JP5232247B2 - Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ、およびこれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、好熱菌由来の新規なＬ−サクシニルアミノアシラーゼに関し、特に、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンやＮ−サクシニル−Ｌ−ビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ジクロロフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ブロモフェニルアラニンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を基質として効率的に利用できる新規なＬ−サクシニルアミノアシラーゼ、およびこの酵素を用いたＬ−アミノ酸の製造方法に関する。
医薬品、農薬および食品などの多くの産業分野でＬ−アミノ酸は有用である。例えば産業上有用なＬ−アミノ酸としては、動物飼料用の添加物、健康食品の成分およびアミノ酸輸液等として使用されるＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−プロリン、肝機能促進薬、アミノ酸輸液および総合アミノ酸製剤等の成分として使用されるＬ−アルギニンおよびＬ−オルニチン、肝機能促進薬およびヒスタミンの前駆体として使用されるＬ−ヒスチジン、甘味料の前駆体として使用されるＬ−フェニルアラニン、様々な医薬品の中間体として使用されるＬ−ターシャリーロイシン、Ｌ−ビフェニルアラニン、Ｌ−シクロヘキシルグリシン、Ｌ−ジクロロフェニルアラニン、Ｌ−ブロモフェニルアラニンなどが知られている。従って、これらの有用なＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸から分離された状態で効率的に得ることが求められている。
Ｌ−アミノ酸の製造方法としては、Ｎ−アシルアミノ酸のラセミ体を合成し、Ｌ−アミノアシラーゼという酵素を用いてラセミ体中のＬ体のみを加水分解し、Ｌ−アミノ酸のみを特異的に生成させる方法が従来から使用されている。この方法で使用するＬ−アミノアシラーゼとしては、例えば、ペニシリウム・フニコロサム由来のＬ−アミノアシラーゼ（特許文献１）やストレプトミセス・モバラエンシス由来のＬ−アミノアシラーゼ（特許文献２）が知られている。
しかし、特許文献１，２に記載のＬ−アミノアシラーゼは、加水分解能に優れるものの、基質特異性は未だ満足のいくものではなく、Ｎ−アシル−Ｌ−ターシャリーロイシン、Ｎ−アシル−Ｌ−ビフェニルアラニン、Ｎ−アシル−Ｌ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−アシル−Ｌ−ジクロロフェニルアラニン、Ｎ−アシル−Ｌ−ブロモフェニルアラニンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を基質として認識することができなかった。従って、特許文献１，２に記載のＬ−アミノアシラーゼを用いた方法では、Ｎ−アシル−ＤＬ−ターシャリーロイシンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を光学分割することができず、医薬品の中間体として有用なＬ−ターシャリーロイシンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を製造することができなかった。
本発明者らは、最近、好熱菌の一種であるゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＡ１５０３株から採取されたＬ−サクシニルアミノアシラーゼが、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを基質として認識することができることを見出し、このＬ−サクシニルアミノアシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定し、特許出願を行った（特許文献３）。特許文献３に記載のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを基質とすることができるという、従来のＬ−アミノアシラーゼが有しない基質特異性を有するものの、酵素活性の点でなお課題を有していた。また、特許文献３では、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシン以外の立体的にかさ高い非天然アミノ酸に対する基質特異性については、このＬ−サクシニルアミノアシラーゼがＮ−サクシニル−Ｌ−シクロヘキシルグリシン及びＮ−サクシニル−Ｌ−４−ブロモフェニルアラニンを基質とすることができることが確認されているにすぎない。
本発明は、かかる従来技術の問題点に鑑み創案されたものであり、その目的は、医薬品の中間体として有用なＬ−ターシャリーロイシンやＬ−ビフェニルアラニン、Ｌ−シクロヘキシルグリシン、Ｌ−ジクロロフェニルアラニン、Ｌ−ブロモフェニルアラニンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を効率良く製造することができる新規なＬ−アミノアシラーゼを提供することにある。
本発明者らは、上記目的を達成するために、様々な生物由来のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの酵素活性について検討した結果、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＩＦ０１２９８３株から採取されたＬ−サクシニルアミノアシラーゼが、特許文献３のＬ−サクシニルアミノアシラーゼと比較してＮ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを基質として効率良く利用できることを見出した。また、この株から採取されたＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリロイシンのみならず、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ジクロロフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ブロモフェニルアラニンなどの他の立体的にかさ高い非天然アミノ酸も基質として効率良く利用できることを見出した。そして、本発明者らは、このＬ−サクシニルアミノアシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明によれば、（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とするタンパク質が提供される：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
また、本発明によれば、（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とする遺伝子が提供される：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
さらに、本発明によれば、上記遺伝子をベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする上記タンパク質の製造方法が提供される。
さらに、本発明によれば、上記タンパク質を用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸中のＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程を含むことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法が提供される。
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、従来公知のＬ−アミノアシラーゼとは異なり、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンやＮ−サクシニル−Ｌ−ビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ジクロロフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ブロモフェニルアラニンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を基質として効率良く利用できるので、医薬品の中間体として有用なＬ−ターシャリーロイシンやＬ−ビフェニルアラニン、Ｌ−シクロヘキシルグリシン、Ｌ−ジクロロフェニルアラニン、Ｌ−ブロモフェニルアラニンなどを効率良く製造することができる。
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質、または（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。配列番号１は、好熱菌の一種であるゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＩＦＯ１２９８３株のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの塩基配列であり、配列番号２は、そのアミノ酸配列である。
上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質は、Ｎ−サクシニルアミノ酸のＤ体とＬ体のうちＬ体であるＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸のみを特異的に加水分解してＬ−アミノ酸を特異的に生成させることができるという特徴を有する。生体内に、Ｎ−アセチルアミノ酸とＮ−サクシニルアミノ酸は一般的に存在すると考えられるが、上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質は、Ｎ−アセチルアミノ酸よりもＮ−サクシニルアミノ酸に対して１００倍以上高い活性を有する。これらのことから、上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質は、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を特異的に加水分解してＬ−アミノ酸とコハク酸を生成する反応を触媒する酵素、つまりＬ−サクシニルアミノアシラーゼであると言える。
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの最大の特徴は、基質のＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸として、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンやＮ−サクシニル−Ｌ−ビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ジクロロフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ブロモフェニルアラニンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を効率良く利用することができることにある。特に、これらの立体的にかさ高い非天然アミノ酸のうち、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ビフェニルアラニン、及びＮ−サクシニル−Ｌ−シクロヘキシルグリシンについては、後述の実施例７で示すように、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、特許文献３に記載のＬ−サクシニルアミノアシラーゼと比較して、これらの非天然アミノ酸を顕著に効率良く利用することができる。本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼと特許文献３に記載のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、同じ生物の異なる株由来の酵素であり、このような由来の近い酵素同士が大きく異なる酵素活性を有することは極めて驚くべきことであり、当業者が容易に予測できないことである。
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの理化学的性質は、以下の（ｉ）〜（ｖ）に示す通りである。
（ｉ）分子量：４３ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；
（ｉｉ）基質特異性：Ｎ−サクシニルターシャリーロイシン、Ｎ−サクシニルビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニルシクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニルジクロロフェニルアラニン、Ｎ−サクシニルブロモフェニルアラニンに作用する；
（ｉｉｉ）温度安定性：３０分間熱処理した場合、７０℃では安定であり７５℃以上では失活する；
（ｉｖ）至適温度：ｐＨ７〜８で反応させる場合、温度５５〜６０℃において作用が至適である；および
（ｖ）至適ｐＨ：６０℃で３０分間反応させる場合、ｐＨ７において作用が至適である。
（ｉ）分子量：４３ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；
（ｉｉ）基質特異性：Ｎ−サクシニルターシャリーロイシン、Ｎ−サクシニルビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニルシクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニルジクロロフェニルアラニン、Ｎ−サクシニルブロモフェニルアラニンに作用する；
（ｉｉｉ）温度安定性：３０分間熱処理した場合、７０℃では安定であり７５℃以上では失活する；
（ｉｖ）至適温度：ｐＨ７〜８で反応させる場合、温度５５〜６０℃において作用が至適である；および
（ｖ）至適ｐＨ：６０℃で３０分間反応させる場合、ｐＨ７において作用が至適である。
また、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、２価または１価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で反応させることで活性を有する。ここで使用する２価または１価の金属イオンとしては、Ｍｎ２＋，Ｃｏ２＋，Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋，Ｎｉ２＋，Ｋ＋などが挙げられ、なかでもＣｏ２＋が特に好ましい。Ｃｏ２＋を使用すると、Ｚｎ２＋を使用したときより活性が２倍以上増加することが判明している。
本発明は、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子、および（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も包含する。これらは、上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質に対応する遺伝子である。
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、上記（ａ）および（ｂ）のものに限定されず、（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質、または（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質も含む。また、本発明の遺伝子は、（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、または（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含む。これは、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果としてタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質であることが多いからである。また、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの遺伝子を、由来生物以外の宿主生物（大腸菌など）に組込んで本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼを発現させる場合、発現効率向上のため、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更することもあるからである。
上記（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部をプローブとしてコロニー又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。なお、本明細書において用いる用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ある塩基配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡのみが特異的にハイブリダイズする条件であることができる。
ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより作り出すことができる。一例を示せば、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行なった後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行なう。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２％×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素（例えばプローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
ハイブリダイゼーションによって得られた遺伝子がＬ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば、得られた遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この酵素タンパク質を精製してＮ−サクシニル−ＤＬアミノ酸に添加してＬ−アミノ酸の生成をクロマトグラフィーなどで測定することによって確認することができる。
また、上記（ｄ）のタンパク質の遺伝子である、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、例えばＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡製）などの市販のキットやＰＣＲ法を利用して配列番号１に記載の塩基配列を改変することによって得ることができる。得られた遺伝子がＬ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、ハイブリダイゼーションによって得られた遺伝子の場合と同様の方法で確認することができる。
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの製造は、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。
ベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター、ウィルスベクター等が包含される。組換えベクターの調製は、常法に従って行えばよく、例えば、これらのベクターに、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの遺伝子を適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより容易に行うことができる。また、Ｔａｑポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、ＴＡクローニングによるベクターへの接続も可能である。
また、宿主細胞としては、従来公知のものが使用可能であり、組換え発現系が確立しているものであれば特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌、放線菌、麹菌、酵母といった微生物ならびに昆虫細胞、動物細胞、高等植物などが挙げられ、より好ましくは微生物が挙げられ、特に好ましくは大腸菌（例えば、Ｋ１２株、Ｂ株など）が挙げられる。形質転換体の調製は、常法に従って行えばよい。
得られた形質転換体を、その宿主細胞に応じた適当な培養条件で一定期間培養すれば、組込まれた遺伝子から本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼが発現されて、形質転換体中に蓄積する。
形質転換体中に蓄積した本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、未精製のまま用いることができるが、精製したものを使用しても良い。この精製方法としては、従来公知のものが使用可能であり、例えば、培養後の形質転換体あるいはその培養物を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理などにより細胞抽出液を得、そこから蛋白質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。このような分離技術としては、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
次に、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼを用いてＬ−アミノ酸を製造する方法について説明する。本発明によるＬ−アミノ酸は、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸（ラセミ体）中のＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸（Ｌ体）を特異的に加水分解する工程によって製造される。
この工程は、具体的には、適当な溶液中に、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼと原料のＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸を溶解させて反応液を調製し、この反応液を適当な条件で反応させることによって行うことができる。
使用する溶液は、蒸留水で十分であるが、必要により、リン酸塩やトリスなどの緩衝剤を使用してもよい。緩衝剤を使用する場合、その濃度は２０〜２００ｍＭであることが好ましく、ｐＨは６．５〜８であることが好ましい。
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、反応液中５〜５００ｍｇ／Ｌ（１００〜１００００Ｕ／Ｌ）の濃度で使用されることが好ましい。また、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、上述の通り、２価または１価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍ（好ましくは０．１〜１ｍＭ）の終濃度で添加することにより活性を持つため、反応液中に２価または１価の金属イオンを添加することが必要である。添加する２価または１価の金属イオンの例としては、Ｍｎ２＋，Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋，Ｎｉ２＋およびＫ＋が挙げられ、特にＣｏ２＋が好適である。
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼと反応させるＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸は、種々の公知の方法によって合成することができ、例えばＳａｋａｉ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，４５（１４），４４５５−６２に記載の方法によって合成することができる。原料のＤＬアミノ酸の種類は、製造したいＬ−アミノ酸の種類に応じて適宜選択すればよく、天然に存在する２０種のアミノ酸およびその誘導体、並びにターシャリーロイシン、シクロヘキシルグリシン、ブロモフェニルアラニン、ビフェニルアラニン、ジクロロフェニルアラニンなどの非天然アミノ酸およびその誘導体であることができる。
反応液中のＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸の濃度は、特に限定されないが、一般的に１重量％〜３０重量％である。
反応液中のＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸の濃度は、特に限定されないが、一般的に１重量％〜３０重量％である。
本発明のＬ−アミノ酸の製造方法では、反応液を反応させる温度は、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には２０〜７０℃が好ましく、３０〜６０℃がより好ましく、５５〜６０℃がさらに好ましい。また、反応時のｐＨは、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼが十分作用するｐＨであれば特に限定されないが、一般的にはｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ６〜９がより好ましい。反応時間は、特に限定されないが、一般的に１日〜７日程度である。反応時間は、製造したいＬ−アミノ酸の種類と所望の収量、収率、使用する酵素や基質の量、量比、反応温度や反応ｐＨなどを考慮し、実験的に適宜選択することができる。
好ましくは、本発明のＬ−アミノ酸の製造方法は、Ｎ−サクシニルラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を生成させる工程をさらに含む。本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸（ラセミ体）中のＬ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸のみを特異的に加水分解するため、このままではラセミ体の残り半分のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸は無駄になってしまう。そこで、Ｎ−サクシニルラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を生成させてやれば、残ったＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸も結果的にすべてＬ−アミノ酸に変換することができる。
Ｎ−サクシニルラセマーゼは、Ｎ−サクシニルアミノ酸のＬ体をＤ体に変換する反応とＤ体をＬ体に変換する反応の両方を触媒してその比率をほぼ等しく（ラセミ化）する酵素である。本発明の製造方法で使用するＮ−サクシニルラセマーゼは、Ｎ−サクシニルアミノ酸をラセミ化することができれば特に限定されず、特開２００７−８２５３４号公報に記載されたＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼや特開２００８−６１６４２号公報に記載されたＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼなどの従来公知のものを使用することができる。
Ｎ−サクシニルラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化する反応は、例えば以下の条件でＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸、Ｎ−サクシニルラセマーゼおよび緩衝剤を含む反応溶液中で混合することにより行なう。反応温度は、使用するＮ−サクシニルラセマーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には２５〜７０℃が好ましく、３７〜７０℃がより好ましい。反応時のｐＨは、使用するＮ−サクシニルラセマーゼが十分作用するｐＨであれば特に限定されないが、一般的にはｐＨ５〜９が好ましく、ｐＨ６．５〜８がより好ましい。Ｎ−サクシニルラセマーゼは、反応液中５〜５００ｍｇ／Ｌ（５００〜５００００Ｕ／Ｌ）の濃度で使用されることが好ましい。Ｎ−サクシニルラセマーゼは、２価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍ（好ましくは０．１〜１ｍＭ）の終濃度で添加することにより活性を持つ。添加する２価の金属イオンとしては、Ｍｎ２＋，Ｃｏ２＋，Ｍｇ２＋，Ｆｅ２＋およびＮｉ２＋が挙げられ、特にＣｏ２＋が好適である。Ｃｏ２＋は終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時、相対活性でＭｎ２＋の終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時の２倍以上の活性を有する。Ｎ−サクシニルラセマーゼの反応に用いる緩衝剤は、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼの反応に用いる緩衝剤と同様のものが使用できる。なお、特開２００７−８２５３４号に記載のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼは、その後の研究により、Ｎ−サクシニルアミノ酸をより好適な基質とするＮ−サクシニルラセマーゼであることが判明している。従って、特開２００７−８２５３４号に記載のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼは、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼと組合せて使用することができる。
前述のＮ−サクシニルラセマーゼによるラセミ化反応とＬ−サクシニルアミノアシラーゼによる加水分解反応は、別々に行なうことも可能であるが、同時に行なわれることが好ましい。同時に行われる場合、微視的に見ると、まずＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸のうちＬ体のみが本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼにより脱アシル化（加水分解）され、目的のＬ−アミノ酸が生成する。基質のＬ体が消費されるとラセミ状態が解消されるため、Ｎ−サクシニルラセマーゼはＤ体をＬ体に変換する反応をより促進する。Ｎ−サクシニルラセマーゼにより生成したＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸は、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼにより順次Ｌ−アミノ酸へと分解される。この繰返しにより、理論的にはほぼすべてのＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸をＬ−アミノ酸に変換することができる。ラセミ化反応および加水分解反応を同時に行う場合の反応条件は、Ｎ−サクシニルラセマーゼおよび本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼが活性を発揮する条件の範囲内であれば特に限定しないが、基質濃度１重量％〜３０重量％、ｐＨ６〜８、温度３０〜６０℃で行うことが好ましい。ラセミ化反応および加水分解反応に要する時間は、原料として用いるＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸が、所望する量のＬ−アミノ酸へと変換し得るまでの時間であれば特に制限されず、仕込み量によっても異なるが、一般的に１日〜７日程度である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されない。
Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸の合成
（１）Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンの合成
Ｄ−ターシャリーロイシン（東京化成工業製）とＬ−ターシャリーロイシン（東京化成工業製）の等モル混合物１０ｇを水５０ｍｌと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１５ｇに溶解し、無水コハク酸８ｇと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１５ｇを加え、２０℃〜４０℃で撹拌しながら反応させた。反応液を塩酸で中和後、酢酸エチルで抽出し、濃縮した。ヘキサンで乾燥させて晶析し、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンの白色粉末を１４ｇ得た。
（２）Ｎ−サクシニル−ＤＬ−バリンの合成
Ｄ−バリン（ナカライテスク製）とＬ−バリン（ナカライテスク製）の等モル混合物１０ｇを水５０ｍｌと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１７ｇに溶解し、無水コハク酸（ナカライテスク製）８．８ｇと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１７ｇを加え、２０℃〜４０℃で撹拌しながら反応させた。反応液を塩酸（ナカライテスク製）で中和後、酢酸エチル（ナカライテスク製）で抽出し、濃縮した。ヘキサンで乾燥させて晶析し、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−バリンの白色粉末を１５ｇ得た。
（３）Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−セリン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−チロシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−４−ブロモフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−３，４−ジクロロフェニルアラニンの合成
これらのＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸は、（２）のＮ−サクシニル−ＤＬ−バリンの合成方法に準じた方法で合成した。
（１）Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンの合成
Ｄ−ターシャリーロイシン（東京化成工業製）とＬ−ターシャリーロイシン（東京化成工業製）の等モル混合物１０ｇを水５０ｍｌと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１５ｇに溶解し、無水コハク酸８ｇと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１５ｇを加え、２０℃〜４０℃で撹拌しながら反応させた。反応液を塩酸で中和後、酢酸エチルで抽出し、濃縮した。ヘキサンで乾燥させて晶析し、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンの白色粉末を１４ｇ得た。
（２）Ｎ−サクシニル−ＤＬ−バリンの合成
Ｄ−バリン（ナカライテスク製）とＬ−バリン（ナカライテスク製）の等モル混合物１０ｇを水５０ｍｌと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１７ｇに溶解し、無水コハク酸（ナカライテスク製）８．８ｇと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１７ｇを加え、２０℃〜４０℃で撹拌しながら反応させた。反応液を塩酸（ナカライテスク製）で中和後、酢酸エチル（ナカライテスク製）で抽出し、濃縮した。ヘキサンで乾燥させて晶析し、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−バリンの白色粉末を１５ｇ得た。
（３）Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−セリン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−チロシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−４−ブロモフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−３，４−ジクロロフェニルアラニンの合成
これらのＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸は、（２）のＮ−サクシニル−ＤＬ−バリンの合成方法に準じた方法で合成した。
Ｎ−サクシニルラセマーゼの調製
（１）特開２００８−６１６４２号公報に記載のＮ−サクシニルラセマーゼの調製
ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌株をＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管；１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１白金耳植菌し、５０℃にて一晩振とう培養した。この菌体１ｍｌ分から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により菌体を回収した。回収した菌体よりＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｇｅｎｏｍｅ−キット（東洋紡製）を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体ＤＮＡを抽出した。１ｍｌの菌体より約２０μｇの染色体ＤＮＡを取得した。
次に、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３株由来のＮ−サクシニルラセマーゼ遺伝子（配列番号３）を、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプライマーは、５’プライマー（５’−ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＴＧＧ ＣＧＡ ＴＣＡ ＡＣＡ ＴＣＧ ＡＧＴ ＡＣ−３’（配列番号：４））および３’プライマー（５’−ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＴＡ ＴＧＣ ＣＧＴ ＣＧＣ ＣＧＴ ＡＣＧ ＡＴＧ ＡＡＡ−３’（配列番号：５））を用いた。これらのＰＣＲプライマーおよびＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）を用いて、上記の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・９０秒を３０サイクル）を行った。
次に、クローニングキットＴａｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、得られた遺伝子をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、組換え発現プラスミドｐＢＳＮＡＲ１を取得した。このｐＢＳＮＡＲ１を用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、形質転換体を取得した。この得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＢＳＮＡＲ１）と命名した。
ＴＢ培地（５００ｍｌ）を２Ｌ容坂口フラスコ２個に分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｇ／ｍｌと０．１ｍＭになるように添加した。この培地に、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＢＳＮＡＲ１）の培養液を５ｍｌ接種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５０℃、１時間の熱処理後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行った。更にＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、およびオクチルセファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。
（１）特開２００８−６１６４２号公報に記載のＮ−サクシニルラセマーゼの調製
ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌株をＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管；１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１白金耳植菌し、５０℃にて一晩振とう培養した。この菌体１ｍｌ分から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により菌体を回収した。回収した菌体よりＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｇｅｎｏｍｅ−キット（東洋紡製）を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体ＤＮＡを抽出した。１ｍｌの菌体より約２０μｇの染色体ＤＮＡを取得した。
次に、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３株由来のＮ−サクシニルラセマーゼ遺伝子（配列番号３）を、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプライマーは、５’プライマー（５’−ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＴＧＧ ＣＧＡ ＴＣＡ ＡＣＡ ＴＣＧ ＡＧＴ ＡＣ−３’（配列番号：４））および３’プライマー（５’−ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＴＡ ＴＧＣ ＣＧＴ ＣＧＣ ＣＧＴ ＡＣＧ ＡＴＧ ＡＡＡ−３’（配列番号：５））を用いた。これらのＰＣＲプライマーおよびＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）を用いて、上記の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・９０秒を３０サイクル）を行った。
次に、クローニングキットＴａｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、得られた遺伝子をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、組換え発現プラスミドｐＢＳＮＡＲ１を取得した。このｐＢＳＮＡＲ１を用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、形質転換体を取得した。この得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＢＳＮＡＲ１）と命名した。
ＴＢ培地（５００ｍｌ）を２Ｌ容坂口フラスコ２個に分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｇ／ｍｌと０．１ｍＭになるように添加した。この培地に、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＢＳＮＡＲ１）の培養液を５ｍｌ接種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５０℃、１時間の熱処理後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行った。更にＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、およびオクチルセファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。
（２）特開２００７−８２５３４号公報に記載のＮ−サクシニルラセマーゼの調製
クロロフレクサス・オーランティアカス由来のＮ−サクシニルラセマーゼ（以下、ＮＡＡＡＲ）遺伝子（配列番号６）を、この配列の上流と下流にそれぞれＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩサイトを付加し、細胞工学別冊「植物のＰＣＲ実験プロトコール」（ｐ８４−８９，秀潤社刊）に記載の方法で人工的に合成した。ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳＮ＋にクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣＦＮＡＲを取得した。このｐＣＦＮＡＲを用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、形質転換体を取得した。得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（ｐＣＦＮＡＲ）と命名した。
ＴＢ培地（５００ｍｌ）を２Ｌ容坂口フラスコ２個に分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｇ／ｍｌと０．１ｍＭになるように添加した。この培地にアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＤＨ５α（ｐＣＦＮＡＲ）の培養液を５ｍｌ接種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行った。更にＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）のカラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。
クロロフレクサス・オーランティアカス由来のＮ−サクシニルラセマーゼ（以下、ＮＡＡＡＲ）遺伝子（配列番号６）を、この配列の上流と下流にそれぞれＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩサイトを付加し、細胞工学別冊「植物のＰＣＲ実験プロトコール」（ｐ８４−８９，秀潤社刊）に記載の方法で人工的に合成した。ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳＮ＋にクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣＦＮＡＲを取得した。このｐＣＦＮＡＲを用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、形質転換体を取得した。得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（ｐＣＦＮＡＲ）と命名した。
ＴＢ培地（５００ｍｌ）を２Ｌ容坂口フラスコ２個に分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｇ／ｍｌと０．１ｍＭになるように添加した。この培地にアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＤＨ５α（ｐＣＦＮＡＲ）の培養液を５ｍｌ接種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行った。更にＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）のカラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。
実施例１ 本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの調製
ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＩＦＯ１２９８３の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌株をＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管；１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１白金耳植菌し、５０℃にて一晩振とう培養した。この菌体１ｍｌ分から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により菌体を回収した。回収した菌体よりＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｇｅｎｏｍｅ−キット（東洋紡製）を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体ＤＮＡを抽出した。１ｍｌの菌体より約２０μｇの染色体ＤＮＡを取得した。
次に、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＩＦＯ１２９８３株由来のＬ−サクシニルアミノアシラーゼ遺伝子（配列番号１）を、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプライマーは、５’プライマー（５’−ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＴＧＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＴＡ ＴＴＣ ＡＧＣ ＡＧＡ ＴＧＡ ＡＡＧ Ｃ−３’（配列番号：７））および３’プライマー（５’−ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＡ ＡＴＧ ＡＴＴ ＴＧＣ ＡＧＣ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＣＧ−３’（配列番号：８））を用いた。これらのＰＣＲプライマー、およびＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）を用いて、上記の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・９０秒を３０サイクル）を行った。
次に、クローニングキット（Ｔａｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ（登録商標）−Ｐｌｕｓ−、東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、得られたベクターをベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、組換え発現プラスミドｐＬＳＡ２を取得した。このｐＬＳＡ２を用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、形質転換体を取得した。得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＬＳＡ２）と命名した。
ＴＢ培地（５００ｍｌ）を２Ｌ容坂口フラスコ２個に分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｇ／ｍｌと０．１ｍＭになるように添加した。この培地に、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＬＳＡ２）の培養液を５ｍｌ接種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５０℃、１時間の熱処理後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行った。さらにＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、およびオクチルセファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、単一であることが確認された。
ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＩＦＯ１２９８３の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌株をＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管；１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１白金耳植菌し、５０℃にて一晩振とう培養した。この菌体１ｍｌ分から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により菌体を回収した。回収した菌体よりＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｇｅｎｏｍｅ−キット（東洋紡製）を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体ＤＮＡを抽出した。１ｍｌの菌体より約２０μｇの染色体ＤＮＡを取得した。
次に、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＩＦＯ１２９８３株由来のＬ−サクシニルアミノアシラーゼ遺伝子（配列番号１）を、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプライマーは、５’プライマー（５’−ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＴＧＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＴＡ ＴＴＣ ＡＧＣ ＡＧＡ ＴＧＡ ＡＡＧ Ｃ−３’（配列番号：７））および３’プライマー（５’−ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＡ ＡＴＧ ＡＴＴ ＴＧＣ ＡＧＣ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＣＧ−３’（配列番号：８））を用いた。これらのＰＣＲプライマー、およびＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）を用いて、上記の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・９０秒を３０サイクル）を行った。
次に、クローニングキット（Ｔａｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ（登録商標）−Ｐｌｕｓ−、東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、得られたベクターをベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、組換え発現プラスミドｐＬＳＡ２を取得した。このｐＬＳＡ２を用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、形質転換体を取得した。得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＬＳＡ２）と命名した。
ＴＢ培地（５００ｍｌ）を２Ｌ容坂口フラスコ２個に分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｇ／ｍｌと０．１ｍＭになるように添加した。この培地に、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＬＳＡ２）の培養液を５ｍｌ接種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５０℃、１時間の熱処理後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行った。さらにＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、およびオクチルセファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、単一であることが確認された。
実施例２ 本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼを用いたＮ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成
上記の（１）で合成したＮ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンを蒸留水に溶解させ、０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ナカライテスク製）で、ｐＨ調整を行い、５重量％ Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシン溶液（ｐＨ７〜８）を調製した。この溶液１０ｍｌに、０．５ｍＭ（終濃度）ＣｏＣｌ２と５．８ｍｇ／ｍｌの実施例１で調製したＬ−サクシニルアミノアシラーゼの溶液を０．５ｍｌ添加し、反応液（ｐＨ ７〜８）を調製した。この反応液を撹拌しながら５７℃で１４４時間保持した。反応開始の２４時間後、４８時間後、７２時間後、および１４４時間後にサンプルを採取し、以下の条件でＨＰＬＣ測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成を確認した。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（粒径５μｍ、内４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）ＧＬサイエンス（株）製
溶離液：ｐＨ２．３リン酸水溶液／ＨＰＬＣ用アセトニトリル＝８０：２０
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ カラム温度：４０℃ 検出器：２１０ｎｍ
上記の（１）で合成したＮ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンを蒸留水に溶解させ、０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ナカライテスク製）で、ｐＨ調整を行い、５重量％ Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシン溶液（ｐＨ７〜８）を調製した。この溶液１０ｍｌに、０．５ｍＭ（終濃度）ＣｏＣｌ２と５．８ｍｇ／ｍｌの実施例１で調製したＬ−サクシニルアミノアシラーゼの溶液を０．５ｍｌ添加し、反応液（ｐＨ ７〜８）を調製した。この反応液を撹拌しながら５７℃で１４４時間保持した。反応開始の２４時間後、４８時間後、７２時間後、および１４４時間後にサンプルを採取し、以下の条件でＨＰＬＣ測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成を確認した。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（粒径５μｍ、内４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）ＧＬサイエンス（株）製
溶離液：ｐＨ２．３リン酸水溶液／ＨＰＬＣ用アセトニトリル＝８０：２０
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ カラム温度：４０℃ 検出器：２１０ｎｍ
ＨＰＬＣ測定の結果を図１に示す。図１からわかるように、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからＬ−ターシャリーロイシンを短期間で、理論上の最高収率である５０％にほぼ等しい収率（以下、「変換率」ということがある）で合成することができた。
実施例３ 本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼを用いたＮ−サクシニル−ＤＬ−バリン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−セリン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−チロシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシンからの対応する各Ｌ−アミノ酸の合成
Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンの代わりに上記の（２）および（３）で合成したＮ−サクシニル−ＤＬ−バリン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−セリン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−チロシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシンを使用して、実施例２と同様の条件で反応を９６時間行った。ただし、各Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸の濃度は１０重量％にした。反応終了後、サンプルを採取して実施例２と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−バリン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−セリン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−チロシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシンに対応する各Ｌ−アミノ酸への変換率を算出した。
Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンの代わりに上記の（２）および（３）で合成したＮ−サクシニル−ＤＬ−バリン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−セリン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−チロシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシンを使用して、実施例２と同様の条件で反応を９６時間行った。ただし、各Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸の濃度は１０重量％にした。反応終了後、サンプルを採取して実施例２と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−バリン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−セリン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−チロシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシンに対応する各Ｌ−アミノ酸への変換率を算出した。
結果を、表１に示す。表１からわかるように、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−バリン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−セリン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−チロシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシンから対応する各Ｌ−アミノ酸を短期間で、効率良く合成できた。特に、非天然アミノ酸のＬ−シクロへキシルグリシンについては、短期間で、理論上の最高収率である５０％にほぼ等しい収率で合成することができた。
実施例４ 本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼおよびＮ−サクシニルラセマーゼを用いたＮ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成（ｉ）
Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシン溶液の濃度を１重量％にし、上記の（１）で調製した９．６ｍｇ／ｍｌのＮ−サクシニルラセマーゼ０．１ｍｌを反応液に添加しておいたことを除いては、実施例２と同様の条件で反応を９０時間行った。反応終了後、サンプルを採取して実施例２と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、Ｌ−ターシャリーロイシンの収率を算出したところ、収率は９０％以上であり、理論上の最高収率である１００％に近い値が得られた。
Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシン溶液の濃度を１重量％にし、上記の（１）で調製した９．６ｍｇ／ｍｌのＮ−サクシニルラセマーゼ０．１ｍｌを反応液に添加しておいたことを除いては、実施例２と同様の条件で反応を９０時間行った。反応終了後、サンプルを採取して実施例２と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、Ｌ−ターシャリーロイシンの収率を算出したところ、収率は９０％以上であり、理論上の最高収率である１００％に近い値が得られた。
実施例５ 本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼおよびＮ−サクシニルラセマーゼを用いたＮ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成（ｉｉ）
Ｎ−サクシニルラセマーゼとして上記の（２）で調製したものを使用したことを除いては、実施例４と同様にして反応を１２０時間行い、反応開始の２４時間後、４８時間後、および１２０時間後にサンプルを採取して実施例２と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成を確認した。
Ｎ−サクシニルラセマーゼとして上記の（２）で調製したものを使用したことを除いては、実施例４と同様にして反応を１２０時間行い、反応開始の２４時間後、４８時間後、および１２０時間後にサンプルを採取して実施例２と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成を確認した。
ＨＰＬＣ測定の結果を図２に示す。図２からわかるように、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼとＮ−サクシニルラセマーゼを併用することにより、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンのほぼすべて（収率９０％以上）をＬ−ターシャリーロイシンに変換できた。
実施例６ 本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼと特許文献３に記載のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの酵素活性の比較試験（ｉ）
上記の（１）で合成したＮ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンを蒸留水に溶解させ、０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ナカライテスク製）で、ｐＨ調整を行い、５重量％ Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシン溶液（ｐＨ７〜８）を調製した。この溶液１０ｍｌに、０．５ｍＭ（終濃度）ＣｏＣｌ２と、１０ｍｇ／ｍｌに調製した上記の（２）のＮ−サクシニルラセマーゼ０．１ｍｌを添加した。得られた溶液に、２．５ｍｇ／ｍｌに調製した特許文献３の実施例１に記載のＬ−サクシニルアミノアシラーゼ、または２．５ｍｇ／ｍｌに調製した上記実施例１で得られた本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの溶液を０．１ｍｌ添加した。得られた反応液を撹拌しながら５０℃で１４４時間保持した。反応開始の２４時間後、４８時間後、７２時間後、および１４４時間後にサンプルを採取し、ＨＰＬＣ測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成を確認した。
上記の（１）で合成したＮ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンを蒸留水に溶解させ、０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ナカライテスク製）で、ｐＨ調整を行い、５重量％ Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシン溶液（ｐＨ７〜８）を調製した。この溶液１０ｍｌに、０．５ｍＭ（終濃度）ＣｏＣｌ２と、１０ｍｇ／ｍｌに調製した上記の（２）のＮ−サクシニルラセマーゼ０．１ｍｌを添加した。得られた溶液に、２．５ｍｇ／ｍｌに調製した特許文献３の実施例１に記載のＬ−サクシニルアミノアシラーゼ、または２．５ｍｇ／ｍｌに調製した上記実施例１で得られた本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの溶液を０．１ｍｌ添加した。得られた反応液を撹拌しながら５０℃で１４４時間保持した。反応開始の２４時間後、４８時間後、７２時間後、および１４４時間後にサンプルを採取し、ＨＰＬＣ測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成を確認した。
ＨＰＬＣ測定の結果を図３に示す。図３からわかるように、特許文献３に記載のＬ−サクシニルアミノアシラーゼと比較して、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからＬ−ターシャリーロイシンへの変換率が顕著に高く、反応性が有意に向上していた。この結果から、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを基質として効率的に利用することができることが明らかである。
実施例７ 本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼと特許文献３に記載のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの酵素活性の比較試験（ｉｉ）
上記の（３）で合成したＮ−サクシニル−ＤＬ−４−ブロモフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−３，４−ジクロロフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンを使用し、それぞれ１０重量％のアミノ酸溶液（ｐＨ７．５）を調製した。０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）緩衝液０．２５ｍｌ、０．１Ｍ酢酸コバルト溶液０．０２５ｍｌ、各アミノ酸溶液０．５ｍｌ、蒸留水４．２ｍｌを混合物した溶液に、５ｍｇ／ｍｌに調製した特許文献３の実施例１に記載のＬ−サクシニルアミノアシラーゼ、または５ｍｇ／ｍｌに調製した上記実施例１で得られた本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの溶液を０．０２５ｍｌ添加した。得られた反応液を、５０℃で撹拌しながら４時間反応を行った。反応終了後、サンプルを採取して実施例２と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−４−ブロモフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−３，４−ジクロロフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンに対応する各Ｌ−アミノ酸への変換率を算出した。
上記の（３）で合成したＮ−サクシニル−ＤＬ−４−ブロモフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−３，４−ジクロロフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンを使用し、それぞれ１０重量％のアミノ酸溶液（ｐＨ７．５）を調製した。０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）緩衝液０．２５ｍｌ、０．１Ｍ酢酸コバルト溶液０．０２５ｍｌ、各アミノ酸溶液０．５ｍｌ、蒸留水４．２ｍｌを混合物した溶液に、５ｍｇ／ｍｌに調製した特許文献３の実施例１に記載のＬ−サクシニルアミノアシラーゼ、または５ｍｇ／ｍｌに調製した上記実施例１で得られた本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの溶液を０．０２５ｍｌ添加した。得られた反応液を、５０℃で撹拌しながら４時間反応を行った。反応終了後、サンプルを採取して実施例２と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−４−ブロモフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−３，４−ジクロロフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンに対応する各Ｌ−アミノ酸への変換率を算出した。
結果を、表２に示す。表２からわかるように、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−４−ブロモフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−３，４−ジクロロフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンのいずれからも対応する各Ｌ−アミノ酸を高変換率で合成できる。これに対して、特許文献３に記載のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−４−ブロモフェニルアラニン及びＮ−サクシニル−ＤＬ−３，４−ジクロロフェニルアラニンについては、対応する各Ｌ−アミノ酸を高変換率で合成できるものの、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンについては、変換率がかなり低い。この結果から、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、特許文献３に記載のＬ−サクシニルアミノアシラーゼが基質として効率良く利用できない非天然アミノ酸も効率良く利用できることが明らかである。
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、Ｌ−ターシャリーロイシンやＬ−ビフェニルアラニン、Ｌ−シクロヘキシルグリシン、Ｌ−ジクロロフェニルアラニン、Ｌ−ブロモフェニルアラニンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸および天然アミノ酸を効率良く製造できるので、医薬品、農薬、食品などの中間体や原料として有用なＬ−アミノ酸を製造するために広く利用できる。
配列番号４，５，７，８は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号６は、大腸菌株Ｋ−１２中で効率的に発現されるように設計されたＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡの配列である。
配列番号６は、大腸菌株Ｋ−１２中で効率的に発現されるように設計されたＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡの配列である。
Claims (5)
- 下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されるタンパク質を用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸中のＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程を含むことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子によってコードされ、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。 - Ｎ−サクシニルラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を生成させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されるタンパク質を用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸中のＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程、およびＮ−サクシニルラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を生成させる工程が同時に行なわれることを特徴とする請求項２に記載の方法：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子によってコードされ、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。 - Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸が、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ジクロロフェニルアラニン、またはＮ−サクシニル−ＤＬ−ブロモフェニルアラニンであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸が、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン、またはＮ−サクシニル−ＤＬ−シクロヘキシルグリシンであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
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