JP5240974B2 - 木材製品の管理方法およびプライマーセット - Google Patents

Description

本発明は、木材製品の管理方法およびプライマーセットに関する。更に詳細には、木材製品のＤＮＡ個体識別をマイクロサテライト領域に基いて行うことにより、その木材製品の原材料となった木の出所を同定しその履歴を管理する木材製品の管理方法、およびマイクロサテライト領域をＰＣＲ法により増幅するために用いることができるプライマーセットに関する。

木材製品の原材料として天然林や人工林から大量の木が伐り出されているが、生物多様性の保護の観点から天然林の伐採は避けるべきである。また地球温暖化の観点からも、植林と伐採のサイクルを繰り返す持続的な管理がなされた人工林の構築が望まれている。２１世紀は環境の時代と呼ばれ、無秩序に伐採された天然林産の木材よりも、持続的な管理のなされた人工林産の木材の方が消費者に受け入れられ易い状況であると考えられる。しかし、これまで製品まで加工された木材の履歴を厳密に明らかにする方法はなかった。
苗から丸太、製品までの履歴をたどる場合には以下の方法が考えられる。林地において伐採する際、植栽時の記録を参照して丸太にペンキや焼印、ＩＣチップなどの方法で個体を識別する印を付け、林地から工場までの過程で適宜、記録をつける。工場ではその記録を引き継ぎ、加工後の製品に対して印刷、シール、焼印、ＩＣチップなどの方法で印を付ける。しかし合板や机、椅子などの複数の木材からなる製品の場合、部位ごとに印を付けることは現実的とは言い難い。また故意や過失による印の付け間違いや、丸太の樹皮の脱落などにより印が失われてしまう可能性は否定できない。

このように従来の技術では、履歴の正確性という点で満足とは言えず、製品に産地や個体の情報が付いていても必ずしもその製品の情報とは言えない為、消費者はそのデータを公表している企業を信頼するしかないというのが実情である。従って人工林産の木材または認証材と謳っても訴求力があるとは言い難い。
非特許文献１に記載のように、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）分析によるＤＮＡ個体識別法を使ったスギ丸太のクローン識別が試みられているが、伐採後１ヶ月以内で樹皮が付いたものに限定されており、加工後の木材製品の識別には至っていない。
２００５年、木材の育種「特別号」、２７−２９頁、「スギ流通丸太を対象としたクローン識別の試み」

本発明の課題は、木材製品の個体識別を行うことによって原材料の履歴を消費者に開示し、訴求力のある木材製品の管理方法を提供することにある。更には、このような木材製品の管理方法に用いることができるマイクロサテライト領域をＰＣＲ法により増幅するためのプライマーセットを提供することにある。

本発明者らは前記状況にかんがみ、丸太や加工後の木材製品の個体識別法について鋭意研究を重ねた結果、樹木の苗または立木の葉からＤＮＡ抽出して遺伝型、具体的には、マイクロサテライト領域を把握しておき、伐採後の丸太や加工後の木材製品からＤＮＡ抽出して遺伝型、すなわち、マイクロサテライト領域を比較することよって個体識別を行い、木材製品の出所、履歴を同定して管理できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、木材製品のＤＮＡ個体識別をマイクロサテライト領域に基いて行うことにより、その木材製品の原材料となった木の出所を同定してその履歴を管理する木材製品の管理方法に関する。
更に、本発明は、マイクロサテライト領域を増幅するためのプライマーセットであって、以下の２１種類から選ばれるプライマーセットに関する：
配列番号１または２で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号４または５で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号６で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号７または８で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号１０または１１で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号１３または１４で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号１５で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号１６または１７で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号１８で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号１９または２０で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号２１で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号２２または２３で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号２４で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号２５または２６で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号２７で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号２８または２９で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号３０で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号３１または３２で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号３３で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号３４または３５で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号３６で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号３７または３８で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号３９で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号４０または４１で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号４２で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号４３または４４で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号４５で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号４６または４７で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号４８で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号４９または５０で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号５１で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号５２または５３で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号５４で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号５５または５６で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号５７で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号５８または５９で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号６０で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；および
配列番号６１または６２で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号６３で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット。

以下に詳細に説明するように、本発明の木材製品の原材料の出所、履歴を管理する方法は、植物個体の固有の生物学的情報を用いてその出所、履歴を同定し管理するために、従来起こりえた詐称や過失による表示間違えを完全になくすことができ、消費者がその木材製品の原材料となった木材が天然林由来なのか、あるいは人工林（認証林を含む）由来なのか選択して購入することが出来る。その結果として、人工林産由来の木材が優先的に利用され、天然林の違法伐採が減少することによって生物多様性が守られる。
また、本発明によれば、丸太はもとより、合板やＬＶＬ、ブロックボードといった加工された木材製品においても個体識別が可能である。ヒノキを例にすれば、約８０年生の木の樹皮から５０年前までの組織から個体識別が可能である。
また合板、ＬＶＬ、ブッロクボードなどの製造時において２３０℃まで加熱して製造されたものであっても製造時の熱により識別不能とはなりえない。

本発明木材製品の管理方法においては、木材製品のＤＮＡ個体識別をマイクロサテライト領域に基いて行い、その木材製品の原材料となった木の出所を同定してその履歴を管理する。
マイクロサテライト領域は、植物のゲノム中に存在する、シトシンとアデニン、チミンとグアニンなどの数塩基からなるモチーフの繰り返し配列であり、高頻度で広く分布することが知られたＤＮＡ領域である。マイクロサテライト領域を増幅するように設計されたＰＣＲマーカーの多くは、多型性が抜きん出て高くしかも共優性であることから、精密な遺伝子解析に適しており、近年、育種学、集団遺伝学などの分野に重用されている。従って、木材製品からＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡを鋳型とし、マイクロサテライト領域を含むマイクロサテライトマーカーをＰＣＲによって増幅し、増幅されたマイクロサテライトマーカーの塩基長によって木材製品の個体識別が可能となる。
マイクロサテライトマーカーは、植物のゲノム中に存在するマイクロサテライト領域に隣接する両端の塩基配列を、ｄｕａｌ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ−ＰＣＲ法（練春蘭ら、日林誌８６（２），１９１−１９８，２００４；Ｃｈｕｎｌａｎ Ｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１４，３８１−３８６，２００１；Ｃｈｕｎｌａｎ Ｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｃｏｌｏｇｙ Ｎｏｔｅｓ ２，２１１−２１３，２００２）により特定することができる。このようにして特定されたマイクロサテライトマーカーにより、ＰＣＲによって増幅するためのプライマーセットを設計することができる。

以後の実施例１の表１に記載されているように、本発明により、クマツヅラ科グメリナ属グメリナ（Ｇｍｅｌｉｎａ ａｒｂｏｒｅａ Ｒｏｘｂ．）、パンヤ科パンヤノキ属ランドウ（Ｃｅｉｂａ ｐｅｎｔａｎｄｒａ）およびマツ科マツ属ラジアータパイン（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）のマイクロサテライト領域を同定、識別するためのプライマーセットが新たに見出された。具体的には、グメリナ用プライマーセットとしては、以下のものが挙げられる。
配列番号１または２で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号４または５で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号６で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号７または８で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号１０または１１で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号１３または１４で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号１５で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号１６または１７で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号１８で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号１９または２０で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号２１で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；および
配列番号２２または２３で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号２４で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット。

ランドウ用プライマーセットとしては、以下のものが挙げられる。
配列番号２５または２６で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号２７で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号２８または２９で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号３０で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号３１または３２で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号３３で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号３４または３５で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号３６で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号３７または３８で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号３９で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号４０または４１で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号４２で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；および
配列番号４３または４４で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号４５で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット。

ラージアパタイン用プライマーセットとしては、以下のものが挙げられる。
配列番号４６または４７で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号４８で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号４９または５０で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号５１で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号５２または５３で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号５４で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号５５または５６で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号５７で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；
配列番号５８または５９で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号６０で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット；および
配列番号６１または６２で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体と、配列番号６３で示される塩基配列を有するプライマーまたはその変異体とからなるプライマーセット。

上記のプライマーセットにおいて、変異体とは、それぞれのプライマーの各配列番号に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するものを指す。ここでいうストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、ＰＣＲ法による増幅における、２本鎖ＤＮＡの変性後のアニーリングの工程で、アニーリングと同様の条件下で、各配列番号に示す塩基配列に相補的な塩基配列とハイブリダイズすることを指す。このようなアニーリングと同様の条件としては、例えば、通常のＰＣＲ反応用緩衝液中で、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）およびＤＮＡポリメラーゼと混合し、混合物を、例えば４３℃から６８℃の温度で反応させる条件が挙げられる。より具体的には、以後の実施例１において採用されるＰＣＲにおけるアニーリング条件が挙げられる。また、同様にプライマーとしての機能を有するとは、ＰＣＲによる、同一個体からのゲノムＤＮＡの増幅において、プライマーとして使用した場合に、同様に、マイクロサテライト領域を増幅できることを指す。

本発明においては、上記のプライマーセット以外にも、既に公知のプライマーセットを使用できることは言うまでもない。このような公知のプライマーセットとしては、例えば、以後に記載する実施例１の表２に示されているように、スギ科スギ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）スギ用のプライマーセット（Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ Ｙ．，Ｉｗａｔａ Ｈ．，Ｕｊｉｎｏ−Ｉｈａｒａ Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｋ．，Ｔａｉｒａ Ｈ．，Ｔｓｕｍｕｒａ Ｙ．（２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｄ．Ｄｏｎ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０６：７５１−７５８）ヒノキ科ヒノキ属（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｏｂｔｕｓａ）ヒノキ用のプライマーセット（Ｎａｋａｏ Ｙ．，Ｉｗａｔａ Ｈ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｙ．，Ｔｓｕｍｕｒａ Ｙ．，Ｔｏｍａｒｕ Ｎ．（２００１）Ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｏｂｔｕｓａ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｆｏｒ．Ｒｅｓ．３１：２２４８−２２５１）を挙げることができる。また、特開２００６−１４１３６８号公報の記載されるモルッカネム用のプライマーセットを挙げることもできる。

上記したプライマーセットを用いて、木材製品から抽出したＤＮＡを鋳型とし、マイクロサテライト領域を含むマイクロサテライトマーカーをＰＣＲによって増幅し、増幅されたマイクロサテライトマーカーの塩基長によって木材製品の個体識別ができる。木材製品からのＤＮＡ抽出は、ＣＴＡＢ法やＳＤＳ法などの定法により行うことができる、また、ＰＣＲ反応後の増幅したＤＮＡの断片長の解析は、ＤＮＡシークエンサーを用いたキャピラリー電気泳動や、ガラス板を用いたポリアクリルアミド電気泳動、マススペクトル法等によって行うことが出来る。キャピラリー電気泳動の場合には、プライマーの片側を蛍光標識して蛍光検出器で検出すればよく、ガラス板を用いたポリアクリルアミド電気泳動の場合には、エチジウムブロマイドや銀染色等の定法を用いて検出することが出来る。

以上に詳述したようにして、木材製品のＤＮＡ個体識別をマイクロサテライト領域に基いて行うことにより、その木材製品の原材料となった木の出所を同定してその履歴を管理することができる。ここで、例えば、当該木材製品の原材料となった木の苗や葉などからＤＮＡを抽出して、上記した方法により、そのマイクロサテライト領域を予め同定しておき、この同定データと、木材製品からのＤＮＡから同定したマイクロサテライト領域を照合することにより、木材製品の原材料となった木の出所を同定し管理することができる。このようにすれば、木材製品の原材料となった木の苗を同定して苗の植えられた林地を同定してその履歴を管理することもできる。
本発明では、木材製品としては、特に制限されず、いずれの木材製品も対象とすることができる。木材製品としては、例えば、丸太、合板、ＬＶＬ（単板積層材）、ブロックボード、パーティクルボードなどが挙げられる。
また、木材製品の原材料としては、針葉樹または広葉樹が好ましいものとして挙げられ、具体的には、グメリナ種、ランドウ種、ラジアータパイン種、モルッカネム種に属する植物、ヒノキ、スギなどが挙げられる。

本発明の方法においては、木材製品の原材料が樹齢８０年までの針葉樹や広葉樹の樹木の場合でも、その出所を同定することができる。より具体的には、例えば、以後の実施例１に示されているように、木材製品の原材料が樹齢４０年までのヒノキの場合に、その出所を同定し管理することができる。また、例えば、樹齢３０年までのスギ、樹齢１５年までのラジアータ、樹齢１２年までのランドウ、樹齢１０年までのメリナ、樹齢７年までのファルカタの場合にも、その出所を同定して管理することができる。
更には、本発明の方法では、以後の実施例１において明らかにされているように、木材製品が、例えば、２３０℃程度に高温処理して得られたものでも、その出所を同定して管理することができる。

以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明は以下の実施例によってなんら限定されるものではなく、本発明の属する技術分野における通常の変更を加えて実施することが出来ることは言うまでもない。
実施例１
１、個体識別用ＤＮＡマーカー（マイクロサテライトマーカー）の作製
グメリナ（Ｇｍｅｌｉｎａ ａｒｂｏｒｅａ）、ランドウ（Ｃｅｉｂａ ｐｅｎｔａｎｄｒａ）、ラジアータパイン（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）のゲノム中に存在するマイクロサテライト領域に隣接する両端の塩基配列を、ｄｕａｌ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ−ＰＣＲ 法（練春蘭ら、日林誌８６（２），１９１−１９８，２００４；Ｃｈｕｎｌａｎ Ｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１４，３８１−３８６，２００１；Ｃｈｕｎｌａｎ Ｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｃｏｌｏｇｙ Ｎｏｔｅｓ ２，２１１−２１３，２００２）に従って特定し、その塩基配列を基にプライマーセットを設計した。プライマー配列については表１に示した。これらのセットは、それぞれグメリナ種、ランドウ種、ラジアータパイン種に属する植物のゲノム中のマイクロサテライト領域をＰＣＲにより増幅するためのプライマーセットとなるものである。

表１中、ＧＡはグメリナ（Ｇｍｅｌｉｎａ ａｒｂｏｒｅａ）を、ＣＰはランドウ（Ｃｅｉｂａ ｐｅｎｔａｎｄｒａ）を、ＲＰはラジアータパイン（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）を示す。

２、木材からのＤＮＡ抽出
ヒノキの板、スギ合板、加熱プレスしたグメリナの単板、ランドウのブロックボード、ラジアータパインのＬＶＬ（単板積層材）をそれぞれヤスリで削り、粉末とした。粉末０．５ｇに対して４ｍｌのＣＴＡＢ溶液（２Ｗ／Ｖ％臭化セチルトリメチルアンモニウム、１．４Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｖ／Ｖ％ ２−メルカプトエタノール）を加え、６５℃で１時間加温した。ついで、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）混液を添加し、ゆっくりと混和してから遠心（１５，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、１８℃）して上清を回収し、この上清に等量のイソプロピルアルコールを加えて混和し、−３０℃で１０分間静置することによりＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を析出させた。析出させた混合物は再び遠心（１５，０００ｒｐｍ、７ｍｉｎ、４℃）してペレットとして分離し、これをＴＥ緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））０．１ｍｌに溶解して１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼ（和光純薬（株）製）１μｌを加え、３７℃で３０分間加温してＲＮＡを分解させた後、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）混液を添加し、ゆっくりと混和してから遠心（１５，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、１８℃）して上清を回収し、この上清に２倍量の１００％エタノールと、１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えて混和し、−３０℃で１０分間静置することによりＤＮＡを析出させた。析出させた混合物は再び遠心（１５，０００ｒｐｍ、７ｍｉｎ、４℃）して得られたペレットに１００μｌのＴＥ緩衝液を加えて溶解し、以後の操作に供した。

３．ＰＣＲ反応によるマイクロサテライト領域の増幅
抽出したＤＮＡを鋳型として、表１または表２に示すプライマーセットを用いて、ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（（株）キアゲン製）によりＰＣＲ反応を行った。即ち、１μｌのＤＮＡ溶液に、２×ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを５μｌ、２μＭの表１に示すフォワードプライマー１か２のいずれか１μｌと、あるいは表２のフォワードプライマーの１μｌと、２μＭの蛍光標識された表１または表２に示すリバースプライマーを１μｌ加え、滅菌蒸留水で全液量を１０μｌとした。これを以下の条件で反応した。

ステップ１：９５℃ １５分 １サイクル
ステップ２：９４℃ ３０秒→５７℃ ９０秒→７２℃ ６０秒 ４０サイクル
ステップ３：６０℃ ３０分 １サイクル

ＰＣＲ 産物は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（株）製）を用いて解析した。

表２中、Ｃｊｇはスギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、Ｃｏはヒノキ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｏｂｔｕｓｅ）を示す。それぞれＭｏｒｉｇｕｃｈｉ Ｙ．，Ｉｗａｔａ Ｈ．，Ｕｊｉｎｏ−Ｉｈａｒａ Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｋ．，Ｔａｉｒａ Ｈ．，Ｔｓｕｍｕｒａ Ｙ．（２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｄ．Ｄｏｎ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０６：７５１−７５８ およびＮａｋａｏ Ｙ．，Ｉｗａｔａ Ｈ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｙ．，Ｔｓｕｍｕｒａ Ｙ．，Ｔｏｍａｒｕ Ｎ．（２００１）Ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｏｂｔｕｓａ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｆｏｒ．Ｒｅｓ．３１：２２４８−２２５１を参考にした。

４．結果
（１）解析結果のいくつかの例を図に示す。図１は実験に用いたヒノキの木材の断面を示す模式図である。図１に示すように、約４０年生のヒノキ板をサンプルとし、中心から樹皮に向かって１０年ごとに、４０−１、４０−２、４０−３および４０−４に示す幅の断面上からそれぞれサンプルを採取し、ＤＮＡを抽出して、配列番号７２および７３のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（株）製）を用いて解析した結果を、それぞれ図３から図６に示した。また、図２に示すように、約８０年生のヒノキ板をサンプルとし、中心から樹皮に向かって１０年ごとに、８０−１、８０−２、８０−３、８０−４、８０−５、８０−６、８０−７および８０−８に示す幅の断面上からそれぞれサンプルを採取し、ＤＮＡを抽出して、プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（株）製）を用いて解析した結果を、それぞれ図７から図１４に示した。図７から１１および図１３は、配列番号７２および７３のプライマーセットを用いた場合の結果を示し、図１２は、配列番号７４および７５のプライマーセットを用いた場合の結果を示し、図１４は、配列番号７８および７９のプライマーセットを用いた場合の結果を示す。
これらの図から得られるヒノキの個体識別の結果を表３にまとめて示す。表３中、○は識別可能、×は識別不能を意味する。

表３から明らかなように、樹齢約４０年のヒノキの場合には、個体識別可能であり、また樹齢約８０年のヒノキでも、その樹皮から約５０年前の組織までは、個体識別可能である。

（２）図１５に示すように、１３０℃、１８０℃および２３０℃でそれぞれ加熱プレスしたグメリナ板の内側および表面からサンプルを採取し、それらのサンプルからＤＮＡを抽出して、プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（株）製）を用いて解析した結果を、図１６から図２１に示した。図１６は、１３０℃で加熱プレスしたグメリナ板の内側からのサンプルを用い、配列番号８および配列番号９をプライマーセットとして用いた場合の結果を、図１７は、１３０℃で加熱プレスしたグメリナ板の表面からのサンプルを用い、配列番号１９および配列番号２１をプライマーセットとして用いた場合の結果を、図１８は、１８０℃で加熱プレスしたグメリナ板の内側からのサンプルを用い、配列番号１９および配列番号２１をプライマーセットとして用いた場合の結果を、図１９は、１８０℃で加熱プレスしたグメリナ板の表面からのサンプルを用い、配列番号１９および配列番号２１をプライマーセットとして用いた場合の結果を、図２０は、２３０℃で加熱プレスしたグメリナ板の内側からのサンプルを用い、配列番号１９および配列番号２１をプライマーセットとして用いた場合の結果を、図２１は、２３０℃で加熱プレスしたグメリナ板の表面のサンプルを用い、配列番号２３および配列番号２４をプライマーセットとして用いた場合の結果を示す。
これらの図から得られるグメリナの個体識別の結果を表４にまとめて示す。表３中、○は識別可能、×は識別不能を意味する。

表４から明らかなように、１３０℃、１８０℃および２３０℃でそれぞれ加熱プレスしたグメリナ板の内側および表面からサンプルした場合に、いずれのサンプルを用いた場合にも、個体識別可能である。

（３）ランドウ ブロックボードのサンプルについて、配列番号３５および配列番号３６のプライマーセットを用いて解析した結果を図２２に、ラジアータイパインＬＶＬのサンプルについて、配列番号４６および配列番号４８のプライマーセットを用いて解析した結果を図２３に、スギ合板のサンプルについて、配列番号７０および７１をプライマーセットを用いて解析した結果を図２４に示す。
これらの図から明らかなように、いずれのサンプルについても、個体識別可能である。

図１は、実施例１で用いた約４０年生のヒノキの木材の断面を示す模図である。 図２は、実施例１で用いた約８０年生のヒノキの木材の断面を示す模図である。 図３は、図１の４０−１に示す幅の断面上からのサンプルについての解析結果を示す。 図４は、図１の４０−２に示す幅の断面上からのサンプルについての解析結果を示す。 図５は、図１の４０−３に示す幅の断面上からのサンプルについての解析結果を示す。 図６は、図１の４０−４に示す幅の断面上からのサンプルについての解析結果を示す。 図７は、図２の８０−１に示す幅の断面上からのサンプルについての解析結果を示す。 図８は、図２の８０−２に示す幅の断面上からのサンプルについての解析結果を示す。 図９は、図２の８０−３に示す幅の断面上からのサンプルについての解析結果を示す。 図１０は、図２の８０−４に示す幅の断面上からのサンプルについての解析結果を示す。 図１１は、図２の８０−５に示す幅の断面上からのサンプルについての解析結果を示す。 図１２は、図２の８０−６に示す幅の断面上からのサンプルについての解析結果を示す。 図１３は、図２の８０−７に示す幅の断面上からのサンプルについての解析結果を示す。 図１４は、図２の８０−８に示す幅の断面上からのサンプルについての解析結果を示す。 図１５は、加熱プレスしたグメリナ板の内側および表面からのサンプル採取の模式図である。 図１６は、１３０℃で加熱プレスしたグメリナ板の内側からのサンプルについての解析結果を示す。 図１７は、１３０℃で加熱プレスしたグメリナ板の表面からのサンプルについての解析結果を示す。 図１８は、１８０℃で加熱プレスしたグメリナ板の内側からのサンプルについての解析結果を示す。 図１９は、１８０℃で加熱プレスしたグメリナ板の表面からのサンプルについての解析結果を示す。 図２０は、２３０℃で加熱プレスしたグメリナ板の内側からのサンプルについての解析結果を示す。 図２１は、２３０℃で加熱プレスしたグメリナ板の表面のサンプルについての解析結果を示す。 図２２は、ランドウ ブロックボードのサンプルについての解析結果を示す。 図２３は、ラジアータイパインＬＶＬのサンプルについての解析結果を示す。 図２４は、スギ合板のサンプルについての解析結果を示す。

Claims (7)

1. 木材製品のＤＮＡ個体識別をマイクロサテライト領域に基いて行うことにより、その木材製品の原材料となった木の出所を同定してその履歴を管理する木材製品の管理方法であって、前記木材製品の原材料となった木の苗を同定してその履歴を管理することを含む、管理方法であって、前記原材料が樹齢５０年までのヒノキ、樹齢３０年までのスギ、樹齢１５年までのラジアータ、樹齢１２年までのランドウ、樹齢１０年までのメリナ、または樹齢７年までのファルカタである、管理方法。
2. 木材製品の原材料となった木の苗を同定して苗の植えられた林地を同定してその履歴を管理する請求項１に記載の管理方法。
3. 木材製品が丸太、合板、ＬＶＬ、ブロックボードまたはパーティクルボードである請求項１または２に記載の管理方法。
4. 木材製品の原材料が針葉樹または広葉樹である請求項１から３のいずれかに記載の管理方法。
5. 木材製品が高温処理して得られたものである請求項１から４のいずれかに記載の管理方法。
6. 木材製品のＤＮＡ個体識別を、マイクロサテライト領域を増幅するためのプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅し、増幅されたＤＮＡの塩基長の相違により行う、請求項１から５のいずれかに記載の管理方法。
7. マイクロサテライト領域を増幅するためのプライマーセットであって、以下の２１種類から選ばれるプライマーセットを用い、木材製品の原材料がヒノキ、スギ、ラジアータ、ランドウ、メリナまたはファルカタである、請求項１〜６のいずれかに記載の管理方法：
   配列番号１または２で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号４または５で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号７または８で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号１０または１１で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号１３または１４で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１５で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号１６または１７で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１８で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号１９または２０で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２１で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号２２または２３で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号２５または２６で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２７で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号２８または２９で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３０で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号３１または３２で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３３で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号３４または３５で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号３７または３８で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３９で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号４０または４１で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号４３または４４で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４５で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号４６または４７で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４８で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号４９または５０で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５１で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号５２または５３で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号５５または５６で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５７で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
   配列番号５８または５９で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号６０で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；および
   配列番号６１または６２で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号６３で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット。