがわかる。更に、酵素とグルコースの両者を導入した場合は、陰イオン膜のみ上昇した。
この結果は、酵素とグルコースの両者の導入により、グルコースはグルコン酸とＨ_２Ｏ_２に分解され、グルコン酸が陰イオン交換膜に吸着し（Ｈ_２Ｏ_２は吸着しない）、そのため、変化が生じたと考えられる。
この実験結果をもとに、図５のような膜の積層構造が考えられる。血液中の余分な陽イオンまたは陰イオンを、陽イオン交換膜（１１）、陰イオン交換膜（１５）で除去し、中性のグルコースのみを通過させる。

更に、酵素付陽イオン交換膜（３）では、グルコースは酵素と反応してグルコン酸＋Ｈ_２Ｏ_２を生成するが、膜（１９）では吸着せず、通過して、次の陰イオン膜（２０）でグルコン酸のみが吸着する。このグルコン酸吸着によるインピーダンスの変化をモニターすることにより、血液中のグルコース濃度を感度良く検知できることができる。

前述のイオン交換膜の積層方式に加え、図６に電気泳動を併用したイオン交換膜による生体関連物質の検知装置の構造を示す。例えば、陰イオン交換膜（３１）に細菌を導入した場合、細胞壁が溶解されて溶出した内容物のうち、プラス電荷を有する物質は陰極側に電気泳動されてイオン交換膜（３２）に補足され、３２膜のインピーダンスの変化を生じる。逆に、マイナス電荷を有する物質は陽極側に電気泳動されてイオン交換膜（３３）に補足されインピーダンスの変化を生じる。この場合、３１膜と３２膜の間、３１膜と３３膜の間にフィルター膜（３７）を挿入して相互拡散を防止している。

相互拡散を防止用のフィルター膜は、検知目的物質によって適切な分画分子量のフィルターを選ぶ必要がある。また、図２や図５の積層タイプにおいても同様にイオン交換膜の間に挿入してもよい。

なお、上述のセンサでは、本発明のセンシング部を搭載したチップとして作成し、このセンシング部を飲料水や食品の抽出液に浸漬して計測する。または、液を１滴チップのセンシング部に滴下し、このチップを計測機器に挿入することで測定してもよい。

また、本発明は、食品用だけでなく、医療用や環境や発酵・醸造プロセスや工業プロセスへの幅広い応用を可能にする。また、大量に需要が見込めることから、大きな経済効果も生み出せる。

細菌によるイオン交換膜のインピーダンス変化のグラフである。積層イオン交換膜による細菌検知装置の構造図である。積層イオン交換膜による細菌検知特性のグラフである。グルコースと酵素によるイオン交換膜のインピーダンス変化のグラフである。積層イオン交換膜による生体関連物質の検知装置の構造図である。電気泳動を併用したイオン交換膜による生体関連物質の検知装置の構造図である。

符号の説明

１１陰イオン交換膜
１２細菌（枯草菌）
１３電極
１４交流インピーダンスアナライザー
１５陽イオン交換膜
１６検知膜
１７相補性ＤＮＡ
１８グルコースオキシターゼ
１９グルコースオキシターゼ付陽イオン交換膜
２０陰イオン交換膜２
３１陰イオン交換膜
３２イオン交換膜
３３イオン交換膜
３４＋電極（ＤＣ）
３５ −電極（ＤＣ）
３６メッシュ電極（ＡＣ）
３７フィルター膜

Claims

陰イオン交換膜と、
前記陰イオン交換膜に対して、さらに積層された陽イオン交換膜と、
前記陽イオン交換膜のインピーダンスの変化を検知するための手段とで構成されたことを特徴とするバイオセンサ。
前記バイオセンサに、さらに相補性ＤＮＡ検知膜を積層したことを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
前記バイオセンサに、さらに酵素を有する陽イオン交換膜を積層したことを特徴とする請求項１または２記載のバイオセンサ。
前記陰イオン交換膜および陽イオン交換膜は、繊維状のイオン交換体を束ねて構成されていることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項記載のバイオセンサ。
前記繊維状のイオン交換体の直径は、１０μｍ〜３０μｍであることを特徴とする請求項
４項記載のバイオセンサ。
被検知体を導入できるようにした陰イオン交換膜と、
該陰イオン交換膜の両側に、プラス電荷を有する物質を電気泳動させて補足するイオン交換膜と、
マイナス電荷を有する物質を電気泳動させて補足するイオン交換膜とをそれぞれフィルタを介して設け、
少なくとも前記プラス電荷を有する物質を電気泳動させて補足するイオン交換膜、あるいは前記マイナス電荷を有する物質を電気泳動させて補足するイオン交換膜のいずれかの膜のインピーダンスの変化を検知するための手段を設けたことを特徴とするバイオセンサ。
陰イオン交換膜により被検知体の一部を溶解し、
前記陰イオン交換膜に対して、さらに陽イオン交換膜を積層し、
前記陽イオン交換膜のインピーダンスの変化を検知することを特徴とする被検知体の検知方法。
陰イオン交換膜により被検知体の一部を溶解し、
前記陰イオン交換膜に対して、さらに陽イオン交換膜を積層し、
相補性ＤＮＡ検知膜を配置し、前記相補性ＤＮＡ検知膜のインピーダンスの変化を検知することを特徴とする被検知体の検知方法。
陰イオン交換膜により被検知体の一部を溶解し、
前記陰イオン交換膜に対して、さらに陽イオン交換膜を積層し、
前記陽イオン交換膜に対して、さらに酵素付き陽イオン交換膜を積層し、
検出用の陰イオン膜を配置し、前記検出用の陰イオン膜のインピーダンスの変化を検知することを特徴とする被検知体の検知方法。
陰イオン交換膜との反応により被検知体からプラスイオン物質ないしマイナスイオン物質
を生成せしめ、該プラスイオン物質ないしマイナスイオン物質を電気泳動させて、他のイ
オン交換膜において補足し、該他のイオン交換膜のインピーダンスの変化を検知すること
を特徴とする被検知体の検知方法。
前記被検知体は、微生物であることを特徴とする請求項７ないし１０のいずれか１項記載の被検知体の検知方法。
前記被検知体の内部のイオン物質が検知されることを特徴とする請求項７ないし１０のいずれか１項記載の被検知体の検知方法。