JP5376802B2 - タンパク質多型と冠動脈心疾患との関係 - Google Patents
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Description
本発明は、冠動脈心疾患に関する危険の増加を同定する方法、および、前記方法に適したプローブ、プライマー、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する。
西欧諸国において、心臓血管疾患は、男女ともに主な死亡原因であって、冠動脈心疾患、特に冠動脈疾患は、心臓血管疾患の主要な原因である。アンギナ（また狭心症とも言う）とは、心筋に十分な酸素が供給されないために発症する一時的な胸部の痛みまたは圧迫感である。動脈が狭くなっていたりブロックされて、筋肉への血流を高めることができずにより多くの酸素への要求を満たすことができない場合、虚血が起こる可能性があり、それにより痛み（すなわちアンギナ）が生じる。
通常、狭心症は、冠動脈疾患が原因で発症するが、他の冠動脈心疾患によっても発症する可能性がある。虚血を起こした全ての人が狭心症を経験するとは限らない。アンギナを起こさない虚血は、無症候性虚血と呼ばれる。無症候性虚血の危険は、心臓組織が同様にダメージを受けるが、患者がそうとは気付かないということにある。従って、患者または担当医師が、最終的に心筋梗塞を引き起こすまで、心臓に受けている可能性のあるダメージを認識しないことが多い。それゆえに、早期診断、従って早期治療または予防措置を可能にする、血管の変性、特に冠動脈の変性（以下、冠動脈心疾患と称する）を認識するための診断原理が大いに必要である。
従って、本発明の目的は、冠動脈心疾患の改善された診断および治療方法を提供することである。
これは、個体中の冠動脈心疾患に関する危険の増加を同定する方法によって達成され、本方法において、Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位におけるグルタミン酸以外のアミノ酸の存在、および／または、３３７位におけるバリン以外のアミノ酸の存在が、サンプル中で決定される。
以下、ヌクレオチドおよびアミノ酸に関する標準的な略語（例えば、アミノ酸の３文字または１文字コード）は、省略されていない用語と同義に用いられる。
Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位でのアミノ酸置換（特に、ＧｌｕからＬｙｓへの場合）、および／または、３３７位でのアミノ酸置換（特に、ＶａｌからＩｌｅへの場合）を含むＫｉｒ６．２のタンパク質配列中の多型の同定を用いて、冠動脈心疾患、好ましくは冠動脈疾患および／または狭心症に関して、高い危険なのか、または、通常の危険なのかを予測することができる。これは、例えば、以下で用いることができる：
１）対象のタンパク質領域の配列解析に基づく方法（例えば、標準的なタンパク質分解、マススペクトロメトリーを用いたタンパク質配列フラグメントの解析）；
２）対象の領域に対する抗Ｋｉｒ６．２抗体の使用に基づく方法（例えばＥＬＩＳＡ）；
３）例えばヒト、動物、細菌または酵母細胞を用いたインビトロ分析でのＫｉｒ６．２の機能的な活性の解析に基づく方法。
１）対象のタンパク質領域の配列解析に基づく方法（例えば、標準的なタンパク質分解、マススペクトロメトリーを用いたタンパク質配列フラグメントの解析）；
２）対象の領域に対する抗Ｋｉｒ６．２抗体の使用に基づく方法（例えばＥＬＩＳＡ）；
３）例えばヒト、動物、細菌または酵母細胞を用いたインビトロ分析でのＫｉｒ６．２の機能的な活性の解析に基づく方法。
本発明はさらに、個体における冠動脈心疾患に関する危険の増加を同定する方法に関し、本方法において、Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位にグルタミン酸以外のアミノ酸、および／または、３３７位にバリン以外のアミノ酸を包含するＫｉｒ６．２ポリペプチド配列が生じるような、Ｋｉｒ６．２遺伝子の対立遺伝子の一方または両方（好ましくは両方）におけるヌクレオチド配列における差異の存在が、サンプル中で決定される。
Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位におけるアミノ酸置換（特に、ＧｌｕからＬｙｓへの場合）、および／または、３３７位におけるアミノ酸置換（特に、ＶａｌからＩｌｅへの場合）が生じるような、Ｋｉｒ６．２遺伝子の対立遺伝子の一方または両方におけるヌクレオチド配列中の多型の同定を用いて、正常な個体、好ましくは糖尿病患者において、冠動脈心疾患、好ましくは冠動脈疾患、より好ましくは狭心症の危険が高いのかどうかを予測することができる。
これは、例えば、以下で用いることができる：
１）対象のヌクレオチド領域の配列解析に基づく方法（例えば、パイロシーケンシング、放射標識したヌクレオチド、または、蛍光性色素で標識したヌクレオチドを用いた配列解析方法、マススペクトロメトリーを用いた配列フラグメントの解析）；
２）対象の領域へのヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに基づく方法（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）；
３）対象のヌクレオチド領域の増幅産物の解析に基づく方法（例えば、ＴａｑＭａｎTM解析）。
１）対象のヌクレオチド領域の配列解析に基づく方法（例えば、パイロシーケンシング、放射標識したヌクレオチド、または、蛍光性色素で標識したヌクレオチドを用いた配列解析方法、マススペクトロメトリーを用いた配列フラグメントの解析）；
２）対象の領域へのヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに基づく方法（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）；
３）対象のヌクレオチド領域の増幅産物の解析に基づく方法（例えば、ＴａｑＭａｎTM解析）。
内向き整流性Ｋ+チャンネルＫｉｒ６．２（ＫＣＮＪ１１またはＢｉｒ）は、膵島のＡＴＰ感受性カリウムチャンネル（ＩKATP）のサブユニットである。Ｋｉｒ６．２に関する遺伝子は、染色体１１ｐ１５．１にマッピングされており、Ｋｉｒ６．２タンパク質は、３９０個のアミノ酸からなる。Ｋｉｒ６．２は、グルコース刺激によるインスリン分泌において主要な役割を有するため、２型糖尿病の発症に関与する遺伝的欠陥に関連する候補遺伝子と考えられている（Ｙａｍａｄａ等（２００１）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｓ Ｒｅｖ １７：２１３〜２１６）。
当業界の最先端では、Ｋｉｒ６．２の数種のタンパク質、ゲノムおよびコードポリヌクレオチド配列は既知である。例えば、数種のヒトタンパク質／ゲノムＤＮＡ／コード配列は、ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；国立医学図書館（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），ビルディング３８Ａ，ベセスダ，メリーランド州２０８９４，米国；www.ncbi.nhm.nih.gov）データベースで、登録番号ＸＰ００６３９８（配列番号３）、（配列番号５）（タンパク質配列）ＸＭ００６３９８（配列番号４）、（配列番号６）（コード配列）で公共的に利用可能である。１つのゲノムのＫｉｒ６．２配列は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＴ＿００９３０７（ヒト第１１染色体のゲノムコンティグ；サイズ：８６６５９３０ｂｐ）で公開されているゲノム連続配列から公共的に利用可能である。ｍＲＮＡ／コード／ゲノムのＫｉｒ６．２配列のアライメントは、以下のインターネットリンク：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?SendTo=on&db=nucleotide&dispmax=1&extrafeat=-1&list_uids=NT_009307.12&showndispmax=1&view=graph&_from=5656500&_to=5659500&_sfrom=5657000&_font=default&_llen=60&_slen=4000を用いて公共的に利用可能である。
このようなアライメントからわかるように、５６５６５００位〜５６５９５００の配列ストレッチ（配列番号１３）は、ゲノムのＫｉｒ６．２遺伝子座を含む。図２および３で示されるように、それぞれのＫｉｒ６．２配列は、タンパク質配列に関して２３位および／または３３７位が異なっており、さらにそれに相当するコード配列の位置に関してそれぞれ６７／６８／６９、および、１００９／１０１０／１０１１で異なっている。コード配列はゲノムＤＮＡの転写産物から生じるため、５６５７１０６／１０７／１０８位、および、５６５７４７８／７９／８０位に関してゲノム配列が異なる数種の変異体も存在するはずである。
Ｋｉｒ６．２という用語は、Ｋｉｒ６．２のタンパク質および核酸を意味する。タンパク質という用語は、ポリペプチドを含み、加えて、２以上のポリペプチド鎖からなるタンパク質も含み、例えば、既知の結合（例えばＳ−Ｓ架橋）によって互いに連結して１つのタンパク質単位を形成するポリペプチドである。Ｋｉｒ６．２タンパク質という用語は、あらゆるＫｉｒ６．２タンパク質またはポリペプチド、または、それらの機能的なフラグメントを指すことができる。Ｋｉｒ６．２フラグメントは、例えば、配列番号１〜８または１３のいずれか１つに記載の配列を有するＫｉｒ６．２タンパク質または核酸より短いあらゆるＫｉｒ６．２タンパク質または核酸であり得る。Ｋｉｒ６．２フラグメントは、好ましくはＫｉｒ６．２の機能的なフラグメントである。Ｋｉｒ６．２タンパク質の機能的なフラグメントは、Ｋｉｒ６．２の機能のうち少なくとも１つを有するタンパク質フラグメントである（例えば上記を参照）。Ｋｉｒ６．２の機能的な核酸は、例えば、Ｋｉｒ６．２タンパク質、または、機能的なそれらのフラグメントをコードする、または、Ｋｉｒ６．２核酸に特異的にハイブリダイゼーションすることができるＫｉｒ６．２核酸フラグメントである。
本願において、タンパク質配列、アミノ酸配列およびポリペプチド配列という用語は同義に用いられる。
驚くべきことに、本発明者等の研究により、Ｋｉｒ６．２ポリペプチドの２３位において最も頻度が高い変異体は、Ｇｌｕ（グルタミン酸，Ｅ）であることが明らかになった。さらに、発明者等は、３３７位において最も頻度が高い変異体は、Ｖａｌ（バリン，Ｖ）であることも明らかにした。従って、本願の範囲内では、それぞれの位置においてこれらのアミノ酸は、Ｋｉｒ６．２の「野生型」とみなす。従って、本願に関するアミノ酸配列において置換もしくは突然変異、または、より頻度の低い変異体と言う場合、２３位および／または３３７位のいずれかにおける野生型アミノ酸が、その「野生型」とは異なることを意味する。
配列番号１に記載の配列（ＮＣＢＩ登録番号Ｄ５０５８２；図１Ａを参照）、および、配列番号２に記載の配列（ＮＣＢＩ登録番号Ｄ５０５８２；図１Ｂを参照）は、ポリペプチド配列の２３位および３３７位（加えて、それぞれ、コード配列の６７／６８／６９位または１００９／１０１０／１０１１位、および、ゲノム配列の５６５７１０６／０７／０８位、および、５６５７４７８／７９／８０位）に関して野生型のＫｉｒ６．２を示す。一方で、ＮＣＢＩデータベースから得られた、配列番号３に記載の配列（ＮＣＢＩ登録番号ＸＰ００６３９８；図２Ａ）、配列番号４に記載の配列（ＮＣＢＩ登録番号ＸＭ００６３９８、図２Ｂ）、および、配列番号５および配列番号６に記載の新規の配列はそれぞれ、ポリペプチド配列の２３位または３３７位のいずれかににおいてより低い頻度で発生する１個のアミノ酸（および、それぞれの配列の、ヌクレオチド配列の６７位または１００９位における差異）を包含する。配列番号７（図４Ａ）および配列番号８（図４Ｂ）に記載の新規の配列は、アミノ酸鎖の２３位および３３７位の両方においてより低い頻度で発生する変異体：アミノ酸配列の２３位のリシン（コード配列の６７／６８／６９位におけるＡＡＧ）、および、３３７位のイソロイシン（コード配列の１００９／１０１０／１０１１位におけるＡＴＣ）を包含する。
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、単一のヌクレオチド位置に置換を包含する、所定のヌクレオチド配列の変異体を示す；ＳＮＰは当業界周知である。
Ｋｉｒ６．２遺伝子で、翻訳されたタンパク質にアミノ酸置換が生じるような数種の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が同定されており、例えば、Ｅ２３Ｋ（タンパク質の２３位におけるグルタミン酸からリシンへの置換）、Ｌ２７０Ｖ（２７０位のロイシンからバリンへの置換）、および、Ｖ３７７Ｉである。
近年の研究によれば、Ｋｉｒ６．２の変異体Ｅ２３Ｋは、白色人種の個体群において２型糖尿病に関連している（Ｈａｎｉ等（１９９８）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４１：１５１１〜１５１５）。
しかしながら、心臓血管疾患に関して、ヒトにおけるＫｉｒ６．２変異体の臨床的な作用に関するデータはこれまでみつかっていない。驚くべきことに、本発明者等の研究により、Ｋｉｒ６．２タンパク質の２３位および／または３３７位におけるアミノ酸配列内の突然変異の存在と、冠動脈心疾患の素因との密接な相関が初めて同定された。
ヒトＤＮＡまたはＫｉｒ６．２タンパク質を解析することによる、Ｋｉｒ６．２遺伝子中の遺伝子多型、特にＫｉｒ６．２−２３−ＫＫ（Ｋｉｒ６．２遺伝子の両方の対立遺伝子のそれに相当する位置での多型の結果として、タンパク質中の２３位にリシン（Ｋ）を有するＫｉｒ６．２変異体）、および、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩ（Ｋｉｒ６．２遺伝子の両方の対立遺伝子のそれに相当する位置での多型の結果として、タンパク質中の３３７位にイソロイシン（Ｉ）を有するＫｉｒ６．２変異体）の検出を、例えば（ａ）特に糖尿病患者における、冠動脈心疾患、より具体的には冠動脈疾患、さらにより具体的には狭心症の予防的処置のための遺伝子マーカーとして、（ｂ）薬物用量を適応させるための遺伝子マーカーとして、（ｃ）薬物スクリーニングの設定を適応させるための遺伝子マーカーとして、および、（ｄ）相／臨床研究において患者を選択するための遺伝子マーカーとして用いることができる。
冠動脈心疾患に関する素因の初期の同定を可能にすることによって、本発明に係る方法は、患者がアンギナまたは心臓組織のダメージのような症状を起こす前に、初期の予防的または治癒的治療を可能にする：上記のアミノ酸置換の一方または両方の同定、または、それらの基礎となるヌクレオチドのｍＲＮＡまたはゲノムレベルでの同定によって、治療する医師にとって、冠状の心臓組織または血管へのすでに存在するダメージをスクリーニングするための、または、ダメージおよび／または痛みが生じる前に予防的な医薬を処方するための明確な指標が得られる。
その上、前記アミノ酸置換と、冠動脈心疾患の発病との驚くべき相関により、前記Ｋｉｒ６．２のアミノ酸置換を示さない冠動脈心疾患患者と比較した場合、所定の医薬の用量がより多く必要であることを示唆すること、または、所定の／異なるタイプの薬物療法が必要であることを示すことによって、より有効な冠動脈心疾患の治療を可能にする。
従って、本発明の他の実施態様は、冠動脈心疾患を治療および／または予防するのに有用な医薬の用量を適応させる方法に関し、本方法において、
ａ）Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位においてグルタミン酸以外のアミノ酸、および／または、３３７位においてバリン以外のアミノ酸、
ｂ）Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位においてグルタミン酸以外のアミノ酸および／または３３７位においてバリン以外のアミノ酸が生じるような、Ｋｉｒ６．２遺伝子の対立遺伝子の一方または両方におけるヌクレオチド配列中の差異、または、
ｃ）Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫ、および／または、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩ、
を有するＫｉｒ６．２の存在が、個体のサンプル中で決定される。
ａ）Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位においてグルタミン酸以外のアミノ酸、および／または、３３７位においてバリン以外のアミノ酸、
ｂ）Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位においてグルタミン酸以外のアミノ酸および／または３３７位においてバリン以外のアミノ酸が生じるような、Ｋｉｒ６．２遺伝子の対立遺伝子の一方または両方におけるヌクレオチド配列中の差異、または、
ｃ）Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫ、および／または、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩ、
を有するＫｉｒ６．２の存在が、個体のサンプル中で決定される。
さらに、本発明のさらにその他の実施態様は、冠動脈心疾患の医薬に応答すると予想される個体を選択する方法に関し、本方法において、
ａ）Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位においてグルタミン酸以外のアミノ酸、および／または、３３７位においてバリン以外のアミノ酸、
ｂ）Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位においてグルタミン酸以外のアミノ酸および／または３３７位においてバリン以外のアミノ酸が生じるような、Ｋｉｒ６．２遺伝子の対立遺伝子の一方または両方におけるヌクレオチド配列中の差異、または、
ｃ）Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫ、および／または、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩ、
を有するＫｉｒ６．２の存在が、個体のサンプル中で決定される。
ａ）Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位においてグルタミン酸以外のアミノ酸、および／または、３３７位においてバリン以外のアミノ酸、
ｂ）Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位においてグルタミン酸以外のアミノ酸および／または３３７位においてバリン以外のアミノ酸が生じるような、Ｋｉｒ６．２遺伝子の対立遺伝子の一方または両方におけるヌクレオチド配列中の差異、または、
ｃ）Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫ、および／または、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩ、
を有するＫｉｒ６．２の存在が、個体のサンプル中で決定される。
上記個体の選択は、好ましくは、糖尿病患者を意味する；上記医薬は、好ましくは冠動脈疾患、最も好ましくは狭心症の予防薬または治療薬である。好ましくは、２３位でのアミノ酸置換は、ＧｌｕからＬｙｓへの置換であり、および／または、３３７位でのアミノ酸置換は、ＶａｌからＩｌｅへの置換である。上記サンプルは、好ましくは、単離されたタンパク質または核酸、生体サンプル、例えば組織サンプル、細胞もしくは組織抽出物、または、細胞である。
当業界の最先端では、広範囲の様々な冠動脈心疾患または狭心症の治療薬または予防薬が既知である。
本発明の研究によって初めてＫｉｒ６．２が冠動脈心疾患の基礎をなすプロセス、または、冠動脈心疾患と相関するプロセスに関与することが同定されたため、本発明のさらなる形態は、冠動脈心疾患を治療および／または予防するのに有用な医薬を同定するための、Ｋｉｒ６．２の使用に関する。
用語「医薬」は、個体における病状の治療または予防的処置に用いることができるあらゆる物質、または、物質の組み合わせを意味する。物質は、どのような生物学的な物質または化学物質でもよいし、または、天然産物の抽出物でもよく、これは、生化学または分子生物学的な方法で精製されたもの、部分的に精製されたもの、合成されたもの、または、製造されたものが可能である。
本発明の様々な形態において、冠動脈心疾患の予防または治療において有用または活性であるとみなされる医薬は、Ｋｉｒ６．２の機能のいずれか１つ、または、細胞中のＫｉｒ６．２（タンパク質または核酸）の量、または、Ｋｉｒ６．２発現に影響を与える物質または物質の組み合わせであれば、どのようなものでもよい。
この目的を達成するためには、上記物質は、Ｋｉｒ６．２の機能（例えば、上記で列挙したものなど）のいずれかを調節することができるものである。上記物質は、例えば、Ｋｉｒ６．２ポリペプチド／タンパク質またはそれらのフラグメントとの直接の相互作用および干渉によって、Ｋｉｒ６．２タンパク質活性を調節することができるものである。また、上記物質は、Ｋｉｒ６．２発現を、例えば転写（開始、伸長、プロセシングなど）、転写安定性、翻訳レベルでも調節することができるものである。その上、上記物質は、Ｋｉｒ６．２の翻訳後修飾、タンパク質フォールディングなどを調節することができるものである。上記物質は、上記の作用を直接的または間接的に働かせることができるものである（間接的とは、すなわち、Ｋｉｒ６．２の機能／タンパク質活性／発現などに影響を有する天然のシグナル伝達カスケードに干渉する（正または負に）ことを意味する）。
本発明の他の実施態様は、冠動脈心疾患を治療および／または予防するのに有用な医薬をスクリーニングする方法に関し、本方法は、以下の工程を含む：
ａ．Ｋｉｒ６．２を含む２種のサンプルを提供すること、
ｂ．１つのサンプルと、可能性のある医薬とを接触させること、
ｃ．可能性のある医薬の存在下および非存在下で、Ｋｉｒ６．２の活性またはＫｉｒ６．２の構造を決定すること、
ｄ．可能性のある医薬の存在下でのＫｉｒ６．２の活性と、可能性のある医薬の非存在下での活性とを比較すること。
ａ．Ｋｉｒ６．２を含む２種のサンプルを提供すること、
ｂ．１つのサンプルと、可能性のある医薬とを接触させること、
ｃ．可能性のある医薬の存在下および非存在下で、Ｋｉｒ６．２の活性またはＫｉｒ６．２の構造を決定すること、
ｄ．可能性のある医薬の存在下でのＫｉｒ６．２の活性と、可能性のある医薬の非存在下での活性とを比較すること。
また、可能性のある医薬物質の存在下での活性または構造（すなわち、Ｋｉｒ６．２タンパク質のフォールディング）は、野生型Ｋｉｒ６．２タンパク質の活性または構造と比較することができる。
好ましくは、上記サンプルは、Ｋｉｒ６．２の単離されたタンパク質またはタンパク質フラグメント、または、Ｋｉｒ６．２の単離された核酸または核酸フラグメントを含むか、または、それ自身である。
本発明に関して、「単離されたタンパク質」、「単離された核酸」等のように用いられている用語「単離された」は、自然源から精製されたタンパク質／核酸、同様に、組換えタンパク質／核酸（当然ながら、これも精製してあってもよい）を意味する。
冠動脈心疾患と相関があると同定されたＫｉｒ６．２中のアミノ酸置換は、冠動脈心疾患の治療および／または予防に影響を与える可能性が極めて高いため、上記の使用または方法のいずれか１つに用いられるＫｉｒ６．２としては、例えば、以下が挙げられる：
ａ）Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位にグルタミン酸以外のアミノ酸、および／または、３３７位にバリン以外のアミノ酸を含む、Ｋｉｒ６．２タンパク質、またはそれらのフラグメント、
ｂ）Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位においてグルタミン酸以外のアミノ酸および／または３３７位においてバリン以外のアミノ酸が生じるような、Ｋｉｒ６．２遺伝子の対立遺伝子の一方または両方におけるヌクレオチド配列中の差異を含むＫｉｒ６．２核酸、またはそれらのフラグメント、または、
ｃ）Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫ、および／または、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩ。
ａ）Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位にグルタミン酸以外のアミノ酸、および／または、３３７位にバリン以外のアミノ酸を含む、Ｋｉｒ６．２タンパク質、またはそれらのフラグメント、
ｂ）Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位においてグルタミン酸以外のアミノ酸および／または３３７位においてバリン以外のアミノ酸が生じるような、Ｋｉｒ６．２遺伝子の対立遺伝子の一方または両方におけるヌクレオチド配列中の差異を含むＫｉｒ６．２核酸、またはそれらのフラグメント、または、
ｃ）Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫ、および／または、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩ。
可能性のある医薬を、前記アミノ酸置換の一方または両方を包含するＫｉｒ６．２のタンパク質の機能および／またはフォールディングを、野生型タンパク質の機能および／またはフォールディングに復元する能力に関してスクリーニングすることによって、冠動脈心疾患を治療および／または予防するための医薬活性物質を同定することができる。
当業界の最先端では、医薬のスクリーニング方法およびシステム、特に、単離されたタンパク質またはタンパク質フラグメント、前記タンパク質を発現する細胞等を用いたハイスループット様式で用いられるような上記方法およびシステムは周知である。
当業界の最先端では、適切な分析方法または分析システム、すなわち、本発明に関して規定された標的分子の活性または濃度、Ｋｉｒ６．２の活性またはフォールディング（すなわち大部分がタンパク質または核酸を標的とする）を、可能性のある医薬化合物の有効性のパラメーターとして測定するために用いられる分析は周知である。分析は、例えば、生化学分析方法またはシステムであってもよく、この場合、単離された、または、部分的に単離された成分を用い、これらを規定の空間と時間内で反応混合物に混合して、可能性のある医薬化合物の有効性を試験してもよい。その他の分析の例としては、標的分子の活性、および、この活性に影響を与える能力の有効性を細胞内で決定することができる生化学分析方法またはシステムが挙げられる。
分析は、生物学的なプロセスのモニターが可能ならばどのようなタイプの分析方法またはシステムでもよい。適切には、細胞または生化学の（インビトロでの）システムで、生理学的な代謝経路の一部を示すが、同時に病的状態も示す分子カスケードおよびメカニズムが再現される。従って、可能性のある医薬化合物の薬理学的な活性は、それらのカスケードまたはメカニズムに干渉する、または、それらを調節する能力に従って決定することができる。
上記分析は、新規の医薬化合物のための薬物スクリーニング、特にハイスループットスクリーニングで使用するために再現可能であることが必要であり、さらに、拡張可能で頑丈であることも好ましい。上記分析は、好ましくは、化学物質を、それらの調査中の標的分子の活性を調節する能力に関してハイスループットスクリーニングすることに適している。分析のタイプは、例えば、用いられる標的分子のタイプ（例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチド）、および、「読み出し値」、すなわちそれに従って標的分子の活性が決定されるパラメーター（以下を参照）に依存する。
当業界の最先端では、このような分析の様々なタイプは一般的に既知であり、商業的な供給元から市販されている。
様々な目的のための適切な分析としては、放射線同位体または蛍光分析、例えば蛍光偏光分析（例えば、パンベラ（Ｐａｎｖｅｒａ）によって市販されているもの）、または、標識された要素と標識されていない要素との相互作用（例えば、標識されたタンパク質受容体と、それらの非標識リガンドとの相互作用）を測定するためのパッカード・バイオサイエンス（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，ＨＴＲＦ；ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎTM）が挙げられる。
さらなる例としては、細胞ベースの分析が挙げられ、この場合、細胞系は、安定して（誘導的に、または、非誘導的に；染色体またはエピソームによって）、または、一時的に、対象の組換えタンパク質を発現する。これらの分析は、例えば、レポーター遺伝子分析を含み、この場合、ある特定のプロモーター、または、シグナル伝達カスケードの要素のシグナル伝達経路の調節は、レポーター酵素の活性に従って測定され、ここにおいて、この酵素の発現は前記ある特定のプロモーターの制御下である。このタイプの分析については、それ自身調査予定であるか、または、調査中のシグナル伝達カスケードで調節されている規定のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含む組換え細胞系を構築しなければならない。当業界の最先端では、適切なレポーター酵素は、一般的に既知であり、例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ（例えば、パッカードの試薬の市販品）、β−ガラクトシダーゼが挙げられる。適切な細胞系は、分析の目的に依存するが、ほとんどがトランスフェクションが容易であり、さらに培養が容易な細胞系であり、例えばＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＩＨ−３Ｔ３などが挙げられる。
細胞内のイオンレベルを測定するための分析としては、例えば、ＦＬＩＰＲ（蛍光イメージングプレートリーダー，モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）から市販されている）分析が挙げられ、ここにおいて、冷却したＣＣＤカメラと連結されたアルゴンレーザー光源によって、３８４ウェルプレート中で、細胞（例えば、ニューロン性細胞、またはその他の細胞（例えば、組換えによって、または、天然に存在するある特定のイオンチャンネルを発現する細胞））内の一過性のイオンシグナル（例えば、Ｃａ2+など）を同時に測定することが可能になる。例えば、ＦＬＩＰＲ分析で、ある特定の蛍光色素、例えばフルオ−３（Ｆｌｕｏ−３）、フルオ−４（Ｆｌｕｏ−４）を用いて細胞内カルシウムをモニターすること、または、ＢＣＥＣＦまたはＢＣＰＣＦまたは特定のＦＬＩＰＲ分析キットを用いて細胞内ｐＨをモニターすること、または、例えばＤｉＢＡＣまたは特定のＦＬＩＰＲ分析キットを用いて膜電位変化を検出すること、または、膜分極をモニターすることが可能である。その他の細胞内イオン、例えば亜鉛またはナトリウムをモニターするために、当業界の最先端では既知のその他の色素を用いることができる。その他のタイプの分析およびその他のタイプの読み出し値が、一般的に当業者既知である。
イオンチャンネル活性の決定、例えばＫｉｒ６．２（これは、例えば細胞内イオン濃度を制御するため、細胞内イオン濃度の測定に用いることができる）のイオンチャンネル活性の決定には、例えば、膜電位感受性分析や色素を用いることができ、例えばＤｉＢＡＣ、または、ＦＬＩＰＲ技術に基づくモレキュラーデバイスの膜電位分析キット；ＪＣ−１色素をＦＬＩＰＲ技術で測定するミトコンドリアの膜分極；イオン感受性色素などが挙げられる。細胞内カリウム濃度などの決定には、パッチ−クランピングに基づく分析、または、原子吸着による分光分析に基づくルビジウムイオン流出測定が特に適している。細胞内のある特定の変化および状態を検出するためのさらなる自動装置は当業者既知であり、例えば、アキュメン・バイオサイエンス（Ａｃｕｍｅｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）製の、アキュメン検出器（蛍光ベースのレーザースキャニングリーダーであって、適切に標識された目的物の分布の３次元的な再構成が可能）が挙げられる。当業界の最先端では、その他のタイプの分析およびその他のタイプの「読み出し値」は周知である。
上記のスクリーニング方法または使用には、Ｋｉｒ６．２タンパク質が、配列番号３、５または７に記載の配列を含む、または、それらを有することが好ましい。また、上記の方法または使用に係るタンパク質フラグメントが、配列番号３、５または７に記載の配列を含む、または、それらを有することも好ましい。好ましくは、上記のスクリーニング方法に係る核酸は、配列番号４、６または８に記載の配列を含む、または、それらを有する。さらに、好ましくは、前記スクリーニング方法に係る核酸フラグメントは、配列番号４、６または８に記載の配列を含む、または、それらを有する。
Ｋｉｒ６．２の、２３位における野生型の変異体Ｇｌｕから、および／または、３３７位における野生型変異体Ｖａｌからのアミノ酸置換は全て、冠動脈心疾患の素因に影響を与える可能性が極めて高い。従って、野生型からのアミノ酸置換は、基本的には、あらゆるタイプのものが可能である。好ましくは、２３位および／または３３７位でのアミノ酸置換は、それぞれ野生型アミノ酸Ｇｌｕ２３およびＶａｌ３３７の特性と異なる特性を有するアミノ酸の取り込みを意味する。従って、２３位に、酸性のグルタミン酸の代わりに、非極性または塩基性アミノ酸が置かれることが好ましい。さらにより好ましくは、塩基性アミノ酸、特にリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）である。野生型ポリペプチドでは非極性アミノ酸のバリン（Ｖａｌ、Ｖ）である３３７位に関しては、３３７位に、バリンの側鎖より嵩高な側鎖を有する非極性アミノ酸、塩基性または酸性アミノ酸が置かれることが好ましい。より好ましくは、本発明の範囲内で、３３７位に、バリンの側鎖より嵩高な側鎖を有する非極性アミノ酸が置かれる。上記の方法の最も好ましい実施態様は、Ｋｉｒ６．２の２３位にリシン、および／または、Ｋｉｒ６．２の３３７位にイソロイシンを有する変異体を含む。
遺伝子コードのゆらぎのために、上記のアミノ酸置換を生じるヌクレオチド置換は数種考えられる。遺伝子コードは周知である（参考として、Ａｌｂｅｒｔｓ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，第三版も参照）。ポリペプチド中の２３位のアミノ酸に関して、グルタミン酸からその他のアミノ酸への置換は、配列番号１に記載のコード配列の６７／６８／６９位のうち１またはそれ以上の突然変異によって引き起こすことができる。３３７位のアミノ酸に関して、バリンからその他のアミノ酸への置換は、配列番号１に記載のＤＮＡ配列１００９位または１０１０位の一方または両方の突然変異によって引き起こすことができる。上述したようなある特定のタイプのアミノ酸置換が好ましいため、ヌクレオチド配列に関しても、好ましくは、前記好ましいアミノ酸置換を生じるヌクレオチド置換である。さらにより好ましくは、Ｅ２３Ｋ置換（ポリペプチド配列の２３位におけるグルタミン酸からリシンへの置換）、および／または、Ｖ３３７Ｉ置換（３３７位におけるバリンからイソロイシンへの置換；図７も参照）が生じるようなヌクレオチド置換である。最も好ましいＳＮＰは、Ｇ６７Ａ（コード配列の６７位におけるＧからＡへの置換）、および／または、Ｇ１００９Ａ（コード配列の１００９位におけるＧからＡへの置換）である。好ましい実施態様は、Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位および／または３３７位でアミノ酸配列に影響を与える、ゲノム配列内のそれぞれのヌクレオチド置換も包含する。
本発明の様々な形態の好ましい実施態様によれば、上記個体は糖尿病患者であり；さらにより好ましくは、上記糖尿病は、２型糖尿病（真性糖尿病）である。また、冠動脈心疾患は、狭心症である場合も好ましい。
２３位でのアミノ酸置換が、ＧｌｕからＬｙｓへの置換である場合、および／または、３３７位でのアミノ酸置換が、ＶａｌからＩｌｅへの置換である場合が有利である。上記サンプルは、好ましくは単離されたタンパク質または核酸、組織サンプル、細胞もしくは組織抽出物、または、細胞である。また、上記サンプルは、人体から単離されることが好ましい。
本発明のその他の好ましい実施態様は、上記の方法のいずれか１つに関し、本方法において、Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫ、および／または、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩの存在が、サンプル中で決定される。上記サンプルは、例えば、生物学的な、例えば組織サンプル、細胞もしくは組織抽出物、または、細胞が可能であり、さらに上記サンプルは、好ましくは、人体から単離されたものである。
生物学的材料、および、生体サンプルは、例えば、細胞、組織もしくは臓器（例えば、脳、血液、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、血管など）の調製物またはその一部を含み、好ましくは、脊椎動物、より好ましくはヒトなどの哺乳動物から得られたものである。また、細胞培養物、好ましくは、多細胞性生物および組織（例えば、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＳＦ９または３Ｔ３細胞）のいずれかから得られた細胞などの真核細胞の培養物からの細胞、または、単細胞生物、例えば酵母（例えば、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、または、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、または、原核細胞の培養物、好ましくはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、または、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）も含まれる。組織から得られた細胞およびサンプルは、血液採取、組織穿刺法または外科的技術のような周知の技術で増やすことができる。組換え分子の製造、および、天然に存在する分子（例えばＤＮＡ、または、細胞または組織由来のタンパク質）の精製、同様に、細胞または組織抽出物の製造は、当業者周知である（例えば、以下に列挙される標準的な文献も参照）。
アミノ酸置換の存在は、例えば、個体のゲノムＤＮＡを解析することによって決定することができる。適切な技術は当業界周知であり、例えば、以下が挙げられる：様々なＰＣＲ技術、チップハイブリダイゼーション、スロット／ドットまたはサザンブロッティング。
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、それらの５’および３’付近に既知の配列のヌクレオチドストレッチを有する配列ストレッチを特異的に増幅させることが可能なインビトロの技術である。所定の配列を増幅するためには、増幅する予定の配列の５’領域の配列がわかっていれば十分である。この場合、まず、増幅する予定のポリヌクレオチドのフラグメントを作製する（これは、既知の技術で行うことができ、例えば制限エンドヌクレアーゼでの消化である）。次に、既知の配列のＤＮＡ分子（「リンカー」）を、製造したポリヌクレオチドフラグメントの３’末端に、リガーゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ、これは様々な供給元から市販されている）によってカップリングする。従って、得られた配列を２種の既知の配列（既知の５’配列、および、３’の既知のリンカー配列）で囲むことによって、ＰＣＲ（この場合、リンカー介在ＰＣＲ「ｌｍＰＣＲ」）によって特異的な増幅を可能にする。
選択された配列を増幅するために、短い一本鎖ＤＮＡ分子（「プライマー」）が用いられるが、これは、増幅する予定のポリヌクレオチド配列の両端にある配列ストレッチに相補的である。ポリヌクレオチドのテンプレートは、ＤＮＡでもＲＮＡでもどちらでもよい。次に、プライマーを一本鎖化したテンプレートにアニールし、規定の、かつ周知の条件下で、特異的な酵素で、いわゆるポリメラーゼ（テンプレートとしてＤＮＡを認識して相補的ＤＮＡポリヌクレオチドを生産するＤＮＡポリメラーゼ、または、テンプレートとしてＲＮＡを認識し、相補的ＤＮＡポリヌクレオチドを生産する逆転写酵素のいずれか）によって延長させ、それによって、テンプレート鎖の配列に相補的な配列を有する新しいＤＮＡ鎖の生成が起こる。規定された温度でのインキュベート工程の規定された順序と、定期的に繰り返される規定された時間間隔を選択することによって、最終的に対象のポリヌクレオチドの指数関数的な増幅が起こるように変性／アニーリング／重合工程の順序が決定される。ポリメラーゼを破壊しないで変性に必要な温度を与えることが可能にするために、９５℃以上もの高い温度で十分な耐性を有する熱安定性の酵素、例えばＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ）、ＰＦＵなど（いずれも様々な供給元から市販されている）が用いられる。適切なポリメラーゼの選択は、使用目的に依存し（例えば、ＰＣＲによるクローニングの場合は、校正性能を有するポリメラーゼであり、例えば、好ましくはＰＦＵが選択される）、これは当業者の技術範囲内である。
典型的なＰＣＲ反応は、ポリヌクレオチドテンプレート（例えば、０.０１〜２０ｎｇ）、２種の適切なプライマー（例えば、それぞれ０.２〜２μＭの濃度で）、ｄＮＴＰ（例えば、それぞれ２００μＭの濃度で）、１〜２ｍＭのＭｇＣｌ2、および、１〜１０単位の熱安定性のポリメラーゼ、例えばＴａｑを含む。典型的な成分および緩衝液は当業者周知であり、一般的に商業的な供給元から入手可能である。
適切なプライマーは、周知のプロトコールに従って化学合成によって作製することができる。また、このようなプライマーも、ＭＷＧバイオテック社（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ）などの様々な供給元から市販されている。
ＤＮＡおよびＲＮＡテンプレート、さらにｃＤＮＡテンプレートも、周知の標準的な手法によって作製することができ（例えば、以下の標準的な文献を参照）、また、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）やストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの商業的な供給元から購入することもできる。
ゲノムＤＮＡ（および／、または、ＲＮＡ、および／または、タンパク質）を含む生体サンプルの製造方法は当業界周知である。参考として、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅを参照。
本発明の好ましい実施態様によれば、アミノ酸置換の存在は、以下の工程からなる、または、含む方法によって決定される：
ｅ．個体からゲノムＤＮＡを含む生体サンプルを製造すること。
ｆ．標的配列が、その場での方法、例えば上記のサンプル（例えば、組織サンプルまたは細胞）を直接用いたインサイチュＰＣＲ、または、直接のゲノム配列解析で直接解析することができない場合、ａ）に記載のサンプルからのゲノムＤＮＡは、単離するか、または、少なくとも部分的に精製する必要がある。
ｇ．コード配列の６７／６８／６９位および／または１００９／１０１０／１０１１位に相当する、ゲノムのＫｉｒ６．２配列のヌクレオチド位置を含むポリヌクレオチドフラグメントを増幅することができるプライマーを用いたＰＣＲ反応によって、ポリヌクレオチドフラグメントを増幅すること。
ｈ．ｃ）に記載のポリヌクレオチドフラグメントを配列解析すること。
ｅ．個体からゲノムＤＮＡを含む生体サンプルを製造すること。
ｆ．標的配列が、その場での方法、例えば上記のサンプル（例えば、組織サンプルまたは細胞）を直接用いたインサイチュＰＣＲ、または、直接のゲノム配列解析で直接解析することができない場合、ａ）に記載のサンプルからのゲノムＤＮＡは、単離するか、または、少なくとも部分的に精製する必要がある。
ｇ．コード配列の６７／６８／６９位および／または１００９／１０１０／１０１１位に相当する、ゲノムのＫｉｒ６．２配列のヌクレオチド位置を含むポリヌクレオチドフラグメントを増幅することができるプライマーを用いたＰＣＲ反応によって、ポリヌクレオチドフラグメントを増幅すること。
ｈ．ｃ）に記載のポリヌクレオチドフラグメントを配列解析すること。
配列番号１３に記載のゲノムのＫｉｒ６．２配列に関して、上記のゲノム配列内の「それに相当する位置」は、それぞれ５６５７１０６／５６５７１０７／５６５７１０８、および、５６５７９７８／５６５７９７９／５６５７９８０である（図８−１および図８−２を参照）。
次に、タンパク質中に上記のアミノ酸置換の１種またはそれ以上が生じるような、ゲノム配列中の１個またはそれ以上のヌクレオチド置換の存在は、既知の標準的な手法（例えば、標識された配列解析用プライマーを用いて、オートラジオグラフィまたは蛍光によるシグナル検出を行うこと）に従って同定することができる。
上記のポリヌクレオチドフラグメントを増幅するための適切なプライマーの選択および設計は、当業者の能力の範囲内である。参考として、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照。前記プライマーの製造にも同じことが当てはまり、これはまた、商業的な供給元（例えば、メタビオン（ＭｅｔａＢｉｏｎ），マルティンスリート，ドイツ）に注文することもできる。配列解析および／または増幅には、好ましくは、配列番号９、１０、１１または１２に記載のプライマーの少なくとも１種が用いられる（図５を参照）。
本発明のその他の好ましい実施態様によれば、アミノ酸置換の存在は、以下の工程を含む、または、それらからなる方法によって決定される：
ａ．染色体／ゲノムＤＮＡを含む生体サンプルを製造すること。
ｂ．ａ）に記載のサンプルから染色体ＤＮＡを単離すること。
ｃ．それをキャリアーに固定すること。
ｄ．ストリンジェントな条件下で、前記アミノ酸置換の一方または両方が生じるような１個またはそれ以上のヌクレオチド置換を包含するＫｉｒ６．２配列に、野生型Ｋｉｒ６．２配列より高い親和性で結合することができる１またはそれ以上のプローブを、固定されたＤＮＡにハイブリダイゼーションすること。
ａ．染色体／ゲノムＤＮＡを含む生体サンプルを製造すること。
ｂ．ａ）に記載のサンプルから染色体ＤＮＡを単離すること。
ｃ．それをキャリアーに固定すること。
ｄ．ストリンジェントな条件下で、前記アミノ酸置換の一方または両方が生じるような１個またはそれ以上のヌクレオチド置換を包含するＫｉｒ６．２配列に、野生型Ｋｉｒ６．２配列より高い親和性で結合することができる１またはそれ以上のプローブを、固定されたＤＮＡにハイブリダイゼーションすること。
ハイブリダイゼーションは、それ相応に標識されたプローブを用いたオートラジオグラフィまたは蛍光のような標準的な方法に従って可視化することができる。
次に、Ｋｉｒ６．２タンパク質中の３３７位および／または２３位においてアミノ酸置換が生じるような、ゲノムのＫｉｒ６．２配列中のヌクレオチド置換の存在または非存在は、患者のサンプルから生じるハイブリダイゼーションパターンおよび／または強度と、野生型ゲノムＤＮＡを含むコントロールサンプルのハイブリダイゼーションパターンおよび／または強度とを比較することによって同定することができる。
単離されたポリヌクレオチド、および、オリゴヌクレオチドを用いて、様々なストリンジェンシー条件でハイブリダイゼーションすることができる。
ストリンジェンシーは、２つの一本鎖化された核酸分子のハイブリダイゼーションまたはアニーリングの特異性に影響を与える反応条件を説明したものである。ストリンジェンシー、すなわち反応特異性は、特に、反応に用いられる温度および緩衝液の条件に依存する：例えば、反応温度を高めたり、および／または、反応緩衝液のイオン濃度を低くしたりすることによって、ストリンジェンシー、すなわち特異性を高めることができる。例えば、ハイブリダイゼーションが、室温で、２×ＳＳＣ溶液中で行われる場合、低ストリンジェンシー条件である（すなわち反応およびハイブリダイゼーション特異性が低い）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、６８℃で、０，１×ＳＳＣ、および、０，１％ＳＤＳ溶液中でのハイブリダイゼーション反応を含む。
本発明の様々な形態におけるストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、好ましくは、以下のように理解される：
１）標識されたプローブを解析する予定の核酸サンプルと、６５℃でハイブリダイゼーションすること、または、オリゴヌクレオチドプローブの場合、オリゴヌクレオチドとサンプルとからなる二重鎖のアニーリングまたは融解温度より５℃低い温度で（アニーリングおよび融解温度は、以下で同義的に理解される）、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７.５）、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０.５ｍｇ／ｍｌ変性サケまたはニシン精液ＤＮＡ中で、一晩ハイブリダイゼーションする。
１）標識されたプローブを解析する予定の核酸サンプルと、６５℃でハイブリダイゼーションすること、または、オリゴヌクレオチドプローブの場合、オリゴヌクレオチドとサンプルとからなる二重鎖のアニーリングまたは融解温度より５℃低い温度で（アニーリングおよび融解温度は、以下で同義的に理解される）、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７.５）、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０.５ｍｇ／ｍｌ変性サケまたはニシン精液ＤＮＡ中で、一晩ハイブリダイゼーションする。
２）室温で１０分間、２×ＳＳＣ中で洗浄する。
３）６５℃（または、オリゴヌクレオチドの場合：アニーリング温度より５℃低い温度で）で３０分間、１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で洗浄する。
４）６５℃（または、オリゴヌクレオチドの場合：アニーリング温度より５℃低い温度で）で３０分間、０.１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で洗浄する。
３）６５℃（または、オリゴヌクレオチドの場合：アニーリング温度より５℃低い温度で）で３０分間、１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で洗浄する。
４）６５℃（または、オリゴヌクレオチドの場合：アニーリング温度より５℃低い温度で）で３０分間、０.１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で洗浄する。
オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドであり、好ましくは、１５〜３０個のヌクレオチド、好ましくは２０個のヌクレオチドの長さを有するＤＮＡフラグメントである。アニーリング温度は、式：Ｔｍ（℃）＝２×（Ａ＋Ｔの数）＋４×（Ｇ＋Ｃの数）に従って決定される。
２×ＳＳＣまたは０.１×ＳＳＣ（または、その他のあらゆる種類のＳＳＣ希釈液）を製造するために、例えば、２０×ＳＳＣを必要に応じて希釈する。２０×ＳＳＣは、３ＭのＮａＣｌ／０.３Ｍのクエン酸Ｎａ×２Ｈ2Ｏからなる。
ポリヌクレオチドが、電気泳動分離を行った後に必要な場合（それに続いて：サザンブロット（ＤＮＡ）またはノーザンブロット（ＲＮＡ））、または、電気泳動分離を行わない場合（それに続いて：スロットまたはドットブロット）、ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション反応を行う前に適切なメンブレン（例えばナイロンまたはニトロセルロースメンブレン）に移される。ハイブリダイゼーションは、適切に標識されたプローブを用いて行われる。適切な標識技術は、例えば、放射標識、または、蛍光色素を用いた標識である。プローブは、一本鎖化されたポリリボまたはポリデオキシリボヌクレオチドであり、これらは、自然状態で一本鎖であるが、通常は二本鎖であり、変性によって一本鎖にする。このプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡサンプル（これらも一本鎖化された状態である）と塩基対を形成することによって結合する。
上記ＤＮＡは、例えば、チップのマトリックス（例えば、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）のチップなど）、または、適切なメンブレン（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、または、ドットまたはスロットブロットに適したもの）に直接固定してもよいし、または、ゲルのマトリックスに移して、電気泳動で分離し、その後適切なメンブレンにブロットしてもよい（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、または、サザンブロットに適したもの）。当業界の最先端では、適切なチップまたはメンブレン、同様にそれに相応する方法は周知である。上記の方法、例えばチップハイブリダイゼーション、ドット／スロットまたはサザンブロッティングは、当業界周知である（参考として、例えば、以下に列挙される文献を参照すること）。
適切なプローブの選択および設計は、当業界周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）。前記プローブの製造にも同じことが当てはまり、これらもまた、商業的な供給元（例えばメタビオン，マルティンスリート，ドイツ）より入手可能である。例えば、Ｋｉｒ６．２タンパク質の２３位および／または３３７位において上記のアミノ酸置換のいずれか１が生じるような、少なくとも１つのヌクレオチド置換を包含する、コード配列の６７／６８／６９位および／または１００９／１０１０／１０１１位に相当するヌクレオチド位置を含むゲノムのＫｉｒ６．２配列の部分に、より高い親和性を有するプローブであればどのようなものでも適切である。適切なプローブは、例えば、図６に記載のゲノムヌクレオチドのトリプレットを包含すると予想されるものである。
また、アミノ酸置換の存在は、個体のＲＮＡを解析することによって決定することもできる。適切な技術は当業界周知であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ技術、チップハイブリダイゼーション、または、ノーザンブロッティングが挙げられる。
本発明のその他の好ましい実施態様によれば、アミノ酸置換の存在は、以下の工程を含む、または、それらからなる方法によって決定される：
ａ．個体由来のＲＮＡを含む生体サンプルを提供すること。
ｂ．ＲＮＡを直接解析する必要がない場合（例えば、その場でのＰＣＲによって）、ａ）に記載のサンプルからＲＮＡを単離するか、または、少なくとも部分的に精製すること。
ｃ．Ｋｉｒ６．２のｃＤＮＡ配列の６７位および／または１００９位を含むポリヌクレオチドフラグメントを増幅することができるプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ反応によってポリヌクレオチドフラグメントを増幅すること。
ｄ．ｃ）に記載のポリヌクレオチドフラグメントを配列解析すること。
ａ．個体由来のＲＮＡを含む生体サンプルを提供すること。
ｂ．ＲＮＡを直接解析する必要がない場合（例えば、その場でのＰＣＲによって）、ａ）に記載のサンプルからＲＮＡを単離するか、または、少なくとも部分的に精製すること。
ｃ．Ｋｉｒ６．２のｃＤＮＡ配列の６７位および／または１００９位を含むポリヌクレオチドフラグメントを増幅することができるプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ反応によってポリヌクレオチドフラグメントを増幅すること。
ｄ．ｃ）に記載のポリヌクレオチドフラグメントを配列解析すること。
配列解析は、標準的な手法に従って行うことができる。生成した配列ラダーの可視化は、例えば、蛍光または放射性標識したプライマーまたはヌクレオチドを用いて行うことができる。
次に、Ｋｉｒ６．２タンパク質中の３３７位および／または２３位においてアミノ酸置換が生じるような、Ｋｉｒ６．２のコード配列中の１個またはそれ以上のヌクレオチド置換の存在または非存在は、得られた配列を解析して、それと野生型Ｋｉｒ６．２配列とを比較することによって決定することができる。
適切なプライマーの選択および設計は当業界周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）。前記プライマーの製造にも同じことが当てはまり、これらもまた、商業的な供給元（例えばメタビオン，，マルティンスリート，ドイツ）より入手可能である。例えば、６７位〜６９位、および／または、１００９位〜１０１１位を包含するＫｉｒ６．２のコード配列の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドを増幅することができるのであればどのようなプライマー群でも適切である。好ましいプライマーは、例えば、配列番号９〜１２に記載のものである。
本発明のその他の好ましい実施態様によれば、アミノ酸置換の存在は、以下の工程を含む、または、それらからなる方法によって決定される：
ａ．個体由来のＲＮＡを含む生体サンプルを提供すること。
ｂ．ａ）に記載のサンプルからＲＮＡを単離すること。
ｃ．該ＲＮＡをキャリアーに固定すること。
ｄ．ストリンジェントな条件下で、２３位にグルタミン酸および／または３３７位にバリンを包含するＫｉｒ６．２ポリペプチドをコードするＫｉｒ６．２のＲＮＡより高い親和性で、２３位にグルタミン酸以外のアミノ酸および／または３３７位にバリン以外のアミノ酸を包含するＫｉｒ６．２ポリペプチドをコードするＫｉｒ６．２のＲＮＡに結合することができる１種またはそれ以上のプローブに、固定されたＲＮＡをハイブリダイゼーションすること。
ａ．個体由来のＲＮＡを含む生体サンプルを提供すること。
ｂ．ａ）に記載のサンプルからＲＮＡを単離すること。
ｃ．該ＲＮＡをキャリアーに固定すること。
ｄ．ストリンジェントな条件下で、２３位にグルタミン酸および／または３３７位にバリンを包含するＫｉｒ６．２ポリペプチドをコードするＫｉｒ６．２のＲＮＡより高い親和性で、２３位にグルタミン酸以外のアミノ酸および／または３３７位にバリン以外のアミノ酸を包含するＫｉｒ６．２ポリペプチドをコードするＫｉｒ６．２のＲＮＡに結合することができる１種またはそれ以上のプローブに、固定されたＲＮＡをハイブリダイゼーションすること。
ハイブリダイゼーションは、それ相応に標識されたプローブを用いたオートラジオグラフィまたは蛍光イメージングのような標準的な手法に従って可視化することができる。
次に、Ｋｉｒ６．２タンパク質中の３３７位および／または２３位においてアミノ酸置換が生じるような、Ｋｉｒ６．２のコード配列中のヌクレオチド置換の存在または非存在は、ハイブリダイゼーションパターン、および／または、シグナル強度を解析し、それと、Ｋｉｒ６．２野生型ＲＮＡを含むコントロールサンプルのハイブリダイゼーションパターン、および／または、シグナル強度とを比較することによって決定することができる。
ＲＮＡは、例えば、ハイブリダイゼーションの前に、チップのマトリックス、または、適切なメンブレンに直接固定することができ、または、ゲルのマトリックス上に置き、ゲル電気泳動を行った後に適切なメンブレンにブロットすることもできる（ノーザンブロッティング）。参考として、例えば、以下に列挙される文献を参照。
適切なプローブの選択および設計は、当業界周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）。前記プローブの製造にも同じことが当てはまり、これらもまた、メタビオン（マルティンスリート，ドイツ）のような商業的な供給元より入手可能である。例えば、Ｋｉｒ６．２タンパク質の２３位および／または３３７位において上記のアミノ酸置換のいずれか１つが生じるような、少なくとも１つのヌクレオチド置換を包含する、６７位〜６９位、および／または、１００９位〜１０１１位を含むＫｉｒ６．２のＲＮＡ配列の一部により高い親和性を有するプローブであればどのようなものでも適切である。
また、アミノ酸置換の存在は、個体のプロテオーム（すなわち、個体内で発現されるタンパク質）を解析することによっても決定することができる。適切な技術は当業界周知であり、例えば以下が挙げられる：プロテオームのチップ解析、タンパク質、細胞または組織サンプルの免疫組織学的または免疫化学的な技術、または、ウェスタンブロット解析。参考として、例えば以下に列挙される文献が参照される。
本発明のその他の好ましい実施態様によれば、アミノ酸置換の存在は、以下の工程を含む、または、それらからなる方法によって決定される：
ａ．個体由来のタンパク質を含む生体サンプルを提供すること。
ｂ．該タンパク質をａ）に記載のサンプルから単離すること。
ｃ．それをキャリアーに固定すること。
ｄ．そのポリペプチド鎖の３３７位にグルタミン酸および／または３３７位にバリンを包含するＫｉｒ６．２より高い親和性で、そのポリペプチド鎖の２３位にグルタミン酸以外のアミノ酸および／または３３７位にバリン以外のアミノ酸を包含するＫｉｒ６．２に結合することができる抗体との結合反応を行うこと（野生型タンパク質に結合することができない条件下、または、かなり低い親和性の条件下で）；
ｅ．該タンパク質への該抗体の結合を可視化すること；（例えば、標識された一次抗体、または、標識された二次抗体などによって）。
ａ．個体由来のタンパク質を含む生体サンプルを提供すること。
ｂ．該タンパク質をａ）に記載のサンプルから単離すること。
ｃ．それをキャリアーに固定すること。
ｄ．そのポリペプチド鎖の３３７位にグルタミン酸および／または３３７位にバリンを包含するＫｉｒ６．２より高い親和性で、そのポリペプチド鎖の２３位にグルタミン酸以外のアミノ酸および／または３３７位にバリン以外のアミノ酸を包含するＫｉｒ６．２に結合することができる抗体との結合反応を行うこと（野生型タンパク質に結合することができない条件下、または、かなり低い親和性の条件下で）；
ｅ．該タンパク質への該抗体の結合を可視化すること；（例えば、標識された一次抗体、または、標識された二次抗体などによって）。
上記タンパク質は、例えば、チップのマトリックス、または、適切なメンブレン上に直接固定してもよいし、または、ＥＬＩＳＡプレートのようなその他のタイプのキャリアーに固定してもよい。また、上記タンパク質は、ゲルに置き、キャリアー（例えば適切なメンブレン）上に移し、ゲル電気泳動を行った後にキャリアー上に固定してもよい（ウェスタンブロット）。
本発明のさらにその他の好ましい実施態様によれば、アミノ酸置換の存在は、以下の工程を含む、または、それらからなる方法によって決定される：
ａ．個体由来の組織サンプルを提供すること。
ｂ．そのポリペプチド鎖の３３７位にグルタミン酸および／または３３７位にバリンを包含するＫｉｒ６．２より高い親和性で、そのポリペプチド鎖の２３位にグルタミン酸以外のアミノ酸および／または３３７位にバリン以外のアミノ酸を包含するＫｉｒ６．２に結合することができる抗体との結合反応を行うこと（野生型Ｋｉｒ６．２タンパク質に結合することができない条件下、または、かなり低い親和性の条件下で）。
ｃ．該タンパク質への該抗体の結合を可視化すること；（例えば、標識された第一または二次抗体によって）。
ａ．個体由来の組織サンプルを提供すること。
ｂ．そのポリペプチド鎖の３３７位にグルタミン酸および／または３３７位にバリンを包含するＫｉｒ６．２より高い親和性で、そのポリペプチド鎖の２３位にグルタミン酸以外のアミノ酸および／または３３７位にバリン以外のアミノ酸を包含するＫｉｒ６．２に結合することができる抗体との結合反応を行うこと（野生型Ｋｉｒ６．２タンパク質に結合することができない条件下、または、かなり低い親和性の条件下で）。
ｃ．該タンパク質への該抗体の結合を可視化すること；（例えば、標識された第一または二次抗体によって）。
次に、突然変異の存在または非存在は、標識された組織サンプルを解析して、そのシグナル強度と、コントロールサンプル（例えば、擬似的な一次抗体または抗血清（すなわち、突然変異を含むＫｉｒ６．２と反応性を有さない一次抗体または抗血清、または、特異的な一次抗体または抗血清よりもかなり低い程度で、突然変異を含むＫｉｒ６．２と反応する一次抗体または抗血清）、または、野生型Ｋｉｒ６．２タンパク質に特異的な一次抗体、および／または、野生型Ｋｉｒ６．２タンパク質のみを含むことが既知のコントロールサンプルで処理した同じ患者からのサンプル）のシグナル強度とを比較することによって決定することができる。
結合の検出は、好ましくは、免疫組織化学的または免疫放射線学的な（ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ）方法によって行われる。
上記の方法の好ましい実施態様によれば、２３位でのアミノ酸置換は、Ｇｌｕ（野生型）からＬｙｓへの置換である；また、３３７位でのアミノ酸置換が、Ｖａｌ（野生型）からＩｌｅへの置換である場合も好ましい。
本発明の様々な形態に関して、冠動脈心疾患は、好ましくは、冠動脈疾患であり、さらにより好ましくは、冠動脈心疾患が狭心症である場合である。
本発明の様々な形態のさらなる好ましい実施態様によれば、Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫ（Ｋｉｒ６．２遺伝子の両方の対立遺伝子におけるヌクレオチド多型の結果として、タンパク質の２３位にリシン（Ｋ）を有するＫｉｒ６．２タンパク質変異体）、および／または、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩ（Ｋｉｒ６．２遺伝子の両方の対立遺伝子におけるヌクレオチド多型の結果として、タンパク質の３３７位にイソロイシン（Ｉ）を有するＫｉｒ６．２タンパク質変異体）の存在が、サンプル中で決定される。
上記サンプルは、それぞれの多型を包含するＫｉｒ６．２を含むあらゆるサンプルが可能である。上記サンプルは、それぞれの多型を簡単に試験できるようにして製造されることが有利である。適切な例は、適用された検出方法に依存し、例えば、組織サンプル、細胞または組織抽出物、または、細胞であり、好ましくは人体から単離されたサンプルである。それぞれの多型を同定するための適切な技術、例えばＰＣＲ、核酸またはタンパク質ベースのアレイ技術、適切な抗体を用いた免疫組織学的または免疫化学的な技術は、当業者既知である。適切なプライマー群や抗体または抗血清の選択および生産にも同じことが当てはまる。このような技術に関して、例えば、以下に列挙される文献が参照される。
その他の本発明の形態は、Ｋｉｒ６．２タンパク質、Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫ、または、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩ中の、２３位におけるグルタミン酸以外のアミノ酸の存在、および／または、３３７位におけるバリン以外のアミノ酸の存在を試験するための試験キットに関し、ここにおいて、本キットは、少なくとも、タンパク質中の前記存在を検出するための手段を含む。
本発明に関して、部品からなるキット（簡略化した形態：キット）は、本願で特定されている成分のあらゆる組み合わせが、共存する空間で一体化されて機能単位になったものと理解され、ここにおいて、本キットは、さらなる成分を含んでいてもよい。
上記手段は、例えば、２３位にグルタミン酸および／または３３７位にバリンを包含するＫｉｒ６．２と、２３位にグルタミン酸以外のアミノ酸および／または３３７位にバリン以外のアミノ酸を包含するＫｉｒ６．２タンパク質との結合特性を識別する抗体であり得る。特異的な抗体の製造は当業界周知である。参考として、例えば、以下に列挙される文献が参照される。その上、本キットに、標識された二次抗体が含まれる場合が好ましい。本キットは、結合および／または標識反応などを行うための適切な試薬、緩衝液などをさらに含んでいてもよい。また、使用説明書（例えば、好ましい反応条件、緩衝液組成物などを開示したマニュアルまたはシート）が含まれたものが適切である。
好ましい例によれば、上記手段は、抗体（すなわち、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗血清、または、組換え抗体）であって、ここにおいて、上記抗体は、野生型Ｋｉｒ６．２と、２３位および／または３３７位にアミノ酸置換を包含するＫｉｒ６．２との結合特性において差異がある。このような抗体は、例えば、２３位および／または３３７位に関して野生型であるＫｉｒ６．２タンパク質とより高い親和性で結合することができるか、または、２３位および／または３３７位に関する変異がかなり低い頻度の変異体の１種またはそれ以上とより高い親和性で結合することができる。また、本試験キットに抗体群が含まれる場合も有利であり、ここにおいて、各抗体は、多型のいずれか１つを特異的に検出することができる；実質的に、野生型タンパク質のみを認識するコントロール抗体も含まれ（および、場合によっては、バックグラウンドシグナルを決定するための疑似的な抗体または抗血清も含まれる）、さらに、選択の検出技術（例えば、タンパク質ブロット、アレイ技術またはその他の免疫学的または免疫組織化学的な技術）を行うのに有用な、または必要な試薬が含まれていてもよい。適切な抗体の入手方法または製造、および、試験キットを組み立てるのに有用な、または必要な試薬の選択は当業界周知である。その上、望ましい結合特性を有する抗体の製造は、バイオトレンド（ＢｉｏＴｒｅｎｄ，コローニュ，ドイツ）のような様々な供給元によって商業的に行われている。
その他の本発明の形態は、Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位にグルタミン酸以外のアミノ酸、および／または、３３７位にバリン以外のアミノ酸を包含するＫｉｒ６．２ポリペプチド配列が生じるような、Ｋｉｒ６．２遺伝子の対立遺伝子の一方または両方における、Ｋｉｒ６．２ヌクレオチド配列中の差異の存在を試験するための試験キットに関し、ここにおいて、該キットは、少なくとも、ヌクレオチド配列中の前記差異を検出するための手段を含む。
その他の手段は、例えば、野生型Ｋｉｒ６．２のＤＮＡまたはＲＮＡのみを特異的に増幅させるための、適切な配列解析用プライマー、または、プライマー群、および／または、２３位および／または３３７位に突然変異を包含するＫｉｒ６．２のＤＮＡまたはＲＮＡのみを増幅するためのプライマー群である。ある特定の配列の特異的な配列解析または増幅に用いることができる適切なプライマーの選択および入手方法は、当業者の能力の範囲内である（例えば、実施例２に記載のプライマーおよび条件を参照）。また、試験キットには、配列解析反応または増幅を行うのに有用な、および必要な試薬、例えばポリメラーゼ、緩衝液、ヌクレオチドなどもが含まれていてもよい（例えば、実施例２に記載のプライマーおよび条件を参照）。本キットが、Ｋｉｒ６．２中の様々なタイプの多型の存在を決定することができるように、様々なＫｉｒ６．２多型に特異的な様々な配列解析用プライマーまたはＰＣＲプライマー群の集合体を含む場合が、極めて有利である。
その他の好ましい実施態様によれば、上記手段は、野生型Ｋｉｒ６．２、および／または、２３位および／または３３７位に突然変異を包含するＫｉｒ６．２を認識する核酸プローブである。選択の検出技術（例えば、あらゆる種類の核酸ブロット、アレイ技術またはその他の種類のチップ技術）を行うのに有用なプローブの入手方法および選択も、当業者の能力の範囲内である。このようにして、同様に試験キットに入れることができる適切な試薬が選択される。好ましくは、本試験キットに、様々な多型を認識する様々なプローブ群が含まれる。
２３位におけるアミノ酸は、好ましくはＬｙｓであり、３３７位におけるアミノ酸は、好ましくはＩｌｅである。
Ｋｉｒ６．２のヌクレオチドの配列が、コード配列の６７位にＡを有する場合が好ましい。また、Ｋｉｒ６．２のヌクレオチドの配列が、コード配列の１００９位にＡを有する場合も好ましい。
好ましい実施態様によれば、本試験キットは、Ｋｉｒ６．２のコード配列の６７位および／または１００９位を含むポリヌクレオチドフラグメントを増幅することができるプライマー群を含む。好ましいプライマーは、例えば、配列番号９〜１２に記載のものである。
その他の好ましい実施態様によれば、本試験キットは、配列番号１３に記載のゲノムのＫｉｒ６．２配列の５６５７１０６／７／８位、および／または、５６５７９７８／７９／８０位を含むポリヌクレオチドフラグメントを増幅することができる少なくとも１つのプライマー群を含む。好ましいプライマーは、例えば、配列番号９〜１２に記載のものである。
その他の好ましい実施態様によれば、本試験キットは、ストリンジェントな条件下で、２３位においてグルタミン酸以外のアミノ酸および／または３３７位においてバリン以外のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を有するＫｉｒ６．２のゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを特異的に認識する１種またはそれ以上の核酸プローブを含む。
その他の本発明の形態は、ポリペプチド配列の２３位にリシン、および、３３７位にイソロイシンを有する単離されたＫｉｒ６．２ポリペプチドまたはそれらのフラグメントに関する。本発明の好ましい実施態様は、２３位および／または３３７位のアミノ酸を含む、配列番号７に記載の単離されたＫｉｒ６．２ポリペプチド、またはそれらのフラグメントに関する。
さらにその他の本発明の形態は、上記の２３位および３３７位を含むＫ２３／Ｉ３３７−Ｋｉｒ６．２ポリペプチドまたはそれらのフラグメントのいずれか１つをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明の好ましい実施態様は、６７位および１００９位のヌクレオチド（好ましくは、さらに６８位、６９位、１０１０位および１０１１位）を含む配列番号８に記載の単離されたＫｉｒ６．２ポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメント、または、高いストリンジェンシー条件下で上記のＤＮＡ配列またはそれらの相補鎖にハイブリダイゼーションする単離されたポリヌクレオチドに関する。
その他の本発明の形態は、ポリペプチド配列の２３位にグルタミン酸、および、３３７位にイソロイシンを有する単離されたＫｉｒ６．２ポリペプチドまたはそれらのフラグメントに関する。本発明の好ましい実施態様は、２３位および／または３３７位のアミノ酸を含む配列番号５に記載の単離されたＫｉｒ６．２ポリペプチド、またはそれらのフラグメントに関する。
さらにその他の本発明の形態は、２３位および３３７位を含む上記のＥ２３／Ｉ３３７−Ｋｉｒ６．２ポリペプチドまたはそれらのフラグメントのいずれか１つをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明の好ましい実施態様は、６７位および１００９位のヌクレオチド（好ましくは、さらに６８位、６９位、１０１０位および１０１１位）を含む配列番号６に記載の単離されたＫｉｒ６．２ポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメント、または、高いストリンジェンシー条件下で上記のＤＮＡ配列またはそれらの相補鎖にハイブリダイゼーションする単離されたポリヌクレオチドに関する。
その他の本発明の形態は、Ｋｉｒ６．２コード配列の６７位および／または１００９位を包含する、または、ゲノムのＫｉｒ６．２配列の５６５７１０６／０７／０８位および／または５６５７９７８／７９／８０位を包含するＫｉｒ６．２配列の、少なくとも１７個、好ましくは１９〜１００個の連続したヌクレオチドを含む、または、それらからなる、Ｋｉｒ６．２遺伝子またはＲＮＡ内のヌクレオチドの差異を検出するためのプローブに関する。
その他の本発明の形態は、Ｋｉｒ６．２ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーまたはプライマー群に関し、ここにおいて、増幅されたポリヌクレオチドは、Ｋｉｒ６．２コード配列の少なくとも６７位および／または１００９位、および／または、ゲノムのＫｉｒ６．２配列の５６５７１０６／０７／０８位および／または５６５７９７８／７９／８０位を含む。
以下、数々の実施例によって本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲を限定する意図はない。
Ｋｉｒ６．２タンパク質の２３位および３３７位におけるＫｉｒ６．２多型（野生型タンパク質配列のＮＣＢＩ登録番号：Ｄ５０５８２（配列番号１；図１Ａ）；コード配列のＮＣＢＩ登録番号：Ｄ０５８５２（配列番号２；図１Ｂ））を、１型および２型糖尿病（大部分が２型、すなわち真性糖尿病）に罹った患者の同齢集団で解析した。
実施例１：研究用被検体（研究用の個体群）
３３５人の患者のゲノムＤＮＡを、タンパク質変異体Ｋｉｒ６．２−Ｅ２３Ｋ、および、Ｋｉｒ６．２−Ｖ３３７Ｉが生じるような、Ｋｉｒ６．２遺伝子中のＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）に関してスクリーニングした。試験対象患者基準は、以下の通り：ドイツ人家系の白色人種の個体、臨床症状、および、冠動脈造影図が安定していること。除外基準は、以下の通り：ＡＣＳ、慢性の非心臓性の病気（すなわちリウマチ性関節炎）以外の急性疾患、および、過去５年以内の悪性疾患の病歴を有すること。表２に、この患者の同齢集団の基本的な特徴を概説した。全ての患者は、書面によるインフォームド・コンセントに署名した。
３３５人の患者のゲノムＤＮＡを、タンパク質変異体Ｋｉｒ６．２−Ｅ２３Ｋ、および、Ｋｉｒ６．２−Ｖ３３７Ｉが生じるような、Ｋｉｒ６．２遺伝子中のＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）に関してスクリーニングした。試験対象患者基準は、以下の通り：ドイツ人家系の白色人種の個体、臨床症状、および、冠動脈造影図が安定していること。除外基準は、以下の通り：ＡＣＳ、慢性の非心臓性の病気（すなわちリウマチ性関節炎）以外の急性疾患、および、過去５年以内の悪性疾患の病歴を有すること。表２に、この患者の同齢集団の基本的な特徴を概説した。全ての患者は、書面によるインフォームド・コンセントに署名した。
実施例２：配列解析および解析によるＳＮＰ検出
２.１：対象の多型を有するゲノム領域の増幅
増幅用プライマー：
Ａ：Ｋｉｒ６．２遺伝子配列の５６５７９７８／７９／８０位におけるヌクレオチド置換を検出するためのプライマー（登録番号ＮＴ＿００９３０７）。
フォワードプライマーＭ６７：５'-AGGTGGAGGTAAGGAAGAG-３'（配列番号９）
リバースプライマーＭ６７：５'-GGTGAAGATGAGCAATGTG-３'（配列番号１０）。
２.１：対象の多型を有するゲノム領域の増幅
増幅用プライマー：
Ａ：Ｋｉｒ６．２遺伝子配列の５６５７９７８／７９／８０位におけるヌクレオチド置換を検出するためのプライマー（登録番号ＮＴ＿００９３０７）。
フォワードプライマーＭ６７：５'-AGGTGGAGGTAAGGAAGAG-３'（配列番号９）
リバースプライマーＭ６７：５'-GGTGAAGATGAGCAATGTG-３'（配列番号１０）。
Ｂ：Ｋｉｒ６．２遺伝子配列の５６５７１０６／０７／０８位におけるヌクレオチド置換を検出するためのプライマー（登録番号ＮＴ＿００９３０７）。
フォワードプライマーＭ１００９：５'-GGGTGGCAACAGCATCTTC-３'（配列番号１１）
リバースプライマーＭ１００９：５'-TGGCTCAGGACAGGGAATC-３'（配列番号１２）。
フォワードプライマーＭ１００９：５'-GGGTGGCAACAGCATCTTC-３'（配列番号１１）
リバースプライマーＭ１００９：５'-TGGCTCAGGACAGGGAATC-３'（配列番号１２）。
また、上記プライマーは、Ｋｉｒ６．２のコード配列の増幅にも適用可能である。
増幅のためのＰＣＲプロトコール：
全ての試薬は、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，米国）から得た：ゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）；ＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼ（１単位）；１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液；５００μＭのｄＮＴＰ；２．５ｍＭのＭｇＣｌ2；２００ｎＭの各増幅用プライマー対（配列は、上記の増幅用プライマー対１．Ａおよび１．Ｂを参照）；Ｈ2Ｏを加えて５μｌにした。
全ての試薬は、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，米国）から得た：ゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）；ＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼ（１単位）；１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液；５００μＭのｄＮＴＰ；２．５ｍＭのＭｇＣｌ2；２００ｎＭの各増幅用プライマー対（配列は、上記の増幅用プライマー対１．Ａおよび１．Ｂを参照）；Ｈ2Ｏを加えて５μｌにした。
ＰＣＲ／遺伝子型解析のための増幅プログラム：
９５℃×１０分×１サイクル
９５℃×３０秒
７０℃×３０秒×２サイクル；
９５℃×３０秒
６５℃×３０秒×２サイクル；
９５℃×３０秒
６０℃×３０秒×２サイクル；
９５℃×３０秒
５６℃×３０秒
７２℃×３０秒×４０サイクル；
７２℃×１０分
４℃×３０秒×１サイクル。
９５℃×１０分×１サイクル
９５℃×３０秒
７０℃×３０秒×２サイクル；
９５℃×３０秒
６５℃×３０秒×２サイクル；
９５℃×３０秒
６０℃×３０秒×２サイクル；
９５℃×３０秒
５６℃×３０秒
７２℃×３０秒×４０サイクル；
７２℃×１０分
４℃×３０秒×１サイクル。
２.２：対象の多型の同定
ミニシーケンスのプロトコール、および、多型の検出：
全ての試薬は、アプライド・バイオシステムズ（フォスターシティー，米国）から得た。精製したＰＣＲ産物２μｌ；ビッグダイ（ＢｉｇＤｙｅ）ターミネーターキット（１．５μｌ）；２００ｎＭの１種の配列解析用プライマー（配列は、上記の増幅用フォワードまたはリバースプライマー１．Ａおよび１．Ｂを参照）；Ｈ2Ｏを加えて１０μｌにした。
ミニシーケンスのプロトコール、および、多型の検出：
全ての試薬は、アプライド・バイオシステムズ（フォスターシティー，米国）から得た。精製したＰＣＲ産物２μｌ；ビッグダイ（ＢｉｇＤｙｅ）ターミネーターキット（１．５μｌ）；２００ｎＭの１種の配列解析用プライマー（配列は、上記の増幅用フォワードまたはリバースプライマー１．Ａおよび１．Ｂを参照）；Ｈ2Ｏを加えて１０μｌにした。
配列解析のための増幅プログラム：
９６℃×２分×１サイクル；
９６℃×１０秒
５５℃×１０秒
６５℃×４分×３０サイクル；
７２℃×７分
４℃×３０秒×１サイクル；
９６℃×２分×１サイクル；
９６℃×１０秒
５５℃×１０秒
６５℃×４分×３０サイクル；
７２℃×７分
４℃×３０秒×１サイクル；
配列解析産物の解析：
まず、生データ抽出のための配列解析ソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，米国）で配列を解析し、Ｐｈｒｅｄ（ベースコーラー）、Ｐｈｒａｐ（アセンブラー）、Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄ（ＳＮＰコーラー）、および、Ｃｏｎｓｅｄ（リザルトビューワー）を用いて加工した。Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ、ＰｏｌｙｐｈｒｅｄおよびＣｏｎｓｅｄは、Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ氏によってＷａｓｈＵ（http://www.genome.washington.edu）で設計されたソフトウェアである。
まず、生データ抽出のための配列解析ソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，米国）で配列を解析し、Ｐｈｒｅｄ（ベースコーラー）、Ｐｈｒａｐ（アセンブラー）、Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄ（ＳＮＰコーラー）、および、Ｃｏｎｓｅｄ（リザルトビューワー）を用いて加工した。Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ、ＰｏｌｙｐｈｒｅｄおよびＣｏｎｓｅｄは、Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ氏によってＷａｓｈＵ（http://www.genome.washington.edu）で設計されたソフトウェアである。
このＰＣＲ反応により、６７位におけるＧからＡへの置換、および、コード配列の１００９位におけるＡからＧへの置換が同定された。
２.３：Ｋｉｒ６．２タンパク質中のアミノ酸置換と、冠動脈心疾患との相関
心臓血管疾患や代謝性疾患に罹った患者における臨床転帰へのＫｉｒ６．２多型の影響を解析するために、本発明者等は、１型または２型糖尿病に罹った３３５人の個体からなる患者の同齢集団における、Ｋｉｒ６．２多型のＥ２３Ｋ、Ｌ２７０ＶおよびＩ３３７Ｖの相関分析を行った。３５０種を超える臨床パラメーターのなかから、狭心症と、Ｋｉｒ６．２タンパク質の２３位のリシン（Ｋ）および／または３３７位のバリン（Ｖ）に関してホモ接合型の患者とが、有意な相関を有していた。
心臓血管疾患や代謝性疾患に罹った患者における臨床転帰へのＫｉｒ６．２多型の影響を解析するために、本発明者等は、１型または２型糖尿病に罹った３３５人の個体からなる患者の同齢集団における、Ｋｉｒ６．２多型のＥ２３Ｋ、Ｌ２７０ＶおよびＩ３３７Ｖの相関分析を行った。３５０種を超える臨床パラメーターのなかから、狭心症と、Ｋｉｒ６．２タンパク質の２３位のリシン（Ｋ）および／または３３７位のバリン（Ｖ）に関してホモ接合型の患者とが、有意な相関を有していた。
Ｋｉｒ６．２−２３−ＥＥ（２３位が野生型）は、Ｋｉｒ６．２対立遺伝子の両方が、Ｋｉｒ６．２タンパク質の２３位においてグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）が生じるようなＫｉｒ６．２遺伝子変異体をコードしている個体群を定義しており、この群は、Ｋｉｒ６．２タンパク質の２３位における上記Ｋｉｒ６．２多型に関してホモ接合型である。
Ｋｉｒ６．２−２３−ＥＫは、Ｋｉｒ６．２対立遺伝子の一方が、Ｋｉｒ６．２タンパク質の２３位においてグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）が生じるようなＫｉｒ６．２遺伝子変異体をコードし、他方のＫｉｒ６．２対立遺伝子が、Ｋｉｒ６．２タンパク質の２３位においてリシン（ＬｙｓまたはＫ）が生じるようなＫｉｒ６．２遺伝子変異体をコードする個体群を定義しており、この群は、Ｋｉｒ６．２タンパク質の２３位における上記Ｋｉｒ６．２多型に関してヘテロ接合型である。
Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫは、Ｋｉｒ６．２対立遺伝子の両方が、Ｋｉｒ６．２タンパク質の２３位においてリシン（ＬｙｓまたはＫ）が生じるようなＫｉｒ６．２遺伝子変異体をコードしている個体群を定義しており、この群は、Ｋｉｒ６．２タンパク質の２３位における上記Ｋｉｒ６．２多型に関してホモ接合型である。Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫはまた、Ｋｉｒ６．２対立遺伝子の両方が、Ｋｉｒ６．２タンパク質の２３位においてリシン（ＬｙｓまたはＫ）が生じるようなＫｉｒ６．２遺伝子変異体をコードしている患者の生体サンプルも定義する。
Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩは、Ｋｉｒ６．２対立遺伝子の両方が、Ｋｉｒ６．２タンパク質の３３７位においてイソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）が生じるようなＫｉｒ６．２遺伝子変異体をコードしている個体群を定義しており、この群は、Ｋｉｒ６．２タンパク質の３３７位における上記Ｋｉｒ６．２多型に関してホモ接合型である。Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩはまた、Ｋｉｒ６．２対立遺伝子の両方が、Ｋｉｒ６．２タンパク質の３３７位においてイソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）が生じるようなＫｉｒ６．２遺伝子変異体をコードしている患者の生体サンプルも定義する。
Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＶは、Ｋｉｒ６．２対立遺伝子の一方が、Ｋｉｒ６．２タンパク質の３３７位においてイソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）が生じるようなＫｉｒ６．２遺伝子変異体をコードし、他方のＫｉｒ６．２対立遺伝子が、Ｋｉｒ６．２タンパク質の３３７位においてバリン（ＶａｌまたはＶ）が生じるようなＫｉｒ６．２遺伝子変異体をコードする個体群を定義しており、この群は、Ｋｉｒ６．２タンパク質の３３７位における上記Ｋｉｒ６．２多型に関してヘテロ接合型である。
Ｋｉｒ６．２−３３７−ＶＶ（３３７位が野生型）は、Ｋｉｒ６．２対立遺伝子の両方が、Ｋｉｒ６．２タンパク質の３３７位においてバリン（ＶａｌまたはＶ）が生じるようなＫｉｒ６．２遺伝子変異体をコードしている個体群を定義しており、この群は、Ｋｉｒ６．２タンパク質の３３７位における上記Ｋｉｒ６．２多型に関してホモ接合型である。
遺伝子型／表現型の相関に関する統計学的なアプローチ：
ＳＡＳ統計パッケージ（バージョン６．１２，ＳＡＳインスティテュート社（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＧｍｂＨ），ハイデルベルグ／ドイツ）を用いて全ての解析を行った。遺伝子の多型と、多数の臨床的な関連パラメーターとの関連を検出するために、記述統計をコンピューターで計算し（中央値、四分位数）、ウィルコクソンの順位和検定を行った。ウィルコクソンの順位和検定は、２つの独立したサンプルを比較するために用いられた。上記検定の統計の計算結果は、プールされたサンプル中の順位に基づく。
ＳＡＳ統計パッケージ（バージョン６．１２，ＳＡＳインスティテュート社（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＧｍｂＨ），ハイデルベルグ／ドイツ）を用いて全ての解析を行った。遺伝子の多型と、多数の臨床的な関連パラメーターとの関連を検出するために、記述統計をコンピューターで計算し（中央値、四分位数）、ウィルコクソンの順位和検定を行った。ウィルコクソンの順位和検定は、２つの独立したサンプルを比較するために用いられた。上記検定の統計の計算結果は、プールされたサンプル中の順位に基づく。
同様の方法で、ＳＮＰと、危険因子や病気との関連に関する検索を行った。χ２乗検定を行い、データを説明するために数値とパーセンテージを計算した。χ２乗検定とは、２変数間の依存性を計算するための統計的検定である。変数の値は、２またはそれ以上のクラスに含まれる。このような変数間の関係を解析するために、分割表を用いた。この表は、第一の変数の実現の数と同数の行と、第二の変数の実現の数と同数の列で構成される。各セルには、特殊な患者の特徴を記載した。統計的検定を構築するために、計算された頻度と観察された頻度と差をコンピューターで計算した。
結果を検査した後、関連する変数を選択した。交絡する共通の変数を考察するために、ロジスティック回帰を用いて、結果を確認した。ロジスティック回帰法は、ある特定の応答変数に対する数種の説明変数の影響を解析するために用いられる。関連する統計的検定により、ｐ値が得られた。このｐ値の解釈は、関連する説明変数の有意な影響があることである。
２値変数に関して、オッズ比を計算した。オッズ比は、１つの群においてある現象が起こると予想されるオッズの、他方の群でその現象が起こると予想されるオッズに対する比率である。
実施例３：解析
表２に、３３５人の個体におけるＫｉｒ６．２変異体Ｅ２３ＫとＶ３３７Ｉとの分布を示す。表３〜８で概説したように、Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫとＫｉｒ６．２−３３７−ＩＩ、Ｋｉｒ６．２−２３−ＥＫとＫｉｒ６．２−３３７−ＶＩ、および、Ｋｉｒ６．２−２３−ＥＥとＫｉｒ６．２−３３７−ＶＶの強い関連が観察された。従って、例えば、Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫに関して得られた全ての統計的分析データは、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩに関するデータに類似しているはずである。
表２に、３３５人の個体におけるＫｉｒ６．２変異体Ｅ２３ＫとＶ３３７Ｉとの分布を示す。表３〜８で概説したように、Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫとＫｉｒ６．２−３３７−ＩＩ、Ｋｉｒ６．２−２３−ＥＫとＫｉｒ６．２−３３７−ＶＩ、および、Ｋｉｒ６．２−２３−ＥＥとＫｉｒ６．２−３３７−ＶＶの強い関連が観察された。従って、例えば、Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫに関して得られた全ての統計的分析データは、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩに関するデータに類似しているはずである。
Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫ、および、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩを有する糖尿病患者は、狭心症との関係が高いことを示す。狭心症を伴う糖尿病患者におけるＫｉｒ６．２−２３−ＫＫの遺伝子型の関係に関してχ２乗検定を用いて計算された統計的有意性は、ｐ値＝０．０１５であり、狭心症を伴う糖尿病患者におけるＫｉｒ６．２−３３７−ＩＩの遺伝子型の関係に関する上記有意性は、ｐ値＝０.０１２であった（図２Ａおよび図３Ａ）。
交絡する因子（例えば心筋梗塞や高血圧）の影響を解析するためのロジスティック回帰によれば、狭心症を伴う糖尿病患者におけるＫｉｒ６．２−２３−ＫＫの遺伝子型の関係については、ｐ値＝０.００８８が得られ、および、狭心症を伴う糖尿病におけるＫｉｒ６．２−３３７−ＩＩの遺伝子型の関係については、ｐ値＝０.００７２が得られた（図２Ｂおよび図３Ｂ）。
Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫの遺伝子型を有する糖尿病患者における狭心症の高い危険のオッズ比は、１.６０１であり、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩの遺伝子型を有する糖尿病患者における上記オッズ比は、１.６１５であった（図２Ｃおよび図３Ｃ）。
ここで示されたデータにより、２３位においてグルタミンからリシンへの置換が生じるようなＫｉｒ６．２遺伝子中の突然変異、特にＫｉｒ６．２−２３−ＫＫ、および、３３７位においてバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換が生じるようなＫｉｒ６．２遺伝子中の突然変異、特にＫｉｒ６．２−３３７−ＩＩは、糖尿病患者における狭心症に関する危険マーカーを表わすことが実証された。狭心症は冠動脈心疾患の徴候であるため、一般的に、これらのマーカーは、冠動脈心疾患の指標になると期待される。その上、Ｋｉｒ６．２タンパク質中の２３位においてアミノ酸置換が生じるようなＫｉｒ６．２遺伝子中の他の突然変異、特に酸性のグルタミンが、非極性、または好ましくは塩基性のアミノ酸で置換されるような突然変異が、同じ、または、類似の作用を有することも期待できる。３３７位において、バリンが、他のアミノ酸、特に酸性もしくは塩基性、または、より嵩高な脂肪族アミノ酸で置換されるようなアミノ酸置換についても同じことが期待できる。これらのアミノ酸置換が、冠動脈心疾患、特に狭心症の発病と極めて密接な相関関係を示す可能性が非常に高く、非糖尿病患者においても同様である。
文献：
Ｙａｍａｄａ Ｙ，Ｋｕｒｏｅ Ａ，Ｌｉ Ｑ，Ｓｏｍｅｙａ Ｙ，Ｋｕｂｏｔａ Ａ，Ｉｈａｒａ Ｙ，Ｔｓｕｕｒａ Ｙ，Ｓｅｉｎｏ Ｙ（２００１）．
Ｇｅｎｏｍｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ．
Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｓ Ｒｅｖ １７：２１３−２１６．
Ｈａｎｉ ＥＨ，Ｂｏｕｔｉｎ Ｐ，Ｄｕｒａｎｄ Ｅ，Ｉｎｏｕｅ Ｈ，Ｐｅｒｍｕｔｔ ＭＡ，Ｖｅｌｈｏ Ｇ，Ｆｒｏｇｕｅｌ Ｐ（１９９８）．
Ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ ｉｎｗａｒｄｌｙ ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ Ｋ＋ ｃｈａｎｎｅｌ ｇｅｎｅ（ＫＩＲ６．２／ＢＩＲ）：ａ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｙｐｅ ＩＩ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｉｎ Ｃａｕｃａｓｉａｎｓ．
Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４１：１５１１−１５１５．
Ｙａｍａｄａ Ｙ，Ｋｕｒｏｅ Ａ，Ｌｉ Ｑ，Ｓｏｍｅｙａ Ｙ，Ｋｕｂｏｔａ Ａ，Ｉｈａｒａ Ｙ，Ｔｓｕｕｒａ Ｙ，Ｓｅｉｎｏ Ｙ（２００１）．
Ｇｅｎｏｍｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ．
Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｓ Ｒｅｖ １７：２１３−２１６．
Ｈａｎｉ ＥＨ，Ｂｏｕｔｉｎ Ｐ，Ｄｕｒａｎｄ Ｅ，Ｉｎｏｕｅ Ｈ，Ｐｅｒｍｕｔｔ ＭＡ，Ｖｅｌｈｏ Ｇ，Ｆｒｏｇｕｅｌ Ｐ（１９９８）．
Ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ ｉｎｗａｒｄｌｙ ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ Ｋ＋ ｃｈａｎｎｅｌ ｇｅｎｅ（ＫＩＲ６．２／ＢＩＲ）：ａ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｙｐｅ ＩＩ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｉｎ Ｃａｕｃａｓｉａｎｓ．
Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４１：１５１１−１５１５．
実験方法のための標準的な文献
特に他の指定がない限り、以下の標準的な文献に従って標準的な実験方法を行った：
Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．５４５ ｐｐ；
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｕｐｄａｔｅｄ，ｅ．ｇ．Ｖｏｌｕｍｅ ２０００；Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｆｒｅｄ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｅｇ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄａｖｉｄ Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊｏｈｎ Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ．
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｕｐｔｄａｔｅｄ；Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｃ．Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ，Ｈｏｎａｔｈａｎ Ｌ．Ｈａｉｎｅｓ，Ｂｒｕｃｅ Ｒ．Ｋｏｒｆ，Ｃｙｎｔｈｉａ Ｃ．Ｍｏｒｔｏｎ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｅ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｇｍａｎ，Ｄｏｕｇｌａｓ Ｒ．Ｓｍｉｔｈ．
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ；ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｕｐｄａｔｅｄ；Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｂｅｎ Ｍ．Ｄｕｎｎ，Ｈｉｄｄｅ Ｌ．Ｐｌｏｅｇｈ，Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，Ｐａｕｌ Ｔ．Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ；ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，Ｂｒａｙ，Ｄ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．，Ｒａｆｆ，Ｍ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｋ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．；Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＆ Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４；
Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｎｓｕｂｅｌ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｄａｖｉｄ Ｄ．Ｍｏｏｒｅ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｊｏｈｎ Ａ．Ｓｍｉｔｈ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ“
特に他の指定がない限り、以下の標準的な文献に従って標準的な実験方法を行った：
Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．５４５ ｐｐ；
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｕｐｄａｔｅｄ，ｅ．ｇ．Ｖｏｌｕｍｅ ２０００；Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｆｒｅｄ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｅｇ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄａｖｉｄ Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊｏｈｎ Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ．
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｕｐｔｄａｔｅｄ；Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｃ．Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ，Ｈｏｎａｔｈａｎ Ｌ．Ｈａｉｎｅｓ，Ｂｒｕｃｅ Ｒ．Ｋｏｒｆ，Ｃｙｎｔｈｉａ Ｃ．Ｍｏｒｔｏｎ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｅ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｇｍａｎ，Ｄｏｕｇｌａｓ Ｒ．Ｓｍｉｔｈ．
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ；ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｕｐｄａｔｅｄ；Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｂｅｎ Ｍ．Ｄｕｎｎ，Ｈｉｄｄｅ Ｌ．Ｐｌｏｅｇｈ，Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，Ｐａｕｌ Ｔ．Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ；ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，Ｂｒａｙ，Ｄ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．，Ｒａｆｆ，Ｍ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｋ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．；Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＆ Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４；
Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｎｓｕｂｅｌ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｄａｖｉｄ Ｄ．Ｍｏｏｒｅ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｊｏｈｎ Ａ．Ｓｍｉｔｈ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ“
図の凡例：
図１：
ポリペプチド鎖の２３位（グルタミン酸）と３３７位（バリン）（コード配列の６７／６８／６９位におけるコドンＧＡＧ、および、１００９／１０１０／１０１１位におけるＧＴＣに相当する）において最も頻度が高い変異体を包含するＫｉｒ６．２（ＫＣＮＪ１１）のタンパク質配列とヌクレオチドのコード配列である。これらの変異体は、Ｋｉｒ６．２−２３Ｋ−３３７Ｖ（または、両方の対立遺伝子が、２３位および／または３３７位に関して同様である場合、ＫＫおよび／またはＶＶ）と称される。このＫｉｒ６．２変異体のタンパク質の登録番号（ＮＣＢＩタンパク質データベース）は、Ｄ５０５８２である。ポリペプチド配列の２３位および３３７位、および、それに相当するヌクレオチド位置、同様に、コード配列中のＡＴＧは、下線で示す。
図１：
ポリペプチド鎖の２３位（グルタミン酸）と３３７位（バリン）（コード配列の６７／６８／６９位におけるコドンＧＡＧ、および、１００９／１０１０／１０１１位におけるＧＴＣに相当する）において最も頻度が高い変異体を包含するＫｉｒ６．２（ＫＣＮＪ１１）のタンパク質配列とヌクレオチドのコード配列である。これらの変異体は、Ｋｉｒ６．２−２３Ｋ−３３７Ｖ（または、両方の対立遺伝子が、２３位および／または３３７位に関して同様である場合、ＫＫおよび／またはＶＶ）と称される。このＫｉｒ６．２変異体のタンパク質の登録番号（ＮＣＢＩタンパク質データベース）は、Ｄ５０５８２である。ポリペプチド配列の２３位および３３７位、および、それに相当するヌクレオチド位置、同様に、コード配列中のＡＴＧは、下線で示す。
図２：
２３位におけるリシンの変異、および、最も頻度が高い３３７位におけるバリンの変異（コード配列の６７／６８／６９位におけるコドンＡＡＧ、および、１００９／１０１０／１０１１位におけるＧＴＣに相当する）を包含するＫｉｒ６．２（ＫＣＮＪ１１）のタンパク質配列とヌクレオチドのコード配列である。このＫｉｒ６．２変異体のタンパク質配列の登録番号（ＮＣＢＩタンパク質データベース）は、ＸＰ＿００６３９８である（図２Ａ；配列番号２）。
ヌクレオチド配列（ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース）に関する登録番号は、ＸＭ＿００６３９８である（図２Ｂ；配列番号４）。コード配列中のポリペプチド配列の２３位および３３７位、および、それに相当するヌクレオチド位置は、下線で示す。
２３位におけるリシンの変異、および、最も頻度が高い３３７位におけるバリンの変異（コード配列の６７／６８／６９位におけるコドンＡＡＧ、および、１００９／１０１０／１０１１位におけるＧＴＣに相当する）を包含するＫｉｒ６．２（ＫＣＮＪ１１）のタンパク質配列とヌクレオチドのコード配列である。このＫｉｒ６．２変異体のタンパク質配列の登録番号（ＮＣＢＩタンパク質データベース）は、ＸＰ＿００６３９８である（図２Ａ；配列番号２）。
ヌクレオチド配列（ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース）に関する登録番号は、ＸＭ＿００６３９８である（図２Ｂ；配列番号４）。コード配列中のポリペプチド配列の２３位および３３７位、および、それに相当するヌクレオチド位置は、下線で示す。
図３：
最も頻度が高い２３位におけるグルタミン酸の変異、および、３３７位におけるイソロイシンの変異（コード配列の６７／６８／６９位におけるコドンＧＡＧ、および、１００９／１０１０／１０１１位におけるＡＴＣに相当する）を包含するＫｉｒ６．２（ＫＣＮＪ１１）のタンパク質配列とヌクレオチドのコード配列である。このタンパク質配列は、配列の登録番号Ｄ５０５８２に記載された「野生型」Ｋｉｒ６．２の配列に相当する（ただし、３３７位において、バリンの代わりにイソロイシンを有することを除く）。このコード配列は、配列の登録番号Ｄ５０５８２に記載された「野生型」Ｋｉｒ６．２の配列に相当する（ただし、１００９位において、グアノシンの代わりにアデノシンを有することを除く）。コード配列中のポリペプチド配列の２３位および３３７位、および、それに相当するヌクレオチド位置は、下線で示す。
最も頻度が高い２３位におけるグルタミン酸の変異、および、３３７位におけるイソロイシンの変異（コード配列の６７／６８／６９位におけるコドンＧＡＧ、および、１００９／１０１０／１０１１位におけるＡＴＣに相当する）を包含するＫｉｒ６．２（ＫＣＮＪ１１）のタンパク質配列とヌクレオチドのコード配列である。このタンパク質配列は、配列の登録番号Ｄ５０５８２に記載された「野生型」Ｋｉｒ６．２の配列に相当する（ただし、３３７位において、バリンの代わりにイソロイシンを有することを除く）。このコード配列は、配列の登録番号Ｄ５０５８２に記載された「野生型」Ｋｉｒ６．２の配列に相当する（ただし、１００９位において、グアノシンの代わりにアデノシンを有することを除く）。コード配列中のポリペプチド配列の２３位および３３７位、および、それに相当するヌクレオチド位置は、下線で示す。
図４：
２３位におけるリシンの変異、および、３３７位におけるイソロイシンの変異（コード配列の６７／６８／６９位におけるコドンＡＡＧ、および、１００９／１０１０／１０１１位におけるＡＴＣに相当する）を包含するＫｉｒ６．２（ＫＣＮＪ１１）のタンパク質配列とヌクレオチドのコード配列である。このタンパク質配列は、配列の登録番号Ｄ５０５８２に記載された「野生型」Ｋｉｒ６．２の配列に相当する（ただし、２３位において、グルタミン酸の代わりにリシンを有し、３３７位において、バリンの代わりにイソロイシンを有することを除く）。このコード配列は、配列の登録番号Ｄ５０５８２に記載された「野生型」Ｋｉｒ６．２の配列に相当する（ただし、６７位において、グアノシンの代わりにアデノシンを有し、１００９位において、グアノシンの代わりにアデノシンを有することを除く）。コード配列中のポリペプチド配列の２３位および３３７位、および、それに相当するヌクレオチド位置は、下線で示す。
２３位におけるリシンの変異、および、３３７位におけるイソロイシンの変異（コード配列の６７／６８／６９位におけるコドンＡＡＧ、および、１００９／１０１０／１０１１位におけるＡＴＣに相当する）を包含するＫｉｒ６．２（ＫＣＮＪ１１）のタンパク質配列とヌクレオチドのコード配列である。このタンパク質配列は、配列の登録番号Ｄ５０５８２に記載された「野生型」Ｋｉｒ６．２の配列に相当する（ただし、２３位において、グルタミン酸の代わりにリシンを有し、３３７位において、バリンの代わりにイソロイシンを有することを除く）。このコード配列は、配列の登録番号Ｄ５０５８２に記載された「野生型」Ｋｉｒ６．２の配列に相当する（ただし、６７位において、グアノシンの代わりにアデノシンを有し、１００９位において、グアノシンの代わりにアデノシンを有することを除く）。コード配列中のポリペプチド配列の２３位および３３７位、および、それに相当するヌクレオチド位置は、下線で示す。
図５：
Ｋｉｒ６．２のコード配列の６７／６８／６９位に相当するＫｉｒ６．２のゲノム配列の位置におけるヌクレオチド置換を検出するための、ＤＮＡプライマーＭ６７フォワード（配列番号９）、および、リバース（配列番号１０）であり、配列の登録番号に記載のＫｉｒ６．２のコード配列の１００９／１０１０／１０１１位に相当するＫｉｒ６．２のゲノム配列の位置におけるヌクレオチド置換を検出するための、ＤＮＡプライマーＭ１００９フォワード（配列番号１１）、および、リバース（配列番号１２）である。配列番号２５に関して、上記位置は、それぞれ５６５７１０６／１０７／１０８、および、５６５７９７８／７９／８０である。
Ｋｉｒ６．２のコード配列の６７／６８／６９位に相当するＫｉｒ６．２のゲノム配列の位置におけるヌクレオチド置換を検出するための、ＤＮＡプライマーＭ６７フォワード（配列番号９）、および、リバース（配列番号１０）であり、配列の登録番号に記載のＫｉｒ６．２のコード配列の１００９／１０１０／１０１１位に相当するＫｉｒ６．２のゲノム配列の位置におけるヌクレオチド置換を検出するための、ＤＮＡプライマーＭ１００９フォワード（配列番号１１）、および、リバース（配列番号１２）である。配列番号２５に関して、上記位置は、それぞれ５６５７１０６／１０７／１０８、および、５６５７９７８／７９／８０である。
また、このプライマー群は、ＮＣＢＩ配列の登録番号Ｄ５０５８２に記載されたＫｉｒ６．２のｃＤＮＡを特異的に増幅するのにも適用することができる。プライマーＭ６７フォワード（配列番号９）、および、リバース（配列番号１０）は、ＲＮＡレベルでＫｉｒ６．２遺伝子中のヌクレオチド置換を検出するために、Ｋｉｒ６．２のｃＤＮＡのヌクレオチド６７／６８／６９を含む領域を増幅する。プライマーＭ１００９フォワード（配列番号１１）、および、リバース（配列番号１２）は、ＲＮＡレベルでＫｉｒ６．２遺伝子中のヌクレオチド置換を検出するために、Ｋｉｒ６．２のｃＤＮＡのヌクレオチド１００９／１０１０／１０１１を含む領域を増幅する。
図６：
いくつかのＫｉｒ６．２変異体のゲノムおよびコード配列の、それに相当するヌクレオチド位置の大要である。ゲノム配列中の位置の番号付けは、ヒト第１１染色体のゲノムコンティグ（ＮＣＢＩ登録番号ＮＴ＿００９３０７）から得られたものである（また、図１０の、Ｋｉｒ６．２のゲノムの遺伝子座を含むコンティグの一部を参照）。
いくつかのＫｉｒ６．２変異体のゲノムおよびコード配列の、それに相当するヌクレオチド位置の大要である。ゲノム配列中の位置の番号付けは、ヒト第１１染色体のゲノムコンティグ（ＮＣＢＩ登録番号ＮＴ＿００９３０７）から得られたものである（また、図１０の、Ｋｉｒ６．２のゲノムの遺伝子座を含むコンティグの一部を参照）。
図７：
ポリペプチド鎖の２３位においてグルタミン酸からリシンへのアミノ酸置換、および、３３７位においてバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換が生じるような、Ｋｉｒ６．２ヌクレオチド配列の差異である。ヌクレオチド位置は、Ｋｉｒ６．２のコード配列を参照している。これらの位置は、配列番号２５に記載のゲノムのＫｉｒ６．２配列の５６５７１０６／７／８位、および、５６５７９７８／７９／８０位と相関がある（ここで、配列番号２５は、タンパク質配列の３３７位においてバリンをコードする）。最も高い頻度で発生する変異体（すなわち野生型）は、通常の文字で記載され、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列中で、この野生型からの変化は、太字で示される。２３位のアミノ酸に関して、単一のヌクレオチド置換Ｇ６７Ａにより、ポリペプチド鎖にリシンが包含されるようになるが、それに対して、置換Ｇ６９Ａは、単独では、アミノ酸配列の変化を起こさない。このタイプの突然変異は、一般的に、サイレント突然変異と称される。一方で、上記のヌクレオチド置換の両方が一緒に起こると、同様に２３位にリシンが包含される。アミノ酸鎖の３３７位に関して、単一のヌクレオチド置換Ｃ１０１１Ｔ、Ｃ１０１１Ａ、および、Ｃ１０１１Ｇはサイレントだが、それに対して、単一のヌクレオチド置換Ｇ１００９Ａにより、このＧ１００９Ａ置換と共に置換Ｃ１０１１ＴまたはＣ１０１１Ａが起こったとしても、ポリペプチド鎖の３３７位にイソロイシンの取り込みが起こる。６７／６８／６９位および／または１００９／１０１０／１０１１位において、その他の置換が生じる可能性があり、それにより、ポリペプチド鎖に、それぞれ２３位にＧまたはＫ以外の、または、３３７位にＶまたはＩ以外のアミノ酸の取り込みが生じる（これらの遺伝子コードから生じる相関は、一般的に当業界の最先端において既知である）。
ポリペプチド鎖の２３位においてグルタミン酸からリシンへのアミノ酸置換、および、３３７位においてバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換が生じるような、Ｋｉｒ６．２ヌクレオチド配列の差異である。ヌクレオチド位置は、Ｋｉｒ６．２のコード配列を参照している。これらの位置は、配列番号２５に記載のゲノムのＫｉｒ６．２配列の５６５７１０６／７／８位、および、５６５７９７８／７９／８０位と相関がある（ここで、配列番号２５は、タンパク質配列の３３７位においてバリンをコードする）。最も高い頻度で発生する変異体（すなわち野生型）は、通常の文字で記載され、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列中で、この野生型からの変化は、太字で示される。２３位のアミノ酸に関して、単一のヌクレオチド置換Ｇ６７Ａにより、ポリペプチド鎖にリシンが包含されるようになるが、それに対して、置換Ｇ６９Ａは、単独では、アミノ酸配列の変化を起こさない。このタイプの突然変異は、一般的に、サイレント突然変異と称される。一方で、上記のヌクレオチド置換の両方が一緒に起こると、同様に２３位にリシンが包含される。アミノ酸鎖の３３７位に関して、単一のヌクレオチド置換Ｃ１０１１Ｔ、Ｃ１０１１Ａ、および、Ｃ１０１１Ｇはサイレントだが、それに対して、単一のヌクレオチド置換Ｇ１００９Ａにより、このＧ１００９Ａ置換と共に置換Ｃ１０１１ＴまたはＣ１０１１Ａが起こったとしても、ポリペプチド鎖の３３７位にイソロイシンの取り込みが起こる。６７／６８／６９位および／または１００９／１０１０／１０１１位において、その他の置換が生じる可能性があり、それにより、ポリペプチド鎖に、それぞれ２３位にＧまたはＫ以外の、または、３３７位にＶまたはＩ以外のアミノ酸の取り込みが生じる（これらの遺伝子コードから生じる相関は、一般的に当業界の最先端において既知である）。
図８−１および図８−２：
５６５７１０６／１０７／１０８位におけるヌクレオチドＧＡＣを包含する（コード配列の１００９／１０１０／１０１１位におけるコドンＧＴＣに相当する、従って、ポリペプチド配列の３３７位のアミノ酸にバリンを包含するタンパク質変異体をコードする）、および、５６５７９７８／７９／８０位におけるヌクレオチドＣＴＴを包含する（コード配列の６７／６８／６９位におけるコドンＡＡＧに相当する、従って、ペプチド配列の２３位のアミノ酸にリシンを包含するタンパク質変異体をコードする）Ｋｉｒ６．２（ＫＣＮＪ１１）遺伝子座のゲノム配列である。示されたヌクレオチドのトリプレットは、太字で記載され、下線で示される。配列番号９〜１２に記載のＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーション位置も同様に、太字で記載され、下線で示される。このプライマー配列は、同様に、テンプレートとしてＫｉｒ６．２のｃＤＮＡを用いてポリヌクレオチドが増幅されるように選択される。このＫｉｒ６．２のゲノム変異体を含むヒト第１１染色体のゲノム連続配列を公共的に利用可能にする配列の登録番号（ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース）は、ＮＴ＿００９３０７である（配列番号２５）。
５６５７１０６／１０７／１０８位におけるヌクレオチドＧＡＣを包含する（コード配列の１００９／１０１０／１０１１位におけるコドンＧＴＣに相当する、従って、ポリペプチド配列の３３７位のアミノ酸にバリンを包含するタンパク質変異体をコードする）、および、５６５７９７８／７９／８０位におけるヌクレオチドＣＴＴを包含する（コード配列の６７／６８／６９位におけるコドンＡＡＧに相当する、従って、ペプチド配列の２３位のアミノ酸にリシンを包含するタンパク質変異体をコードする）Ｋｉｒ６．２（ＫＣＮＪ１１）遺伝子座のゲノム配列である。示されたヌクレオチドのトリプレットは、太字で記載され、下線で示される。配列番号９〜１２に記載のＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーション位置も同様に、太字で記載され、下線で示される。このプライマー配列は、同様に、テンプレートとしてＫｉｒ６．２のｃＤＮＡを用いてポリヌクレオチドが増幅されるように選択される。このＫｉｒ６．２のゲノム変異体を含むヒト第１１染色体のゲノム連続配列を公共的に利用可能にする配列の登録番号（ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース）は、ＮＴ＿００９３０７である（配列番号２５）。
表の凡例：
表１：
全ての解析を行った患者の同齢集団の基本的な特徴である。
表１：
全ての解析を行った患者の同齢集団の基本的な特徴である。
表２：
解析された糖尿病患者の同齢集団におけるＫｉｒ６．２変異体の分布である。
解析された糖尿病患者の同齢集団におけるＫｉｒ６．２変異体の分布である。
表３：
χ２乗検定で計算した、タンパク質の２３位におけるＫｉｒ６．２変異体と、糖尿病患者における狭心症との関係である。狭心症陽性群において、Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫキャリアーの頻度が高いことが観察できた。
χ２乗検定で計算した、タンパク質の２３位におけるＫｉｒ６．２変異体と、糖尿病患者における狭心症との関係である。狭心症陽性群において、Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫキャリアーの頻度が高いことが観察できた。
表４：
ロジスティック回帰による、Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫと、糖尿病患者における狭心症との関係に関する統計的有意性の計算である。
ロジスティック回帰による、Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫと、糖尿病患者における狭心症との関係に関する統計的有意性の計算である。
表５：
Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫキャリアーの狭心症を伴う糖尿病患者の危険と、Ｋｉｒ６．２−２３−ＥＫ、および、Ｋｉｒ６．２−２３−ＥＥキャリアーの危険とを比較したオッズ比の計算である。
Ｋｉｒ６．２−２３−ＫＫキャリアーの狭心症を伴う糖尿病患者の危険と、Ｋｉｒ６．２−２３−ＥＫ、および、Ｋｉｒ６．２−２３−ＥＥキャリアーの危険とを比較したオッズ比の計算である。
表６：
χ２乗検定で計算された、タンパク質の３３７位におけるＫｉｒ６．２変異体と、糖尿病患者における狭心症との関係である。狭心症陽性群において、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩキャリアーの頻度が高いことが観察できた。
χ２乗検定で計算された、タンパク質の３３７位におけるＫｉｒ６．２変異体と、糖尿病患者における狭心症との関係である。狭心症陽性群において、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩキャリアーの頻度が高いことが観察できた。
表７：
ロジスティック回帰による、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩと、糖尿病患者における狭心症との関係に関する統計的有意性の計算である。
ロジスティック回帰による、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩと、糖尿病患者における狭心症との関係に関する統計的有意性の計算である。
表８：
Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩキャリアーの狭心症を伴う糖尿病患者の危険と、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＶＩ、および、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＶＶキャリアーの危険とを比較したオッズ比の計算である。
Ｋｉｒ６．２−３３７−ＩＩキャリアーの狭心症を伴う糖尿病患者の危険と、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＶＩ、および、Ｋｉｒ６．２−３３７−ＶＶキャリアーの危険とを比較したオッズ比の計算である。
Claims (19)
- 個体における狭心症に関する危険の増加を同定する方法であって、Ｋｉｒ６.２タンパク質中の２３位におけるリシンの存在、および／または、３３７位におけるイソロイシンの存在が、サンプル中で決定される、上記方法。
- 個体における狭心症に関する危険の増加を同定する方法であって、Ｋｉｒ６.２タンパク質中の２３位にリシン、および／または、３３７位にイソロイシンを包含するＫｉｒ６.２ポリペプチド配列が生じる、Ｋｉｒ６.２遺伝子の対立遺伝子の一方または両方における、Ｋｉｒ６.２ヌクレオチド配列中の変異の存在が、サンプル中で決定される、上記方法。
- ヌクレオチド配列は、Ｋｉｒ６.２のコード配列の６７位にＡを有する、請求項２に記載の方法。
- ヌクレオチド配列は、Ｋｉｒ６.２のコード配列の１００９位にＡを有する、請求項２または３に記載の方法。
- 個体は糖尿病患者である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 糖尿病は真性糖尿病である、請求項５に記載の方法。
- Ｋｉｒ６.２−２３−ＫＫ、および／または、Ｋｉｒ６.２−３３７−ＩＩの存在が、サンプル中で決定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- サンプルは、組織サンプル、細胞もしくは組織抽出物、または、細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
- アミノ酸置換の存在は、
ｂ）サンプルから染色体ＤＮＡを単離すること、
ｃ）コード配列の６７／６８／６９位および／または１００９／１０１０／１０１１位に相当する、ゲノムのＫｉｒ６.２配列のヌクレオチド位置を含むポリヌクレオチドフラグメントを増幅することができるプライマーを用いたＰＣＲ反応によって、ポリヌクレオチドフラグメントを増幅すること、
ｄ）ｃ）に記載のポリヌクレオチドフラグメントを配列決定すること、
によって決定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。 - ポリヌクレオチドフラグメントの増幅は、配列番号９〜１２に記載のプライマーの少なくとも１種、好ましくは２種を用いて行われる、請求項９に記載の方法。
- 配列決定は、配列番号９〜１２に記載のプライマーの１種を用いて行われる、請求項９または１０に記載の方法。
- アミノ酸置換は、
ｂ）サンプルからＲＮＡを単離すること、
ｃ）Ｋｉｒ６.２のｃＤＮＡ配列の６７位および／または１００９位を含むポリヌクレオチドフラグメントを増幅することができるプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ反応によってポリヌクレオチドフラグメントを増幅すること、
ｄ）ｃ）に記載のポリヌクレオチドフラグメントを配列決定すること、
によって決定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。 - 配列番号９〜１２に記載のプライマーの少なくとも１種が用いられる、請求項１２に記載の方法。
- Ｋｉｒ６.２タンパク質中の２３位にリシン、および／または、３３７位にイソロイシンを包含するＫｉｒ６.２ポリペプチド配列が生じる、Ｋｉｒ６.２遺伝子の対立遺伝子の一方または両方における、Ｋｉｒ６.２ヌクレオチド配列中の変異の存在を試験するための試験キットであって、該キットは、個体における狭心症に関する危険の増加を同定するものであり、少なくとも、ヌクレオチド配列中の該変異を検出するためのプライマー群を含む、上記キット。
- Ｋｉｒ６.２のヌクレオチドの配列は、コード配列の６７位にＡを有する、請求項１４に記載の試験キット。
- Ｋｉｒ６.２のヌクレオチドの配列は、コード配列の１００９位にＡを有する、請求項１４または１５に記載の試験キット。
- Ｋｉｒ６.２のコード配列の６７位および／または１００９位を含むポリヌクレオチドフラグメントを増幅することができるプライマー群を含む、請求項１５または１６に記載の試験キット。
- 配列番号１３に記載のＫｉｒ６.２のゲノム配列の５６５７１０６／１０７／１０８位および／または５６５７９７８／７９／８０位を含むポリヌクレオチドフラグメントを増幅することができるプライマー群を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の試験キット。
- 配列番号９〜１２に記載のプライマーの少なくとも１種を含む、請求項１７または１８に記載の試験キット。
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