JP5373077B2 - ポリペプチド系物質、その製造方法、組織器官の虚血の予防用薬及び治療用薬 - Google Patents

Description

本発明はポリペプチド系物質に関するもので、具体的には、二種類の活性ポリペプチド、その製造方法及び用途に関するものである。

「心筋保護」はここ数年、心臓内科、外科の研究で注目された焦点になっている。最近の資料によれば、虚血、酸欠の心筋細胞内にたくさんの変化が発生するが、細胞内のカルシウム超荷重、遊離基の発生、膜の障害、ＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＴＰ）のレベルの低減、酸素の消耗等を含む。

心筋の虚血に関与して、心筋を保護するために、ここ２０年来に、例えばβ−受容体遮断薬、カルシウム拮抗薬、転移酵素抑制剤、各種類の酸素遊離基消去剤など、多くの薬物を研究したが、それの心筋保護の効果が臨床でまだ認められていないのである。現在、心筋虚血の治療薬物は、まだ絶対に心筋梗塞を減らして、心筋虚血に対抗するものがない。

従来の各種の心臓血管病の治療薬物は、増殖因子の発生を阻止し、蛋白質の合成を抑制して、心筋の肥厚（Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）を軽減する役割を果たす転移酵素抑制剤を除いて、その他の薬物が直接に心筋の成長、分化、修復を調節する役割を果たしていない。ここ数年、国外ですでに薬物方法で心筋自身の保護能力を誘導することを重視するようになっている。例えば、遺伝子変換で心筋細胞の再生を促進する研究、ＣａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎとＭｙｏｔｒｏｐｈｉｎの研究。一方、細胞外のシングルで各種類の伝達構造を触発して、心筋、血管細胞の増殖や再構造を調節する。しかしすべてのこれらの研究は動物試験や臨床前の研究段階にある。

上記の研究は以下のことを明らかにした。体外循環の心筋保護方法がまだ整っていない状況で、体に対して損害がなく、また手術前、手術中および手術後に心筋を保護する薬物を設計することが心筋虚血および再潅流傷害の予防治療に、新しい構想と道筋を提供し、重要な意味を持っている。

ＺＬ９４１０２７９８には心筋細胞成長刺激ペプチドとその製造方法を開示したが、健康な幼い哺乳動物の心臓を選び取って、機械で粉砕し、−２０℃で凍結−溶解の後に６０−１００℃に加熱し、更に−２０℃で凍結−溶解の後に３０００ｒｐｍで遠心し、負圧保持カラム−除菌−選別−凍結乾燥−包装を経て、分子量が２００００ドールトン以下のポリペプチド系活性物質を得る。

ＺＬ９４１０２７９９には初代培養心筋細胞に刺激するＤＮＡ合成と蛋白質合成を持つ心筋細胞成長刺激ペプチド（ＧＭＧＳＰ）を開示したが、健康の幼い哺乳動物の心臓から抽出して製造したもので、ｐＨ２−９の範囲内で安定している。９５−１００℃で１０分間に加熱し、６０−７０℃で３０分間に、生物の活性は変わらない。多種類の卵白水解酵素で、３７℃で２時間の条件で生物の活性が喪失する。水溶液の２２℃−３０℃の条件でポリマーを形成するが、生物の活性が明らかに変えない。３％−８％のマニトールを入れて凍結乾燥の密封条件で、室温で１．５年間、４℃で２年間、−２０℃で３年間に貯蔵すると、生物の活性が変わらない。

ＨＰＬＣ分析をした上で、上記のＧＭＧＳＰは四つの成分から構成されて、各成分の相対ピークと保留時間がそれぞれ１０．４％（２．８８分間）、６．４％（３．９３分間）、３６．３％（５．０９分間）、７．３％（７．４１分間）で、すべての成分が生物の活性を持っていることが明らかにした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析で表示された二本の帯の分子量がそれぞれ８５００Ｄａ、１０８００Ｄａで、ＨＰＬＣ分析で数平均分子量が９８００Ｄａで、重量平均分子量が１０５００Ｄａ、二つの成分が生物の活性を持っている。

中国の発明特許の０３１４１３５２．８の心筋ペプチドとその用途で、当該発明は心筋ペプチドが人以外の健康な哺乳動物の心臓から抽出されたものを開示して、その中にポリペプチドの含有量が７５％−９０％、遊離アミノ酸が６％−１５％、リボ核酸の含有量が１％−２％、脱酸リボース核酸の含有量が３％−７％、重量平均分子量が１０００−１０００ドールトンである。当該発明はまた上記の心筋ペプチドの心臓血管病の治療薬物と心筋の虚血と再潅流傷害の治療薬物の製造での用途を開示したものである。中国の発明特許の０３１３７１３３．７では心筋ペプチドの製造方法を開示したが、その具体的な方法として、人以外の健康な哺乳動物の心室筋肉を洗浄し、細かく切り、殺菌蒸留水で均一に製造し、均一な液体を繰り返して凍結し、３−４回解凍し、６５−９５℃に加熱して滓を濾過し、板枠濾過器で濾過し中間濾液を得てから、中空繊維カラムで超濾過し、精密な濾液を得て、超濾過膜で超濾過し、重量平均分子量が１００００Ｄａ以下の心筋ペプチド溶液を残し、逆相浸透濃縮カラムで濃縮し、最後に濾過除菌をし、冷凍乾燥の後完了品を得る。

しかし、上記の研究結果によって、心筋ペプチドが人以外の健康な哺乳動物の心臓から抽出されたもので、その中にポリペプチド、遊離アミノ酸、脱酸リボース核酸などの多種類の活性成分を含んでいることが分かる。

ポリペプチドは各種類のアミノ酸が異なった順序で配列して構成されたチェーン状の蛋白質類化合物である。このような化合物は常に強い生理活性と機能の特異性を持っている。そのため、これらのポリペプチド系物質は一部の疾病の治療薬物の製造での用途がとても広い。

しかし今まで、心筋ペプチドに含まれたポリペプチドの配列と用途について、関連特許と文献報道がない。

本発明の目的は二種類のポリペプチドを提供することにあり、その中の一種のポリペプチドの配列がＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅで、分子量が１２９４．７５である（心筋ペプチドＸと略称）。上記のポリペプチドに基づき、トリプトファンをつなぐ端にアラニン、グリシン、リジンをつないで、新しいポリペプチドを形成する（心筋ペプチドＣと略称する）。

そのアミノ酸の配列順序がＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ− Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅで、分子量は１５５０．９１である。上記のポリペプチドが心筋ペプチド溶液から抽出され、測定した結果、上記のポリペプチドが活性を持っているとともに、心筋虚血、脳虚血、肝虚血、胃虚血、腸虚血、肺虚血、腎臓虚血を含め、組織器官の虚血の治療薬の製造で用途が著しいである。

上記の目的を実現するため、本発明で採用された手段として、
ポリペプチドで、上記のポリペプチドのアミノ酸の配列順序がＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅである。

上記のポリペプチドのトリプトファンをつないだ端に順次にアラニン、グリシン、リジンをつないで、新しいポリペプチドを形成するが、そのアミノ酸の配列順序がＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅである。

本発明のもう一つの目的は心筋ペプチドＣの抽出方法を提供することにある。

上記の目的を実現するため、本発明で採用された手段として、
心筋ペプチド溶液から心筋ペプチドＣを抽出する方法で、上記の方法が下記のステップを含む。

（１）心筋ペプチドの溶液に硫酸アンモニウムの溶液を入れ、放置し、遠心して、上清液と沈殿物を分離する。

（２）上清液を取って、固定抽出カラムを通し、有機溶剤で溶出し、画分Ａを収集する。

（３）収集した画分Ａを濃縮して、それから逆相クロマトグラフィーで分離して、活性がある画分Ｂを収集する。

（４）活性がある画分Ｂを濃縮して、それから解析型逆相クロマトグラフィーで更に分離して、活性がある画分Ｃを収集する。

（５）活性がある画分Ｃに質量スペクトルの測定を行い、質量スペクトルのデータで分析し、画分Ｃの中に活性があるペプチドのアミノ酸の配列があることと同定すると、上記の画分Ｃが上記のポリペプチドであることが分かる。

本発明による硫酸アンモニウム溶液の質量パーセンテージ濃度が６０−８０％で、上記の濃度は７０％が好ましい。

本発明において、ステップ（２）に記載の有機溶剤が６０％のアセトニトリールと０．１％の三フッ素酢酸の混合溶液である。

本発明のステップ（３）では画分Ａを元の体積の１／８−３／４に濃縮する。逆相製造クロマトグラフィーで分離する条件として、移動相：Ａ相が１００％Ｈ_２０＋０．１％ＴＦＡで、Ｂ相が６０％ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡで、紫外線測定機器の波長λ＝２８０ｎｍ、Ｒ＝３．０、勾配溶出０−５ｍｉｎ０％Ｂ、５−３５ｍｉｎ０％−１００％Ｂ、３５−４０ｍｉｎ１００％Ｂ、４０−４５ｍｉｎ１００％−０％Ｂである。

本発明に記載のステップ（４）では画分Ｂを元の体積の１／８−１／２に濃縮する。上記の解析型逆相クロマトグラフィーで更に分離することが下記のクロマトグラフィー条件で行われた。即ち、移動相：Ａ相が１００％Ｈ_２０＋０．１％ＴＦＡで、Ｂ相が９５％ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡで、紫外線測定機器の波長λ＝２８０ｎｍ、Ｒ＝３．０で、勾配溶出：０−５ｍｉｎ０％Ｂ、５−５０ｍｉｎ０％−１００％Ｂ、５０−６０ｍｉｎ１００％Ｂ、６０−６５ｍｉｎ１００％−０％Ｂである。

本発明で述べられた心筋ペプチド溶液は人以外の健康な哺乳動物の心臓から抽出されたポリペプチド溶液を含んで、そのポリペプチドの含有量が７５％〜９０％で、遊離アミノ酸の含有量が６％〜１５％で、リボ核酸の含有量が２％以下で、脱酸リボース核酸の含有量が７．５％以下で、分子量が１００００ドールトン以下で、現存する心筋ペプチド製品でもよいのである。

本発明の更にもう一つの目的は心筋ペプチドＣの化学合成方法を提供することにある。

上記の目的を実現するため、本発明で採用された手段として、
心筋ペプチドＣを製造する化学合成方法で、上記の方法は下記のことを含む。

（１）それぞれトリプトファン、セリン、アスパラギン、バリン、ロイシン、アルギニン、グリシン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、リジンのアミノ基を保護基で保護する。

（２）先に固相担体を溶解し、更にポリペプチドのアミノ酸の配列順序の中の最初に保護されたアミノ酸を当該固相担体に固定し、それから得た物を洗い、最初に保護されたアミノ酸につながった固相担体を得る。

（３）２つ目の保護アミノ酸を最初のアミノ酸を結合した固相担体に入れ、縮合剤の存在で反応を行ってペプチド結合を形成し、それからアミノ酸のアミノ基の保護基を除いて、そして得た固相担体を洗浄する。

（４）ポリペプチドのアミノ酸の順序によって、順次に相応の保護アミノ酸を入れ、上記のアミノ基の保護基を取り除き、洗浄ステップを繰り返し、最後のアミノ酸がペプチドチェーンと結び付けたまでペプチドチェーンを絶えず延長する。

（５）分離液を取って上記のステップ（４）で得たポリペプチドを結合した固相担体を浸漬して、それから濾過後に得た濾液を取って沈殿を行い、ポリペプチドの中間体を得る。

（６）得たポリペプチドの中間体を分離純化して、目標のものを得る。

本発明のステップ（１）に記載のアミノ酸のアミノ基は下記の基で保護されることができる。

（１）カルボベンゾキシ基（ＣａｒｂｏｂｅｎｚｏＸｙｌ）
（２）ｔ−ブトキシカルボニル基（ｔ−ＢｕｔｙｌｏＸｙｃａｒｂｏｎｙｌ）
（３）トシル（Ｔｏｓｙｌ）基
（４）９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ：９−ＦｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏＸｙｃａｒｂｏｎｙｌ）。

自然界で全てのポリペプチドや蛋白質は遊離アミノ酸がポリペプチド結合の形式で重合されたものである。蛋白質の転換中に、ポリペプチド結合の発展はいつもアミノ基端（Ｎ−端）からカルボキシル基端（Ｃ−端）に行うのである。化学合成の初めに、先にカルボキシル基端の初めてのアミノ酸が活性化の樹脂に固定して、それからアミノ基の保護で、更にカルボキシル基端の２つ目のアミノ酸を化学反応機に入れ、二つのアミノ酸が互いに反応してペプチド結合を形成し、それからポリペプチドのアミノ酸の配列によって順次に第３、第４のアミノ酸を入れ、最後のアミノ酸がペプチドチェーンに結び付けるまでとする。

本発明の別の目的として、ポリペプチドＣの組織器官の虚血の予防および／あるいは治療用薬の製造での用途を提供することにあるが、上記のポリペプチドの心筋虚血、脳虚血、肝臓虚血、胃虚血、腸虚血、肺虚血あるいは腎臓虚血の予防および／あるいは治療用薬の製造での用途が好ましくて、上記のポリペプチドの心筋虚血の予防および／あるいは治療用薬の製造での用途が更に好ましい。

本発明の効果として、本発明に二種類のポリペプチドの抽出方法を開示して、しかも心筋ペプチド溶液に含まれた二種類のポリペプチドと配列を開示して、この二種類のポリペプチドの化学合成、純化、活性の測定と同定を完了したのである。活性の測定はこの二種類のポリペプチドが活性を持つことを示し、動物実験と臨床研究によって、この二種類のポリペプチドが心筋虚血、脳虚血および肝虚血の治療薬の製造での役割が著しいことを明らかにした。同時にこの二種類は構造が明確で、活性が高い、生産しやすい、コストが低い、その役割の構造を研究して説明しやすいという特徴を持っている。

分子量が１２９４５．７５の（心筋ペプチドＸ）の質量スペクトル図である（４７００ＭＳ／ＭＳ Ｐｒｏｃｕｒｓｏｒ １２９４．７５ Ｓｐｅｃ＃１ ＭＣ［ＢＰ＝１１４７．４、４８８６］） 分子量が１５５０．９１の（心筋ペプチドＣ）の質量スペクトル図である（４７００ＭＳ／ＭＳ Ｐｒｏｃｕｒｓｏｒ １５５０．９１ Ｓｐｅｃ ＃１ ＭＣ［ＢＰ＝１４０３．５，３６３０］） 分子量が１５５０．９１の（心筋ペプチドＣ）二次スペクトルｄｅｎｏｖｏ配列整合ＫＧＡＷＳＮＶＬＲＧＭＧＧＡＦである。 分子量が１２９４．７５の（心筋ペプチドＸ）二次スペクトルｄｅｎｏｖｏ配列整合ＷＳＮＶＬＲＧＭＧＧＡＦである。 画分Ｃのクロマトグラフィー図である。 ポリペプチド（心筋ペプチドＣ）の抽出方法の具体的なフローチャートである。 心筋ペプチドＣの予防性投薬が虚血でと再潅流したマウスの心筋梗塞面積に対する影響であるが、図７−ａが仮手術グループで、図７−ｂが模型グループで、図７−ｃが陽性薬グループで、図７−ｄがＣＭＰＣグループである。 心筋ペプチドＣの治療性投薬が虚血でと再潅流したマウスの心筋梗塞面積に対する影響であるが、図８−ａが仮手術グループで、図８−ｂが模型グループで、図８−ｃが陽性薬グループで、図８−ｄがＣＭＰＣグループである。

本実施例はポリペプチド（心筋ペプチドＣ）の合成に関するものである。

上記のポリペプチドの配列がＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅである。

１．合成：まずポリペプチドに含まれたアミノ酸のアミノ基用アミノ基保護基（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基）を保護して（使用量が２０−１００グラム／グラム）で、Ｗａｎｇ樹脂用塩素エーテルで溶けて膨れる。使われた塩素エーテルの使用量が５０−１００ミリリットル／グラムで、それから初めてのアミノ酸をこの樹脂に入れて、それを樹脂に固定する。二塩化メチルで洗った後に、アミノ基の保護基は六水素ピリジン（使用量が１０―８０％、２０−４０％が好ましい）で保護する。同時に、２つ目のアミノ酸のカルボキシル基をＨＢＴＵ［２−（１水素−ｄｔｈｙｌｈｅＸｙｌｏＸｙｐｈｅｎｄ）−１、１、３、３−テトラメチルアルデヒド−六フッ素燐酸エステル］の活性化とジイソプロピルエチルアミンと中和した後に、初めてのアミノ酸を結合した樹脂に入れて、二つのアミノ酸が反応した後にペプチド結合を形成することができる。それからポリペプチド物質のアミノ酸の順序によって、順次に相応のアミノ酸を入れて、上記の洗浄、アミノ基の保護の取り除き、アミノ酸のカルボキシル基の活性化などのステップを繰り返しながら、１４回のペプチド結合反応を行い、最後のアミノ酸がペプチドチェーンに結合するまでポリペプチドチェーンを絶えず延長する。合成後のポリペプチドは依然として樹脂と結び付けて、分離液でポリペプチド物質を樹脂から遊離し取る。分離液はフェノール、チオアニソールと三フッ素酢酸の中の一種や何種類の混合物を採用することができるが、１０−８０ミリリットルの分離液を取って上記のポリペプチド系物質（ＩＩ）を結合した樹脂を浸漬し、室温で１．５時間に攪拌し、それから濾過して得た濾液がポリペプチド物質の混合液体である。遊離するポリペプチド物質がエーテルで沈殿した後に、分離することができる。分離したポリペプチド物質を水や１０−４０％の塩基溶液（塩基が炭酸水素アンモニウム、炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウムを選択可能）に溶解し、それから常規の液体クロマトグラフィーを使って、完備したポリペプチド物質を純化することができる。純化したポリペプチド物質は紫外線分光光度法でその濃度を測って、質量スペクトル分析で合成したポリペプチド系物質のアミノ酸の配列を分析することができる。

本実施例は心筋ペプチドＸの化学合成方法に関するものである。

上記のポリペプチドＣのアミノ酸の配列がＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅである。

方法は実施例１と同じである。

本実施例は心筋ペプチドＣの化学合成方法に関するものである。

上記のポリペプチドの配列がＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ− Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅである。

上記の方法は下記のステップを含む。

（１）保護基Ｆｍｏｃの取り除き：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＣＬＴＲ樹脂を取って、二塩化メチルで浸漬してから、３回洗浄し、毎回２分間とする。それから乾燥して、室温で５０％のピペリジンの二塩化メチル溶液を１０ｍＬ入れて、５分間反応した後に乾燥して、依然として上記の同じ量の溶液で更に３０分間反応させ、更に乾燥し、その後に順次に８ｍＬ−１０ｍＬの二塩化メチル、アルコールと二塩化メチルで洗浄し、乾燥し、少量の樹脂（２ｍｇ〜１０ｍｇ）を取ってから、サリチルアルデヒド定量遊離基法で総括的なアミノ基の量を測定する。

（２）ペプチド結合の形成（ＤＣＣ―ＨＯＢｔ縮合法）：上記のＦｍｏｃの保護基を取り除いた樹脂にＦｍｏｃ−Ｇｌｙ（ｔ−Ｂｕ）の二塩化メチル溶液と１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの二塩化メチル溶液を入れると同時に、ジメチルホルムアミド溶液を入れて３０分間溶解を助けた後、Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドの二塩化メチル溶液の２ｍＬを入れて、２０℃で一晩反応させ、乾燥し、洗浄し、樹脂ペプチドＦｍｏｃ−Ｇｌｙ（ｔ−Ｂｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｒを得る。少量の樹脂を取って乾燥して一定の重量になると、サリチルアルデヒド定量自由アミノ基法で残ったアミノ基の量を測定し、これで縮合率を計算する。反応中に、ニンヒドリン色表示法で反応の進行を監視測定して、樹脂が無色で透明な形を呈した時に、縮合反応がすでに完了したことを示す。

（３）未縮合アミノ基のアセチル化：１０ｍＬの５０％の無水酢酸を含むピリジン溶液で室温でステップ２）で得た樹脂ペプチドを３０分間処理し、洗浄し、乾燥し、同じ溶液と量で更に一回処理して、未縮合のアミノ基をアセチル化する。

（４）ステップ（１）の樹脂ペプチドＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ−ＲをＦｍｏｃ−Ｇｌｙ（ｔ−Ｂｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｒに変えて、ステップ（２）のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ（ｔ−Ｂｕ）をＦｍｏｃ−Ａｌａ（Ｔｒｔ）に変えて、ステップ（１）〜ステップ（３）の操作を繰り返して、これで類推して、前のステップで合成した樹脂ペプチドを次のステップで合成したアミノ基の成分として、１４回ペプチド結合反応を行い、１５のアミノ酸の間のペプチド結合が全て形成するまでする。

（５）サイドチェーン保護基とペプチドチェーンの樹脂の取り除き：最後に形成した１２ペプチド樹脂に、二塩化メチル３０ｍＬ、三フッ素酢酸３．０ｍＬを入れて、２５℃で６０分間反応し、濾過して、濾液を保留する。５０％の三フッ素酢酸を含む二塩化メチル溶液１０ｍＬを濾液に入れて、２０分間反応し、その後上記の溶液で３回洗浄し、洗浄液体を前回の濾液と合わせて、回転蒸発器で少しだけの液体が残るまで蒸発し、大量に無水エーテルを入れ、白色の粉末状のものを析出し、遠心分離して液体を取り除いて、無水エーテルで粉末を５回細かく砕いて、真空乾燥し、算出率を再計算する。

（６）少量の物を取って電気泳動測定とＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行って、クロマトグラフィーの条件として、Ａｌｌｔｅｃｈ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｃ１８クロマトグラフィーカラム、緩衝液Ａが０．１％の三フッ素酢酸（ＴＦＡ）の水溶液で、緩衝液Ｂが０．１％のＴＦＡと９０％のアセトニトリール（上記の全てが体積率である）水溶液で、溶出の勾配が４０分間緩衝液Ｂの体積数が１０％から５０％に上がり、移動相の速度が１．０ｍｌ／ｍｉｎで、測定波長が２１４ｎｍである。

本実施例はポリペプチド（心筋ペプチドＸ）の合成に関わったものである。

ポリペプチドの配列がＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅである。

方法は実施例３と同じである

本実施例は心筋ペプチド溶液からポリペプチド（心筋ペプチドＣ）を抽出する方法に関わったものである。

（１）機器設備
エリート高圧液体クロマトグラフィーＰ２３０システム、ＰＦ−２の二次元液体クロマトグラフィー分離システム（米国ダイオネクス社）解析型クロマトグラフィーカラム、ｗａｔｅｒｓ、Ｃ１８、４．６Ｘ２５０ｍｍ、ＳＰＥ固相抽出カラム（ｗａｔｅｒｓ社）、Ｃ１８半調製逆相クロマトグラフィーカラム（米国熱電会社）、真空冷凍乾燥機（米国熱電会社）、遠心分離機など。

（２）実験条件と方法
１．心筋ペプチド溶液に７０％の硫酸アンモニウム溶液を入れ、温度が４℃の条件で一晩放置し、遠心して、上清液と沈殿物を分離する。
２．上清溶液を取って、ＳＰＥ固相抽出カラムを通し、６０％のアセトニトリールと０．１％の三フッ素酢酸の混合溶液で溶出して、画分Ａを収集する。

３．収集した画分Ａを濃縮して、それから逆相クロマトグラフィーで分離して、活性がある画分Ｂを収集する。

クロマトグラフィーの条件として、移動相：Ａ相が１００％Ｈ_２０＋０．１％ＴＦＡで、Ｂ相が６０％ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡである。

紫外線メーター、波長λ＝２８０ｎｍ、Ｒ＝３．０
勾配溶出：０−５ｍｉｎ０％Ｂ、５−３５ｍｉｎ０％−１００％Ｂ、３５−４０ｍｉｎ１００％Ｂ、４０−４５ｍｉｎ１００％−０％Ｂ。

４．活性がある画分Ｂを濃縮して、それから解析型逆相クロマトグラフィーで更に分離して、活性がある画分Ｃを収集する。

クロマトグラフィーの条件として、
移動相：Ａ相が１００％Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡで、Ｂ相が９５％ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡである
紫外線メーター：波長λ＝２８０ｎｍ、Ｒ＝３．０
勾配溶出：０−５ｍｉｎ０％Ｂ、５−５０ｍｉｎ０％−１００％Ｂ、５０−６０ｍｉｎ１００％Ｂ、６０−６５ｍｉｎ１００％−０％Ｂ。

５．活性がある画分Ｃに質量スペクトルの測定を行って、質量スペクトルのデータで分析して、図２−図３のように、画分Ｃの中に活性があるペプチドのアミノ酸の配列を同定する。

本実施例は心筋ペプチド溶液からポリペプチド（心筋ペプチドＣ）を抽出する過程での構造同定と品質測定に関するものである。

（１）質量スペクトルの測定
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量スペクトルメーター（米国ＡＢ会社−４８００）で得た物に対して質量スペクトルの測定を行うが、その中にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ一級質量スペクトルは陽イオン反射測定モードを採用して、二次タンデム質量スペクトルは陽イオン反射モードを採用して、測定の結果は図２の通りである。

（２）活性の測定
活性の測定は大連珍奥薬業公司の提供した「心筋細胞育成活性測定試験」の方法で行われる。この方法は体外培養心筋細胞のアドリアマイシンによる中毒試験に基づき、２、４−ジフェニル臭素化テトラゾール（ＭＴＴ）を反応指示薬として、心筋ペプチドが障害を受けた心筋細胞線粒体の脱酸酵素の活力を強化する作用を観察して、心筋の保護作用を判定する。

活性測定の結果は下記の表の通りである。

本実施例は心筋ペプチドＣ（ＣＭＰＣ）の心筋虚血用薬の製造および／あるいは治療の用途に関するものである。

一、実験材料
１．試験用動物
ＳＤ幼いマウス、２−４の日齢、瀋陽薬科大学動物センターから提供されたもの。

ＳＤマウス、体重が２００〜３００ｇで、雌雄がそれぞれ半分で、中国人民解放軍軍事医学科学院試験動物センターから提供されたもので。動物合格証の番号：ＳＣＸＫ（軍）２００２−００１。

２．試験用薬物と試薬
心筋ペプチドＣ（ＣＭＰＣ）、大連珍奥薬業有限公司から提供されたもので、ロット番号：Ｃ１５８６１０２。

ベラパミル注射液（Ｖｅｒ）：上海穀豊製薬有限公司、仕様：２ｍｌ：５ｍｇ、ロット番号：０７０７０１。

注射用ドキソルビシン（アドリアマイシン）：広東汕頭特区明治医薬有限公司、仕様：１０ｍｇ／瓶、ロット番号：０７０２０２。

ＤＭＥＭ培養基（高糖）：Ｇｉｂｃｏ、ロット番号：１２９０００７。

ＤＭＥＭ培養基（低糖）：Ｇｉｂｃｏ、ロット番号：１３４８５２９。

ＩＩ型コラゲナーゼ：Ｇｉｂｃｏ；ＦＢＳ：天津市ハオヤン生物製品科技責任有限公司、ロット番号：０４７００７０１−３１００。

メチルチアゾリルテトラゾリウム（ＭＴＴ）：Ａｍｒｅｓｃｏ；ＮＢＴ：Ａｍｒｅｓｃｏ、仕様：１００ｍｇ。

ウレタン：天津基準化学試薬有限公司、ロット番号：２００６０２１８。

スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、マロンアルデヒドジアニリド（ＭＤＡ）、クレアチニンキナーゼ（ＣＫ）と乳酸脱酸酵素（ＬＤＨ）の試薬箱が南京建成バイオロジカルエンジニアリング研究所から購入されたもので、ロット番号：２００８０１２２。

氷酢酸：天津市百世化工有限公司、仕様：５００ｍｌ、ロット番号：２００７０７１２。

無水アルコール：天津市百世化工有限公司、仕様：５００ｍｌ、ロット番号：２００７０４１０。

二、実験方法
１．体外試験
１．１心筋細胞の初代培養
幼いマウスの心室を取って、Ｄ−Ｈａｎｋ’ｓで洗った後に細かく切って、ＩＩ型コラゲナーゼで消化して、心筋細胞と繊維細胞を得て、１５％のＦＣＳを含む高糖ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−Ｈ−１５）で培養する。差異的細胞接着と化学方法で繊維細胞を取り除いて、心筋細胞を９６孔の板に接種する。

１．２．初代培養心筋細胞のアドリアマイシンによる障害作用の抵抗
細胞の培養方法が１．１と同じである。

模型の製造：実験は空白対照群、模型群、陽性対照群（ベラパミル２、０．４、０．０８のｍｇ／Ｌ）と異なった濃度の試薬群（ＣＭＰＣ５０、１０、２、０．４、０．０８、０．０１６、０．００３２、０．０００６４ｍｇ／Ｌ）を設けて、上記の空白対照群：心筋細胞がＤＭＥＭ−Ｈ−１５で培養する。上記の模型群：１ｍｇ／Ｌのアドリアマイシンを入れて、１時間培養した後に、ＤＭＥＭ−Ｈ−１５で板を２回洗って、ＤＭＥＭ−Ｈ−１５を入れて培養する。アドリアマイシンで障害を受けた１時間後の心筋細胞をＤＭＥＭ−Ｈ−１５で２回洗った後にそれぞれ各濃度のベラパミル注射液（Ｖｅｒ）とＣＭＰＣに入れる（上記の各群の培養体系の総括的な容積が全部１００μｌ／孔で、薬物の濃度が最終濃度を指す）。２４時間培養し続けた後にＭＴＴ法で心筋細胞内線粒体の琥珀酸脱酸酵素の活力を測定して、そして保護率を計算して、ＥＣ_５０値を算出する。保護率＝（Ａ_Ｘ−Ａ_{ｍｏｄｅｌ}）／（Ａ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}−Ａ_{ｍｏｄｅｌ}）×１００％であるが、Ａ_Ｘ、Ａ_{ｍｏｄｅｌ}、Ａ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}がそれぞれ各投薬群、模型群と空白対照群の吸光度値を示す。

アドリアマイシン障害模型で、ＣＭＰＣは心筋細胞の生存率を著しく高めることができて、薬物の濃度が０．０１６−２ｍｇ／Ｌの時にその保護効果がわりに良くて、模型群と比較して著しい相違がある。アドリアマイシン障害模型で培養板の１、２、３のＣＭＰＣのＥＣ_５０がそれぞれ０．１５、０．１３、０．２７ｍｇ／Ｌである。結果は表１（ＣＭＰＣの心筋細胞に対する保護率が「％」で表す）を参照する。

心筋ペプチドＣのアドリアマイシンで障害を受けた心筋細胞の生存率に対する影響

^＊＊Ｐ＜０．０１，^＊Ｐ＜０．０５ 模型群との対比 ^＃＃Ｐ＜０．０１、^＃Ｐ＜０．０５ 空白対照群との対比
１．３． ＣＭＰＣの初代培養心筋細胞酸素不足―酸素再供給による障害作用の抵抗
細胞の培養方法が１．１と同じである。

模型の製造：４８−７２時間培養された心筋細胞製造模型を取って、培養板内の各孔の細胞を対照群、模型群、ベラパミル群（２、０．４、０．０８ｍｇ／Ｌ最終濃度）及びＣＭＰＣ群（最終濃度が５０、１０、２、０．４、０．０８、０．０１６、０．００３２ｍｇ／Ｌ）に分けて、各群が３つの孔である。対照群を除き、その他の細胞は下記の方法で模型を製造する。即ち、培養板の心筋細胞の単層を低糖培養基（相応濃度のベラパミルやＣＭＰＣを含む）に変えた後に、培養板を真空乾燥器に入れて、窒素を入れて、それから密閉して培養する。１５時間酸欠して、心筋細胞に障害をもたらす。酸欠後に高糖ＤＭＥＭ培養液（９５％の空気＋５％のＣＯ２）に変えて１時間培養して、酸素再供給障害をもたらす。ＭＴＴ法で５４０ｎｍでの吸光度値を測定して、上記と同じで保護率を計算して、ＥＣ_５０値を算出する。

酸欠の酸素再供給障害模型で、ＣＭＰＣは著しく心筋細胞の生存率を高めることができるが、薬物濃度が０．０８−２ｍｇ／Ｌの時にその保護効果がわりに良くて、模型群と比較して著しい相違があって、培養板１、２、３でＣＭＰＣのＥＣ_５０がそれぞれ０．６６、０．１４、０．８２のｍｇ／Ｌである。結果は表２（ＣＭＰＣの心筋細胞に対する保護率が「％」で表す）を参照する。

心筋ペプチドＣの酸欠―酸素再供給障害を受けた心筋細胞の生存率に対する影響

^＊＊Ｐ＜０．０１，^＊Ｐ＜０．０５ 模型グループとの対比 ^＃＃Ｐ＜０．０１、^＃Ｐ＜０．０５ 空白対照群との対比
２．体内実験
２．１．ＣＭＰＣ予防性投薬のマウスの心筋虚血−再潅流傷害に対する保護作用
２５０−３００ｇ のＳＤマウスを７０匹取って、その中の６０匹を体重のバランスによって無作為に６群に分けて、群ごとに１０匹で、残った１０匹が各群の死亡動物の補充とする。正常対照群：仮手術を行って、即ち冠動脈左前下行枝（ＬＡＤ）で糸を通して、結紮しない。模型群：結紮の前に３０分間静脈を経由して生理食塩水を５ｍｌ／ｋｇ投薬して、虚血−再潅流操作は模型の製造を参照する。陽性薬群：結紮の前に３０ｍｉｎに静脈を経由してベラパミルを１．０ｍｇ／ｋｇ投薬して、虚血−再潅流操作が模型群と同じである。ＣＭＰＣの高、中、低の薬分量群：結紮の前に３０ｍｉｎに静脈を経由して相応濃度のＣＭＰＣ（１．８、０．６、０．２ｍｇ／ｋｇ）を投薬して、虚血−再潅流操作が模型群と同じである。

模型の製造：６％のウレタン溶液を２０ｍｌ／ｋｇで腹腔に注射して動物に麻酔をかけた後に、動物を仰向けに寝て手術台に固定する。心電図機をつないで、身体ＩＩ心電図を測る。気管に挿管して、動物人工呼吸機をつないで、６ｍｌ／２００ｇの湿度で、５５回／ｍｉｎの頻度で呼吸させて、プラスの圧力で空気を通して、呼吸比が２：１である。胸骨左縁の第四／五のあばらの隙間に開胸術を行って、肋骨を分離して心嚢を取り除いた後に、左心耳の下縁を標識にして、６／０の絹糸で冠動脈左前下行枝を結紮して、結紮糸と血管の間に直径が１ｍｍのポリエチレンパイプを入れる。絹糸を結紮して、ポリエチレンパイプで冠動脈左前下行枝を圧迫して心筋に虚血させる。局部の心筋が青白く変わったことと心電図Ｓ−Ｔ段が高くなったことで冠動脈左前下行枝の結紮が成功したと表す。３０ｍｉｎ後にポリエチレンパイプを真剣に取り出して再潅流させる。虚血区の反応性充血と高くなったＳ−Ｔ段が１／２以上に下がったことで再潅流が成功したことを実証する。３０分間再潅流して、腹の大動脈から血を取って、血清を製造して、生物化学指標の測定に用いる（試薬箱の説明書によってＣＫ、ＬＤＨ、ＭＤＡ、ＳＯＤの含有量を測定する）。

血を取った後にマウスの心臓を取って、生理食塩水で心臓内の血を洗って、全体の心の重量を量って、脂肪を取り除いて、心筋を４−５切れに横切って試験管に入れて、３７℃でＮＢＴ染色して（正常の組織で染色して、虚血の組織で染色しない）、写真を撮る。虚血の心筋を切って重量を量って、虚血の心筋の重量と完全の心の湿った重量のパーセンテージで心筋梗塞の面積（ＭＩＳ）を計算する。

模型群ではマウスの血清のＣＫ、ＬＤＨが著しく高く上がった（Ｐ＜０．０１）。陽性薬群で血清ＣＫ、ＬＤＨ活性（Ｐ＜０．０５）を著しく下げた。ＣＭＰＣ高薬分量群、ＣＭＰＣ中薬分量群では模型群と比較して、マウスの血清ＬＤＨ活性（Ｐ＜０．０５）を著しく下げることができる。ＣＭＰＣ高薬分量群、ＣＭＰＣ中薬分量群ではＣＫ活性（Ｐ＜０．０５）を著しく下げることができる。ＣＭＰＣ低薬分量群はＬＤＨ、ＣＫの活性を下げることができるが、著しい相違（Ｐ＞０．０５）がないのである。結果は表３を参照する。

心筋ペプチドＣの予防性投薬の虚血再潅流したマウス血清ＣＫ、ＬＤＨに対する影響（Ｘ±ＳＤ）

^＊Ｐ＜０．０５，^＊＊Ｐ＜０．０１ 模型群との対比。^＃＃Ｐ＜０．０１仮手術群との対比
模型群ではマウスの血清のＳＯＤ活性が著しく下がって（Ｐ＜０．０１）、ＭＤＡ値が著しくあがった（Ｐ＜０．０１）。陽性薬Ｖｅｒが血清ＳＯＤ活性（Ｐ＜０．０１）を著しく高めて、ＭＤＡ活性を下げる（Ｐ＜０．０５）。ＣＭＰＣ−Ｈ、Ｍ、Ｌ薬分量群では模型群と比較して、冠動脈を結紮したマウスの血清のＳＯＤ活力を高めて（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）、ＭＤＡの含有量（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５〉を下げることができる。結果は表４を参照する。

心筋ペプチドＣの予防性投薬の虚血再潅流したマウス血清ＳＯＤ、ＭＤＡに対する影響（Ｘ±ＳＤ）

^＊Ｐ＜０．０５，^＊＊Ｐ＜０．０１ 模型群との対比。^＃＃Ｐ＜０．０１仮手術群との対比
模型群ではマウスの心筋梗塞の面積が著しくて上がった（Ｐ＜０．０１）ことに対して、陽性薬群、ＣＭＰＣの各予防性投薬群では模型群と比較して、マウスの心筋梗塞の面積を著しく下げることができる（Ｐ＜０．０１）。結果は表５を参照する。

心筋ペプチドＣの予防性投薬の虚血再潅流したマウスの心筋梗塞面積に対する影響（Ｘ±ＳＤ）

^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１ 模型群との対比。^＃＃Ｐ＜０．０１仮手術群との対比
２．２．ＣＭＰＣ治療性投薬のマウスの心筋虚血−再潅流傷害に対する保護作用
ＬＡＤを結紮した後に５ｍｉｎに尾静脈に注射投薬して、ＬＡＤを結紮した ３０ｍｉｎの後に３０ｍｉｎに再潅流して、腹大動脈で血を採取した後に心臓を取って、上記の方法で生物化学指標と心筋梗塞の面積を測定する。

模型群ではマウスの血清ＣＫ、ＬＤＨが著しく上がった（Ｐ＜０．０１）。陽性薬Ｖｅｒが血清ＣＫ、ＬＤＨ活性を著しく下げた（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）。ＣＭＰＣ−Ｈ、Ｍ薬分量群では模型群と比較して、マウスの血清ＣＫ、ＬＤＨ活性を著しく下げることができる（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）。ＣＭＰＣ−ＬがＬＤＨ、ＣＫの活性を下げることができるが、著しい相違がない（Ｐ＞０．０５）。結果は表６を参照する。

心筋ペプチドＣの治療性投薬の虚血再潅流したマウス血清ＣＫ、ＬＤＨに対する影響（Ｘ±ＳＤ）

^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１ 模型群との対比。^＃＃Ｐ＜０．０１仮手術群との対比
模型群ではマウスの血清ＳＯＤ活性が著しく下がって（Ｐ＜０．０５）、ＭＤＡ値が著しく上がった（Ｐ＜０．０１）。陽性薬Ｖｅｒでは血清ＳＯＤ活性を著しく上げて（Ｐ＜０．０５）、ＭＤＡ含有量を下げることができる（Ｐ＜０．０５）。ＣＭＰＣ−Ｈ、Ｍでは模型群と比較して、マウスの血清ＳＯＤ活力を著しく上げることができる（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）。ＣＭＰＣ−ＬではＳＯＤ活性を上げる成り行きがあるが、模型群と比較して、著しい相違がない（Ｐ＞０．０５）。ＣＭＰＣ−Ｈ、Ｍ、Ｌの各薬分量群ではＭＤＡ含有量を著しく下げることができる（Ｐ＜０．０５）。結果は表７を参照する。

心筋ペプチドＣの治療性投薬の虚血再潅流したマウス血清ＳＯＤ、ＭＤＡに対する影響（Ｘ±ＳＤ）

^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１ 模型群との対比。^＃＃Ｐ＜０．０１仮手術群との対比
模型群ではマウスの心筋梗塞の面積が著しく上がった（Ｐ＜０．０１）ことに対して、陽性薬Ｖｅｒ、ＣＭＰＣの各治療性投薬群では模型群と比較して、マウスの心筋梗塞の面積を著しく下げることができる（Ｐ＜０．０１）。結果は表８、図８を参照する。

心筋ペプチドＣの治療性投薬の虚血再潅流したマウスの心筋梗塞面積に対する影響（Ｘ±ＳＤ）

^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１ 模型群との対比。^＃＃Ｐ＜０．０１仮手術群との対比
三、結論
体外初代培養乳マウスの心筋細胞のアドリアマイシンによる障害と酸欠―酸素再供給による障害の模型で、心筋ペプチドＣは障害を受けた心筋細胞線粒体の脱酸酵素の活性を高めて、障害を受けた心筋細胞に対して一定の保護の作用を持っている。体内の心筋ペプチドＣの予防性と治療性投薬は虚血と再潅流したマウスの血清ＣＫ、ＬＤＨ、ＭＤＡの含有量を著しく下げ、ＳＯＤ含有量を上げ、しかも一定の薬分量の依存性があるとともに、マウスの心筋梗塞の面積を下げることができるので、心筋ペプチドＣの治療性と予防性投薬の虚血と再潅流による障害を受けたマウスの心筋に保護の作用を持っていることが分かる。

Claims (8)

1. アミノ酸の配列順序がＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅであることを特徴とするポリペプチド。
2. 下記のステップを含む方法：
   （１）心筋ペプチドの溶液に質量パーセンテージ濃度が６０−８０％の硫酸アンモニウムの溶液を入れ、放置し、遠心して、上清液と沈殿物を分離する；
   （２）上清液を取ってから、固相抽出カラムを通し、６０％のアセトニトリールと０．１％の三フッ素酢酸の混合溶液で溶出し、画分Ａを収集する；
   （３）収集した画分Ａを元の体積の１／８−３／４に濃縮してから、逆相クロマトグラフィで分離し、活性がある画分Ｂを収集し、逆相クロマトグラフィで分離する条件が、移動相：Ａ相が１００％Ｈ_２Ｏ＋０．１％ＴＦＡで、Ｂ相が６０％ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡで、紫外線測定機器の波長λ＝２８０ｎｍ、Ｒ＝３．０で、勾配溶出：０−５ｍｉｎ０％Ｂ、５−３５ｍｉｎ０％−１００％Ｂ、３５−４０ｍｉｎ１００％Ｂ、４０−４５ｍｉｎ１００％−０％Ｂである；
   （４）活性がある画分Ｂを元の体積の１／８−１／２に濃縮し、それから解析型逆相クロマトグラフィで更に分離し、活性がある画分Ｃを収集し、解析型逆相クロマトグラフィで分離する条件が、移動相：Ａ相が１００％Ｈ_２Ｏ＋０．１％ＴＦＡで、Ｂ相が９５％ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡで、紫外線測定機器の波長λ＝２８０ｎｍ、Ｒ＝３．０で、勾配溶出：０−５ｍｉｎ０％Ｂ、５−５０ｍｉｎ０％−１００％Ｂ、５０−６０ｍｉｎ１００％Ｂ、６０−６５ｍｉｎ１００％−０％Ｂである；
   （５）活性がある画分Ｃに質量スペクトルの測定を行い、質量スペクトルのデータで分析した結果、画分Ｃの中に活性があるペプチドのアミノ酸の配列があること同定すると、上記の画分Ｃが上記のポリペプチドであることが分かる；
   を特徴とする、心筋ペプチドの溶液から請求項１に記載のポリペプチドを抽出する方法。
3. 上記の硫酸アンモニウムの溶液の質量パーセンテージ濃度が７０％であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 下記のステップ：
   （１）それぞれトリプトファン、セリン、アスパラギン、バリン、ロイシン、アルギニン、グリシン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、リジンのアミノ基を保護基で保護する；
   （２）先に固相担体を溶解し、更にポリペプチドのアミノ酸の配列順序の中の最初に保護されたアミノ酸を当該固相担体に固定してから、得た物を洗浄し、最初に保護されたアミノ酸とつながった固相担体を得る；
   （３）第二の保護アミノ酸を最初のアミノ酸を結合した固相担体に入れて、縮合剤の存在で反応を行いペプチド結合を形成してから、アミノ酸のアミノ基の保護基を除いて、得た固相担体を洗浄する；
   （４）ポリペプチドのアミノ酸の順序によって、順次に相応の保護アミノ酸を入れ、上記のアミノ基保護基を取り除き、洗浄ステップを繰り返して、最後のアミノ酸がペプチドチェーンと結び付けるまでペプチドチェーンを絶えず延長する；
   （５）分離液を取って、上記のステップ（４）で得たポリペプチドを結合した固相担体を浸漬してから、濾過後に得た濾液を取って沈殿を行い、ポリペプチドの中間体を得る；
   （６）得たポリペプチドの中間体を分離純化して、目標のものを得る；
   を含む方法を特徴とする請求項１に記載のポリペプチドを製造する化学合成方法。
5. ステップ（１）に記載のアミノ酸が下記のグループ：
   （１）カルボベンゾキシ基（Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙｌ）；
   （２）ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）基；
   （３）トシル（Ｔｏｓｙｌ）基；
   （４）９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ：９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）；
   で保護されることを特徴とする請求項４に記載の化学合成方法。
6. 請求項１に記載のポリペプチドを含む組織器官の虚血の予防用および／あるいは治療用薬。
7. 請求項１に記載のポリペプチドを含む心筋虚血、脳虚血、肝虚血、胃虚血、腸虚血、肺虚血あるいは腎臓虚血の予防用および／あるいは治療用薬。
8. 請求項１に記載のポリペプチドを含む心筋虚血の予防用および／あるいは治療用薬。