JP5246639B2 - ４−ヒドロキシ−ｌ−イソロイシンの製造法 - Google Patents

Description

本発明は、微生物産業に関し、詳しくは、新規なジオキシゲナーゼ及び4-ヒドロキシ-L-イソロイシン又はその塩の製造法に関する。

4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、コロハ（フェヌグリーク）種子 (Trigonella foenum-graecum L.leguminosae) から抽出、精製できるアミノ酸である。4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、興味深いインスリン分泌性(insulinotropic)活性を示すが、これは、単離潅流ラット膵臓及びヒトの膵島の両者で実証されているように、その促進効果がミディアム中の血漿グルコース濃度に明白に依存するからである (Sauvaire, Y.ら, Diabetes, 47: 206-210, (1998)) 。そのようなグルコース依存性は、２型糖尿病[非インスリン依存性糖尿病、（NIDD) mellitus (NIDDM)]の治療に現在使用されている唯一のインスリン分泌活性薬であるスルホニル尿素(Drucker, D. J., Diabetes 47: 159-169, (1998)) では確認されていない。その結果、低血糖症が依然として、スルホニル尿素治療の通常望ましくない副作用である。(Jackson, J., and Bessler, R. Drugs, 22: 211-245; 295-320, (1981); Jennings, A. ら. Diabetes Care, 12: 203-208, (1989))。またグルコース耐性の改善も知られている。（(Am. J. Physiol. Endocrinol., Vol. 287, E463-E471, 2004) 。このグルコース代謝増強活性とその医薬品と健康食品への応用の可能性が報告された(特開平6-157302号公報；US2007-000463A1)。

植物にのみ発見されている4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、その特別なインスリン分泌性作用のために、様々な程度のインスリン耐性に関連するインスリン分泌不全を特徴とする疾病である２型糖尿病の治療用の可能性を秘めた新規分泌促進剤と見なしてもよい(Broca, C. ら, Am. J. Physiol. 277 (Endocrinol. Metab. 40): E617-E623, (1999))
。

フェヌグリーク抽出液中のジオキシゲナーゼ活性を利用する鉄、アスコルビン酸、２−オキシグルタル酸、酸素に依存するイソロイシンの酸化法が4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造法として、報告されている(Phytochemistry, Vol. 44, No. 4, pp. 563-566, 1997) 。しかし、この方法は、20mM以上のイソロイシン濃度で酵素活性が基質で阻害され、この酵素が同定されていなく、酵素は植物の抽出液から誘導され、たやすく大量に得られなく、かつ、この酵素が安定でないために、4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造法として不充分である。

光学的に純粋な(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-Ｌ-イソロイシンが全収率39%で得られる効率的な8工程合成が開示されている。この合成の重要な工程は、エチル2-メチルアセトアセテートをGeotrichum candidum でエチル(2S,3S)-2-メチル-3-ヒドロキシブタノエートに生物変換すること、及び不斉Strecker 合成を含む (Wang, Q. ら, Eur. J. Org. Chem., 834-839 (2002)) 。

短い6工程で立体化学を完全に制御した(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシンの化学酵素的合成も発表されているが、最終工程は市販のEupergit C(E-PAC)上固定化ペニシリン・アシラーゼGを使用したN-フェニルアセチルラクトン誘導体の加水分解による酵素的分割である(Rolland-Fulcrand, V. ら, J. Org. Chem., 873-877 (2004)) 。

しかし、現在、L-イソロイシンジオキシゲナーゼのクローニング、及び、L-イソロイシンジオキシゲナーゼを用いるL-イソロイシンの直接的酵素水酸化により(2S,3R,4S)-4-ヒ
ドロキシ-L-イソロイシンを生成する報告はない。

微生物によるイソロイシン類似体の生産については、バチルス属細菌による２−アミノ−３−ケト−４−メチルペンタン酸（ＡＭＫＰ）生産の報告がある[Bioorganic Chemistry, Vol. 6, pp.263-271 (1977)]。しかしながら、微生物由来イソロイシン水酸化酵素に関する報告はない。

本発明の課題は、大量調製が可能な微生物由来の酵素を用いて４−ヒドロキシイソロイシン（遊離形態及びその塩形態の両方を含む意味で用い、「4HIL」とも呼ぶ。以下、同じ）を製造する方法を提供することにある。

本発明の課題には、イソロイシンから4-ヒドロキシイソロイシンを生成する酵素活性を有する微生物、及び、微生物由来酵素を用いる水酸化反応によりイソロイシンから4-ヒドロキシイソロイシンを製造する方法を提供することも包含される。上記の課題は、イソロイシンから4-ヒドロキシイソロイシンを生成する酵素活性を有する微生物を見出すことにより達成された。

本発明の課題は、(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシン（遊離形態及びその塩形態の両方を含む意味で用い、「(2S,3R,4S)-4HIL」とも呼ぶ。以下、同じ）の製造を改良することであり、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ又はL-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有する微生物を用いてL-イソロイシンの直接的酵素水酸化により(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシン又はその塩を製造する方法を提供することにある。上記課題を解決すべく鋭意研究された結果、本願の発明者は、自然から、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性の高い細菌を単離し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子をクローニングし、目的の(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンの合成に好ましくは用いることができるL-イソロイシンジオキシゲナーゼを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の目的は、新規L-イソロイシンジオキシゲナーゼ及びL-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードするDNAwo提供し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼを用いる(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンの製造方法を提供することである。上記の目的は、本発明の新規L-イソロイシンジオキシゲナーゼを見出すことにより達成された。

本発明の目的の一つは、微生物由来の、イソロイシンから４−ヒドロキシイソロイシンを生成する水酸化酵素存在下でイソロイシン又はその塩を水酸化反応に供し、４−ヒドロキシイソロイシンを生成させる工程を含むことを特徴とする、４−ヒドロキシイソロイシン又はその塩の製造方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、微生物がバチルス属に属する微生物である、上記の製造方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、バチルス属に属する微生物がBacillus thuringiensis、Bacillus licheniformis、及び、Bacillus sphaericusから選択される微生物である、上記の製造方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、水酸化反応が、微生物の対数増殖期細胞から調製された破砕液の存在下で行われる、上記の製造方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、L-イソロイシンを水酸化反応に供する、上記の製造方法を提
供することである。

本発明のさらなる目的は、水酸化酵素が、ジオキシゲナーゼである、上記の製造方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、水酸化酵素が以下の性質を有する、上記の製造方法を提供することである。
（ａ）補因子として、酸素、Ｆｅ²⁺、アスコルビン酸、及び、２−オキソグルタル酸を要求する。
（ｂ）反応至適ｐＨがｐＨ５〜ｐＨ８。
（ｃ）反応至適温度が４５℃以下。
（ｄ）５０℃以上で失活する。
（ｅ）ＥＤＴＡやＣｕ²⁺、Ｚｎ²⁺により阻害される。

本発明のさらなる目的は、以下の性質を有し、バチルス属細菌から単離されうるジオキシゲナーゼを提供することである。
（ａ）補因子として、酸素、Ｆｅ²⁺、アスコルビン酸、及び、２−オキソグルタル酸を要求する。
（ｂ）反応至適ｐＨがｐＨ５〜ｐＨ８。
（ｃ）反応至適温度が４５℃以下。
（ｄ）５０℃以上で失活する。
（ｅ）ＥＤＴＡやＣｕ²⁺、Ｚｎ²⁺により阻害される。
（ｆ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定される分子量が３１，０００±２０，０００のサブユニットからなる。
（ｇ）配列番号２に示すアミノ酸配列をＮ末端に有する。

本発明のさらなる目的は、バチルス属細菌がBacillus thuringiensisである、上記のジオキシゲナーゼを提供することである。

本発明のさらなる目的は、
(a) 配列番号１の塩基配列を含むDNA、
(b) 配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA、
(c) 配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(d)配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA、及び、
(e)配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９８％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
からなる群から選ばれるDNAを提供することである。

本発明のさらなる目的は、上記を含むDNAとベクターDNAとを連結することにより得られる組換えDNAを提供することである。

本発明のさらなる目的は、上記を含む組換えDNAにより形質転換された細胞を提供することである。

本発明のさらなる目的は、上記組換えDNAを含む細胞を培地に培養し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質を、培地、細胞又はそれらの両方に蓄積させる
ことを含む、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、
(f) 配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(g)配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び、
(h)配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９８％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
からなる群から選ばれるタンパク質を提供することである。

本発明のさらなる目的は、下記の性質を有するタンパク質を提供することである。
(A)L-イソロイシンの水酸化により(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンを生成する反応を触媒する活性を有する。
(B)前記活性が二価カチオンFe²⁺に依存する。
(C)SDS-PAGEにより測定した分子量が約29±2.0 kDaである。

本発明のさらなる目的は、
(f) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(g)配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び、
(h)配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種のL-イソロイシンジオキシゲナーゼの存在下で水性溶媒中でL-イソロイシンを反応させ、生成した (2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンを単離することを含む(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシン又はその塩の製造方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、
(f) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(g)配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び、
(h)配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選ばれるL-イソロイシンジオキシゲナーゼを含む細菌の存在下で水性溶媒中でL-イソロイシンを反応させ、生成した (2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンを単離することを含む(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシン又はその塩の製造方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、前記細菌がL-イソロイシンジオキシゲナーゼの活性が増強されるように改変されている上記の方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、L-イソロイシンジオキシゲナーゼの活性が、前記L-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の発現の増大により増強されている上記の方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、L-イソロイシンジオキシゲナーゼの活性が、前記L-イソロイ
シンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の発現調節配列の改変、又は、前記L-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子のコピー数の増大により増強されている上記の方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、前記細菌が、Escherichia, Pseudomonas, Corynebacterium,
Arthrobacter, Aspergillus又は Bacillus属に属する上記の方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、前記細菌が、Escherichia coli, Arthrobacter simplex, Corynebacterium glutamicum, Arthrobactor globiformis, Arthrobactor sulfureus, Arthrobactor viscosus 又はBacillus subtilisに属する上記の方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、前記細菌が、細菌培養物、細胞、細胞処理物又は細胞破砕液である上記の方法を提供することである。

本明細書において、４−ヒドロキシイソロイシンとは、 (2S,3S,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン[(2S,3S,4S)-4-hydroxyisoleucine]、(2S,3R,4R)-4-ヒドロキシイソロイシン[(2S,3R,4R)-4-hydroxyisoleucine]、(2S,3S,4R)-4-ヒドロキシイソロイシン [(2S,3S,4R)-4-hydroxyisoleucine]及び(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン [(2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine]からなる群より選ばれる1種、又は2種以上のジアステレオマー混合物をいう。４−ヒドロキシイソロイシンは、好ましくは、(2S,3R,4S)もしくは(2R,3R,4S) -4-ヒドロキシイソロイシン、又は、それらの混合物であり、更に好ましくは、(2S,3R,4S) -4-ヒドロキシイソロイシンである。

特に、「(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシン」又は「(2S,3R,4S)-4-HIL」は、単一の化合物又は(2S,3R,4S) -4-ヒドロキシイソロイシンを含む混合物をいうことがある。

本明細書で用いる「細菌」又は「微生物」の語は、酵素生産細菌又は微生物、このような細菌又は微生物の、目的酵素活性がある又は増強されている変異体及び遺伝子組換え体を包含する。

＜Ｉ＞イソロイシンから4HILを生成する酵素活性
本発明の水酸化酵素によるイソロイシン水酸化反応を介した４−ヒドロキシイソロイシン製造方法において用いる水酸化酵素としては、イソロイシンを４−ヒドロキシイソロイシンに変換する酵素活性を有する限り、微生物の培養物、菌体、細胞破砕液による粗精製酵素、又は精製酵素のいずれでも用いることが出来るが、細胞破砕粗酵素や精製酵素であることが望ましい。

水酸化酵素としては、オキシゲナーゼやジオキシゲナーゼ等が挙げられるが、好ましくは、ジオキシゲナーゼである。さらに好ましくは、2-e-2菌株から単離され得る、下記の性質を有する水酸化酵素である。

（ａ）補因子として、酸素、Ｆｅ²⁺、アスコルビン酸、及び、２−オキソグルタル酸を要求する。
（ｂ）反応至適ｐＨがｐＨ５〜ｐＨ８。
（ｃ）反応至適温度が４５℃以下。
（ｄ）５０℃以上で失活する。
（ｅ）ＥＤＴＡやＣｕ²⁺、Ｚｎ²⁺により阻害される。

2-e-2菌株から単離され得る水酸化酵素はさらに以下の性質を有する。
（ｆ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定される分子量が３１，０００±２０，０００のサブユニットからなる。
（ｇ）配列番号２に示すアミノ酸配列をＮ末端に有する。

水酸化酵素が補因子を要求する場合には、系に補因子を添加又は供給することが好ましい。補因子としては、例えば、ジオキシゲナーゼの場合には、Ｆｅ²⁺、アスコルビン酸、及び、２−ケトグルタル酸が挙げられる。これらの補因子は、塩となり得る場合には、塩として系に添加又は供給してもよい。

微生物としては水酸化反応条件下、イソロイシンを４−ヒドロキシイソロイシンに変換する酵素活性を有する微生物であれば、いずれの微生物でも用いることができる。

用いられる微生物として、バチルス属に属する微生物、あるいはその突然変異体や誘導体などが挙げられる。また当該水酸化酵素を組換え発現させた微生物であって、４−ヒドロキシイソロイシンを生成する活性を有するものであってもよい。

具体的にはBacillus thuringiensis(2-e-2株、AKU238株、NBRC3958株、ATCC35646株等)や、Bacillus licheniformis（AKU223株、IAM11054株等）、Bacillus sphaericus（AKU227株、NBRC3526株等）があげられる。2-e-2株は、AJ110584株と命名され、ブタペスト条約に基づいて2006年9月27日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１ 中央第６）にFERM BP-10688として寄託されている。

なお、上記微生物について、株名がAKUから始まるものは、京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻発酵生理及び醸造学研究室より分譲を受けることが出来る。株名がＩＡＭから始まるものは、東京大学分子細胞生物学研究所バイオリソーシス研究分野IAMコレクションに保管されていて、登録番号を利用して、分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、IAMのカタログに記載されている（IAM Catalogue of strain Third
Edition,2004）。株名がNBRCから始まるものは、独立行政法人製品評価技術基盤機構（〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8）より分譲を受けることが出来る。株名がATCCから始まるものは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所 ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,United States of America ）。

Bacillus thuringiensis 2-e-2株は、本発明者らによって京都市の土壌より新たに分離された菌株であって、その科学的性質を以下に示す。

Bacillus thuringiensis 2-e-2株の分類学的性質
1. 表現形質
細胞形態
桿菌（大きさ:1.0-1.2× 2.0-3.0 μm）
グラム染色 +
内生胞子 +
酸素に対する態度 好気性
生育温度 20-35℃で良好な生育
至適 pH 7.0〜7.5

2. 16S rDNAの塩基配列に基づく分子系統解析
本2-e-2菌株の16S rDNAの塩基配列（配列番号１）を用いて、BLASTにより細菌基準株デ
ータベース（エヌシーアイエムビー・ジャパン、静岡）及び国際塩基配列データベース（GeneBank/DDBJ/EMBL）に対し相同検索を行い、それぞれ相同率の上位30株を決定した。その後、細菌基準株データベースで検索された上位30株と各検体の16S rDNA塩基配列を用いて近隣結合法により分子系統樹を作成した。相同性検索及び簡易分子系統樹の作成にはDNASISpro（日立ソフトウェアエンジニアリング、東京）を使用した。

BLASTを用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、2-e-2株の16S rDNA部分塩基配列は相同性１００％で、Bacillus thuringiensis ATCC10792株の16S rDNAと一致した。GenBank/DDBJ/EMBLに対する相同性検索の結果においても、2-e-2株の16S rDNAはBacillus thuringiensisに対し、高い相同性を示した。また、2-e-2株の16SrDNAと細菌基準株データベースに対する相同性検索上位30株の16S rDNAを用いた簡易分子系統解析の結果、2-e-2株はBacillus thuringiensisの16S rDNAとほぼ同一の系統枝を形成し、非常に近縁である事が示された。

3. 分類・同定の結果
簡易形態観察の結果、2-e-2株はBacillusの一般的な性状を示し、16S rDNA部分配列解析の結果からも、2-e-2株はBacillus thuringiensisに帰属する事が示された。2-e-2と同レベルのAMKP生産活性を示す微生物は見出されなかったため、本株を新規の株と同定した。

本発明で用いられる微生物の培養は、通常の培養方法に従って行うことができる。培養に用いられる培地は、用いる微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。

炭素源としては、用いる微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸、あるいはエタノール、プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。窒素源としては、用いる微生物が資化しうるかぎり、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。

無機塩としては、用いる微生物が利用しうるかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどを用いることができる。他に微量元素としてカルシウム、亜鉛、ほう素、銅、コバルト、モリブデンなどの塩類を加えてもよい。また必要に応じてチアミン、ビオチンのようなビタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸のようなアミノ酸、アデニン、グアニンのような核酸関連物質などを添加してもよい。

培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１０〜３７℃がよく、培養時間は５〜４０時間である。培養中ｐＨは、５．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。

本発明において用いられる細胞破砕粗酵素、すなわち微生物の細胞破砕液としては、菌体外の水酸化酵素を含むものであればよく、菌体の界面活性剤又は有機溶剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、溶媒処理物、菌体の蛋白質分画、菌体処理物の固定化物などがあげられる。細胞破砕液は、対数増殖期細胞から調製することが好ましい。

細胞破砕液の調製法に関して、培養菌体は生理食塩水などの等張液で洗浄した後、フレンチ・プレス、ガラスビーズ、超音波破砕器、マントン・ガウリン・ホモゲナーザー、乳鉢などによる圧搾粉砕や、これらの組み合わせなど、如何なる方法でも良い。更に効率的な破砕のため、細胞を凍結処理や、酵素処理などにより細胞膜表面に物理的、化学的処理を行っても良い。細胞破砕時は、常に低温を維持し、破砕処理により破砕液の温度が上昇した場合は、速やかに冷却すれば良い。

細胞破砕液の水性媒体としては、水、ホウ酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス、リン酸塩、クエン酸塩、Ｇｏｏｄバッファー等の緩衝液があげられるが、これらに限定されるものでない。また酵素安定化剤としてグリセロールやDTT等を添加しても良いし、プロテアーゼ阻害剤として、EDTA、EGTA、PMSF、ペプスタチン、E-64等を添加しても良いし、阻害剤の組み合わせや、阻害剤カクテルなどを添加しても良い。

上記の細胞破砕液を用いて、４−ヒドロキシイソロイシン生成反応する場合の基質液組成は、５mM イソロイシン、５mM ２−ケトグルタル酸、５mM アスコルビン酸、５mM Fe²⁺を含有する１００mM HEPES緩衝液（ｐH７.０）、液量１００μｌとし、３０℃、６０分間反応する。緩衝液はHEPES以外にも、MESやGTA広域緩衝液など如何なる緩衝液でも良い。反応液は必要に応じて酵素失活し、遠心上清画分をフィルター濾過し、高速液体クロマトグラフィーやTLCを用いて４−ヒドロキシイソロイシンの生成を確認する。

４−ヒドロキシイソロイシンの定量は、他の成分との分離可能な分析系であればどのような方法を用いても良いが、例えばTLCや高速液体クロマトグラフィーがあげられる。この内、高速液体クロマトグラフィーは高感度・高分離であることから定量分析には優れている。例えばアミノ酸分析法のウォーターズ AccQ・Tag^TMメソッド等があげられる。ウォーターズ AccQ・Tag^TMメソッドの改変法（後記実施例参照）により、４−ヒドロキシイソロイシンのジアステレオマー分離や、天然体４−ヒドロキシイソロイシンと４−ヒドロキシイソロイシンの水酸基が酸化されたケト体である、２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸の分離が可能である。

本発明により製造された４−ヒドロキシイソロイシンは、通常用いられるアミノ酸の精製法を用いて単離することができる。例えば、遠心分離により固形物を除いた反応液上清から、イオン交換樹脂や膜処理法、晶析法などの操作を組み合わせて、４−ヒドロキシイソロイシンを単離することができる。

本発明の製造法において、イソロイシン水酸化反応のｐHはｐＨ５〜８である事が好ましい。反応液の組成として、酵素反応に必須な因子が存在することが好ましい。因子としてFe²⁺が必須の場合には、HEPESバッファー、MESバッファー、GTA広域バッファーなどFe²⁺とキレートする可能性が少ない反応液組成が望ましいが、Fe²⁺の作用が保持されていれば何ら制限を受けない。

本発明の製造法において、イソロイシン水酸化反応の温度は、通常には１５〜３０℃であり、４５℃以下である事が好ましい。反応時間は、酵素量により異なるが通常には、5分〜２００時間である。
水酸化反応に供するイソロイシンとしては、L-イソロイシンを用いることが好ましい。

反応を実施する溶媒としては、水、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液等の水性溶媒、ならびに、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などの有機溶媒や、これらを含有した水性溶媒があげられる。また必要に応じて水酸化反応活性
化因子を添加しても良い。

本発明の製造法において用いられる微生物の細胞破砕液のタンパク質濃度は０．１〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｍｌ（微生物菌体（湿重量）換算）である。水性媒体に、当該微生物破砕液、基質、補因子を適切な濃度添加し、温度４５℃以下、好ましくは３０℃、ｐＨ５〜１２、好ましくはｐＨ５〜７．５の条件下で、５分〜１２０時間反応させ、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを製造することができる。

＜II＞L-イソロイシンジオキシゲナーゼ及びL-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードするDNA並びにそれらの用途
以下に、[I]L-イソロイシンジオキシゲナーゼ及び[II]本発明のL-イソロイシンジオキシゲナーゼを用いる(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンの製造法について、図面を参照しながら詳細に説明する。

［Ｉ］L-イソロイシンジオキシゲナーゼ
本発明の発明者らの研究により、Bacillus属の細菌株に、(2S,3R,4S)-4HILの生成能を有するL-イソロイシンジオキシゲナーゼが確認された。微生物細胞由来のL-イソロイシンジオキシゲナーゼを、以下、IDOと略記する。

上述のように、本発明の発明者らにより準備された環境微生物のスクリーニングにより、独自の微生物であるBacillus thuringiensis 2-e-2株が、L-イソロイシンから(2S,3R,4S)-4HILを直接生成する反応を触媒できる活性を有することが明らかになった。本発明の発明者らは、微生物の培養細胞から新規なL-イソロイシンジオキシゲナーゼを精製、単離した。以下、これをIDO(Lys,23)と略記する。

さらに、本発明の発明者らは、Bacillus thuringiensis 2-e-2株由来ジオキシゲナーゼを精製することによりIDO(Lys,23)のN-末端アミノ酸配列を決定した。Bacillus thuringiensis 2-e-2株はBacillus thuringiensis AJ110584と命名され、ブタペスト条約に基づいて2006年9月27日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１ 中央第６）にFERM BP-10688として寄託されている。

さらに、本発明の発明者らは、IDO(Lys,23)のアミノ酸配列から推定される約30塩基対の合成DNA分子を合成し、Bacillus thuringiensis 2-e-2株の染色体DNAを用いて、IDO(Lys,23)をコードする全長DNA、及び、コントロールとしてBacillus thuringiensis (serovar israelensis) 株(ATCC 35646)由来のL-イソロイシンジオキシゲナーゼ（以下、IDO(Lys,32)と略記する）を単離、取得し、組換えプラスミド及びそれらによるE. coliの形質転換細胞を構築した。組換えE. coli IDO活性の、その後の分析により、Bacillus thuringiensis 2-e-2株由来のIDO(Lys,23)遺伝子における独自の変異の結果として、IDO(Lys,23)の活性が、IDO(Lys,32)に比べて極めて高い（５倍高い）ことが判明した。

実施例に記載されたように同定された本発明のIDO(Lys,23)をコードするDNAは、配列表の配列番号１に示される。さらに、配列番号１の塩基配列によりコードされるIDO(Lys,23)のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。配列番号２は、配列番号１の塩基配列によりコードされるIDO(Lys,23)のアミノ酸配列である。配列番号２のIDO(Lys,23)はL-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有し、下記式(I)に示す(2S,3R,4S)-4HILを、L-イソロイシン一分子から直接合成する反応を触媒する。

次に、(1)L-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードするDNA、(2)L-イソロイシンジオキシゲナーゼの性質、及び(3)L-イソロイシンジオキシゲナーゼの製造方法について順に詳細に説明する。

（１）L-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードするDNA
配列番号１の塩基配列を有する本発明のIDO(Lys,23)遺伝子は、実施例に記載するように、Bacillus thuringiensis 2-e-2株の染色体DNAから単離された。IDO(Lys,23)をコードするBacillus thuringiensis 2-e-2株由来の配列番号１の塩基配列は、Bacillus thuringiensis (serovar israelensis) 株 (ATCC 35646)由来のゲノム塩基配列の非注釈部分に対して、塩基配列（図１９）及びアミノ酸配列（図１８）において高い相同性を示した。そのゲノム配列の一つは、2007年1月17日にNational Center for Biotechnology Information, NIH, Bethesda, MD 20894, USA (Accession No: AAJM00000000.1, GI:74494335)に提出されたものであり、また、別の一つが、VKPM B-197の受託番号でRussian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) に保存され、そこから受領した同一Bacillus thuringiensis (serovar israelensis) 株の、IDO(Lys,32)をコードするゲノムDNAの配列決定の結果として得られたものであった。IDO(Lys,32) をコードするBacillus thuringiensis (serovar israelensis) 株VKPM B-197由来の塩基配列は、配列番号７に示される。

以下に、IDO生産細菌からIDOのアミノ酸配列を得る方法について説明する。
主要タンパク質をゲルから回収し、MS分析により、Bacillus thuringiensis (serovar israelensis) ATCC 35646株由来の推定RBTH_06809タンパク質と同定した（図１３）。

SDS-PAGEから抽出したタンパク質試料の質量分析を行った。ゲルの処理、トリプシン分解、タンパク質抽出及び、飛行時間マトリックス支援レーザ脱離イオン化法による質量分析（MALDI-TOF）は、Govorun, V.M. et al, (The proteome comparative analysis of Helicobacter pylori clinical isolates. Biochemistry (Mosc), 68, 1, 42-49 (2003))のプロトコルに従って行った。タンパク質は、Mascot software (Matrix Science, USA)のPeptide Fingerprintオプションを用いて、光分解ペプチド質量のセットにより同定された。

IDOをコードするDNA断片は、Bacillus thuringiensis (serovar israelensis)株(ATCC 35646)の配列に基づき設計した適切なプライマーを用いるPCRにより得ることができる。

PCRに用いる手順は、White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)等の文献に記載されている。染色体を単離する方法、及び、DNA分子をプローブとして遺伝子ライブラリーから目的のDNA分子を単離する方法は、Molecular Cloning, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等の文献に記載されている。

IDOをコードする単離DNAの塩基配列を決定する方法は、A Practical Guide to Molecul
ar Cloning, John Wiley & Sons, Inc. (1985)に記載されている。さらに、塩基配列は、Applied Biosystems製のDNAシークエンサーを用いて決定できる。Bacillus thuringiensis 2-e-2株由来のIDO(Lys,23)をコードするDNAは配列番号１に示される。Bacillus thuringiensis (serovar israelensis) 株VKPM B-197由来のIDO(Lys,32)をコードする塩基配列は配列番号７に示される。

L-イソロイシンから(2S,3R,4S)-4HILを生成する反応を触媒する IDOをコードするDNAは配列番号１に示されるDNAに限られない。これは、L-イソロイシンから(2S,3R,4S)-4HIL を生成する反応を触媒するIDOを生産する種や、Bacillus種の株のそれぞれに見られる塩基配列の相違があるはずだからである。

本発明のDNAは、IDOをコードする単離DNAを含むだけでなく、IDO生産微生物の染色体DNAから単離されたIDOをコードするDNAに人工的に変異が加えられたDNAも、前記反応を触媒する活性を有するIDOをコードする限り、本発明のDNAに含まれる。人工的に変異を加える方法には、Method. in Enzymol., 154 (1987)に記載されている部位特異的変異を導入する方法などの通常に用いられる方法が含まれる。

配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、IDO活性を有するタンパク質をコードするDNAも、本発明のDNAに含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。これらの条件を数値で示すことは難しいが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である３７℃、０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度が挙げられる。プローブの長さは、ハイブリダイゼーションの条件により適宜選択されるが、通常には、100bp〜1Kbpである。さらに「L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性」は、L-イソロイシンから(2S,3R,4S)-4HILを合成する活性であればよい。しかし、配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質に対して、３７℃、ｐＨ８の条件で、１０％以上、好ましく３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上のL-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を保持することが好ましい。

さらに配列番号１のDNAによりコードされるIDOに実質的に同一なタンパク質をコードするDNAも本発明のDNAに含まれる。すなわち、以下のDNAも本発明のDNAに含まれる。
(a) 配列番号１の塩基配列を含むDNA、
(b) 配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA、
(c) 配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(d)配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA、及び、
(e)配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９８％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
からなる群から選ばれるDNA。

ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の３Ｄ構造又はL-イソロイシンジオ
キシゲナーゼ活性が実質的に損なわれない範囲であり、具体的には１から７８個、好ましくは、１から５２個、より好ましくは１から２５個、さらに好ましくは１から１３個である。

上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加は、酵素活性が維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換の例としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからAsn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。

さらに、「L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性」は、上述のようにL-イソロイシンから(2S,3R,4S)-4HILを合成する活性を意味する。しかし、配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列の場合には、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質に対して、３７℃、ｐＨ６．０の条件で、１０％以上、好ましく３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上のL-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を保持することが好ましい。本発明のIDOのL-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いるL-イソロイシンからの(2S,3R,4S)-4HIL生成の分析により測定することができる。

さらに、配列番号１のホモログDNAも、本発明のL-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子として用いることができる。ホモログDNAがL-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードするか否かは、細胞破砕液、又は、ホモログDNAを過剰発現させた微生物の細胞破砕液のL-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を測定することにより確認できる。

配列番号１のホモログDNAは、本発明のL-イソロイシンジオキシゲナーゼとして、他のBacillus種、例えば、Bacillus cereus, Bacillus weihenstephanensisのゲノムから調製することもできる。

Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus weihenstephanensisのアミノ酸配列のアライメントを図２０に示す。また、Bacillus属で保存された配列を配列番号６に示す。

他の細菌由来のコードするホモログDNAは、Bacillus, Escherichia, Corynebacterium,
Arthrobacter, Aspergillus, Pseudomonas, Granulibacter, Methylobacillus, Granulibacter, Acidiphilium, Agrobacterium, Gluconobacter, Caulobacter, Stigmatella, Myxococcus, Polaromonas, Caulobacter, Polaromonas, Sphingomonas, Acidovorax, Mycobacterium, Azotobacter, Vibrio, Polynucleobacter, Streptomycesなどから、下記（表１）にリストする遺伝子の相同性に基づきクローニングすることにより得ることができる。ホモログDNAは、例えば、配列番号３及び４に示す合成オリゴヌクレオチドを用いるPCRにより増幅できる。

（２）IDOの性質
次に、精製した、Bacillus thuringiensis 2-e-2株由来のL-イソロイシンジオキシゲナーゼ(IDO(Lys,23))の性質について説明する。

本発明のIDO(Lys,23)は、上述の遺伝子単離及び分析により決定されたように、配列番号２のアミノ酸配列を有する。しかし、本発明は、配列番号２、８、１３、１７又は２１
のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質を含む。

すなわち、本発明のIDOは下記のタンパク質を含む。
(f) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(g)配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び、
(h)配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質

ここで、「数個」及び「L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性」の定義は、上記(1)L-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードするDNAのセクションで定義したのと同様である。

本発明のIDOは、水酸化反応によりL-イソロイシンから(2S,3R,4S)-4HILを合成する反応を触媒する。

本発明のIDOのL-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いるL-イソロイシンからの(2S,3R,4S)-4HIL生成の分析により測定することができる。

本発明のIDOは、水酸化反応によりL-イソロイシンから(2S,3R,4S)-4HILを合成する反応を触媒する。ジオキシゲナーゼにより触媒される水酸化反応において、分子酸素の一原子がL-イソロイシンに導入され、他の酸素原子が他の酸素受容体例えばα−ケトグルタル酸に導入される。その結果、二酸化炭素が遊離するとともに(2S,3R,4S)-4HIL及びコハク酸が形成される。ジオキシゲナーゼは、脂肪族炭素鎖を立体特異的に水酸化できる。L-イソロイシンを基質とする水酸化反応を触媒できる植物酵素の一例が、フェヌグリーク抽出液由来のL-イソロイシンジオキシゲナーゼに関して報告されている(Phytochemistry, Vol. 44, No. 4, pp. 563-566, 1997)。しかし、この方法は、20mM以上のイソロイシン濃度で酵素活性が基質で阻害され、この酵素が同定されていなく、酵素は植物の抽出液から誘導され、たやすく大量に得られなく、かつ、この酵素が安定でないために、4−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造法として不充分である。

次に、精製IDO(Lys,23)について調べられた酵素的性質について説明する。
IDO(Lys,23)は、下記の反応でL-イソロイシンから下記(I)で表わされる(2S,3R,4S)-4HILを生成する反応を触媒する。

ゆえに、本発明のIDO(Lys,23)を用いて、L-イソロイシンから(2S,3R,4S)-4HILを製造する方法も本願発明に含まれる。

さらに、本発明のIDO(Lys,23)の活性は、二価カチオンFe²⁺に厳密に依存し、EDTAの存在により完全に阻害される。IDO(Lys,23)は、L-イソロイシンに酸素原子の一つを転移させ、他の酸素原子を、受容分子であるα−ケトグルタル酸に転移させる。従って、IDO(Lys,23)はα−ケトグルタミン酸依存ジオキシゲナーゼに属する。

SDS-PAGEで測定したIDO(Lys,23)のサブユニット分子量は、約29±2.0 kDaである。従って、本発明は下記の性質で定義されるタンパク質も包含する。
(A)L-イソロイシンの水酸化により(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンを生成する反応を触媒する活性を有する。
(B)前記活性が二価カチオンFe²⁺に依存する。
(C)SDS-PAGEにより測定した分子量が約29±2.0 kDaである。

Bacillus thuringiensis (serovar israelensis) 株 VKPM B-197由来のIDO(Lys,32)は、配列番号８のアミノ酸配列を有する。

（３）L-イソロイシンジオキシゲナーゼの製造法
次に、本発明のIDOの製造法について説明する。本発明のIDOを製造するには二つの方法がある。これらは、(i)IDO生産微生物を培養し、IDOを生成蓄積させる方法、及び (ii)組換えDNA技術によりIDOを生産する形質転換体を調製し、形質端歓待を培養してIDOを蓄積する方法である。

(i) 微生物培養によりIDOを生成蓄積する方法
IDO生産微生物を培養することによりIDOを生成蓄積する方法において、IDOの取得源になる微生物の例には、Escherichia, Pseudomonas, Corynebacterium, Arthrobacter, Aspergillus又はBacillus属に属する微生物が含まれる。

Bacillus, Escherichia, Corynebacterium, Arthrobacter, Aspergillus, Pseudomonas, Granulibacter, Methylobacillus, Granulibacter, Acidiphilium, Agrobacterium, Gluconobacter, Caulobacter, Stigmatella, Myxococcus, Polaromonas, Caulobacter, Polaromonas, Sphingomonas, Acidovorax, Mycobacterium, Azotobacter, Vibrio, Polynucleobacter, Streptomyces属に属する微生物が、L-イソロイシンとα−ケトグルタル酸から(2S,3R,4S)-4HILを合成する反応を触媒するIDOを生成する限り、本発明で使用できる。好ましい微生物は、Bacillus thuringiensis 2-e-2株及びBacillus thuringiensis (serovar israelensis; ATCC 35646) 株を含む。これらのうち、Bacillus thuringiensis 2-e-2株が特に好ましい。

IDOの取得源としての微生物は、液体培養、固体培養等の任意の形態で培養できるが、工業的に有利な方法は、深部通気撹拌培養である。微生物培養において通常に使用される炭素源、窒素源、無機塩類、及び他の微量栄養素を栄養培地の栄養成分として使用できる。全ての栄養源は、用いる微生物が利用可能である限り使用できる。

培養は、振盪培養、深部換気撹拌培養等の好気的条件で実施する。培養温度は、微生物が生育し、IDOが生産される範囲であればよい。従って、条件は厳密ではないが、培養温度は、通常には、10〜50℃であり、好ましくは15〜42℃である。培養時間は、他の培養条件により変わる。例えば、多量のIDOが生成するまで培養してよく、通常には約５時間から７日であり、好ましくは約10〜96時間である。

培養後、微生物細胞を遠心（10,000xg、10分）で回収する。IDOの大部分は、細胞内に存在するので、微生物細胞を破砕又は溶解することによりIDOを可溶化する。超音波破砕、フレンチプレス破砕又はガラスビーズ破砕を、微生物細胞の破砕に使用できる。細胞を溶解する場合には、卵白リゾチーム、ペプチダーゼ処理やそれらの適切な組み合わせを採用できる。

IDO生産微生物由来のIDOを精製する場合、IDOは出発材料の酵素可溶化溶液を用いて精製することもできるが、非破砕又は非溶解残渣が残るときには、可溶化液を再遠心して、残渣を沈殿させることが精製に有利である。

通常の酵素を精製するために通常に使用される方法の全てをIDOの精製に使用できる。それらの例としては、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーがある。結果として、より高い比活性を有するIDO含有画分が得られる。

(ii)組換えDNA技術を用いる製造法
次に、組換えDNA技術を用いるIDOの製造法について説明する。組換えDNA技術を用いて、酵素や生理学的活性物質などの有用なタンパク質を製造する数多くの既知例がある。組換えDNA技術の使用は、天然には痕跡量しか存在しない有用タンパク質の大量生産を可能にする。

図１１は、本発明のIDOを製造する方法のフローチャートである。
最初に、本発明のIDOをコードするDNAを調製する（ステップS1）。

次に、調製したDNAをベクターDNAと連結し、組換えDNAを作成し（ステップS2）、組換えDNAにより細胞を形質転換して形質転換体を作成する（ステップS3）。続いて、形質転換体を培地で培養し、IDOを、培地、細胞、又はその両方に生成、蓄積させる（ステップS4）。

その後、方法はステップS5に進み、酵素を回収、精製することにより精製IDOが製造される。

目的の(2S,3R,4S)-4HILは、ステップS5で製造された精製IDO又はステップS4でIDOが蓄積した培地、細胞もしくは両方を用いて、水酸化反応で大量に製造できる（ステップS6）。

ベクターDNAと連結したDNAは、本発明のIDOを発現させ得る。
ここで、ベクターDNAに連結したIDO遺伝子の例としては、先に[I]で記載したDNAが含まれる。

組換えDNA技術を用いる大規模タンパク質製造の場合、細菌細胞、Actinomyces細胞、酵素細胞、真菌細胞、植物細胞、及び動物細胞などの細胞が、形質転換される宿主細胞として使用できる。 宿主−ベクター系が開発されている細菌細胞の例には、Escherichia 種、Pseudomonas種、Corynebacterium種、Arthrobacter種、Aspergillus種及びBacillus種がある。好ましくは、Escherichia coli又はCorynebacterium glutamicumが使用される。形質転換E. coliを用いるL-イソロイシンジオキシゲナーゼの製造法を以下に説明する。以下のE. coliに関する方法は、Corynebacterium glutamicumや Bacillus細菌に適用できる。

E. coliによる異種タンパク質生産に通常に使用されるプロモーターをIDOをコードする
DNAを発現させるプロモーターとして使用できる。それらの例には、T7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター及びPLプロモーターがある。

IDOを、融合タンパク質封入体の形態で製造する場合には、他のタンパク質、好ましくは親水性ペプチドをコードする遺伝子をIDO遺伝子の上流又は下流に連結し融合タンパク質遺伝子とする。他のタンパク質をコードする遺伝子は、蓄積する融合タンパク質の量を増加させたり、変性及び再生工程後の融合タンパク質の溶解性を増大させたり遺伝子でよい。それらの例としては、T7遺伝子10、β−ガラクトシダーゼ、デヒドロフォーレートレダクターゼ遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン２遺伝子及びプロキモシン遺伝子がある。

これらの遺伝子を、IDOをコードする遺伝子と連結するときには、コドン読み取り枠を適合させる。遺伝子は、適切な制限酵素部位で連結してもよいし、適切な配列の合成DNAを用いてもよい。

製造量を増加させるために、融合タンパク質遺伝子の下流にターミネーターの形態で転写終結配列を組み合わせることが好ましい。このようなターミネーターの例には、T7ターミネーター、fdファージターミネーター、T4ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子ターミネーター及びE. coli trpA遺伝子ターミネーターがある。

IDO又はIDOと他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子をE. coliに導入するのに用いるベクターとしてはマルチコピーベクターが好ましい。このようなものの例としては、pUCプラスミド、pBR322プラスミド、それらの誘導体などのCol E1由来複製開始点を有するプラスミドがある。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位により改変を受けたプラスミドを意味する。ここでの改変には、変異原物質やUV照射を用いる変異誘発処理や、自然突然変異、ランダム変異により生じる改変を含む。

ベクターは、形質転換体を選択するために、アンピシリン耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドの例には、市販の強力なプロモーターを有する発現ベクター（例えば、pUC (Takara), pPROK (Clontech)及びpKK233-2 (Clontech)）がある。

組換えDNAは、プロモーター、IDO又はIDOと他のタンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子、及び、ターミネーターをこの順に連結したDNAフラグメントをベクターDNAと連結することによって得ることができる。

E. coliを組換えDNAで形質転換し、次いで培養する場合、IDO又はIDOと他のタンパク質との融合タンパク質が発現し生成する。異種遺伝子の発現に通常に使用される株を形質転換の宿主として使用でき、E. coli JM109 (DE3)株及びE. coli JM109株が特に好ましい。形質転換方法及び形質転換体を選択する方法は、例えば、Molecular Cloning, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載されている。

融合タンパク質の発現の場合、IDOを、IDOに存在しない配列を認識配列とする、血液凝固因子Xaやカリクレインなどの制限的プロテアーゼで切り出してもよい。

E. coliの培養に通常に用いられる培地を生産培地に用いることができる。このようなものの例としては、M9-カザミノ酸培地、LB培地がある。さらに、培養及び生産誘導の条件は、用いるベクターのマーカー及びプロモーターの種類、並びに、用いる宿主微生物の種類に応じて適切に選択すればよい。

以下の方法は、IDO又はIDOと他のタンパク質との融合タンパク質を回収するために使用できる。IDO又はその融合タンパク質が微生物細胞内で可溶の場合には、微生物細胞を回収し、回収した細胞を破砕又は溶解した後の粗酵素溶液の形態で使用できる。さらに、IDO又はその融合タンパク質は、必要に応じて、沈殿、ろ過、カラムクロマトグラフィー、その他の通常の技術により精製した後に使用することもできる。この場合、精製方法は、IDO又はその融合タンパク質に対する抗体を用いるものであってもよい。

タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤により可溶化する。細菌細胞タンパク質と共に可溶化してもよいが、その後の精製の手順を考慮すると、封入体を取り出し、次いで可溶化することが好ましい。従来技術で既知の方法が細菌細胞から封入体を回収するために使用できる。例えば、封入体を、細菌細胞を破砕し、次いで遠心分離することにより回収できる。タンパク質封入体を可溶化する変性剤の例としては、グアニジン塩酸(例えば 6 M, pH 5-8)及び尿素(例えば 8 M)がある。

タンパク質封入体は、透析などの処理によりこれらの変性剤を除くことにより活性タンパク質として再生させることができる。Tris-HCl緩衝液やリン酸緩衝液などの透析溶液を透析に使用でき、濃度は、20 mM〜0.5 M、ｐＨは、５〜８でよい。

再生工程におけるタンパク質濃度は、約500μg/ml以下に保持することが好ましい。再生したIDOが自己架橋するのを防ぐために、透析温度は５℃以下が好ましい。さらに活性は、上述の透析に加えて、希釈や限外ろ過のような変性剤を除く他の方法によって回復すると予測できる。

IDO遺伝子が、Bacillus属に属する細菌由来である場合、好ましい態様の一つでは、IDOを、Escherichia, Pseudomonas, Corynebacterium, Arthrobacter, Aspergillus又はBacillus属の細菌を宿主として用いて発現させ生産することができる。

遺伝子のコピー数は、遺伝子をマルチコピーベクターに挿入し、ベクターを微生物に導入することによって増加させることができる。使用できるベクターには、pMW118, pBR322, pUC19, pBluescript KS+, pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22bなどのE. coliプラスミド、pHY300PLK, pGK12, pLF14, pLF22などのE. coli-B. subtilisシャトルベクター、l1059, lBF101, M13mp9, Mu phage (特開平2-109985)などのファージベクター、及び、Mu, Tn10, Tn5などのトランスポゾン(Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417 (1983))がある。また、プラスミドを用いる相同組換えにより遺伝子を染色体に組み込むことにより遺伝子のコピー数を増加させることができる。この場合の宿主細胞及び発現系の例には、Shaw P. C. et al. (J Gen Micobiol. 134 (1988) p.903-911)によるArthrobacter nicotinovoransでの組換え発現法の報告、Morikawa, M. et al. (Appl Microbiol Biotechnol., 42 (1994), p.300-303)によるArthrobacter sp.での組換え発現法の報告がある。また、コリネ型細菌のために開発された発現系がArthrobacter種にも使用できるといういくつかの報告がある(Sandu C. et al.)。しかし、宿主細胞として使用されるBacillus種細菌及びBacillus IDO用に使用される発現系はこれらのものに限定されない。

［II］(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンの製造法
本発明の、一般式(I)で表わされる(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシン ((2S,3R,4S)-4HIL)の製造法は、下記の反応で示される、(2S,3R,4S)-4HIL を生成するL-イソロイシンの直接的酵素水酸化の一工程反応を含む。

上記反応は、酸素原子の一つの受容分子としてL-イソロイシン、他の酸素原子の受容分子としてα−ケトグルタル酸、二つの酸素原子の供与体として一つの酸素分子、及び、反応を触媒するIDOの存在下で行われる。

本発明において、「酵素水酸化」は、IDO酵素により行われる水酸化反応を意味する。特に細菌IDOが好ましい。

反応を触媒するIDOは特に限定されず、α−ケトグルタル酸及び酸素の存在下でL-イソロイシンの水酸化反応を触媒できるタンパク質である限り、使用可能である。

このようなIDOの好ましい例は、IDOについて記載したセクション[1]で説明したIDOである。本発明の方法において、上述の(2S,3R,4S)-4HILを生産する反応を触媒する上記IDOを含む限り、細菌（培養物、培養細胞、処理細胞を含む）、精製酵素、粗酵素などの任意の形態でIDOを使用できる。IDOの源として細菌を用いる場合、(1) Bacillus属に属する微生物などの天然にIDOを産生する細菌、及び(2)セクション[1]に記載したような組換えDNAで形質転換した組換え微生物の両方を、該微生物を培養することによりIDOを蓄積させるために使用できる。

IDOの性質決定に用いたタンパク質配列は、L-イソロイシンジオキシゲナーゼに分類される(配列番号２、配列番号８、表１)。

本発明のL-イソロイシンジオキシゲナーゼは、下記の性質により定義されるタンパク質も含む。
(A)L-イソロイシンの水酸化により(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンを生成する反応を触媒する活性を有する。
(B)前記活性が二価カチオンFe²⁺に依存する。
(C)SDS-PAGEにより測定した分子量が約29±2.0 kDaである。

例えば、IDOを生産する細菌又は組換えDNAにより形質転換された細菌細胞を用いる(2S,3R,4S)-4HILの製造工程において、培養中に、直接、基質を培養培地に加えてもよいし、培養物から分離した菌体又は洗浄菌体の形態で用いてもよい。さらに、破砕又は溶解した菌体処理物を、直接に用いてもよいし、菌体処理物からIDOを回収して、粗酵素溶液として用いてもよいし、酵素を精製した後に用いてもよい。すなわち、IDOを有する画分の形態である限り、本発明の(2S,3R,4S)-4HILの製造法に用いることができる。

IDOを用いる水酸化反応を実施するために、L-イソロイシン、α−ケトグルタル酸、反応を触媒するタンパク質又はIDO含有組成物を含む反応液を20〜50℃の適切な温度に調整し、pHを５〜12に維持して、30分から５日、静置、振盪又は撹拌する。

反応速度を、Fe²⁺などの二価カチオンを反応液に加えることで改善することもできる。
これらの二価カチオンを反応液に加えた場合、反応を妨げない限り、塩も使用できる。好ましくは、FeSO₄などが使用できる。これらの二価カチオンの濃度は、当業者が行う単純な予備試験で決めることができる。これらの二価カチオンは、0.01 mM 〜50 mM、好ましくは0.1 mM〜25 mMの範囲で加えることができる。

培養中、培養容量の規則的な撹拌の結果として、酸素は、空気から反応に供給される。

反応液で生成した一般式(I)の(2S,3R,4S)-4HILは、既知の技術により分離又は精製でき、あるいは、IDOを発現する組換え微生物を用いて反応を行う場合には特に、そのまま使用してもよい。

分離及び精製法の例としては、(2S,3R,4S)-4HILをイオン交換樹脂に接触させ、塩基性アミノ酸を吸着させ、次いで溶出及び結晶化する方法、及び、溶出により得られる産物を脱色し、活性炭でろ過し、結晶化して、(2S,3R,4S)-4HILを得る方法がある。

他の微生物に由来する非解明遺伝子を、既知のIDO遺伝子との相同性に基づき同定し、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を評価することにより同定できる。

二つのアミノ酸配列の間の相同性は、周知の方法、例えば、スコア、同一性及び類似性の３つのパラメーターを計算するコンピュータープログラムBLAST 2.0を用いて決定できる。

従って、Bacillus thuringiensis 2-e-2株及びBacillus thuringiensis (serovar israelensis; ATCC 35646)株由来の、全長IDOをコードするDNA断片を、既知断片のアミノ酸及び塩基配列に基づき調製したプライマーを用いるPCR（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照）により得ることができる。他の微生物由来のIDOをコードするDNA断片を同様にして得ることができる。

細菌株間でDNA配列に相違があり得るため、使用される、上述のIDOをコードする断片は、配列番号１、７、１２、１６、２０、図１８又は表１に示される塩基配列に限定されず、配列番号１、７、１２、１６、２０、図１８又は表１に示した塩基配列に類似した塩基配列も含まれる。従って、上記の遺伝子によりコードされるタンパク質変異体は、配列番号２、８、１３、１７、２１、図１８又は表１に示されるアミノ酸配列に対し、タンパク質の、前記反応を触媒する能力が維持される限り、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の類似性を有し得る。

さらに、上記DNA断片は、配列番号１、７、１２、１６、２０、図１８又は表１に示した塩基配列に塩基配列又はこれらの塩基配列に基づき調製されたプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る変異体により示され得る。ここで、「ストリンジェントな条件」は、[1](1)IDOをコードするDNAのセクションに記載したのと同様である。

本発明で使用される菌体処理物の形態としては、乾燥菌体、凍結乾燥菌体、界面活性剤又は有機溶剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的摩砕物、溶媒処理物、菌体のタンパク質分画、菌体の固定化物、菌体加工物があげられる。

IDOは、上述のように分離して調製し、反応液に添加してもよい。IDOをコードするDNAを発現する細菌（宿主細胞）は、それらの活性を有する宿主細胞で発現できる形態でIDOをコードするDNAを機能的に含む発現ベクターのトランスフェクションにより調製できる。さらに、IDOをコードする遺伝子の発現を増加することによりIDOの活性が増大した宿主細胞が好ましくは用いられる。

「遺伝子の発現を増加する」という語句は、遺伝子の発現が非改変菌株、例えば野生型菌株より高いことを意味する。そのような改変の例は、細胞１個当たりの発現された遺伝子のコピー数を増加させること、遺伝子の発現レベルを増加させることなどを含む。発現された遺伝子のコピー数の量は、例えば、染色体のDNAの制限後、遺伝子配列に基づいた
プローブを用いたサザンブロッティング、蛍光in situハイブリッド法（FISH）等で測定する。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量的RT-PCRなどを含む様々な既知の方法で測定することができる。遺伝子によってコードされたタンパク質の量は、SDS-PAGE後イムノブロッティング法検定(ウェスタンブロッティング分析)等を含む既知の方法で測定することができる。

「タンパク質をコードするDNAによる細菌の形質転換」とは、細菌にDNAを例えば、従来の方法で導入することを意味する。このDNAの形質転換は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現の増加をもたらし、細菌の細胞中のタンパク質の活性を増強することになる。形質転換の方法は、従来報告されたすべての既知の方法を含む。例えば、細胞のDNAに対する浸透性を増加させるために塩化カルシウムで受容体細胞を処理する方法がエシェリヒア・コリK-12株について報告されており、使用できる。(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).

遺伝子発現を増強する方法は遺伝子コピー数を増加させることを含む。本発明の細菌中で機能できるベクターへ遺伝子を導入すれば、遺伝子のコピー数が増加する。そのような目的のために、好ましくは多コピーベクターが使用できる。多コピーベクターは、pBR322、pMW119、pUC19、pET22b等が例示される。

遺伝子発現の増強は、例えば相同的組み換え、または、Mu組込みなどにより細菌の染色体へ、遺伝子の多数のコピーを導入することでも達成できる。例えば、Mu組込み1回の実行で、細菌の染色体中に遺伝子のコピーが3個まで導入できる。

遺伝子のコピー数を増加させることは、細菌の染色体のDNAへ遺伝子の多数のコピーを導入することによっても達成できる。細菌の染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入するためには、多数のコピーが存在する配列を染色体のDNA中の標的として使用して、相同的組み換えを実行する。染色体のDNAに多数のコピーを持つ配列は、反復DNAまたは転位因子の末端にある逆方向反復を含むが、これらに制限されない。さらに、米国特許番号5,595,889に開示のように、トランスポゾンに遺伝子を組み入れて、それを染色体のDNAへ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させることも可能である。

遺伝子発現を増強することは、本発明のDNAを強力なプロモーターの制御下におくことによっても達成できる。例えば、P_tac プロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、λファージのP_RまたはP_Lプロモーターはすべて有効なプロモーターであることが知られている。強力なプロモーターは遺伝子コピーの増加と組み合わせて使用できる。

あるいは、プロモーターの効果は、例えば、プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増加するよう、プロモーターに変異を導入して増強できる。更に、リボソーム結合部位(RBS)と開始コドン間のスペーサ中のいくつかのヌクレオチド、特に開始コドンのすぐ上流配列の置換がmRNA翻訳能力に深く影響することが知られている。例えば、開始コドンに先行する3箇のヌクレオチドの性質によって発現レベルに20倍の範囲があることが見出されている(Gold ら, Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui ら., EMBO J., 3, 623-629, 1984)。以前に、rhtA23変異は、ATG開始コドンに対して−1の位置でGをAに置換することであると報告されている(1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biologyと共催の第17回 International Congress of Biochemistry and Molecular Biology San Francisco, California August 24-29, 1997, 抄録番号 457).

さらに、細菌の染色体上の遺伝子のプロモーター領域にヌクレオチド置換を導入するこ
とも可能であって、これによりプロモーター機能がより強められる。発現制御配列の変更は、例えば、国際公開WO 00/18935 および特開平1-215280号に開示されているように温度敏感なプラスミドを使用して行う遺伝子置換と同様に実行可能である。

プラスミドDNAの調製方法は、DNAの消化と連結、形質転換、プライマーとしてオリゴヌクレオチドの選択など、または、当業者に既知の他の方法を含むが、これらに限定されない。これらの方法は、例えばSambrook, J., Fritsch, E..F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載されている。

以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。なお本発明は、この実施例により何ら限定されない。

［実施例１］L-Ile水酸化酵素を有する株のスクリーニング
＜１＞４-ヒドロキシイソロイシン生産株のスクリーニングとブロスの解析
L-イソロイシンを基質に、４-ヒドロキシイソロイシン生成能を有する微生物のスクリーニングを実施した。可溶性澱粉０．４％（ｗ／ｖ）、酵母エキス ０．４％、麦芽エキス １％、L-イソロイシン ０．２％を水に溶解後、ｐＨ７〜７．５に調整した培地に土壌菌を植菌した。２８℃で２日間、振とう培養した後、遠心上清のアミノ酸分析により、４−ヒドロキシイソロイシンの分析を行った。

アミノ酸分析条件
４−ヒドロキシイソロイシンの検出はウォーターズ AccQ・Tag^TMメソッドを用いた。定法に従って適切な濃度に希釈した反応液５μｌ中のアミノ酸を誘導体化し、ＨＰＬＣにて分析することで４−ヒドロキシイソロイシン生成量を測定した。その結果、菌株の一つ（2-e-2株）に４−ヒドロキシイソロイシンと同じリテンションタイムの物質を生成する活性が見出された。16SrDNAの解析から、2-e-2株はBacillus thuringiensisと同定された。そこで、他のバチルス属に関してもスクリーニングしたところ、Bacillus licheniformis（AKU223株、IAM11054株）、Bacillus sphaericus（AKU227株、NBRC3526株）、Bacillus thuringiensis（AKU238株、NBRC3958株）にも同様の活性が見出された。

生成物の同定
上記スクリーニングで取得されたバチルス属菌株がＬ−イソロイシンを基質に生成する物質の同定を実施した。まず、生成物の分子量をＭＳにより分析したところ、１４５であり、４−ヒドロキシイソロイシンよりも、２小さい値であった。また高分解能質量分析装置（Q-TofMS）による精密質量測定で組成式を推定したところ、C₆H₁₁NO₃で４−ヒドロキシイソロイシンよりも水素原子が２少ないことが判明した。以上の結果より、上記バチルス属菌株で生成されている物質は、２−アミノ−３−ケト−４−メチルペンタン酸（ＡＭＫＰ）の可能性が示唆された。バチルス属細菌によるＡＭＫＰ生産の報告[非特許文献５]に記載の実験方法に従ってAMKPを合成・精製し、また、上記バチルス菌培養培地中より生成物を非特許文献５のAMKP精製法に従って精製し、NMR分析を実施したところ、両者は同じケミカルシフトを示した。

以上より、今回見出されたバチルス菌はAMKPを産生している事が明らかとなった。なお、2-e-2株によるAMKP産生量は１〜２mM程度である。一方、非特許文献５に記載のバチルス菌のAMKP産生推定量は０．０４mMと記載されており、2-e-2株のAMKP高生産活性が確認された。

＜２＞ＡＭＫＰとＨＩＬの分離分析法確立
2-e-2株等ののバチルス菌にAMKP生産活性が見出されたため、AMKPと４−ヒドロキシイソロイシンの分離分析法を確立する必要があることが判明した。そこで鋭意検討の結果、ウォーターズ AccQ・Tag^TMメソッドを改変することでAMKPと４−ヒドロキシイソロイシンの分離分析法を確立した。具体的条件として、カラムをXBridge C18 5mm, 2.1 x 150mm (Waters)に、溶離液BをMeOH、溶離液流速を0.3ml/minに変更した。溶離液の勾配は下表に示す。

上記条件で、培地中AMKPは11.0minあたりに、4-ヒドロキシイソロイシンは11.9minあたりに溶出され、分離可能となった。

＜３＞培養時の補因子添加によるＡＭＫＰの生成量変化
AMKP生成活性の機構として、水酸化による分子状酸素の取り込みの可能性を考えた。そこで2-e-2株培養時に、モノオキシゲナーゼの補因子NAD(P)Hを、あるいはジオキシゲナーゼの補因子Fe²⁺、2-オキソグルタル酸、アスコルビン酸を添加した場合のAMKP生成活性を解析した。

先のスクリーニングに用いた培地での培養をコントロールとし、１０mM NADP、１０mM NADPHを添加した群、Fe²⁺を添加した群、並びに、Fe²⁺、２−オキソグルタル酸及びアスコルビン酸を添加した群でAMKP生産活性を比較した。培養温度は30℃で、培養時間は22時間とした。培養上清のAMKP濃度を測定した。結果を表３に示す。

AMKP生成にはその生成過程にジオキシゲナーゼが関与している可能性が示唆された。

＜４＞2-e-2株ブロスの経時的変化
AMKP生産培地（可溶性澱粉０．４％（ｗ／ｖ）、酵母エキス ０．４％、麦芽エキス １％、L-イソロイシン ０．２％、グルコース ０．５％、アスコルビン酸 １mM、２−オキソグルタル酸 １mM、CaCl₂ １mM、MgSO₄ １mM、ｐＨ７〜７．５）を３Lの坂口フラスコに張り込み、2-e-2株を23℃にて振とう培養した。培養開始後、０、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０時間後に培養液をサンプリングし、培養液の４−ヒドロキシイソロイシンとAMKPを上記＜２＞記載の方法にて定量した。また濁度(OD₆₆₀)を測定した。

図１に４−ヒドロキシイソロイシン(HIL)とAMKPの濃度を、図２に培養液の濁度を示す。４−ヒドロキシイソロイシンとAMKPの総和は対数増殖期に増加し、その後はプラトーに達した。また、プラトーに達した後、４−ヒドロキシイソロイシンは斬減し、AMKPは斬増した。

上記の各培養時間での培養液200μｌから2-e-2株菌体を取得し、生理食塩水で洗浄した後、100μlのジオキシゲナーゼ反応液（１０mM Ile、１mM Fe²⁺、１０mM ２−オキソグルタル酸、１０mM アスコルビン酸、５０mM リン酸カリウムバッファー(pH7.0)）に懸濁させ、30℃、1時間振とうさせながら反応し、その上清中の４−ヒドロキシイソロイシンとAMKP生成量を測定した。その結果、図３に示すとおり微量であるが対数増殖期の細胞を用いた場合のみ、４−ヒドロキシイソロイシンとAMKPの生成が確認できた。

＜５＞２−ｅ−２株細胞破砕液によるＨＩＬ生成
AMKP生産培地にてOD₆₆₀=3.2まで培養後、集菌洗浄した2-e-2株菌体を乳鉢で破砕した後、懸濁用緩衝液（５０mM HEPES pH7.0、１０％ グリセロール、complete mini (Roche)）で懸濁し、タンパク質濃度が10 mg/ml程度の懸濁液（破砕液）、並びに懸濁液の遠心沈殿物を得た。遠心沈殿物は最終的に破砕液と同じ容量の生理食塩水で懸濁した。これらを等量の2×ジオキシゲナーゼ反応液（１０mM Ile、２mM Fe²⁺、１０mM ２−オキソグルタル酸、１０mM アスコルビン酸、１００mM HEPES(pH7.0)）と混合し、３０℃で１時間反応させた。同様に、破砕液調製に使用した休止菌体を洗浄後、培養ブロスの10倍濃度に生理食塩水で懸濁し、等量の2×ジオキシゲナーゼ反応液と混合し反応させた。各サンプルのAMKPと４−ヒドロキシイソロイシン生成量を図４に示す。

破砕液を用いる事でIleを基質にした４−ヒドロキシイソロイシンの生成活性が明確に確認できた。

＜６＞２−ｅ−２株細胞破砕液酵素の補因子の影響
対数増殖期の2-e-2株細胞破砕液を用いて、Ileの水酸化による４−ヒドロキシイソロイシン生成反応時の補因子の影響を検討した。上記＜５＞記載の方法にて調製した対数増殖期2-e-2株細胞破砕液(lysate)を最終濃度が５mM Ileと５mM 各種補因子を含有した５０mM
HEPES (pH7)反応液にて反応させ、４−ヒドロキシイソロイシン生成量を測定した。表４に示すとおり、４−ヒドロキシイソロイシン生成にFe²⁺(Fe)と２−オキソグルタル酸(a-KG)が必須であり、更にアスコルビン酸(Asc.)を添加することで４−ヒドロキシイソロイシン生成量は最大となった。よってイソロイシン水酸化による４−ヒドロキシイソロイシン生成にはジオキシゲナーゼが関与している可能性が強く示唆された。

＜７＞2-e-2株破砕液生成物の立体配置
４−ヒドロキシイソロイシンには3ヵ所の不斉炭素があり、8種類のジアステレオマー、4対のエナンチオマーが存在する。具体的にはエナンチオマーは(2S,3S,4S)と(2R,3R,4R)｛以降HIL１とも記載する｝、(2S,3S,4R)と(2R,3R,4S)｛以降HIL2とも記載する｝、(2S,3R,4R)と(2R,3S,4S)｛以降HIL3とも記載する｝、(2S,3R,4S)と(2R,3S,4R)｛以降HIL4とも記載する｝の4対であり、Fenugreekなどに存在する天然型HILは(2S,3R,4S)である。本発明において、基質は(2S,3S)イソロイシンを使用しているため、水酸化反応で生成する４−ヒドロキシイソロイシンは(2S,3R,4S)あるいは、(2S,3R,4R)のいずれかとなる。そこで、2-e-2株にて生成する４−ヒドロキシイソロイシンの立体配置を決定することとした。

各種エナンチオマー対として、(2R,3R,4R)：HIL1と(2S,3R,4R)：HIL3をTetrahedron 47(32), 6469-6482, (1991)に従って、(2R,3R,4S)：HIL2と(2S,3R,4S)：HIL4をEur. J. Org. Chem. 834-839, (2002)に従って取得した。化学合成法にて取得したHIL1〜4を、上記＜２＞の４−ヒドロキシイソロイシン、ANKP同時分析条件で分析したところ、リテンションタイムは表５の通りであった。

上記＜６＞にて調製した４−ヒドロキシイソロイシン含有サンプルを分析したところ、リテンションタイムは11.99minであり、HIL4のスタンダードの４−ヒドロキシイソロイシンと混合して分析したところ、ピークは完全に一致した。よって、(2S,3S)イソロイシンを基質とした場合、生成する可能性のあるHIL3、HIL4のうち、本酵素により生成する４−ヒドロキシイソロイシンはHIL4となり、天然型４−ヒドロキシイソロイシンであることが示された。

＜８＞2-e-2株破砕液酵素の至適ｐＨ
上記＜５＞に記載の方法に従って、OD₆₆₀=7の2-e-2株菌体より調製した細胞破砕液を用いて、４−ヒドロキシイソロイシン生成活性のpH依存性を評価した。ジオキシゲナーゼ反応液組成は５mM Ile、５mM Fe²⁺、５mM ２−オキソグルタル酸、５mM アスコルビン酸、１００mM GTAであり、反応後に反応液のpHを測定した。反応温度は30℃とした。生成した４−ヒドロキシイソロイシンは＜２＞の方法で分析した。最大生成量を示したpHのHIL量を100%とし、それに対する相対活性比率で各pHの反応性を図５に示す。pHがpH5〜8において活性が確認できた。

＜９＞2-e-2株破砕液酵素の至適温度
上記＜５＞に記載の方法に従って、OD₆₆₀=7の2-e-2株菌体より調製した細胞破砕液を用いて、４−ヒドロキシイソロイシン生成活性の温度依存性を評価した。ジオキシゲナーゼ反応液組成は５mM Ile、５mM Fe²⁺、５mM ２−オキソグルタル酸、５mM アスコルビン酸、１００mM GTA (pH6)で反応温度は15〜50℃とした。生成した４−ヒドロキシイソロイシンは＜２＞の方法で分析した。最大生成量を示したpHの４−ヒドロキシイソロイシン量を100%とし、それに対する相対活性比率で各温度の反応性を図６に示す。至適温度は45℃以下であった。

＜１０＞2-e-2株破砕液酵素の温度安定性
上記＜５＞に記載の方法に従って、OD₆₆₀=7の2-e-2株菌体より調製した細胞破砕液を用いて、４−ヒドロキシイソロイシン生成活性の温度安定性を評価した。破砕液を0〜50℃で1hrインキュベーションした後、Ile水酸化活性を測定した。基質反応液組成は５mM Ile、５mM Fe²⁺、５mM ２−オキソグルタル酸、５mM アスコルビン酸、１００mM Hepes (pH7)で反応温度は30℃とした。生成した４−ヒドロキシイソロイシンは実施例2の方法で分析した。最大生成量を示した温度の４−ヒドロキシイソロイシン量を100%とし、それに対する相対活性比率で各温度の温度安定性を図７に示す。50℃以上で酵素は失活した。

＜１１＞2-e-2株破砕液酵素の基質反応特性
上記＜５＞に記載の方法に従って、OD₆₆₀=7の2-e-2株菌体より調製した細胞破砕液を用
いて、各種アミノ酸に対する反応特性を評価した。破砕液と基質溶液と混合後、３０℃、１時間反応させ、TLCやアミノ酸分析によって新たな物質の生成を評価した。基質反応液組成は５mM アミノ酸、５mM Fe²⁺、５mM ２−オキソグルタル酸、５mM アスコルビン酸、１００mM Hepes (pH7)で、アミノ酸としてL-イソロイシンに加えてL-ロイシン、L-バリン、L-グルタミン酸、L-リジンを個別に評価した。生成した４−ヒドロキシイソロイシンは実施例１の方法で分析した。結果を表６に示す。L-イソロイシン以外のアミノ酸に対しては、新たな物質の生成は確認できなかった。よって、本酵素はイソロイシン特異的なジオキシゲナーゼであると示唆された。

＜１２＞2-e-2株破砕液酵素の阻害剤の影響
上記＜５＞に記載の方法に従って、OD₆₆₀=7の2-e-2株菌体より調製した細胞破砕液を用いて、４−ヒドロキシイソロイシン生成活性に対する阻害剤の影響を検討した。上記＜５＞に記載の方法に従って、OD₆₆₀=7の2-e-2株菌体より調製した細胞破砕液を用いた。ジオキシゲナーゼ反応液組成は５mM Ile、５mM Fe²⁺、５mM ２−オキソグルタル酸、５mM アスコルビン酸、１００mM Hepes (pH6)で反応温度は30℃、反応時間は1時間とした。反応時に、10 mMの阻害剤（EDTA, Cu²⁺, Zn²⁺）を個別に添加した場合の４−ヒドロキシイソロイシン生成量を測定した。４−ヒドロキシイソロイシンは上記＜２＞の方法で分析した。イソロイシン水酸化活性は阻害剤により活性が消失した。

［実施例２］ L-Ile水酸化酵素の単離と精製
（１）無細胞抽出液の調製
2-e-2を合計２LのAMKP生産培地にてOD₆₆₀=6.0まで培養後、生理食塩水で菌体を洗浄した。菌体は細胞膜処理液（10 mg/ml Lysing enzyme(SIGMA), 5 mg/ml Cellulase "ONOZUKA" R-10(Yakult), Yatalase(Takara Bio), 1 mg/ml Lysozyme (SIGMA)を0.2 M NaH₂PO₄,
0.6 M KCl (pH5.5)に溶解）に懸濁後、30℃、1 hrインキュベーションした。インキュベーションした菌体を生理食塩水で洗浄した後、緩衝液A（５０mM HEPES pH7.0, １０％ グリセロール, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, complete (Roche)）に懸濁し、氷冷下、超音波破砕機（Branson）にて菌体を破砕した。この処理液を4℃、１８，５００×ｇ、６０分間遠心分離し、上清を取得した。これ以降の単離・精製操作は全て４℃あるいは氷冷下にて実施した。

（２）陰イオン交換クロマトグラフィー
前工程で得た上清を０．４５μｍのフィルターで濾過した後、予め緩衝液Aで平衡化しておいたDEAE（１６ｍｍ×１００ｍｍ：GEヘルスケアバイオサイエンス）に供した。カラムを緩衝液Aで洗浄後、緩衝液B（５０mM HEPES pH7.0, １０％ グリセロール, 2 mM DTT,
1 mM EDTA, 0.5 M NaCl, complete (Roche)）にて食塩の直線濃度勾配を用いて溶出した
。

（３）活性画分の検出
各フラクションはIle水酸化活性反応液（最終濃度が100 mM Hepes (pH6.0), 5 mM L-Ile, ５mM Fe²⁺, ５mM ２−オキソグルタル酸, ５mM アスコルビン酸）を用いて30℃、３０分間反応させた。100℃にて酵素失活した後、先述のAMKP, HIL分離測定法にて４−ヒドロキシイソロイシン量を定量した。これ以降の分析の４−ヒドロキシイソロイシンとは天然型４−ヒドロキシイソロイシンと同じリテンションタイムを有する異性体のみを示す。なお、１分間当たり１ｎｍｏｌのHILを生成する酵素活性を１Uとした。

（４）陽イオン交換クロマトグラフィー
前工程で得た活性画分をdesalting column（GEヘルスケアバイオサイエンス）にて緩衝液C（５０mM MES pH5.2、１０％ グリセロール、2 mM DTT, 1 mM EDTA, complete (Roche)）に置換した。本置換液を、予め緩衝液Cで平衡化しておいたmonoS（１０ｍｍ×１００ｍｍ：GEヘルスケアバイオサイエンス）に供した。カラムを緩衝液Cで洗浄後、緩衝液D（５０mM MES pH5.2、１０％ グリセロール、2 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl, complete
(Roche)）にて食塩の直線濃度勾配を用いて溶出し、各フラクションのIle水酸化活性を測定した。

（５）硫酸アンモニウム沈殿
前工程で得た可溶性画分に2 M硫酸アンモニウムを添加溶解した。十分に攪拌した後、遠心分離にて可溶性画分と沈殿画分に分画し、沈殿画分は緩衝液Aにて溶解した。各画分のIle水酸化活性を測定したところ、沈殿画分に活性が検出された。

（６）サイズ排除クロマトグラフィー
前工程で得た活性画分を、予め緩衝液Aで平衡化しておいたSuperdex 75（１０ｍｍ×３００ｍｍ：GEヘルスケアバイオサイエンス）に供した。緩衝液Aにて溶出し、各画分のIle水酸化活性を測定した。

（７）疎水性相互作用クロマトグラフィー
前工程で得た活性画分を緩衝液E（５０mM MES pH6.5、１０％ グリセロール、2mM DTT,
1mM EDTA, １M 硫酸アンモニウム, complete (Roche)）に置換した。緩衝液置換サンプルは、予め緩衝液Eで平衡化しておいたResource PHE（1ml：GEヘルスケアバイオサイエンス）に供した。カラムを緩衝液Eで洗浄後、Ile水酸化活性酵素を含む画分を緩衝液F（５０mM MES pH6.5、１０％ グリセロール, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, complete (Roche)）を用いて硫酸アンモニウムの逆直線濃度勾配を用いて溶出した。

L-Ile水酸化酵素の単離、精製の概要を表７にまとめた。

［実施例３］l-Ile水酸化酵素の性質決定
＜１＞電気泳動による分析
実施例２で得られた精製標品を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動法（第一化学薬品製ポリアクリルアミドゲルPAGミニ 「第一」 15/25 (13well)、及びバイオラッド社製分子量スタンダード Prestained SDS-PAGE standards, Low Range）によって分析した。その結果、本酵素は分子量約３１，０００±２０，０００のほぼ均一なサブユニットからなることが明らかとなった。

＜２＞補因子の添加効果
精製酵素を用いて、Ileの水酸化による４−ヒドロキシイソロイシン生成反応時の補因子の影響を検討した。実施例２記載の方法にて調製したL-Ile水酸化酵素を最終濃度が５mM L-Ileと５mMの各種補因子を含有した100mM HEPES (pH6)反応液にて反応させ、４−ヒドロキシイソロイシン生成量を測定した。表８に示すとおり、４−ヒドロキシイソロイシン生成にFe²⁺と２−オキソグルタル酸が必須であり、更にアスコルビン酸を添加することで４−ヒドロキシイソロイシン生成量は最大となった。よってL-イソロイシン水酸化による４−ヒドロキシイソロイシン生成にはジオキシゲナーゼが関与している可能性が強く示唆され、破砕液を用いた検討結果と同じであった。

＜３＞至適pH
実施例２記載の方法に従って調製したL-Ile水酸化酵素を用いて、４−ヒドロキシイソロイシン生成活性のpH依存性を評価した。酵素反応液組成は５mM L-Ile、５mM Fe²⁺、５mM ２−オキソグルタル酸、５mM アスコルビン酸、２００mM GTA (pH3〜12)とした。反応温度は30℃とした。最大生成量を示したpHの４−ヒドロキシイソロイシン量を100%とし、それに対する相対活性比率で各pHの反応性を図８に示す。pHがpH４〜8において活性が確認でき、ｐＨ５〜８において高い活性が確認できた。

＜４＞至適温度
実施例２記載の方法に従って調製したL-Ile水酸化酵素を用いて、４−ヒドロキシイソロイシン生成活性の至適温度を評価した。酵素反応液組成は５mM Ile、５mM Fe²⁺、５mM ２−オキソグルタル酸、５mM アスコルビン酸、100 mM Hepes (pH6)とした。最大生成量を示した温度の４−ヒドロキシイソロイシン量を100%とし、それに対する相対活性比率で各温度での反応性を図９に示す。0℃〜40℃の温度帯で高い活性が確認できた。

＜５＞温度安定性
実施例２記載の方法に従って調製したL-Ile水酸化酵素を用いて、４−ヒドロキシイソロイシン生成活性の温度安定性を評価した。pH7.0の酵素液を0〜70℃で1hrインキュベーションした後、Ile水酸化活性を測定した。酵素反応液組成は５mM Ile、５mM Fe²⁺、５mM
２−オキソグルタル酸、５mM アスコルビン酸、100 mM Hepes (pH6)で反応温度は30℃とした。最大生成量を示した保存温度の４−ヒドロキシイソロイシン量を100%とし、それに対する相対活性比率で各温度の温度安定性を図１０に示す。60℃以上で酵素は失活した。

＜６＞基質反応特性
実施例２記載の方法に従って調製したL-Ile水酸化酵素を用いて、各種アミノ酸に対する反応特性を評価した。酵素液と反応液とを混合後、３０℃、１時間反応させ、HPLC分析によって新たな物質の生成を評価した。酵素反応液組成は５mM アミノ酸、５mM Fe²⁺、５mM ２−オキソグルタル酸、５mM アスコルビン酸、１００mM Hepes (pH6)で、アミノ酸としてL-イソロイシンに加えてD-イソロイシン、L-ロイシン、L-バリン、L-グルタミン酸、L-リジンを個別に評価した。生成した４−ヒドロキシイソロイシンは実施例１の方法で分析した。結果を表９に示す。破砕液を用いた検討結果と同様に、L-イソロイシン以外のアミノ酸に対しては、新たな物質の生成は確認できなかった。よって、本酵素は細胞破砕液を用いて検討した結果と同様に、L-イソロイシン特異的なジオキシゲナーゼで天然型HILを生成する活性を有すると示唆された。

＜７＞阻害剤の影響
実施例２記載の方法に従って調製したL-Ile水酸化酵素を用いて、４−ヒドロキシイソロイシン生成活性に対する阻害剤の影響を検討した。酵素反応液組成は５mM Ile、５mM Fe²⁺、５mM ２−オキソグルタル酸、５mM アスコルビン酸、１００mM Hepes (pH6)で反応温度は30℃、反応時間は1時間とした。反応時に、10 mMの阻害剤（EDTA, Cu²⁺, Zn²⁺）を個別に添加した場合の４−ヒドロキシイソロイシン生成量を測定した。阻害剤を添加しない場合の４−ヒドロキシイソロイシン生成活性を100%とし、その生成量に対する相対活性を表１０に示した。イソロイシン水酸化活性は阻害剤により活性が消失した。

＜８＞N末端アミノ酸配列
実施例２記載の方法に従って調製したL-Ile水酸化酵素を実施例３の方法に従って電気泳動した後、PVDF膜（バイオラッド社製 sequi-Blot^TM PVDF membrane）に転写し、島津製作所社製プロテインシーケンサーPPSQ-10に供した。上記方法にて取得した酵素のN末端配列として、以下の結果を得た。

1 LysMetSerGlyPheSerIleGluGluLys 10
11 ValHisGluPheGluSerLysGlyPheLeu 20
（配列番号５）

［実施例４］Bacillus thuringiensis (2-e-2) 株由来IDOの精製
本発明の発明者らにより準備された環境微生物のスクリーニングにより、α−ケトグルタル酸依存Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有する独自の微生物が見出された。これは、Bacillus thuringiensisと同定され、Bacillus thuringiensis 2-e-2 (FERM BP-10688)として保存された。

１．１．培養条件
下記の培養培地を実験に用いた。
CM1 (トリプトン 10g/l; イーストエキストラクト 10 g/l; NaOHでpH 7.0に調整)
CM6 (トリプトン 10 g/l; イーストエキストラクト 40 g/l; NaOHでpH 7.0に調整)

１．２．接種物調製
Bacillus thuringiensis 2-e-2株を、90 mM KPi バッファー (90 mM KH₂PO₄ (KOHでpH
7に調製))を加えたCM1培地で一晩30℃において培養した。次いで、グリセロールを培養物に２０％まで添加した。得られた細胞懸濁液を1.9 mlバイアルに分け、-使用時まで70℃で保存した。

１．３．培養条件
Bacillus thuringiensis 2-e-2株の培養を、Marubischi ファーメンターを用いて行った。培養パラメーターは次の通りであった。開始培養容積600ml、撹拌800rev/min、空気1:1、1N NaOH/HClの供給によりpH 7.0に調製。１バイアル(1.9 ml)の凍結懸濁液（上記参照）を、600mlのCM6培地への接種に用いた。2-e-2株を、約7.5時間培養した。次いで、遠心により菌体を採取し、使用時まで-70℃で保存した。

１．４．IDO活性測定
Bacillus thuringiensis 2-e-2株の培養物25〜100mlから、菌体を遠心分離で採取し、2mlのバッファーＡ（50 mM MOPS, 10% グリセロール, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, プロテアーゼインヒビター, pH 7.2）に再懸濁した。菌体をフレンチプレスセルを用いて破砕した（1000 Psiで３回）。反応液(50μl)は、50 mM HEPES pH 7.0; 5 mM Ile; 5 mM アスコルビン酸; 10 mM FeSO₄; 5mM α-ケトグルタル酸及びタンパク質調製物の試料を含むものであった。反応は、34℃で40分、振盪しながら保温した。合成された4HILをTLC分析で検出した。薄層シリカゲルプレート(10x15 cm)に、反応液の試料(1~2μl)をスポットし、展開溶媒（2-プロパノール: アセトン: アンモニア: 水 =100:100: 25:16）で展開した。4HILをニンヒドリン試薬で検出した。HPLC分析は実施例４に記載されたように行った。

１．５．Bacillus thuringiensis 2-e-2株由来IDOの精製及び同定
全てのクロマトグラフィーの操作は、AKTAbasic100 システム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて行った。精製プロトコルは次の段階を含む。凍結細胞（62g生物体重量）を融解し、150mlのバッファーＡ[50 mM TRIZMA, 5% グリセロール, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, プロテアーゼインヒビター, HClでpH 7に調整]に再懸濁した。

段階１． 菌体をフレンチプレスセル(max P = 1000 Psi)を２回通過させて破砕し、遠心し(14000 g, 4℃, 20 min)、細胞片を除いた。得られたタンパク質調製物をバッファーＡで平衡化したDEAE樹脂150mlに加えた。最終懸濁液を４℃で約10分、ゆっくり振盪しながら保温した。次いで、吸着したタンパク質を有する樹脂をカラム(26X30 cm)に移し、２ステップ溶出を行った。最初に、カラムをバッファーＡ中50 mM NaClで洗浄し、次いで、IDO活性をバッファーＡ中250 mM NaClで溶出した。

段階２． IDO活性を硫酸アンモニウム沈殿(1.9 M)で濃縮し、約３mlのバッファーＢ[50 mM TRIZMA, 5% グリセロール, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, pH 7]に再懸濁した。

段階３． 段階２で得られた調製物の1.5mlを、バッファーＢで平衡化したSuperdex 200 HR 10/30Aにアプライした。アイソクラティック溶出を、0.5 ml/minの流速で行った。活性画分を集めた。

段階４． 段階３で得られたタンパク質調製物を、バッファーＡで平衡化した1.6mlのSourse15Qカラムにアプライした。溶出は、バッファーＢ中の0-0.5 M NaClの直線グラディエント（10倍カラム容量）を用いて0.5 ml/minの流速で行った。各1mlの画分を回収し、活性画分を集めた。

結果として、IDOは約120倍（表１１参照）に精製された。最終タンパク質調製物のSDS-PAGEにより、主なバンドは１本のみであることが示された（全タンパク質の約70%、図１２参照）。

１．６．IDOの同定
SDS-PAGEから主なタンパク質を抽出し、重量分析により分析した。ゲルの処理、トリプシン分解、タンパク質抽出及び、飛行時間マトリックス支援レーザ脱離イオン化法による質量分析（MALDI-TOF）は、Govorun, V.M. et al, (The proteome comparative analysis
of Helicobacter pylori clinical isolates. Biochemistry (Mosc), 68, 1, 42-49 (2003))のプロトコルに従って行った。タンパク質は、Mascot software (Matrix Science, USA)のPeptide Fingerprintオプションを用いて、光分解ペプチド質量のセットにより同定された。分析されたタンパク質は、MS分析により、Bacillus thuringiensis (serovar israelensis; ATCC 35646) 株由来の推定RBTH_06809タンパク質と同定された（図１３）。

［実施例５］Bacillus thuringiensis 2-e-2株及びBacillus thuringiensis (serovar israelensis, ATCC 35646) 株由来のIDO遺伝子のクローニング
精製した試料をSDS(15-25%)ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。タンパク質のポリビニリデンジフルオリド膜への転写は、室温で１時間1 mA cm²で行った。CBBで染色後、IDOバンドを切り出し、プロテインシークエンサーPPSQ-10型 (島津製作所,日本)による自動Edman分解に付した。精製タンパク質のN-末端の最初の２０アミノ酸が決定された。

31-kDaポリペプチドのN-末端アミノ酸配列は、KMSGFSIEEKVHEFESKGFL (配列番号５)と決定された。BLAST検索により、このアミノ酸配列は、表１に示した、Bacillus thuringiensis (serovar israelensis) ATCC 35646由来のRBTH_06809及び、Bacillus cereus ATCC
14579 由来のBC1061の仮想タンパク質と高い相同性を示した。RBTH_06809のORFの配列分析及び精製タンパク質のN-末端アミノ酸の決定により、古典的SD配列が、ATG開始コドンの８ｂｐ上流に位置することから、可能性のある翻訳開始部位は一つのみであることが示された（図１４）。しかし、精製タンパク質のLys(7)がN-末端アミノ酸である。N-末端プロセッシング（N-末端アミノ酸の切断）がIDO活性に必要と推測された。おそらく、この切断は、Bacillus sp.ではIDOと同時発現し、E. coliでは欠損している特異的プロテアーゼによるものである。従って、E. coliで成熟IDOを製造するためには特別な組換えプラスミドが構築された。

２．１．細菌
Bacillus thuringiensis (serovar israelensis, ATCC 35646) 株は、Russian Collect
ion of Industrial Microorganisms (VKPM)から入手した（accession number B-197）。

２．２．pMW119-IDO(Lys, 32)プラスミドの構築
pMW119-IDO(Lys, 32)を構築するために、以下の手順を行った。
Bacillus thuringiensis (serovar israelensis, ATCC 35646) 株染色体の0.8 kb DNA断片を、オリゴヌクレオチドSVS 170 (配列番号３)及びSVS 169 (配列番号４) をプライマーとして （詳細は図１５参照）、精製染色体DNAをテンプレートとして用いて増幅した。次のPCRプロトコルを用いた。最初のサイクル：94℃30秒、４サイクル：94℃40秒、49℃30秒及び72℃４０秒、３５サイクル：94℃30秒、54℃30秒及び72℃30秒。得られたPCRフラグメントをBamHI及びSacIエンドヌクレアーゼで消化し、次いで、同じ制限酵素で予め処理したpMW119ベクターに連結した。

２．３．pMW119-IDO(Lys, 23)プラスミドの構築
Bacillus thuringiensis 2-e-2株染色体の0.8 kb DNA断片を、オリゴヌクレオチドSVS 170 (配列番号３)及びSVS 169 (配列番号４)をプライマーとして（詳細は図１５参照）、精製染色体DNAをテンプレートとして用いて増幅した。次のPCRプロトコルを用いた。最初のサイクル：94℃30秒、４サイクル：94℃40秒、49℃30秒及び72℃４０秒、３５サイクル：94℃30秒、54℃30秒及び72℃30秒。得られたPCRフラグメントをBamHI及びSacIエンドヌクレアーゼで消化し、次いで、同じ制限酵素で予め処理したpMW119ベクターに連結した。

E. coli TG1株の細胞を、連結混合物で形質転換した。得られるクローンをX-gal/IPTG 寒天-プレート (ブルー/ホワイトテスト)で選択した。次いで、IDO活性を、選択したクローンの粗細胞破砕液で試験した。

その結果、TG1 [pMW119-(Lys, 32)] 及びTG1 [pMW119-(Lys, 23)]の二つのクローンが選択された。対応するプラスミドを単離し、各プラスミドのクローンされたBamHI-SacI 断片の配列決定を行った（図１６、図１７参照）。

決定されたDNA配列の分析により、クローンされた遺伝子と、既知のRBTH_06809 ORFとの不一致が明らかになった（図１８、図１９）。さらに、pMW119プラスミド上のIDO(Lys,
23)の調節領域の点変異が決定され（図１５Ｃ）、リーダーペプチド(1)のTAAストップコドンの消失、及び、ATG開始コドンとオーバーラップする、TGAストップコドンまでの翻訳の延長（リーダーペプチド(2)）が生じていた（図１５Ａ、Ｃ）。さらなる変異が、"-2"位置に検出され、ＣがＡにより置換されていた（図１５Ｃ）。

２．４．TG1[pMW119-IDO(Lys, 23) 及びTG1[pMW119-IDO(Lys, 32)株の粗菌体破砕液のIDO活性測定
組換えE. coli株の粗菌体破砕液のIDO活性を調べるため、以下の手順を行った。５ｍｌの培養物から菌体を４℃で遠心により採取し、0.5mlのバッファーＡ*(50 mM TRIZMA, 5%グリセロール, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, HClによりpH 7に調整)に再懸濁し、超音波により４℃で破砕した。反応液(50μｌ)は、50 mM HEPES pH 7.0; 5 mM Ile; 0.5mM α-ケトグルタル酸; 5 mM アスコルビン酸; 5 mM FeSO₄ 及びタンパク質調製物の試料を含むものであった。反応は、34℃で１時間、振盪しながら保温した。合成された4HILを、実施例４に記載したようにTLC分析又はHPLC分析で検出した。結果を表１２にまとめる。

［実施例６］ IDO活性を用いるL-イソロイシンの4HILへの生物変換
E. coli TG1[pMW119-IDO(Lys, 23)] 及び TG1[pMW119-IDO(Lys, 32)]株の菌体を、アンピシリン(100 mg/l)を加えたLB培地で、光学密度A₅₄₀=4〜5となるまで（約６時間）培養した。2 mlの培養液から菌体を遠心で採取した後、1 mlの溶液MI50(100 mM KH₂PO₄ (NaOHでpH 7に調整), NH₄Cl 20 mM, MgSO₄ 2 mM, CaCl₂ 0.1 mM, アンピシリン 150 μg/ml, Ile 50 mM, 0.5mM α-ケトグルタル酸,グリセロール 1 %, イーストエキストラクト 0.005
g/l)に再懸濁した。

次いで、菌体を約12時間培養した。その後、4HILの濃度をTLC(HPLC)分析で調べた。得られたデータを表１３にまとめる。表１３から明らかなように、TG1[pMW119-IDO(Lys, 23)] は、TG1[pMW119-IDO(Lys, 32)]と比べて、より多くの4HILを蓄積した。

［実施例７］ 蓄積した4-ヒドロキシ-L-イソロイシンのHPLC測定
HPCL分析：スペクトロフォトメーター1100シリーズを備えた高圧クロマトグラフ(Waters, USA)を用いた。選択した検出波長範囲：励起波長は250ｎｍで、発光波長範囲は320〜560ｎｍであった。accq-tag法による分離をカラムNova-Pak^TM C18 150 × 3.9 mm, 4μm (Waters, USA)を用いて +400℃で行った。試料の注入容量は５μｌであった。アミノ酸誘導体の生成及びそれらの分離は、製造者Watersの推奨に従っておこなった(Liu, H. et al, J. Chromatogr. A, 828, 383-395 (1998); Waters accq-tag chemistry package. Instruction manual. Millipore Corporation, pp.1-9 (1993))。6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートによるアミノ酸誘導体を得るために、キットAccq-Flu
or^TM (Waters, USA)を用いた。accq-tag法による分析は、濃Accq-tag Eluent А(Waters,
USA)を用いて行った。全ての溶液は、Milli-Qを用いて調製し、標準溶液は+ 4 ℃で保存した。

［実施例８］ Bacillus cereus ATCC14579、B.thuringiensis AKU238及びB. weihenstephanensis KBAB4由来ido遺伝子のクローニング
(1) 染色体ＤＮＡの調製
Bacillus cereus ATCC14579株、 B.thuringiensis AKU238株及びB. weihenstephanensis KBAB4株をそれぞれ５ｍｌのＬＢ培地を用いて２８℃で一晩培養した（前培養）。この培養液１．５ｍｌを種菌として、５０ｍｌのＬＢ培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液５０ｍｌを遠心分離操作（12000×ｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。

(2) ＰＣＲによるido遺伝子の取得
B. cereus ATCC14579株について公開されているゲノム配列情報をもとに (GenBank accession No. AE016877)、以下のプライマーを合成した。
CATATGGAGGTTTTTATAATGACGTTTGTT (配列番号１０)
CTCGAGTTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGT (配列番号１１)

作製したプライマーを用いて、B. cereus ATCC14579株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲ反応は、PrimeSTAR（TaKaRa社製）を用いて行い、98℃10秒、52℃15秒及び72℃１分の条件で３０サイクル行った。

ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約750ｂｐの断片の増幅が認められた。該ＤＮＡ断片を回収し、制限酵素NdeI及びXhoIで処理した後に、同じ制限酵素で処理した発現ベクターｐＥＴ21ｂ（Novagene）にクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、取得したＤＮＡ断片の相同性から、ido相同遺伝子が取得されたことが確認された（配列番号１２及び１３）。塩基配列レベルでの相同性はB.thuringiensis israelensis ATCC35646株由来のido遺伝子と比較して98%、B.thuringiensis 2-e-2株由来のido遺伝子と比較して98%であった。

B.thuringiensis AKU238株については、B.thuringiensis 2-e-2株由来ido遺伝子クローニングに使用したプライマー（配列番号１４及び１５）を用いて、上記と同様にＰＣＲにてido遺伝子をクローニングした（配列番号１６及び１７）。塩基配列レベルでの相同性はB.thuringiensis israelensis ATCC35646株由来のido遺伝子と比較して98%、B.thuringiensis 2-e-2株由来のido遺伝子と比較して98%であった。
CATATGAAAATGAGTGGCTTTAGCATAGAA (配列番号１４)
CTCGAGTTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGT (配列番号１５)

B. weihenstephanensis KBAB4株については、B. weihenstephanensis KBAB4株について公開されているゲノム配列情報 (GenBank accession No. NZ_AAOY01000001)をもとに、以下のプライマーを合成した（配列番号１８及び１９）。上記と同様にＰＣＲにてido遺伝子をクローニングした（配列番号２０及び２１）。塩基配列レベルでの相同性はB.thuringiensis israelensis ATCC35646株由来のido遺伝子と比較して78%、B.thuringiensis 2-e-2株由来のido遺伝子と比較して78%であった。
CATATGCTAACAACAGTTTCTAATAAGACA (配列番号１８)
CTCGAGTTTTGGCTCCTTATAAGAAAACGT (配列番号１９)

［実施例９］ E. coliでのido遺伝子の発現とIleからのＨＩＬ生産
（１） E. coliでのido遺伝子の発現
実施例８で構築したB. cereus ATCC14579株、B.thuringiensis AKU238株、又は、B. weihenstephanensis KBAB4由来ido発現プラスミドをE.coli Rosetta2 (DE3)に導入し、形質転換体を５０μg/ｍｌ アンピシリンを含むＬＢ培地で一昼夜３７℃で振盪培養した（前培養）。前培養液を５０ ｍｌのＬＢ培地に１％シードし、３７℃にて本培養を行った。培養開始約２時間後に終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、１ ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ７．６)に懸濁し、ソニケーター（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ ２０１Ｍ・ＫＵＢＯＴＡ製）を用いて菌体を破砕した。破砕液を15000 rpmで１０分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。

（２）粗酵素液を用いたIleからのＨＩＬ生産
（１）で調製した粗酵素液を用いて、ＩｌｅからのＨＩＬへの変換活性を測定した。反応液組成は以下に示す通りで、28℃で振とう（300 rpm）させながら3時間反応後、ＨＰＬＣにて生成したＨＩＬを定量した。定量結果を表１４に示す。

その結果、B. cereus ATCC14579、B. thuringiensis AKU238又はB. weihenstephanensis KBAB4株由来ido発現株を用いた場合も、明らかにHILの生成が認められ、これらの遺伝子がHIL生産に使用できることが確認された。

配列の説明
1: B. thuringiensis 2-e-2株由来IDO遺伝子の塩基配列
2: B. thuringiensis 2-e-2株由来IDOのアミノ酸配列
3: プライマーsvs 170; IDO遺伝子増幅用
4: プライマーsvs 169; IDO遺伝子増幅用
5: B. thuringiensis 2-e-2株由来IDOのN-末端配列
6: Bacillus属におけるIDO保存配列
7: B. thuringiensis ATCC 35646株由来IDO遺伝子の塩基配列
8: B. thuringiensis ATCC 35646株由来IDOのアミノ酸配列
9: B. thuringiensis 2-e-2株の16S rDNA塩基配列
10: B. cereus ATCC 14579由来IDO遺伝子の増幅用プライマー
11: B. cereus ATCC 14579由来IDO遺伝子の増幅用プライマー
12: B. cereus ATCC 14579由来IDO遺伝子の塩基配列
13: B. cereus ATCC 14579由来IDOのアミノ酸配列
14: B. thuringiensis AKU238由来IDO遺伝子の増幅用プライマー
15: B. thuringiensis AKU238由来IDO遺伝子の増幅用プライマー
16: B. thuringiensis AKU238由来IDO遺伝子の塩基配列
17: B. thuringiensis AKU238由来IDOのアミノ酸配列
18: B. weihenstephanensis KBAB4由来IDO遺伝子の増幅用プライマー
19: IDO gene from B. weihenstephanensis KBAB4由来IDO遺伝子の増幅用プライマー
20: B. weihenstephanensis KBAB4由来IDO遺伝子の塩基配列
21: B. weihenstephanensis KBAB4由来IDOのアミノ酸配列

本発明によれば、イソロイシンの直接水酸化反応により４−ヒドロキシイソロイシンを生成する反応を触媒する、微生物由来の酵素により４−ヒドロキシイソロイシンを製造する方法が提供される。本発明は医薬分野、食品分野において極めて有用である。

本発明のL-イソロイシンジオキシゲナーゼは、L-イソロイシンの水酸化反応を触媒する新規なジオキシゲナーゼであり、好ましくは、インスリン分泌活性を有する医薬組成物の成分として有用な(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンの合成に使用できる。

2-e-2株培養時の４−ヒドロキシイソロイシンとAMKP生成量の経時的変化を示す。 2-e-2株培養時の濁度変化を示す。 2-e-2株の休止菌体を用いた４−ヒドロキシイソロイシンとAMKPの生成活性を示す。 各種サンプルの４−ヒドロキシイソロイシン生成活性を示す。 2-e-2株破砕液による４−ヒドロキシイソロイシン生成活性のpH依存性を示す。 2-e-2株破砕液による４−ヒドロキシイソロイシン生成活性の温度依存性を示す。 2-e-2株破砕液による４−ヒドロキシイソロイシン生成活性の温度安定性を示す。 精製酵素による４−ヒドロキシイソロイシン生成活性のpH依存性を示す。 精製酵素による４−ヒドロキシイソロイシン生成活性の温度依存性を示す。 精製酵素による４−ヒドロキシイソロイシン生成活性の温度安定性を示す。 本発明のIDOを製造する方法のフローチャートを示す。 Bacillus thuringiensis 2-e-2株由来IDOの精製（写真）を示す。精製段階のタンパク質試料のSDS-PAGEを示す。レーン：１−示した分子量のマーカー；２−粗細胞破砕液；３−硫酸アンモニウム沈殿：４−ＳＥＣ；５−ＡＥＣ。 Bacillus thuringiensis 2-e-2株由来IDOのＭＳ同定を示す。 Bacillus thuringiensis (serovar israelensis, ATCC 35646) RBTH_06809 ORF の推定翻訳開始部を示す。 組換えプラスミドpMW119-IDO(Lys, 32/23)の人工発現モジュールを示す。 pMW119-IDO(Lys, 23)プラスミドの物理的地図、及び、IDO構造遺伝子を保持するクローンされたBamHI-SacI断片の決定された配列を示す。調節領域における自然点突然変異を灰色で示す。 pMW119-IDO(Lys, 32)プラスミドの物理的地図、及び、IDO構造遺伝子を保持するクローンされたBamHI-SacI断片の決定された配列を示す。 IDO(Lys, 23), IDO(Lys, 32)及びRBTH_6809 (5'-端短縮)に相当する構造遺伝子のDNAアラインメントを示す。可変部位を灰色で示す。 IDO(Lys, 23), IDO(Lys, 32)及びRBTH_06890 ORFのタンパク質アライメントを示す。可変部位を灰色で示す。 Bacillus thuringienesis由来IDO、Bacillus cereus由来BC1061及びBacillus weihenstephanensis由来保存仮想タンパク質のタンパク質アライメントを示す。

Claims (15)

1. 微生物由来の、イソロイシンから４−ヒドロキシイソロイシンを生成する水酸化酵素存在下でイソロイシン又はその塩を水酸化反応に供し、４−ヒドロキシイソロイシンを生成させる工程を含むことを特徴とする、４−ヒドロキシイソロイシン又はその塩の製造方法であって、
   水酸化反応が、
   (f) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列を有するタンパク質、
   (g) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び、
   (h) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種のL-イソロイシンジオキシゲナーゼの存在下または当該L-イソロイシンジオキシゲナーゼを含む細菌の存在下で水性溶媒中で行われる、方法。
2. 微生物がバチルス属に属する微生物である、請求項１に記載の製造方法。
3. バチルス属に属する微生物がBacillus thuringiensis、Bacillus licheniformis、及び、Bacillus sphaericusから選択される微生物である、請求項２に記載の製造方法。
4. 水酸化反応が、微生物の対数増殖期細胞から調製された破砕液の存在下で行われる請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. L-イソロイシンを水酸化反応に供する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
6. 水酸化酵素が、ジオキシゲナーゼである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方
   法。
7. 水酸化酵素が以下の性質を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
   （ａ）補因子として、酸素、Ｆｅ²⁺、アスコルビン酸、及び、２−オキソグルタル酸を要求する。
   （ｂ）反応至適ｐＨがｐＨ５〜ｐＨ８。
   （ｃ）反応至適温度が４５℃以下。
   （ｄ）５０℃以上で失活する。
   （ｅ）ＥＤＴＡやＣｕ²⁺、Ｚｎ²⁺により阻害される。
8. (f) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列を有するタンパク質、
   (g) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び、
   (h) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種のL-イソロイシンジオキシゲナーゼの存在下で水性溶媒中でL-イソロイシンを反応させ、生成した (2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンを単離することを含む(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシン又はその塩の製造方法。
9. (f) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列を有するタンパク質、
   (g) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び、
   (h) 配列番号２、８、１３、１７又は２１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を有し、L-イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選ばれるL-イソロイシンジオキシゲナーゼを含む細菌の存在下で水性溶媒中でL-イソロイシンを反応させ、生成した (2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシンを単離することを含む(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-L-イソロイシン又はその塩の製造方法。
10. 前記細菌がL-イソロイシンジオキシゲナーゼの活性が増強されるように改変されている請求項９に記載の方法。
11. L-イソロイシンジオキシゲナーゼの活性が、前記L-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の発現の増大により増強されている請求項１０に記載の方法。
12. L-イソロイシンジオキシゲナーゼの活性が、前記L-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の発現調節配列の改変、又は、前記L-イソロイシンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子のコピー数の増大により増強されている請求項１１に記載の方法。
13. 前記細菌が、Escherichia, Pseudomonas, Corynebacterium, Arthrobacter, Aspergillus又は Bacillus属に属する請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記細菌が、Escherichia coli, Arthrobacter simplex, Corynebacterium glutamicum, Arthrobactor globiformis, Arthrobactor sulfureus, Arthrobactor viscosus 又はBacillus subtilisに属する請求項１３に記載の方法。
15. 前記細菌が、細菌培養物、細胞、細胞処理物又は細胞破砕液である請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。