JP5260976B2

JP5260976B2 - 血液凝固第ｖｉｉｉ因子ｃ２ドメインタンパク質の製造方法

Info

Publication number: JP5260976B2
Application number: JP2008029107A
Authority: JP
Inventors: 均柿谷
Original assignee: Sagami Chemical Research Institute; Tosoh Corp
Current assignee: Sagami Chemical Research Institute; Tosoh Corp
Priority date: 2008-02-08
Filing date: 2008-02-08
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2028-02-08
Also published as: JP2009183250A

Description

本発明は、大腸菌を宿主とした遺伝子組換え技術を用いたヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメインタンパク質の製造方法に関するものであり、より詳しくは、前記タンパク質を組換え大腸菌で発現させた後の菌体内可溶性画分、及び精製に用いる緩衝液に、適切な濃度の尿素を加えて精製することを特徴とする、簡便、かつ効率的な前記タンパク質の製造方法に関する。

ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は血液凝固系においてＦＩＸａの補助因子としてはたらく重要なタンパク質であり、これが欠乏した場合には血友病Ａを発症する。統計的には男子の５千人にひとりが遺伝的にこの因子を欠失しており、ＦＶＩＩＩ製剤の投与が必要な患者は全世界で４０万人以上にのぼると推定されている。ＦＶＩＩＩは永らく血液製剤のひとつとしてヒトの血液から分離精製されてきたが、ＨＩＶ、ＨＣＶ、プリオンなど様々な病原体の混入が懸念された。そこで、遺伝子工学的な手法を用いたＦＶＩＩＩの製造方法について研究され、その結果、１９９０年代初頭には遺伝子組換え体の製品が臨床現場で使われはじめ、現在では血液製剤と遺伝子組換え体の両者が市場に流通している。しかしながら、ＦＶＩＩＩは血液中の含量が少なく、遺伝子工学的な手法を用いても生産性が高くないため、ＦＶＩＩＩ精製法の改良が求められている。ＦＶＩＩＩ精製法の先行技術としては、製造プロセスにも採用されているマウスモノクローナル抗体をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィー、及びファージディスプレーを用いて見出された低分子の親和性ペプチドをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィー（非特許文献１及び２）があげられるが、必ずしも十分な精製法とはいえず、技術開発の余地が大きい。

ＦＶＩＩＩは分子量２８万から３０万の大きな糖タンパク質であり、Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２という６つのドメインから構成されている（非特許文献３）。このうちＣ末端に位置するＣ２ドメイン（以下ＦＶＩＩＩＣ２と略記する）は血液中のフォン・ヴィルブラント因子（ｖＷＦ）に結合し、また中和抗体（インヒビター）の標的になっていることが多く（非特許文献４）、生理的な血液凝固過程においてもまた血友病Ａの治療においても重要なドメインとして認識されている。またＦＶＩＩＩＣ２はホスファチジルセリンに富んだ酸性細胞膜（活性化血小板細胞膜のモデル）に結合する領域を有し（非特許文献５）、他のドメインと構造的にも機能的にも分離していることから（非特許文献３）、抗凝固剤のターゲットとしての利用、及びＦＶＩＩＩを精製するためのアフィニティークロマトグラフィー用リガンドのターゲットとしての利用が期待される。しかしながら、前述したように、ＦＶＩＩＩは血液中の含有量が低く、きわめて高価であるため、ＦＶＩＩＩを原料としてＦＶＩＩＩＣ２を調製することは経済的な負担が大きい。そこで遺伝子工学的な手法を用いたＦＶＩＩＩＣ２の製造方法についてこれまで研究されてきた。

遺伝子工学的な手法を用いたＦＶＩＩＩＣ２の製造としては、大腸菌（非特許文献６）あるいはピキア酵母（特許文献１、非特許文献７）を宿主とした製造が開示されているが、ＦＶＩＩＩＣ２には糖鎖が付加しないため、ピキア酵母よりも大腸菌を用いて生産するほうが簡便である。組換え大腸菌を用いてＦＶＩＩＩＣ２の細胞内発現を行なった非特許文献６では、遺伝子発現誘導剤であるＩＰＴＧを添加した後に培養温度を３７℃から１６℃に下げ、１６から２０時間培養して菌体を集める方法が開示されている。前記操作が必要な理由は開示されていないが、３７℃で培養すると凝集体が生成するものと推測できる。しかしながら１６℃という温度では大腸菌の生育が大幅に抑制されるため、長時間培養しても菌体密度が十分に上昇しないこと、及び培養中にＦＶＩＩＩＣ２の分解が進行するため、高い生産性を得ることは困難である。

米国公開特許公報２００６／０２９３５０５号ＮｏｒｄＫ．ら、ＥｕｒｏｐａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６８、４２６９−４２７７、２００１ＫｅｌｌｙＢ．Ｄ．ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＡ、１０３８、１２１−１３０、２００４Ｓｔｏｉｌｏｖａ−ＭｃＰｈｉｅＳ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９９（４）、１２１５−１２２３、２００２ＺｈｏｎｇＤ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９２（１）、１３６−１４２、１９９８ＬｅｗｉｓＤ．Ａ．ら、ＢｌｏｏｄＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄＦｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、１４、３６１−３６８、２００３ＳｐｉｇｅｌＰ．Ｃ．ら、ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ、１１、１４１３−１４２２、２００４ＰｒａｔｔＫ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４０２、４３９−４４２、１９９９

血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメイン（ＦＶＩＩＩＣ２）は前述のような有用性があるため、経済的かつ簡便な製造方法が望まれている。本発明は大腸菌を宿主とした遺伝子組換え技術を用いたＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の製造において、簡便、かつ効率的に前記タンパク質を製造する方法を提供する。

上記課題を解決するために、本発明では遺伝子組換え大腸菌で発現させた血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメイン（ＦＶＩＩＩＣ２）タンパク質について、精製条件を詳細に検討することにより、前記タンパク質を簡便、かつ効率的に得る方法を見出した。

即ち本発明は、以下の発明を包含する：
第一の発明は、ＦＶＩＩＩＣ２遺伝子を含むポリヌクレオチドを導入した組換え大腸菌を用いた、ＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の製造方法において、前記組換え大腸菌の菌体内にＦＶＩＩＩＣ２タンパク質を発現させた後の菌体内可溶性画分に対し、尿素を１Ｍから３Ｍの範囲内で加え、その後１Ｍから３Ｍの範囲内の尿素存在下で金属キレートクロマトグラフィーを行なうことで、前記タンパク質を精製することを特徴とする、ＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の製造方法である。

第二の発明は、前記組換え大腸菌の菌体内にＦＶＩＩＩＣ２タンパク質を発現させた後の菌体内可溶性画分に対し、さらに、イミダゾールの初期濃度を２０から５０ｍＭの範囲内、最終濃度を２００から５００ｍＭの範囲内とする濃度勾配をかけることで、金属キレートクロマトグラフィー担体から前記タンパク質を溶出させて精製することを特徴とする、第一の発明に記載のＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の製造方法である。

第三の発明は、前記ＦＶＩＩＩＣ２遺伝子を含むポリヌクレオチドが、ＦＶＩＩＩＣ２遺伝子の５’末端側に少なくともヒスチジンタグ配列を付加したものであることを特徴とする、第一または第二の発明に記載のＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の製造方法である。

第四の発明は、前記ＦＶＩＩＩＣ２遺伝子を含むポリヌクレオチドが、配列番号１からなるポリヌクレオチドであることを特徴とする、第一または第二の発明に記載のＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の製造方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明における、ＦＶＩＩＩＣ２遺伝子は、ヒトのＦＶＩＩＩの遺伝子配列が公知であるため（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿０１９８６３）、これをもとにＦＶＩＩＩＣ２に相当する領域を化学合成して遺伝子を調製することができる。また、市販のヒトｃＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡクローンを用いて、より簡便に前記遺伝子を調製することも可能であり、一例としてインビトロジェン社製のＵｌｔｉｍａｔｅ^ＴＭＨｕｍａｎＯＲＦＣＬＯＮＥがあげられる。

本発明における、ＦＶＩＩＩＣ２遺伝子を含むポリヌクレオチドは、ＦＶＩＩＩＣ２遺伝子のポリヌクレオチドに５’末端側または３’末端側に１から４０アミノ酸をコードするポリヌクレオチドを付加したポリヌクレオチドを指す。前記ＦＶＩＩＩＣ２遺伝子の５’末端側または３’末端側に付加するポリヌクレオチドとしては、ヒスチジンタグ、Ｓタグ、ＧＳＴタグ、インテインタグといったタグ配列をコードするポリヌクレオチドが例示できるが、特に本発明におけるポリヌクレオチドは、融合タンパク質の生産性、融合タンパク質の精製効率、融合タンパク質の安定性、クロマトグラフィー担体の入手容易性、及び経済性から、ＦＶＩＩＩＣ２遺伝子の５’末端側に少なくともヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドを付加するのが好ましい。さらに好ましくは、ＦＶＩＩＩＣ２遺伝子を含むポリヌクレオチドが、ＦＶＩＩＩＣ２遺伝子の５’末端側にｐＥＴ２８ａ（ノバジェン社）の有するヒスチジンタグ領域のポリヌクレオチド１１４塩基を付加した、配列番号１からなるポリヌクレオチドである。

本発明における、ＦＶＩＩＩＣ２タンパク質を発現させる組換え大腸菌株は特に限定はなく、Ｋ１２系統ではＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、Ｃ６００及びこれらの誘導体を、Ｂ系統ではＢＬ２１及びその誘導体を、それぞれあげることができ、さらに生産させるタンパク質あるいはそのポリヌクレオチドとの相性に応じてより細かく選択することができる。実施例では、組換え大腸菌株の好ましい一例である、ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ^ＴＭ（ＤＥ３）−ＲＩＰＬ（ストラタジーン社製）を組換え大腸菌株として選択したが、本発明はこれに限定されるものではない。

本発明における、組換え大腸菌の培養に用いる培地の種類については特に限定はなく、天然培地であるＬＢ培地や２×ＹＴ培地、合成培地であるＭ９培地が例示できる。組換え大腸菌を培地に植菌後、遺伝子発現誘導剤を添加するまでの培養温度は特に限定はなく、好ましい一例として、大腸菌の至適生育温度である３７℃があげられる。遺伝子発現誘導剤の添加時期としては、組換え大腸菌の対数増殖期に実施するのが好ましく、特に菌体密度がＯ．Ｄ．_６００で１．０から１．２に達した時点で遺伝子発現誘導剤を添加するのが好ましい。遺伝子発現誘導剤の種類には特に限定はなく、ＩＰＴＧやアラビノースを例示することができる。遺伝子発現誘導剤を添加後、組換え大腸菌の菌体内にＦＶＩＩＩＣ２タンパク質を発現させる際の、培養温度については、実施例４より、３７℃で培養すると発現したＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の大部分が不溶化すること、及び２５℃で培養するとＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の発現量が少ないことから、２６℃から３５℃の温度条件で培養するのが好ましい。さらに、実施例４において２９℃、及び３２℃で培養するとＦＶＩＩＩＣ２タンパク質が主に可溶性タンパク質として大量に発現していることから、２９℃から３２℃にて培養するのが特に好ましい。また、ＦＶＩＩＩＣ２タンパク質発現後の組換え大腸菌を破砕する際に用いる緩衝液には、その後の精製操作におけるカラムへの非特異的な吸着を抑制するために低濃度（好ましくは２０から５０ｍＭ）のイミダゾールを添加するのが好ましい。

本発明におけるＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の製造方法は、組換え大腸菌の菌体内にＦＶＩＩＩＣ２タンパク質を発現させた後の菌体内可溶性画分に対し、尿素を１Ｍから３Ｍの範囲内で加え、その後１Ｍから３Ｍの範囲内の尿素存在下で金属キレートクロマトグラフィーを行なうことで、前記タンパク質を精製することを特徴としている。金属キレートクロマトグラフィー担体としてはＧＥヘルスケア社のＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ、ＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、キアゲン社のＮｉ−ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅを、担体を充填したカラムとしてはＧＥヘルスケア社のＨｉｓＴｒａｐＨＰ、ＨｉｓＴｒａｐＦＦ、ＨｉｓＳｐｉｎＴｒａｐ、キアゲン社のＮｉ−ＮＴＡＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎを例示できる。菌体内可溶性画分、及び精製に用いる緩衝液に添加する尿素の濃度としては、尿素によるタンパク質の非可逆的な変性が軽微で、かつ、非特異的な相互作用を抑えることができる、前記範囲の濃度が好ましく、２Ｍの尿素を添加して精製を行なうのがさらに好ましい。また、前記濃度の尿素を菌体内可溶性画分、及び精製に用いる緩衝液に添加することで、ヒスチジンタグの溶媒への露出促進効果、及び菌体抽出物中に存在する各種プロテアーゼの作用抑制効果も期待できる。特に金属プロテアーゼの阻害剤であるＥＤＴＡのようなキレート剤は金属キレートクロマトグラフィーにおいて用いることができないため、尿素添加による効果が高い。

本発明における、ＦＶＩＩＩＣ２タンパク質精製のさらに好ましい態様は、前記条件に加え、前記タンパク質を金属キレートクロマトグラフィー担体に吸着させた後、低濃度のイミダゾールを含む緩衝液をカラム容量の１０倍以上通液させることで非特異的に吸着したタンパク質を有効に取り除いた後、高濃度のイミダゾールを添加、あるいは緩衝液のｐＨを低下させることで目的とするタンパク質を回収する精製法である。イミダゾールの添加、あるいは緩衝液のｐＨの低下は一段階で行うことが多いが、より精密な精製のためには勾配をかけて溶出するほうが好ましい。しかしながら、一般にｐＨの勾配を制御することは困難であるため、イミダゾールの濃度勾配をかけて溶出させるほうがさらに好ましい。イミダゾールの初期濃度と最終濃度は目的とするタンパク質と夾雑タンパク質の分離状況に応じて設定すればよいが、本発明における最も好ましいイミダゾール濃度は初期濃度が２０から５０ｍＭ、最終濃度２００から５００ｍＭである。溶出したタンパク質はそのまま用いることもできるが、透析やゲル浸透クロマトグラフィー担体を用いて高濃度の尿素やイミダゾールを除いてから使用するのが好ましい。前記操作により尿素で弱く変性されたタンパク質の立体構造と活性の回復が図られる。

本発明の製造方法で得られたＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の評価には、結合活性が知られている化合物を用いることが好ましく、抗体や化学合成ペプチドを例示できる。抗体としてはＦＶＩＩＩのアフィニティー精製に用いられているもののうち、その結合ターゲットがＣ２ドメインであるという知見が得られているものや、ＦＶＩＩＩＣ２を抗原として調製したポリクローナルあるいはモノクローナル抗体を例示できる。化学合成ペプチドとしては非特許文献１及び２にあげたペプチドやその類縁体を例示できる。ＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の活性測定の方法としては表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析、ＥＬＩＳＡ、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）を例示できる。

本発明は、大腸菌を宿主とした遺伝子組換え技術を用いた血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメイン（ＦＶＩＩＩＣ２）タンパク質の製造において、前記タンパク質を組換え大腸菌で発現させた後の菌体内可溶性画分、及び精製に用いる緩衝液に、適切な濃度の尿素を加えて精製することを特徴とする。本発明の製造方法により得られたＦＶＩＩＩＣ２タンパク質は、生理的な血液凝固過程、及び血友病Ａの治療において重要なドメインであるため、血友病をはじめとする凝固系の疾患の治療、診断、あるいは研究に用いることができる。

以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例１血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメイン（ＦＶＩＩＩＣ２）遺伝子組換え大腸菌の調製（その１）
Ｕｌｔｉｍａｔｅ^ＴＭＨｕｍａｎＯＲＦＣＬＯＮＥＩＯＨ１０７０４（インビトロジェン社）よりＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔＩ（ＯｍｅｇａＢＩＯ−ＴＥＫ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出／精製し、これを鋳型に用いて、配列番号３で示したプライマーＦ８Ｃ２Ｆ４と配列番号４で示したプライマーＦ８Ｃ２Ｒ２Ｘを用いてＰＣＲを行ない、ヒトＦＶＩＩＩＣ２遺伝子を含んだＤＮＡを増幅した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いた。増幅したＤＮＡをＳａｃＩとＸｈｏＩで処理し、ＳａｃＩとＸｈｏＩで処理したクローニングベクターｐＥＴ２８ａ（ノバジェン社製）に組み込み、大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル（タカラバイオ社製）をヒートショック法で形質転換することにより組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＦ８Ｃ２＿１１を得た。

実施例２ＦＶＩＩＩＣ２遺伝子組換えプラスミドの塩基配列解析
実施例１で得られた組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＦ８Ｃ２＿１１よりＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔＩ（ＯｍｅｇａＢＩＯ−ＴＥＫ社製）を用いてプラスミドｐＦ８Ｃ２＿１１を抽出し、これを鋳型に用いて、配列番号５で示したプライマーＴ７ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒからジデオキシヌクレオチド法により塩基配列の決定を行ない、その結果、配列番号１の塩基配列を得た。

実施例３ＦＶＩＩＩＣ２遺伝子組換え大腸菌の調製（その２）
実施例１で得られたｐＦ８Ｃ２＿１１を用いて大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ^ＴＭ（ＤＥ３）−ＲＩＰＬのコンピテントセル（ストラタジーン社製）をヒートショック法で形質転換することにより組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＰＬ／ｐＦ８Ｃ２＿１１を得た。

実施例４ＦＶＩＩＩＣ２遺伝子組換え大腸菌からのＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の発現
実施例３で得られた、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＰＬ／ｐＦ８Ｃ２＿１１を用いて以下の方法に従い、ＦＶＩＩＩＣ２タンパク質を発現させた。
（１）ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＰＬ／ｐＦ８Ｃ２＿１１を、カナマイシンとクロラムフェニコールをそれぞれ２０μｇ／ｍＬ含むＬＢ培地（４０ｍＬ）中３７℃で菌体密度がＯ．Ｄ．_６００で１．０から１．２になるまで振とう培養した。
（２）（１）の培養物にＩＰＴＧを１ｍＭになるように添加し、以下の条件で振とう培養することでＦＶＩＩＩＣ２タンパク質を発現させた。

ａ）２５℃で５時間
ｂ）２９℃で４時間
ｃ）３３℃で３時間
ｄ）３７℃で３時間
（３）各条件で培養後、培養物を氷冷し、それぞれを４℃冷却下で遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）して培養液を除いた。
（４）培養液の除去を完全にするため遠心分離を繰り返した後、菌ペレットを５ｍＬのＬｙｓｉｓ緩衝液（組成：２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／２００ｍＭＮａＣｌ／４０ｍＭイミダゾール）で懸濁し、４℃冷却下超音波破砕機で菌を破砕した。
（５）菌破砕液を４℃冷却下で遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分間）して上清と沈殿を分離し、沈殿は５ｍＬのイオン交換水で再懸濁した。
（６）上清と沈殿の懸濁物の一部を還元剤存在下で熱処理した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（１５％アクリルアミド）ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に等量アプライして分析した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１に示す。培養温度が２５℃の時はＦＶＩＩＩＣ２タンパク質に相当する２３ｋＤａのバンドは上清画分（可溶性タンパク質）、沈殿画分（不溶性タンパク質）いずれも明瞭には観察されなかった。培養温度が２９℃、３２℃、３７℃の場合は、上清画分、沈殿画分、いずれも２３ｋＤａのバンドが観察されたが、培養温度が３７℃の場合は沈殿画分の割合が高く、培養温度が２９℃と３２℃では上清画分の割合が高かった。不溶性タンパク質として発現すると、可溶化など煩雑な作業を必要とするため、簡便、かつ効率的にタンパク質を製造するには、可溶性タンパク質として発現するのが好ましい。そのため、組換え大腸菌からＦＶＩＩＩＣ２タンパク質を発現させる際の培養温度としては、２６℃から３５℃が好ましいといえる。特に、２９℃と３２℃で培養した場合は、可溶性タンパク質を大量に発現したことから、２９℃から３２℃で培養するのがさらに好ましいといえる。

また、本実施例における、ＦＶＩＩＩＣ２タンパク質を発現させる際の培養時間は３から４時間と、従来技術（１６℃で１６から２０時間培養、非特許文献６）と比較して短時間であるため、ＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の分解も抑えることができる。

実施例５ＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の精製
実施例３で得られた、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＰＬ／ｐＦ８Ｃ２＿１１を用いて以下の方法に従って、ＦＶＩＩＩＣ２タンパク質を精製した。
（１）ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＰＬ／ｐＦ８Ｃ２＿１１を、カナマイシンとクロラムフェニコールをそれぞれ２０μｇ／ｍＬ含むＬＢ培地（２Ｌ）中３７℃で菌体密度がＯ．Ｄ．_６００で１．２になるまで振とう培養した。
（２）（１）の培養物にＩＰＴＧを１ｍＭになるように添加し、３０℃で３時間振とう培養することでＦＶＩＩＩＣ２タンパク質を発現させた。
（３）培養物を氷冷して４℃冷却下で遠心分離（８０００ｒｐｍ、３０分間）して培養液を除いた。
（４）菌ペレットを３０ｍＬのＬｙｓｉｓ緩衝液で懸濁した後、４℃冷却下で遠心分離（８０００ｒｐｍ、３０分間）して上清を除き、菌ペレットを１２０ｍＬのＬｙｓｉｓ緩衝液で再懸濁した。これを４℃冷却下超音波破砕機で菌を破砕した。
（５）菌破砕液を４℃冷却下で遠心分離（９０００ｒｐｍ、４０分間）して上清を得た。
（６）上清に等容量の４Ｍ尿素を添加し、溶媒組成を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／１００ｍＭＮａＣｌ／２０ｍＭイミダゾール／２Ｍ尿素とした。
（７）金属キレートクロマトグラフィー充填カラムＨｉｓＴｒａｐＨＰ５ｍＬ（ＧＥヘルスケア社製）を吸着／洗浄緩衝液（組成：２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／５００ｍＭＮａＣｌ／４０ｍＭイミダゾール／２Ｍ尿素）で平衡化しておき、これに（６）で調製された菌抽出液全量を通液し、しかる後に吸着／洗浄緩衝液７０ｍＬを通液することによりカラムを洗浄し、非特異的な吸着物を除去した。
（８）溶出緩衝液（組成：２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／５００ｍＭＮａＣｌ／４００ｍＭイミダゾール／２Ｍ尿素）を用意し、溶出緩衝液の割合を０から１００％にする直線濃度勾配をかけて溶出されるタンパク質をモニタリングした。この操作にはＧＥヘルスケア社製の中低圧クロマトグラフィーシステムであるＡＫＴＡＰｒｉｍｅを用いた（図２）。
（９）溶出されたタンパク質のピーク画分を還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミド）で分析し（図３）、純度の高い部分（図３中３６から４１番目の画分）を集めて透析緩衝液（組成：１０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）／１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌ）に対して透析し、最終標品とした。最終標品は分注して−８０℃で保存し、またＢＳＡを標準タンパク質としてＢｒａｄｆｏｒｄ法により濃度検定した（タンパク質濃度：０．７ｍｇ／ｍＬ）。なお、最終標品タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。

実施例６ＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の確認（その１）
実施例５で得られたタンパク質標品を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミド）を用いて分析した。ゲルにアプライする前に９８℃で５分間の熱処理を行なった場合には２本の、熱処理を行なわなかった場合には１本のバンドが検出された（図４）。前者において上側の薄いバンドは還元条件下でのバンドの位置に一致した。この結果は、実施例５で得られたタンパク質標品は２つのシステイン残基（配列番号２の４０番目と１９２番目のシステイン）の間でジスルフィド結合しており、この結合が熱処理で部分的に還元的に開裂したものと解釈できる。

実施例７ＦＶＩＩＩＣ２タンパク質の確認（その２）
非特許文献２を参考にして図５の構造を有するＦＶＩＩＩＣ２結合性ペプチドを化学合成した（林化成社に合成委託）。合成には通常の固相ペプチド合成法を用い、Ｎ末端をアセチル基で保護し、Ｎ末端から７番目と１４番目のシステイン残基をジスルフィド結合させた。標品の同定は質量分析（ＨＰ１１００ｓｅｒｉｅｓＬＣ／ＭＳＤ：ヒューレット・パッカード社製）、純度検定はＨＰＬＣ（ＳｈｉｓｅｉｄｏｃａｐｃｅｌｌｐａｋＣ１８カラム：資生堂社製）で行ない、純度９９％以上を確認した。このペプチドをＤＭＳＯに溶解し、ＳＰＲ解析装置であるＢＩＡＣＯＲＥ２０００のＣＭ５センサーチップにアミンアップリング法で固定化し、実施例５で得られたタンパク質標品をＨＢＳ−ＥＰで３．０μＭに希釈してアナライトとして分析することにより、図６に示すセンサーグラムを得た。これをＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムで解析することにより両者の相互作用を表す解離定数（ＫＤ）として１．０×１０^−７Ｍを得た。本結果より、本発明の方法で製造したＦＶＩＩＩＣ２タンパク質は、天然のＦＶＩＩＩＣ２タンパク質と同等の親和性を有していることが示された。

各培養温度におけるＦＶＩＩＩＣ２の発現と局在性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。図中のＳは上清画分（可溶性タンパク質）を、Ｐは沈殿画分（不溶性タンパク質）を、矢印はＦＶＩＩＩＣ２タンパク質（２３ｋＤａ）に相当するバンドを、それぞれ示す。イミダゾール濃度勾配でのタンパク質溶出プロファイル。図２における各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。図中の矢印はＦＶＩＩＩＣ２タンパク質（２３ｋＤａ）に相当するバンドを示す。非還元条件下での精製ＦＶＩＩＩＣ２タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＦＶＩＩＩＣ２結合性ペプチドの構造。ＦＶＩＩＩＣ２結合性ペプチドと精製ＦＶＩＩＩＣ２標品の相互作用解析結果（ＢＩＡＣＯＲＥセンサーグラム）。

Claims

血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメイン遺伝子を含むポリヌクレオチドを導入した組換え大腸菌を用いた、血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメインタンパク質の製造方法において、
遺伝子発現誘導剤を添加後、２９℃から３２℃で培養することで、前記組換え大腸菌の菌体内に血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメインタンパク質を発現させ、
前記組換え大腸菌の菌体内可溶性画分に対し、尿素を１Ｍから３Ｍの範囲内で加え、その後１Ｍから３Ｍの範囲内の尿素存在下で金属キレートクロマトグラフィーを行なうことで、前記タンパク質を精製することを特徴とする、血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメインタンパク質の製造方法。
前記組換え大腸菌の菌体内可溶性画分に対し、さらに、イミダゾールの初期濃度を２０から５０ｍＭの範囲内、最終濃度を２００から５００ｍＭの範囲内とする濃度勾配をかけることで、金属キレートクロマトグラフィー担体から前記タンパク質を溶出させて精製することを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメインタンパク質の製造方法。
前記血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメイン遺伝子を含むポリヌクレオチドが、血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメイン遺伝子の５’末端側に少なくともヒスチジンタグ配列を付加したものであることを特徴とする、請求項１または２に記載の血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメインタンパク質の製造方法。
前記血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメイン遺伝子を含むポリヌクレオチドが、配列番号１からなるポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１または２に記載の血液凝固第ＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメインタンパク質の製造方法。