JP5468719B2 - レトロウイルスベクターによる遺伝子導入鳥類での遺伝子発現法およびそれによって得られる遺伝子導入烏類 - Google Patents

Description

本発明は、血液中ならびに卵中に、抗体、例えばｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体を産生するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類に関する。また本発明は、複製能欠失型レトロウイルスベクターによって外来性抗体遺伝子が導入されたＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製し、血中、卵白中あるいは卵黄中に産生した抗体を回収することからなる抗体産生法に関する。更に本発明は、効率的に導入遺伝子を発現するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法ならびに該作製法より得られるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類に関する。

遺伝子機能の研究手段として、外来遺伝子を宿主に組み込んだ遺伝子導入（トランスジェニック）動物の研究が盛んに行われているが、このトランスジェニック動物は、基礎研究だけでなく、品種改良や物質生産、移植用臓器のドナー等、産業応用にも有効である。ウシ、ヤギ、ヒツジ等の乳汁に生理活性物質を産生させる試みが実用に近づいており、その代表例としてα１−アンチトリプシンやアンチスロンビンは、医薬品への応用を目的として現在臨床段階にある。
ウズラやニワトリに代表される家禽鳥類は、食肉用、採卵用家畜としての飼育実績が長く、トランスジェニック研究の目的としても耐病性や肉質向上等、品種改良に係るさまざまなアプローチが考えられる。また、鳥類は性成熟までの期間が短く、小さなスペースで飼育可能なことから、安価なコストで実施可能なタンパク質発現系と考えられ、抗体医薬品や希少タンパク質の産生手段としてのトランスジェニック作製に期待が持たれている。鳥類の卵は多量のタンパク質を含有し、毎日連続的に生産されることから、導入遺伝子産物を組換えタンパク質として意図的に卵中に産生させることができれば、効率的な生産システムとなると考えられる。
近年数多くの品目が上市され、医薬品として注目されているモノクローナル抗体は、大腸菌などによる安価な発現システムでは生産できず、単価が高いことが普及の妨げとなっている。鳥類細胞は抗体タンパク質を構成する機能を備えており、トランスジェニック鳥類は、従来大量生産が困難であった医療用抗体等の生産手段として期待できる。更にこれらのタンパク質生産物には、鳥類細胞によって糖鎖が付与されることにより血中での安定性が向上する等、医薬、検査薬としての応用上有利な性質を備える可能性が高いと考えられる。
このように、有用タンパク質の生産手段としての応用が待たれるトランスジェニック鳥類であるが、一方で現在までに様々な試みがあるにも係らず、鳥類の卵に実用レベルで目的とする組換えタンパク質を蓄積させた例はない。また、抗体のような複数のユニットからなる高次構造をもったタンパク質を、高濃度に発現するトランスジェニック鳥類を作製した例も、未だ報告されていない。
Ｈａｒｖｅｙら（Ｈａｒｖｅｙ，Ａ．Ｊら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９，３９６）はエビアン・ロイコシス・ウイルス由来のベクターを用い、β−ラクタマーゼ遺伝子をニワトリに導入し、Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリを作製したが、血清あるいは卵への酵素発現量は５０〜２５０ｎｇ／ｍｌ程度であった。このＧ０トランスジェニックキメラニワトリの交配により作製されたＧ１〜Ｇ３トランスジェニックニワトリは、全身の体細胞に遺伝子が導入されることにより、酵素の発現量が増加したが、それでも数μｇ／ｍｌのレベルに留まり、実用には遠い値であった。
一般的に遺伝子導入動物を作製するには、受精卵の前核へＤＮＡをマイクロインジェクションする手法がとられるが、鳥類にはこの方法は応用できない。鳥類では１細胞期の胚を取得するのが困難なこと、また取得できたとしても、卵内の核を見分ける手法がないことがその理由である。１細胞期の胚を取得するには、雌性鳥類の輸卵管内から受精直後の卵を取得し、正常に発生させなければならない。近年Ｐｅｒｒｙによって鶏の卵割前細胞を取得し、体外で培養するシステムが確立された（Ｐｅｒｒｙ、Ｍ．Ｍ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３１）が、この手法によっても卵内の核を見分け、核内へ目的遺伝子を導入することは不可能である。
従って、鳥類受精卵への遺伝子導入は、細胞質へのＤＮＡ注入に限られ、ＤＮＡ封入脂質二重膜（リポソーム）の利用やリン酸カルシウム法、電気導入法（エレクトロポレーション）の利用が試みられてきた。しかし、これらの手法では遺伝子の導入効率が悪く、また導入されたプラスミドＤＮＡは、染色体に取り込まれる確率が低い。マイクロインジェクションによる遺伝子導入法は、効率的に目的ＤＮＡを受精卵に送り込むことができるが、導入されたプラスミドＤＮＡは宿主染色体に組み込まれないため、宿主の体細胞分裂に伴って導入遺伝子プラスミドは脱落してしまい、安定な遺伝子導入効果は望めない。
１９８６年に初めてレトロウイルスベクターによるトランスジェニックニワトリの作製例が報告されている（Ｓａｌｔｅｒ，Ｄ．Ｗら（１９８６）Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．，６５）。レトロウイルスベクターをマイクロインジェクション法で受精卵に注入する手法は、遺伝子の導入効率の高い手法であり、核内へ直接ＤＮＡを注入できない鳥類において、染色体へ目的遺伝子が挿入された安定なトランスジェニックを作製する唯一の実用的方法である。
本発明者らは鋭意研究を重ね、遺伝子治療にも応用されている安全な自己複製能欠失型ウイルスベクターを使用し、効率的に目的遺伝子を導入するトランスジェニック鳥類の作製法を見出した（特開２００２−１７６８８０号公報）。これにより、安全かつ効率的に複数の導入遺伝子コピー数をもつトランスジェニック鳥類の作製が可能となった。またこの手法によれば、導入遺伝子は高い効率で次世代に伝達されることもわかり、物質生産システムとしての遺伝子導入鳥類の利用が実用に近づいた。
しかしながら、このとき導入された遺伝子の大部分は、発生初期に宿主によって不活性化されるため（遺伝子のサイレンシングと呼ばれる）、遺伝子発現の結果としてのタンパク質産生はごく微量であった。導入遺伝子が不活性化される生物学的メカニズムは未だ解明されていないが、この不活性化を回避し、目的遺伝子を効率的に発現させる技術が、トランスジェニック鳥類の応用開発に必須である。
発明の要約
レトロウイルスベクターによって受精卵に導入された遺伝子が、発生後どの時期に不活性化されるのかを特定するため、本発明者らはβ−ガラクトシダーゼ発現遺伝子を指標とし、受精後の様々な時期にベクターを導入して発現量がどう変化するかを検討した。その結果、導入遺伝子の発現量は該遺伝子が胚発生のどの時期に導入されたかによって大きく変化してくることを発見し、本発明に至った。すなわち、導入遺伝子の不活性化は、放卵直後に導入された遺伝子に対して顕著であり、放卵から一定時間経過後に導入された遺伝子は、発現頻度が高いというものである。
本発明者らはこの知見を利用し、鳥の種類によって決まる特定の時間が孵卵開始時より経過した後に、その初期胚へ外来遺伝子を導入すれば、宿主による不活性化の影響を受けず、目的遺伝子を効率的に発現させることが可能となることを見出した。
さらに、医薬品として有用なキメラ抗体、例えばｓｃＦｖ−Ｆｃ（１本鎖抗体）をコードした遺伝子を組み込んだベクターを作り、この方法によりウズラに導入して、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製したところ、血中、卵白、卵黄中に導入遺伝子に由来する抗体が高濃度に発現することが見出された。
すなわち第一の本発明は、鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期（ステージＸ）を除くそれ以降の初期胚へ複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることからなるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法、及び該方法により作製されたＧ０トランスジェニックキメラ鳥類に関し、第二の本発明は、複製能欠失型レトロウイルスベクターによって外来性抗体遺伝子が導入されたＧ０トランスジェニックキメラ鳥類であって、導入遺伝子に由来する抗体を血中、卵白中及び卵黄中の少なくとも１つに産生することを特徴とするＧ０トランスジェニックキメラ鳥類に関し、第三の本発明は、上記Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製し、該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類の血中及び／又は卵中から抗体を回収することよりなる抗体の生産法に関する。
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類による導入遺伝子の発現は、誕生したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類が成烏になっても維持されることが確認された。したがって、本発明により特定の遺伝子を鳥類に導入し、目的タンパク質を成長後も産生する、実用的な生産システムを構築することができる。また、本発明によって作製されたＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の導入遺伝子は、交配により高い伝播効率で次世代に受け継がれる。導入遺伝子は、染色体に組み込まれたかたちで次世代に受け継がれるため、このトランスジェニック鳥類による生産システムは、安定的な物質生産が可能である。
本発明により、トランスジェニック鳥類がその体細胞中に産生させた目的タンパク質は、血液中に分泌され、血清から分離することで利用可能となる。
更に本発明者らは、ヒトＩｇＧクラスの定常領域をもつ抗体や、ウズラＩｇＧ、ニワトリＩｇＧ又はマウスＩｇＧの定常領域をもつ抗体が、ウズラ、ニワトリにおいて血中から卵中に効率的に移行することを見出した。これらの定常領域をもつ抗体を本発明の方法により作製されたＧ０トランスジェニックキメラ鳥類に発現させた場合、血中に分泌された抗体が卵中に高濃度に蓄積される。
トランスジェニック動物に遺伝子を導入して目的タンパク質を取得する場合、哺乳類では乳汁中に分泌させて回収するのが一般的だが、鳥類のトランスジェニックでは卵に目的物を蓄積させ、その卵白、卵黄から回収、精製するのが実際的である。
鶏卵などでは全成分の３０％がタンパク質であり、その主成分となるタンパク質はオボアルブミンである。従来トランスジェニック鳥類の卵中に組換えタンパク質を発現させる方法として、このオボアルブミン等の発現プロモーターを利用し、その下流に目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込んで、卵白中にオボアルブミンに代えて目的物を発現させるという考え方がとられていた。
しかし、本発明の方法において、構成的なプロモーター、例えばニワトリβ−アクチンプロモーター等の制御のもとに、大量に発現した抗体、例えば前記ＩｇＧクラス抗体等を血中に分泌させ、卵中に蓄積させることが可能となる。なお本明細書において、構成的なプロモーターとは、全身性に発現するプロモーターのことを意味する。
更に抗体の構造のなかで、卵中への移行に必須な部分を特定するため、抗体をＦａｂ、Ｆｃフラグメントとしたものを、ウズラ、ニワトリ血中に接種して卵への移行性を調べた。その結果、卵内にはＦｃフラグメントが蓄積され、抗体の卵内への移行はＦｃレセプターを介して行われることが示唆された。
このことからトランスジェニック鳥類による抗体の卵内での生産法を、タンパク質全般の生産に汎用化する方法として、ヒトＩｇＧの定常領域（Ｆｃ）が融合した構造をもつタンパク質を生産するベクターを設計し、トランスジェニック鳥類を作製して卵から目的物を含むタンパク質を回収し、Ｆｃ部を切断して目的物を精製する生産法が考えられる。
また、従来哺乳類のトランスジェニック動物を使って抗体を生産した場合、産生動物がもつ自己抗体と目的抗体を分離精製するのが困難との問題が指摘されていた。産生動物に鳥類を使う抗体生産法の利点として、鳥類の自己抗体がプロテインＡ、プロテインＧカラムに吸着されないため、目的とする組換え抗体との分離が容易な点も挙げられる。
前述のように、ヒトモノクローナル抗体は、医薬品として有用であるにも係らず、その生産には動物細胞培養やマウス腹水といった高価な生産手段しかなく、単価が高いことが普及に際して妨げとなっている。
近年遺伝子工学的手法を用いて、抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域のみをリンカー配列でつなげたｓｃＦｖ（１本鎖抗体）が作製されているが、これは大腸菌でも生産されるという利点があり、コストの点から注目されている。しかし、低分子抗体と呼ばれるこれらのタンパク質は、血中での安定性が低いため、治療用、試験用としての実用性に難があった。
ｓｃＦｖにＦｃ領域をつなげたｓｃＦｖ−Ｆｃは、血中でも安定であり、より実用的と考えられるが、大腸菌では生産できず、動物細胞を使ったバイオリアクターでしか供給できない。ニワトリなど他の動物に作らせた結合領域をもつｓｃＦｖにヒトのＦｃを結合させたヒト化ｓｃＦｖ−Ｆｃは治療用としても有望であり、このタンパク質を本発明によるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類により大量に生産できれば、その有用性は大きい。
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類は、ｓｃＦｖ−Ｆｃのような組換え抗体、キメラ抗体、ヒトモノクローナル抗体など、従来の方法では少量しか生産できなかった抗体タンパク質を安価に大量に生産し、実用的に回収、精製して利用することに応用できる。
このように本発明ではレトロウイルスベクターによるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類において、導入遺伝子を効率的に発現させる作製法を開示する。また本発明では、特定遺伝子を導入することにより、鳥類体細胞に有用な目的タンパクを産生させるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法を開示する。更に従来大腸菌等で産生することが不可能だったモノクローナルヒト型抗体や、キメラ抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体、複雑な高次構造をもった機能性タンパク等、医薬、検査薬として有用な物質を鳥類細胞に産生させ、血清や卵中から回収して利用する、生産コストの低いタンパク生産システムを開示する。
また本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法を応用して、家禽鳥類を好ましい方向へ改質する手法および改質された鳥類を提供することも考えられる。家禽鳥類の好ましい性質としては、肉質改善、耐病性の向上、生育速度の向上等が挙げられる。鳥類はまた愛玩用途としても多種の需要をもっているが、本発明の作製法は、羽毛色の改善、攻撃性の低下等、愛玩用として好ましい形質へ短期間で品種改良するための手段としても応用しうる。
更に、現在哺乳類、両生類、魚類等のトランスジェニック作製は、核移植によって行われるのが通常であるが、本発明はそれに代わる新たなトランスジェニック動物作製の効率的手法としても応用できる。
即ち、本発明は、複製能欠失型レトロウイルスベクターによって外来性抗体遺伝子が導入されたＧ０トランスジェニックキメラ鳥類であって、導入遺伝子に由来する抗体を、血中、卵白中及び卵黄中の少なくとも１つに産生するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類である。上記抗体の定常領域は、クラスがヒトＩｇＧであるか、サブクラスがヒトＩｇＧ１であるか、ウズラＩｇＧ、ニワトリＩｇＧ、あるいはマウスＩｇＧであることが好ましい。上記抗体遺伝子は、構成的なプロモーターにより制御されていることが好ましく、上記構成的なプロモーターは、ニワトリβ−アクチンプロモーターであることが好ましい。上記レトロウイルスベクターは、モロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス由来ベクターであることが好ましく、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプであることが好ましい。本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類は、ニワトリあるいはウズラであることが好ましい。上記抗体は、キメラ抗体であることが好ましく、上記キメラ抗体の産生量は、血液中には、０．５μｇ／ｍｌ以上であることが好ましく、より好ましくは５μｇ／ｍｌ以上であり、卵白中には、０．１μｇ／ｍｌ以上であることが好ましく、より好ましくは１μｇ／ｍｌ以上であり、卵黄中には、０．１μｇ／ｍｌ以上であることが好ましく、より好ましくは１μｇ／ｍｌ以上である。また、上記抗体は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体であることが好ましく、上記ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体の産生量は、血液中には、２０μｇ／ｍｌ以上であることが好ましく、より好ましくは２０００μｇ／ｍｌ以上であり、卵白中には、５μｇ／ｍｌ以上であることが好ましく、より好ましくは５００μｇ／ｍｌ以上であり、卵黄中には、５μｇ／ｍｌ以上であることが好ましく、より好ましくは５００μｇ／ｍｌ以上である。本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製し、上記Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類の血中及び／又は卵中から抗体を回収する抗体の生産法もまた、本発明の１つである。
鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚へ複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることからなるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法もまた、本発明の１つである。本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法において、複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させる時期は、孵卵開始から２４時間以降であることが好ましい。上記複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させる方法は、初期胚に形成される心臓ないしは血管内へマイクロインジェクションすることであるのが好ましい。上記心臓ないしは血管は、孵卵開始から２４時間以降の初期胚に形成されるものであることが好ましい。マイクロインジェクションする複製能欠失型レトロウイルスベクターの活性は、１×１０^７ｃｆｕ／ｍｌ以上のタイターであることが好ましく、１×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ以上のタイターであることがより好ましく、１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ以上のタイターであることが更に好ましい。上記レトロウイルスベクターは、モロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス由来ベクターであることが好ましく、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプであることが好ましい。本発明で作製するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類は、ニワトリまたはウズラであることが好ましい。上記複製能欠失型レトロウイルスベクターに組み込まれる導入遺伝子は、レトロウイルスに由来しない遺伝子配列を含有することが好ましい。上記レトロウイルスに由来しない遺伝子配列は、ニワトリβ−アクチンプロモーターにより制御されている遺伝子配列であることが好ましく、抗体遺伝子又は融合タンパク遺伝子をコードする遺伝子配列であることが好ましい。上記抗体遺伝子は、キメラ抗体遺伝子であることが好ましく、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体遺伝子であることが好ましい。
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法で作製されたＧ０トランスジェニックキメラ鳥類もまた、本発明の１つである。

図１は、複製能欠失型レトロウイルスベクターのベクターコンストラクトｐＭＳＣＶＮΔＡβの構造を示す。Ｎｅｏ^ｒはネオマイシン耐性遺伝子を、Ａｍｐ^ｒはアンピシリン耐性遺伝子を示す。Ｐ_ΔＡｃｔはβ−アクチンプロモーター遺伝子を示す。β−Ｇａｌはβ−ガラクトシダーゼ発現遺伝子を示す。Ψ＋はパッケージングシグナル配列を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはそれぞれＭｏＭＬＶのロングターミナルリピート配列を示す。
図２は、Ｇ０トランスジェニックキメラウズラにおける、遺伝子の導入時期とβ−ガラクトシダーゼ活性発現との関係を示す。横軸は孵卵時間（ｈｒ）を、縦軸はｍＵｎｉｔ／ｍｇで表されるβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。
図３は、Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリにおける、遺伝子の導入時期とβ−ガラクトシダーゼ活性発現との関係を示す。横軸は孵卵時間（ｈｒ）を、縦軸はｍＵｎｉｔ／ｍｇで表されるβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。
図４は、導入したレトロウイルスベクターのタイターとＧ０トランスジェニックキメラウズラでのβ−ガラクトシダーゼ活性発現との関係を示す。横軸はｃｆｕ／ｍｌで表されるウイルスタイターを、縦軸はｍＵｎｉｔ／ｍｇで表されるβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。
図５は、導入したレトロウイルスベクターのタイターとＧ０トランスジェニックキメラニワトリでのβ−ガラクトシダーゼ活性発現との関係を示す。横軸はｃｆｕ／ｍｌで表されるウイルスタイターを、縦軸はｍＵｎｉｔ／ｍｇで表されるβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。
図６は、ウズラ卵中に蓄積したヒトＩｇＧ抗体を示す。抗体値は３羽のウズラで行った同一の実験結果の平均値を示している。
図７は、ニワトリ卵中に蓄積したヒトＩｇＧ抗体を示す。抗体値は３羽のニワトリで行った同一の実験結果の平均値を示している。
図８は、ウズラ卵中に蓄積したＦａｂフラグメントを示す。抗体値は３羽のウズラで行った同一の実験結果の平均値を示している。
図９は、ニワトリ卵中に蓄積したＦａｂフラグメントを示す。抗体値は３羽のニワトリで行った同一の実験結果の平均値を示している。
図１０は、ウズラ卵中に蓄積したＦｃフラグメントを示す。抗体値は３羽のウズラで行った同一の実験結果の平均値を示している。
図１１は、ニワトリ卵中に蓄積したＦｃフラグメントを示す。抗体値は３羽のニワトリで行った同一の実験結果の平均値を示している。
図１２は、抗ＣＤ２抗体発現ベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬ（図１２（Ａ））、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＨ（図１２（Ｂ））及びｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨ（図１２（Ｃ））の構造を示す。Ａｍｐ^ｒはアンピシリン耐性遺伝子を示す。Ｐ_ΔＡｃｔはβ−アクチンプロモーター遺伝子を示す。Ψ＋はパッケージングシグナル配列を示す。ＧＦＰはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子を示す。Ｌは抗ＣＤ２抗体軽鎖遺伝子を示す。Ｈは抗ＣＤ２抗体重鎖遺伝子を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはそれぞれＭｏＭＬＶのロングターミナルリピート配列を示す。
図１３は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体発現ベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃの構造を示す。Ａｍｐ^ｒはアンピシリン耐性遺伝子を示す。Ｐ_ΔＡｃｔはβ−アクチンプロモーター遺伝子を示す。Ψ＋はパッケージングシグナル配列を示す。ＧＦＰはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子を示す。ｓｃＦｖ−ＦｃはｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体遺伝子を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはそれぞれＭｏＭＬＶのロングターミナルリピート配列を示す。
図１４は、Ｇ０トランスジェニックキメラウズラ血清中に発現したｓｃＦｖ−Ｆｃ量を示す。横軸は個体番号、縦軸はｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。
図１５は、Ｇ０トランスジェニックウズラ卵中に発現したｓｃＦｖ−Ｆｃ量をしめす。横軸は産卵開始からの採卵日、縦軸はｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。
図１６は、精製したｓｃＦｖ−ＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果を示す。レーン１は低分子量マーカー（ＬＭＷ）を、レーン４は高分子量マーカー（ＨＭＷ）を示す。レーン２は還元処理したｓｃＦｖ−Ｆｃを、レーン３は還元処理していないｓｃＦｖ−Ｆｃを電気泳動した結果を示す。
発明の詳細な開示
以下に本発明を詳述する。
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類は、複製能欠失型レトロウイルスベクターによって外来性抗体遺伝子が導入された鳥類であって、導入遺伝子に由来する抗体を、血中、卵白中あるいは卵黄中に産生することを特徴とする。
本発明で使用する鳥類としては、特に限定されず、例えばニワトリ、七面鳥、カモ、ダチョウ、ウズラなど、食肉、採卵目的で家畜化されている家禽鳥類や愛玩用鳥類を挙げることができる。なかでもニワトリやウズラは入手が容易で、産卵種としても多産である点が好ましい。
本発明で使用されるレトロウイルスベクターとしては、モロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、エビアン・ロイコシス・ウイルス（ＡＬＶ）等に由来するベクターが挙げられる。なかでもＭｏＭＬＶに由来するものが好ましいが、本発明はこれに限定されるものではない。
安全性を考慮し、遺伝子導入ベクターとして用いられるウイルスは、通常ウイルス粒子の複製に必要な３種の遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖのうちのいずれか又は全てを欠くことにより、自己複製能を欠失したウイルスが用いられる。鳥類細胞にこのウイルスベクターを効率的に感染させるため、外皮タンパク質を人工的にＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス由来）シュードタイプとしたウイルスベクターが好ましいが、本発明はこのウイルスタイプに限定されるものではない。
パッケージング細胞またはヘルパーウイルス等を利用することにより調製されたシュードタイプのウイルスベクターは、通常のマイクロインジェクション法（Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ，Ｒ．Ａら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３、５３３）により、初期胚、血管内、心臓内へ導入される。遺伝子導入法としては、この他にもリポフェクションやエレクトロポレーション法等が考えられる。
本発明により鳥類に導入される遺伝子は特に限定されないが、マーカー遺伝子や目的タンパク質を発現するための構造遺伝子、これらの遺伝子発現をコントロールするプロモーター遺伝子、分泌シグナル遺伝子等により構成される。
上記マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、β−ガラクトシターゼ遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ（グリーン・フロオロレッセント・プロテイン）等をコードした遺伝子が挙げられる。
上記目的タンパク質を発現するための構造遺伝子としては特に制限されず、ヒトモノクローナル抗体など遺伝子産業上有用な抗体、酵素等をコードした遺伝子などが挙げられる。また、その他の有用生理活性物質の遺伝子を用いることもできる。特に、卵中での蓄積がよいことから、ヒトＩｇＧクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子、ヒトＩｇＧ１のサブクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子、ウズラＩｇＧ、ニワトリＩｇＧやマウスＩｇＧの定常領域をもつ抗体の遺伝子など外来性抗体の構造遺伝子が好ましい。
また好ましい上記構造遺伝子としては、キメラ抗体の構造遺伝子が挙げられる。
キメラ抗体とは、２種以上の異なる遺伝形質から構成される抗体のことをいう。
従来、マウスハイブリドーマによって作製された医療用抗体はマウス由来であるため、ヒト体内に投与されると免疫系による拒絶反応が引き起こされるという問題があった。上記キメラ抗体としては、例えば、抗ヒトＣＤ２抗体、抗ＣＤ２０受容体抗体、抗ＴＮＦ抗体など、当該欠点を改良し、マウス抗体のうち抗原タンパク質と結合する領域以外をヒト抗体で置き換え、拒絶反応をなくしたキメラ抗体が挙げられ、すでに医薬品として上市されているものもある。
さらに好ましい上記構造遺伝子としては、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体の構造遺伝子が挙げられる。
医療用の組換え抗体には、低分子抗体と称される一群がある。免疫グロブリンＩｇＧには直接抗原と結合する可変領域（Ｆｖ：Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｅｏｎ）と呼ばれるＶＨ、ＶＬのヘテロ二量体からなるドメインがあり、このＦｖドメインはＩｇＧの約５分の１の分子量でありながら、単独で充分な抗原結合能を持つ。ＶＨ、ＶＬドメイン間を人工的にペプチドリンカーで結合したものが１本鎖抗体（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）と呼ばれる低分子抗体で、ＶＨ、ＶＬ単独よりも安定性が向上することが知られていた。
Ｐｏｗｅｒｓら（Ｐｏｗｅｒｓ，Ｄ．Ｂら（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄ．２５１，１２３）は、このｓｃＦｖにヒトＩｇＧ１に由来するＦｃ部を融合させることで、血中での安定性が増すことを見出した。このｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体は医療用として有用と考えられるが、安価な大量生産システムである大腸菌では生産されない。
他の好ましい上記遺伝子配列として、融合タンパクの構造遺伝子が挙げられる。
遺伝子組み換えにより２種あるいはそれ以上のタンパクの一部を融合させた人工的な一群のタンパクは融合タンパクと称され、医薬品として実用化されているものに、ＴＮＦ受容体に免疫グロブリンのＦｃを融合させたＴＮＦＲ−ＦｃやＬＦＡ３にＦｃを融合させたＬＦＡ３−Ｆｃなどがある。これらはＦｃを融合させることで可溶化され、より強力な生理活性をもつように設計された人工タンパクである。
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類において、鳥類に導入される遺伝子として、これらヒトモノクローナル抗体遺伝子、キメラ抗体遺伝子、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体遺伝子を使用することにより、従来生産が困難だった抗体医薬品を安価に大量生産できる。
例えば、キメラ抗体遺伝子を導入したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の場合、血液中の抗体含有量は、好ましくは０．５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは５μｇ／ｍｌ以上である。また、卵白中の抗体含有量は、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１μｇ／ｍｌ以上であり、卵黄中の抗体含有量は、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１μｇ／ｍｌ以上である。
また、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体遺伝子を導入したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の場合、血液中の抗体含有量は、好ましくは２０μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは２０００μｇ／ｍｌ以上である。また、卵白中の抗体含有量は、好ましくは５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは５００μｇ／ｍｌ以上である。卵黄中の抗体含有量は、好ましくは５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは５００μｇ／ｍｌ以上である。
上記プロモーター遺伝子としては、構成的なプロモーターが挙げられる。抗体遺伝子が構成的なプロモーターにより制御されている場合、抗体遺伝子発現が安定してよいので好ましい。より好ましい構成的なプロモーターとして、ニワトリβ−アクチンプロモーターが挙げられる。
本発明の抗体の生産法は、本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を作成し、上記Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類の血中及び／又は卵中から抗体を回収することを特徴とする。
次に本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法について説明する。
当該作製法の１つとして、鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚へ複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させる作製法が挙げられる。また、鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始から２４時間以降の初期胚へ複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させる作製法も、本発明の作製法の１つとして挙げられる。
より好ましくは、上記初期胚に形成される心臓ないしは血管内へ、複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションする方法である。
つまり、本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法は、放卵後特定の時間経過した受精卵に複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションすることよりなる。放卵後の受精卵の初期発生についてニワトリを例にとると、まず輸卵管内で受精した卵は、受精後約１．５時間で卵割を開始する。細胞質がつながったまま盤割が始まった卵は、１日かけて体外に放出される間に分裂し、約６万個の細胞からなる胚盤葉と呼ばれる胚になる（胚盤葉期）。この胚盤葉は、卵黄中央部の直径３〜４ｍｍの白いリングとして観察される。この胚は、上層と下層に分裂し、割腔を形成する。放卵は胚盤葉下層が形成されるころに起こり、原条が形成され、胚盤葉は上、中、下の三重構造を取り、三胚葉が形成される。その後、胚の形成、成長を経て、排卵から２２日目に孵化する。胚盤葉期は、ステージＸとも呼ばれ、この時期の細胞の一部から生殖細胞が生じることから、従来は遺伝子導入の対象としてこの時期の受精卵を使用している。
本発明においては、放卵直後、胚盤葉期の受精卵を孵化条件、例えばニワトリならば３７．７〜３７．８℃、湿度５０〜７０％程度の孵化に適した環境条件においた時間を０時間とし、これを孵卵開始時として、経時的に各種の処置を行った。ウズラでは孵卵開始から３６時間後、ニワトリでは孵卵開始後５０時間頃から、卵黄上に血管系の形成が観察され、心臓に分化する器官の脈動が観察できた。
上述の遺伝子を導入した受精卵の孵化には、本発明者らが開発した人工卵殻による方法（Ｋａｍｉｈｉｒａ，Ｍ．ら（１９９８）Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．，４０，４４９）等が応用できる。
本発明の作製法において使用する複製能欠失型レトロウイルスベクター、導入する遺伝子、遺伝子導入鳥類としては、上述したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類と同様のものが挙げられる。
上記複製能欠失型レトロウイルスベクターに組み込まれる導入遺伝子は、レトロウイルスに由来しない遺伝子配列を含有することが好ましい。なお本発明の作製法において、「レトロウイルスに由来しない遺伝子」としては、上述した構造遺伝子、プロモーター遺伝子、分泌シグナル遺伝子等が挙げられる。上記レトロウイルスに由来しない遺伝子配列は、ニワトリβ−アクチンプロモーターにより制御されている遺伝子配列であることが好ましく、抗体遺伝子又は融合タンパク遺伝子をコードする遺伝子配列であることが好ましい。
本発明の作製法では、１×１０^７ｃｆｕ／ｍｌ以上、好ましくは１×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ以上、より好ましくは１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ以上のタイターを持つ複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションすることが、遺伝子を効率よく導入できる点で好ましい。
本発明の作製法で受精卵に遺伝子を導入された鳥類は、その体細胞にモザイク状に導入遺伝子をもったトランスジェニック鳥類として成長する。この一世代目の遺伝子導入鳥類をＧ０トランスジェニックキメラ鳥類と呼ぶ。
このような本発明の作製法によって得られるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類も、本発明の１つである。
Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類と非トランスジェニック鳥類、あるいはＧ０トランスジェニックキメラ鳥類同士を交配させて誕生する二世代目、三世代目が導入遺伝子を染色体にもつ生殖細胞から発生した場合、全身の体細胞に導入遺伝子を含有する個体として成長する。Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類個体から導入遺伝子を受け継ぐ子孫を、代々Ｇ１〜Ｇ２〜Ｇ３トランスジェニック鳥類と称する。
本発明によるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を同種の非トランスジェニック鳥類あるいは配偶型Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類と交配させることにより、導入遺伝子を子孫に伝播させることができるとともに、全身の体細胞に導入遺伝子をもつ完全なトランスジェニック鳥類を作製できる。完全なトランスジェニック鳥類は、導入遺伝子をもつ体細胞の割合が多いことから、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類に比べ、導入遺伝子に由来する組換えタンパク質の産生量が増加することが期待できる。更に、安定的に導入遺伝子を伝播するトランスジェニック鳥類の系統を確立することで、タンパク質産生システムとしての品質の安定化が可能である。

以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
（実施例１）β−ガラクトシダーゼ発現ベクターコンストラクトの調製
β−ガラクトシダーゼ発現ベクターコンストラクトｐＭＳＣＶＮΔＡβは、以下のように作製した。
１．プラスミドｐＬＸＲＮ（クロンテック社製）からラウス・ザルコーマ・ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）のＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ＲＳＶを作製した。
２．プラスミドｐＣＭＶβ（クロンテック社製）からβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩによって切り出し、プラスミドｐＺｅｏＳＶ２（＋）（インビトロジェン社製）のＮｏｔＩサイトへ挿入した。Ｔ７プロモーターと同方向にβ−Ｇａｌ遺伝子が挿入された構造のプラスミドをｐＺｅｏ／ｌａｃＺとした。
３．ｐＢｌｕｅ／ＲＳＶからＲＳＶプロモーター断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＰｓｔＩによって切り出した。ｐＺｅｏ／ｌａｃＺからβ−Ｇａｌ遺伝子断片を制限酵素ＰｓｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出した。制限酵素ＸｈｏＩによって処理したプラスミドｐＬＮＨＸ（クロンテック社製）のベクター断片に上記切り出した２断片を連結し、プラスミドｐＬＮＲβを作製した。
４．ｐＬＮＨＸから一連のモロニー・ミューリン・ザルコーマ・ウイルス（ＭｏＭｕＳＶ）５’−ロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）、ウイルス・パッケージング・シグナル及びネオマイシン耐性（Ｎｅｏ^ｒ）遺伝子を含む断片を、制限酵素ＳａｃＩＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、制限酵素ＳａｃＩＩ及びＸｈｏＩによって処理したｐＬＸＲＮのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＸＬを作製した。
５．ｐＺｅｏ／ｌａｃＺからβ−Ｇａｌ遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩによって処理したｐＬＸＬのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＺＬを作製した。
６．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｇｇｔｃｔａｇａｇｇａａｔｔｃａｇｔｇｇｔｔｃｇ−３’（配列番号１）及び５’−ｃｃａｇｇａｔｃｃｇａｃｇｔｔｇｔａａａａｃｇａｃｇ−３’（配列番号２；下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→５５℃／３０秒→７２℃／１分３０秒：３５サイクル；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製））により、プラスミドｐＭｉｗＺ（Ｓｕｅｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆ．Ｄｅｖ．２９：１８１−１８５）からＲＳＶプロモーターとニワトリβアクチン（Ａｃｔ）プロモーターのハイブリッドプロモーター（Ｍｉｗプロモーター）の５’領域断片を増幅後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＭｕｎＩによって切り出し、プラスミドｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ−１（ギブコＢＲＬ社製）のＢａｍＨＩ、ＭｕｎＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＧｍｉｗ５’を作製した。
７．ｐＭｉｗＺからＭｉｗプロモーター５’側中央領域断片を制限酵素ＭｕｎＩ及びＣｌａＩによって切り出し、ｐＧｍｉｗ５’のＭｕｎＩ、ＣｌａＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＧｍｉｗ５’−２を作製した。
８．ｐＧｍｉｗ５’−２からＭｉｗプロモーター５’領域及び５’側中央領域を含む断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／Ｍｉｗ５’を作製した。
９．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｃａａａｇｃｔｔｇｃｃｇｃａｇｃｃａｔｔｇｃｃｔｔｔｔ−３’（配列番号３；下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｔａｃｃｔａｇｇｇｇｃｔｇｇｃｔｇｃｇｇａｇｇａａｃ−３’（配列番号４；下線部はＢｌｎＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９８℃／１５秒→６０℃／３０秒→７２℃／３０秒：３５サイクル）によりｐＭｉｗＺからＭｉｗプロモーター３’領域断片を増幅後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｌｎＩによって切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｌｎＩによって処理したｐＬＸＬのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＭｉｗ３’を作製した。
１０．ｐＭｉｗＺからＭｉｗプロモーター３’側中央領域断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＭｂｏＩＩによって切り出した。ｐＬＭｉｗ３’からＭｉｗプロモーター３’領域断片を制限酵素ＭｂｏＩＩ及びＫｐｎＩによって切り出した。ｐＢｌｕｅ／Ｍｉｗ５’のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩサイトへ上記切り出した２断片を挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／Ｍｉｗを作製した。
１１．ｐＢｌｕｅ／ＭｉｗからＭｉｗプロモーター全長を含む断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｌｎＩによって切り出し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｌｎＩによって処理したｐＬＸＬのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＭＬを作製した。
１２．ｐＬＭＬからＡｃｔプロモーター断片を制限酵素ＳｍａＩ及びＸｂａＩで切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＥｃｏＲＶ、ＸｂａＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／Ａｃｔを作製した。
１３．ｐＬＭＬからＭｉｗプロモーター断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩによって切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって処理したｐＬＺＬのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＭβＬを作製した。
１４．ｐＢｌｕｅ／ＡｃｔからＡｃｔプロモーター断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＢｌｎＩによって切り出した。ｐＬＭβＬからβ−Ｇａｌ遺伝子断片を制限酵素ＢｌｎＩ及びＢｇｌＩＩによって切り出した。制限酵素ＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩによって処理したｐＬＮＲβのベクター断片に上記切り出した２断片を連結し、プラスミドｐＬＮＡβを作製した。
１５．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｔｔｔａｇｃｔａｇｃｔｇｃａｇｃｔｃａｇｔｇｃａｔｇｃａｃ−３’（配列番号５；下線部はＮｈｅＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｔａａｔｃｔａｇａａａｃｇｃａｇｃｇａｃｔｃｃｃｇｃ−３’（配列番号６；下線部はＸｂａＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９８℃／１５秒→６０℃／３０秒→６８℃／２分：３０サイクル）によりｐＭｉｗＺからイントロン欠失アクチン（ΔＡｃｔ）プロモーター断片を増幅後、制限酵素ＸｈｏＩ（ＸｈｏＩ制限酵素サイトは増幅断片中に存在）及びＸｂａＩによってΔＡｃｔプロモーターの一部を含む断片を切り出した。ΔＡｃｔプロモーターの残りの部分とβ−Ｇａｌ遺伝子を含む断片をｐＬＮＡβから制限酵素ＢｌｎＩ及びＢｇｌＩＩによって切り出した。制限酵素ＸｂａＩ及びＢｇｌＩＩによって処理したｐＬＮＡβのベクター断片に上記切り出した２断片を連結し、プラスミドｐＬＮΔＡβを作製した。
１６．ｐＬＮΔＡβから一連のＮｅｏ^ｒ遺伝子、ΔＡｃｔプロモーター、及びβ−Ｇａｌ遺伝子を含む断片を制限酵素ＢｌｎＩ及びＢｇｌＩＩによって切り出し、制限酵素ＢｌｎＩ及びＢｇｌＩＩによって処理したｐＬＸＬのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＮΔＡβ−２を作製した。
１７．ｐＬＮΔＡβ−２から一連のＮｅｏ^ｒ遺伝子、ΔＡｃｔプロモーター、及びβ−Ｇａｌ遺伝子を含む断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩによって切り出し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩによって処理したプラスミドｐＭＳＣＶｎｅｏ（クロンテック社製）のベクター断片に連結した。ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩサイトが消失したプラスミドをｐＭＳＣＶＮΔＡβとした。
このように作製した複製能欠失型レトロウイルスベクターのベクターコンストラクトｐＭＳＣＶＮΔＡβの構造を図１に示した。
（実施例２）β−ガラクトシダーゼ発現レトロウイルスベクターの調製
実施例１で作製したベクターコンストラクトｐＭＳＣＶＮΔＡβよりレトロウイルスベクターを調製するため、パッケージング細胞ＧＰ２９３（クロンテック社製）を直径１００ｍｍの培養ディッシュに５×１０^６細胞植え、培養した。培地を新鮮なＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）に交換し、ｐ−ＶＳＶ−Ｇベクター（クロンテック社製）８μｇとｐＭＳＣＶＮΔＡβ８μｇをリポフェクション法により前記ＧＰ２９３細胞に導入した。４８時間後、ウイルス粒子を含む培養上清を回収し、０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（アドバンテック社製）を通して、夾雑物を除去した。得られた溶液にポリブレン（シグマ社製）を１０μｇ／ｍｌとなるように加えウイルス液とした。
調製したウイルス液を別に培養したＧＰ２９３細胞に加え、４８時間培養後、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を含む培養液で植え継ぎ、Ｇ４１８安定形質転換ＧＰ２９３株を取得した。
得られた安定形質転換株を８０％コンフルエントとなるよう直径１００ｍｍディッシュに培養し、１６μｇのｐＶＳＶ−Ｇベクターをリポフェクション法で導入した。４８時間後ウイルス粒子を含む培養上清１２ｍｌを回収した。
この培養上清を５０，０００×ｇ、４℃で１．５時間遠心を行い、ウイルスを沈殿させた。上清を除き、ウイルス粒子を含む沈殿物に５０μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加え、４℃で一晩放置後、よく懸濁してウイルス溶液を回収した。このようにして得られた高タイターウイルスベクターは、１０^８〜１０^９ｃｆｕ／ｍｌであった。
ウイルスタイターの測定は、以下のように行った。測定の前日にＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を直径３５ｍｍのディッシュに７×１０^４細胞植え、培養した。１０^２〜１０^６倍に希釈したウイルス溶液を各ディッシュに１ｍｌ加え、４８時間後に蛍光顕微鏡によりＧＦＰ（グリーン・フルオレッセント・プロテイン）を発現している細胞の割合を測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。
ウイルスタイター＝細胞数×希釈率×発現割合 （ｃｆｕ／ｍｌ）
（実施例３）ウズラ胚へのレトロウイルスベクターのインジェクション
ＷＥ系統のウズラ受精卵（日本生物科学研究所）を使用した。この受精卵を自動転卵装置が内蔵された孵卵器（昭和フランキ社製Ｐ−００８型）内で３７．９℃、湿度６５％環境に置いた時刻を孵卵開始時刻（０時間）とし、以後１５分毎に９０度転卵しながら孵卵を行った。
孵卵開始時、受精卵の卵殻を７０％エタノールで消毒し、鋭端部を直径２ｃｍの円形にダイヤモンドカッター（ＭＩＮＩＭＯ７Ｃ７１０、ミニター社製）で切り取り、胚を露出させた。胚盤葉を実体顕微鏡で観察しながら、ガラス管（ＣＤ−１、オリンパス社製）をマイクロピペット製作器（ＰＣ−１０、オリンパス社製）で加工し、外径約２０μｍとなるよう先端を折って作製した針を刺し、マイクロインジェクター（Ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ５２４６、エッペンドルフ社製）を用いて、胚盤下腔の中央に実施例２で調製したウイルス溶液約２μｌを微量注入した。この卵殻の切り口まで卵白を満たした後、卵白を糊としてテフロン膜（ミリラップ、ミリポア社製）とポリ塩化ビニリデンラップ（サランラップ、旭化成社製）とで蓋をし、１５分毎に９０度転卵しながら孵卵を行った。
孵卵開始から１２時間後、２４時間後の受精卵に同様の方法でウイルスを注入した。孵卵後約３６時間目から卵黄表面に血管の発生が認められ、その一部が脈動して心臓の原基となることが実体顕微鏡で観察できる。孵卵後３６時間、４８時間、５５時間の心臓内へ、実施例２で調製したウイルス溶液２μｌをマイクロインジェクターにより微量注入した。
（実施例４）ニワトリ胚へのレトロウイルスベクターのインジェクション
ニワトリ受精卵（日本生物科学研究所）を使用した。この受精卵を自動転卵装置が内蔵された孵卵器（昭和フランキ社製Ｐ−００８型）内で３７．９℃、湿度６５％環境に置いた時刻を孵卵開始時刻（０時間）とし、以後１５分毎に９０度転卵しながら孵卵を行った。
孵卵開始時、受精卵の卵殻を７０％エタノールで消毒し、鋭端部を直径３．５ｃｍの円形にダイヤモンドカッター（ＭＩＮＩＭＯ７Ｃ７１０、ミニター社製）で切り取り、胚を露出させた。胚盤葉を実体顕微鏡で観察しながら、ガラス管（ＣＤ−１、オリンパス社製）をマイクロピペット製作器（ＰＣ−１０、オリンパス社製）で加工し、外径約２０μｍとなるよう先端を折って作製した針を刺し、マイクロインジェクター（Ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ５２４６、エッペンドルフ社製）を用いて胚盤下腔の中央に、実施例２で調製したウイルス溶液約２μｌを微量注入した。この卵殻の切り口まで卵白を満たした後、卵白を糊としてテフロン膜（ミリラップ、ミリポア社製）とポリ塩化ビニリデンラップ（サランラップ、旭化成社製）とで蓋をし、１５分毎に９０度転卵しながら孵卵を行った。
孵卵開始から１２時間後、２４時間後の受精卵を同様に処理した。孵卵後約５０時間目から卵黄表面に血管の発生が認められ、その一部が脈動して心臓の原基となることが実体顕微鏡で観察できる。孵卵後５０時間、５５時間、６０時間の心臓内へ、実施例２で調製したウイルス溶液２μｌをマイクロインジェクターにより微量注入した。
（実施例５）β−ガラクトシダーゼ活性測定
孵卵開始から１１５時間後、胚を卵殻より取り出しＰＢＳ（リン酸緩衝液）にて洗浄し、胚をとり囲む膜を取り除いた。摘出した胚を細かくせん断し、０．８ｍｌの反応バッファー（１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬工業製）、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール（和光純薬工業製）、２ｍＭ リン酸バッファー ｐＨ７．５）を加えて超音波破砕し、細胞液を得た。
０．６ｍｌの細胞液を、３７℃で１０分間インキュベートし、あらかじめ暖めておいた４ｍｇ／ｍｌのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）（シグマ社製）を０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解した液０．１ｍｌを添加した。反応後０．３ｍｌの１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３（和光純薬工業製）を加え、吸光度計にて４２０ｎｍの波長強度を計測した。
β−ガラクトシダーゼの活性はＯＮＰＧｕｎｉｔで表した（１ｕｎｉｔ：１μｍｏｌのｏ−ニトロフェノールが１分間に生成されるときの活性）。３回実験を行い、その平均値をβ−ガラクトシダーゼ活性とした。
ニワトリおよびウズラの、遺伝子導入時期とβ−ガラクトシダーゼ活性測定結果との関係を図２、図３に示した。ウズラでは孵卵後４８時間後、ニワトリでは孵卵後５５時間後に導入したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、それ以前の時期に導入されたものに比べ、強く発現した。これは鳥類受精卵が、レトロウイルスによる外来遺伝子を不活性化する（サイレンシング）メカニズムが受精直後に顕著であり、時間を経るごとに弱くなっていくことを示唆する。このことから、鳥類の種類によって決まる特定の時間経過した受精卵に目的遺伝子を導入することで、不活性化されることなく効率的に導入遺伝子を発現するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製が可能になる。
（実施例６）ウイルスタイターによる遺伝子発現の効率
実施例２で調製した１×１０^８ｃｆｕ／ｍｌのウイルス液を、希釈溶媒（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液）で１０倍、１００倍、１０００倍に３段階希釈し、１×１０^７、１×１０^６、１×１０^５ｃｆｕ／ｍｌのタイター・ウイルス溶液とした。ウズラ受精卵を孵卵し、４８時間後の発生初期心臓に、調製したウイルス液２μｌをマイクロインジェクションした。同様にして４８時間後の発生初期心臓に希釈溶媒のみを２μｌインジェクションしたものを対照とした。
孵卵開始から１１５時間後、実施例５に準じてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。ウズラでのウイルスタイターと遺伝子発現結果との関係を図４に示した。
同様にニワトリ受精卵を孵卵し、５５時間後の発生初期心臓に、調製したウイルス液２μｌをマイクロインジェクションした。５５時間後の発生初期心臓に希釈溶媒のみを２μｌインジェクションしたものを対照とした。
孵卵開始から１１５時間後、実施例５に準じてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。ニワトリでのウイルスタイターと遺伝子発現結果との関係を図５に示した。
１×１０^８ｃｆｕ／ｍｌのウイルスが注入されたウズラおよびニワトリで顕著なβ−ガラクトシダーゼ活性が確認され、それ以下の濃度では発現量は低かった。導入遺伝子の発現にはウイルスタイターが大きく影響すること、すなわち本発明によるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類で、導入遺伝子を効率的に発現させるためには高タイターの複製能欠失型ベクターを使用するのが有効であるということが示唆された。
（実施例７）ヒト抗体のウズラ、ニワトリ卵内への移行性
３種のサブクラスをもつヒト抗体（ＩｇＧ１、２、３）（コスモバイオ社製）を混合したもの、および対応する３種の抗体フラグメント（Ｆａｂ−１、Ｆａｂ−２、Ｆａｂ−３、Ｆｃ−１、Ｆｃ−２、Ｆｃ−３）（コスモバイオ社製）を１００μｇ／ｍｌとなるようＰＢＳで希釈し、希釈液１００μｌをウズラ成鳥（３羽）またはニワトリ成鳥（３羽）の翼下静脈に注射した。
抗体を静脈に注射した翌日から２０日目まで採卵を行い、卵中に移行した抗体を定量した。卵黄は５０％（Ｗ／Ｖ）、卵白は１０％（Ｖ／Ｖ）となるようＰＢＳを用いて希釈し、凍結保存して測定用サンプルとした。
（実施例８）ＥＬＩＳＡ法による卵黄中抗体の定量
ＰＢＳで希釈した抗ヒトＩｇＧ抗体（コスモバイオ社製）をＥＬＩＳＡプレートに１００μｇ／ｗｅｌｌ入れて、４℃で一晩静置した。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を２００μｌで各ｗｅｌｌを３回洗浄した後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液−２％スキムミルクを１５０μｌ／ｗｅｌｌ入れた。
室温で２時間静置後、ｗｅｌｌを２００μｌのＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で３回洗浄し、採取した血液、卵白、卵黄サンプルを１２０μｌ入れ、４℃で一晩静置した。このＥＬＩＳＡプレートを室温に戻した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液で３回各ｗｅｌｌを洗浄し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で希釈したＰｅｒｏｘｉｄｅ（ＰＯＤ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体（コスモバイオ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ入れて、室温で１時間静置した。
ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液でｗｅｌｌを４回洗浄し、発色液（１０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン（片山化学工業製）を１ｍｌのメタノールに溶解し、蒸留水で１００ｍｌとしたものに、１０μｌの過酸化水素水（和光純薬工業製）を加えて調製した）１００μｌをｗｅｌｌに加えた。８Ｍ硫酸を５０μｌ添加して反応を止め、４９０ｎｍの蛍光強度をプレートリーダーで測定して、標準検量線から濃度を計算した。ウズラ、ニワトリ各々３羽から得られたサンプルの抗体濃度を平均したものを結果とした。
標準検量線作製のための標準抗体（コスモバイオ社製）は、５０％卵黄−ＰＢＳ（Ｗ／Ｖ）で希釈した。
ウズラおよびニワトリの卵中に蓄積された抗体濃度を図６、７に示した。ウズラおよびニワトリの卵中に蓄積されたＦａｂ，Ｆｃフラグメント濃度を図８、９、１０、１１に示した。
ウズラ、ニワトリにおいて、ヒトＩｇＧ抗体、サブクラスではヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ１が効率よく卵中に蓄積されることが示された。またＦｃフラグメントが卵内への高い移行性を示したことから、ヒトＩｇＧの移行はＦｃレセプターを介したものであることが示唆された。
（実施例９）抗ＣＤ２抗体発現ベクターコンストラクトの作製
抗ＣＤ２抗体発現用ベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＨ、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬ及びｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨは、以下のように作製した。
１．ヒト抗体（ＩｇＭ）産生ハイブリドーマ細胞Ｄ２５３−１５−６（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＨＢ−８７８９）からＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）を用いてｍＲＮＡを取得し、得られたｍＲＮＡからＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）を用いてｃＤＮＡライブラリを調製した。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｔｃｃｔｃｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇ−３’（配列番号７；下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）及び５’−ｃｃｃｇｇａｔｃｃｃｔａａｃａｃｔｃｔｃｃｃｃｔｇｔｔｇａａｇｃｔ−３’（配列番号８；下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１分→５０℃／１分→７２℃／１分３０秒：２５サイクル；Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社製））により上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｌ鎖κ定常領域（ｈＣκ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（ストラタジーン社製）のＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＣκを作製した。
２．同様にして、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｇｃｇｇｃｃｇｃｔａｃａｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｇａｃａｔｃｇｔｇａｔｇａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃ−３’（配列番号９；下線部はＮｏｔＩ制限酵素サイト）及び５’−ｃｃｔｃｔｃｇａｇｇａｔａｇａａｇｔｔａｔｔｃａｇｃａｇｇｃａｃａｃ−３’（配列番号１０；下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｌ鎖可変領域（ｈＶＬ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）のＮｏｔＩ、ＸｈｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＶＬを作製した。
３．同様にして、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｃｃｔｃｇａｇｃｇｔｇｇｃｃｇｔｔｇｇｃｔｇｃｃｔｃｇｃａｃａ−３’（配列番号１１；下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｃｔａａｇｃｔｔａｃｇｔｔｇｔａｃａｇｇｇｔｇｇｇｔｔｔａｃｃ−３’（配列番号１２；下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｈ鎖μ定常領域（ｈＣμ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）のＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＣμを作製した。
４．同様にして、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｇｃｇｇｃｃｇｃｔａｃａｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｔｃｔｇｇ−３’（配列番号１３；下線部はＮｏｔＩ制限酵素サイト）及び５’−ｃａｃｇｃｔｃｇａｇｇｔａｔｃｃｇａｃｇｇｇｇａａｔｔｃｔｃａｃａｇｇａ−３’（配列番号１４；下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｈ鎖可変領域（ｈＶＨ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）のＮｏｔＩ、ＸｈｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＶＨを作製した。
５．ｐＢｌｕｅ／ｈＣκからｈＣκ遺伝子断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、プラスミドｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）のＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＥＰ４／ｈＣκを作製した。
６．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｃｃａａｇｃｔｔｇａｔｃｔｃｃａｃｔｇｇｇａｔｇｇｔｇｇｇｇｇｃｃｃｔｃｃｔｃｔｔｇｃｔｇｃｔｇ−３’（配列番号１５；下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）及び５’−ｃｃｃｇｇａｔｃｃｔｃａｇｔｃａａｇｇｃｇｃｃｔｔｃｇｃａｔｇａａｇａｇｇｃｃｇａｔｃｃｃｃａｇｇｇｃｃａｃｃａｃｃａｇｃａｇｃａａｇａｇｇａｇｇｇｃｃｃｃ−３’（配列番号１６；下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）を２１ｂｐｓにわたって相補的な３’末端でアニールさせ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いたＤＮＡ２重鎖合成反応によって上皮増殖因子受容体膜貫通領域（ＴＭ）の遺伝子断片を調製した。得られたＴＭ遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって処理後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩサイトに挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ＴＭを作製した。
７．ｐＢｌｕｅ／ｈＣμからｈＣμ遺伝子断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅ／ＴＭのＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＣμＴＭを作製した。
８．ｐＢｌｕｅ／ｈＣμＴＭから一連のｈＣμ遺伝子及びＴＭ遺伝子を含む断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、ｐＣＥＰ４のＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＥＰ４／ｈＣμＴＭを作製した。
９．ｐＣＥＰ４／ｈＣμＴＭを制限酵素ＢａｍＨＩによって切断し、末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑処理後、セルフライゲーションによりプラスミドｐＣＥＰ４／ｈＣμＴＭΔＢを作製した。
１０．化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｔｇａａｇａｃａｇａｔｇｇｃｇｃｃｇｃｃａｃａｇｔｔｃｇｔｔｔ−３’（配列番号１７；下線部はＮａｒＩ制限酵素サイト）を用いた部位特異的変異導入によりｐＢｌｕｅ／ｈＶＬが保有するｈＶＬの３’末端にアミノ酸暗号の変更を伴わずに制限酵素ＮａｒＩサイトを導入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＶＬＮを作製した。
１１．化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｔｇｇｇｇｃｇｇａｔｇｃｇｇａｔｃ ｃｔｇａｇｇａｇａｃｇｇｔ−３’（配列番号１８；下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）を用いた部位特異的変異導入によりｐＢｌｕｅ／ｈＶＨが保有するｈＶＨの３’末端にアミノ酸暗号の変更を伴わずに制限酵素ＢａｍＨＩサイトを導入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＶＨＢを作製した。
１２．抗ヒトＣＤ２マウス抗体産生ハイブリドーマ細胞ＴＳ２／１８．１．１（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＨＢ−１９５）からＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてｍＲＮＡを取得し、得られたｍＲＮＡからＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡライブラリを調製した。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔｃａｇｇｇａａａｇｔｔｔｇａａｇａｔｇ−３’（配列番号１９；下線部はＮｏｔＩ制限酵素サイト）及び５’−ｃｇｇｃｇｃｃｇｃｃａｃａｇｔｃｃｇｔｔｔｔａｔｔｔｃｃａｇｃｔｔｇｇｔ−３’（配列番号２０；下線部はＮａｒＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからマウス抗体Ｌ鎖可変領域（ｍＶＬ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＮａｒＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅ／ｈＶＬＮのＮｏｔＩ、ＮａｒＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｍＶＬを作製した。
１３．同様にして、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｇｃｇｇｃｃｇ ｃｇａａｃａｃｇｇａｍｃｃｃｔｃａｃｃａｔｇ−３’（配列番号２１；下線部はＮｏｔＩ制限酵素サイト）及び５’−ｃｇｇａｔｃｃｔｇｃａｇａｇａｃａｇｔｇａｃｃａｇａｇｔ−３’（配列番号２２；下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからマウス抗体Ｈ鎖可変領域（ｍＶＨ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）のＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｍＶＨを作製した。
１４．ｐＢｌｕｅ／ｍＶＬからｍＶＬ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＣＥＰ４／ｈＣκのＮｏｔＩ、ＸｈｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＥＰ４／ＩｇＬκを作製した。
１５．ｐＢｌｕｅ／ｈＶＨＢからｈＶＨ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＣＥＰ４／ｈＣμＴＭΔＢのＮｏｔＩ、ＸｈｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＥＰ４／ｈＩｇＨμＴＭを作製した。
１６．ｐＢｌｕｅ／ｍＶＨからｍＶＨ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩによって処理したｐＣＥＰ４／ｈＩｇＨμＴＭのベクター断片に連結し、プラスミドｐＣＥＰ４／ＩｇＨμＴＭを作製した。
１７．プラスミドｐＭＳＣＶｎｅｏ（クロンテック社製）から一連のミューリン・ホスホグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びＮｅｏ^ｒ遺伝子を含む断片を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩによって除去し、残ったベクター断片のセルフライゲーションによりプラスミドｐＭＳＣＶを作製した。
１８．プラスミドｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ−１（ギブコＢＲＬ社製）からＧＦＰ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩによって切り出し、ｐＺｅｏＳＶ２（＋）のＮｏｔＩサイトに挿入した。Ｔ７プロモーターと同方向にＧＦＰ遺伝子が挿入された構造のプラスミドをｐＺｅｏ／ＧＦＰとした。
１９．ｐＺｅｏ／ＧＦＰからＧＦＰ遺伝子断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩによって処理したｐＭＳＣＶのベクター断片に連結し、プラスミドｐＭＳＣＶ／Ｇを作製した。
２０．ヒト抗体（ＩｇＧ１）産生ミエローマ細胞ＩＭ−９（ジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソーシズ ００２４）からｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ロッシュ社製）を用いてｍＲＮＡを取得し、得られたｍＲＮＡからＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡライブラリを調製した。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃａａｇｃｔｔｃａａｇｇｇｃｃｃａｔ−３’（配列番号２３）及び５’−ａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａ−３’（配列番号２４）をプライマーとするＰＣＲ（９５℃／２分→５２℃／３０秒→７４℃／３分：３０サイクル；Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ社製））により上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｈ鎖γ１定常領域（ｈＣγ１）の遺伝子断片を増幅した。さらに、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｔａｇｇａｔｃｃｇｃｔａｇｃｔｔｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇ−３’（配列番号２５；下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｇｃａａｇｃｔｔｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａ−３’（配列番号２６；下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→５８℃／３０秒→６８℃／１分：３０サイクル；ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ）により上記ＰＣＲ産物からｈＣγ１遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＣγ１を作製した。
２１．ｐＣＥＰ４／ＩｇＨμＴＭからｍＶＨ遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって切り出した。ｐＢｌｕｅ／ｈＣγ１からｈＣγ１遺伝子断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出した。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって処理したプラスミドｐＥＴＢｌｕｅ−２（ノバジェン社製）のベクター断片に上記切り出した２断片を連結し、プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ／ＩｇＨγ１を作製した。
２２．ｐＥＴＢｌｕｅ／ＩｇＨγ１から抗体Ｈ鎖γ１（ＩｇＨγ１）の遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧのＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入した。ＧＦＰ遺伝子と同方向にＩｇＨγ１遺伝子が挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧＨとした。
２３．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｃｇｃｇｔｃｇａｃｇｔｇｃａｔｇｃａｃｇｃｔｃａｔｔｇ−３’（配列番号２７；下線部はＳａｌＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｃｇｃｇｔｃｇａｃａａｃｇｃａｇｃｇａｃｔｃｃｃｇ−３’（配列番号２８；下線部はＳａｌＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→５０℃／３０秒→６８℃／１分：１０サイクル；９４℃／１５秒→６２℃／３０秒→６８℃／１分：３０サイクル）によりｐＭｉｗＺからΔＡｃｔプロモーター断片を増幅後、制限酵素ＳａｌＩによってΔＡｃｔプロモーター断片を切り出し、ｐＥＴＢｌｕｅ−２のＳａｌＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ／ΔＡｃｔを作製した。
２４．ｐＥＴＢｌｕｅ／ΔＡｃｔからΔＡｃｔプロモーター断片を制限酵素ＳａｌＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧＨのＸｈｏＩサイトへ挿入した。ＩｇＨγ１遺伝子と同方向にΔＡｃｔプロモーターが挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＨとした。
２５．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａａｔｇｔｃｇａｃａｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｔｃｔｃａｇｃｔｃ−３’（配列番号２９；下線部はＳａｌＩ制限酵素サイト）及び５’−ｔｔｃｇｔｃｇａｃｃｔａａｃａｃｔｃｔｃｃｃｃｔｇｔｔｇａａ−３’（配列番号３０；下線部はＳａｌＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９５℃／３０秒→５０℃／３０秒→７４℃／２分：１０サイクル；９５℃／３０秒→６０℃／３０秒→７４℃／２分：３０サイクル；Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ）によりｐＣＥＰ４／ＩｇＬκから抗体Ｌ鎖κ（ＩｇＬκ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＳａｌＩによって切り出し、ｐＥＴＢｌｕｅ−２のＳａｌＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ／ＩｇＬκを作製した。
２６．ｐＥＴＢｌｕｅ／ΔＡｃｔからΔＡｃｔプロモーター断片を制限酵素ＳａｌＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧのＸｈｏＩサイトへ挿入した。ＧＦＰ遺伝子と同方向にΔＡｃｔプロモーターが挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡとした。
２７．ｐＥＴＢｌｕｅ／ＩｇＬκからＩｇＬκ遺伝子断片を制限酵素ＳａｌＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡのＳａｌＩサイトへ挿入した。ΔＡｃｔプロモーターと同方向にＩｇＬκ遺伝子断片が挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬとした。
２８．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｃｇｃｇｔｃｇａｃｃｇｃｃｃｃｔｃｔｃｃｃｔｃｃｃｃｃ−３’（配列番号３１；下線部はＳａｌＩ制限酵素サイト）及び５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇａｔｔａｔｃａｔｃｇｔｇｔｔｔｔｔｃａａａｇｇａａａａｃｃａｃｇｔｃ−３’（配列番号３２；下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→６０℃／３０秒→６８℃／１分：３０サイクル）によりプラスミドｐＬＸＩＮ（クロンテック社製）からＩＲＥＳ断片を増幅後、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＥＴＢｌｕｅ−２のＳａｌＩ、ＸｈｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ／ＩＲＥＳを作製した。
２９．ｐＥＴＢｌｕｅ／ＩＲＥＳからＩＲＥＳ断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＨのＳａｌＩサイトへ挿入した。ＩｇＨγ１遺伝子と同方向にＩＲＥＳが挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＩＨとした。
３０．ｐＥＴＢｌｕｅ／ＩｇＬκからＩｇＬκ遺伝子断片を制限酵素ＳａｌＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＩＨのＳａｌＩサイトへ挿入した。ΔＡｃｔプロモーターと同方向にＩｇＬκ遺伝子断片が挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨとした。
このように作製した複製能欠失型レトロウイルスベクターのベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＨ、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬ及びｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨの構造を図１２に示した。
（実施例１０）抗ＣＤ２抗体発現Ｇ０トランスジェニックキメラウズラの作製
実施例２に準じて、ベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＨ、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬ及びｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨより３種類のレトロウイルスベクターを調製した。このレトロウイルスベクターのタイターを測定したところ、１０^８ｃｆｕ／ｍｌ〜１０^９ｃｆｕ／ｍｌだった。
得られたレトロウイルスベクターを、実施例３に準じて孵卵後３６時間のウズラ受精卵心臓にマイクロインジェクションし、３７．９℃，湿度６５％で１５分毎に９０度転卵させながら孵卵した。
軽鎖（Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ）、重鎖（Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ）からなる抗体をトランスジェニック動物で発現させるには、軽鎖、重鎖それぞれを発現させるベクターを各々単独で導入する方法と、軽鎖を発現する遺伝子と重鎖を発現する遺伝子をＩＲＥＳのような配列で区切り、同一のベクターとして導入する方法が考えられる。そこでインジェクションは、 ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＨ、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬを同時に感染させた場合（実施例１１、実験例１）と、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨより調製したベクターを単独で導入した場合（実施例１１、実験例２）に分けて行った。
孵卵４８時間後、発生が正常に進行していることを確認し、ニワトリのＳサイズの卵殻の鈍端部に直径４ｃｍの穴を開けたものに、このウイルス導入胚を移した。胚を上にして空気に触れるようにし、濃度５０ｍｇ／ｍｌで卵白に懸濁した乳酸カルシウム（シグマ社製）溶液を０．５ｍｌ添加後、卵白を糊としてラップで密閉した。再度孵卵器に入れ、３７．９℃、湿度６５％で１時間毎に６０度転卵しながら１３日間培養した。転卵を止めて静置状態にし、胚が肺呼吸に移行したら、ラップに針で小さな穴を開け、呼吸を助けた。漿尿膜の血が引いたら培養器から雛を出し、孵化させた。
（実施例１１）血清中、卵中の抗ＣＤ２抗体濃度の測定
実施例１０により孵化させたＧ０トランスジェニックキメラウズラを１ヶ月間飼育して雛を成長させた。３０日後および６０日後、成長したＧ０トランスジェニックウズラの翼下静脈より採血を行い、血液サンプルを得た。得られた血液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清として得られる血清から抗ＣＤ２抗体量の測定を行った。
孵化から１．５ヵ月後、産卵を始めた雌性トランスジェニックウズラより採卵を行い、実施例７に準じて調製した卵白、卵黄中の抗ＣＤ２抗体量を、実施例８に準じてＥＬＩＳＡ法により定量した。
実験例１、実験例２の定量結果を示す。
（実験例１）
ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＨ、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬから調製したベクター（３〜４×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ）を同時に感染させたＧ０トランスジェニックキメラウズラ（個体識別番号＃１１１３）は、卵黄中に０．６μｇ／ｍｌ、卵白中に０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２抗体を発現した。
（実験例２）
ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨより調製したベクター（５×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ）を単独で導入したＧ０トランスジェニックキメラウズラ（＃４２０２）は、血清中に５．２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２抗体を発現した。
（実施例１２）ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体発現ベクターコンストラクトの作製
ＳｃＦｖ−Ｆｃ抗体発現ベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ｓｃＦｖ−Ｆｃは、以下のように作製した。
１．５’末端をリン酸化した２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｔａｇ ａｃｃａｔｇａｇｇｔｃｔｔｔｇｃｔａａｔｃｔｔｇｇｔｇｃｔｔｔｇｃｔｔｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｇ−３’（配列番号３３；ｃｔａｇ ａはＸｂａＩ認識部位末端、ｇｇはＨａｅＩＩＩ認識部位末端）及び５’−ｃｃｃｃａｇａｇｃａｇｃｃａｇｇｇｇｃａｇｇａａｇｃａａａｇｃａｃｃａａｇａｔｔａｇｃａａａｇａｃｃｔｃａｔｇｇｔ−３’（配列番号３４；ｃｃはＸｂａＩ認識部位末端、ｔはＨａｅＩＩＩ認識部位末端）をアニールさせ、リゾチーム分泌シグナルの遺伝子断片を調製した。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｇｃｇｔｔｔａａａｇｔｇａｃｇｔｔｇｇａｃｇｔｃｃｇ−３’（配列番号３５；ｔｔｔａａａはＤｒａＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｔｔａｇｇａｔｃｃｇｃｇｃｔｔａａｇｇａｃｇｇｔｃａｇｇ−３’（配列番号３６；ｇｇａｔｃｃはＢａｍＨＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→５８℃／３０秒→６８℃／１分：３０サイクル；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ）により、ＨＵＣ２−１３細胞のニワトリ抗体可変領域遺伝子から調製された一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の遺伝子を含んだプラスミドｐＰＤＳ／ｓｃＦｖ（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：１９１−１９８）からｓｃＦｖ遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＤｒａＩ及びＢａｍＨＩによって切り出した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＸｂａＩ、ＢａｍＨＩサイトに上記調製した２断片を挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｓｃＦｖを作製した。
２．ｐＢｌｕｅ／ｓｃＦｖからｓｃＦｖ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、ｐＣＥＰ４のＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＥＰ４／ｓｃＦｖを作製した。
３．ヒトＩｇＧ１産生ミエローマ細胞ＩＭ−９からｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてｍＲＮＡを取得し、得られたｍＲＮＡからＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅを用いてｃＤＮＡライブラリを調製した。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃａａｇｃｔｔｃａａｇｇｇｃｃｃａｔ−３’（配列番号２３）及び５’−ａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａ−３’（配列番号２４）をプライマーとするＰＣＲ（９５℃／２分→５２℃／３０秒→７４℃／３分：３０サイクル；Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ）により上記ｃＤＮＡライブラリからｈＣγ１遺伝子断片を増幅した。さらに、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｔｔａｇｇａｔｃｃｇａｇｃｃｃａａａｔｃｔｔｇｔｇａｃａａａａｃｔｃ−３’（配列番号３７；ｇｇａｔｃｃはＢａｍＨＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｇｃａａｇｃｔｔｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａ−３’（配列番号２６；ａａｇｃｔｔはＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→５８℃／３０秒→６８℃／１分：３０サイクル；ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ）により上記ＰＣＲ産物からヒト抗体Ｈ鎖γ１のＦｃ領域（Ｆｃ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／Ｆｃを作製した。
４．ｐＣＥＰ４／ｓｃＦｖからｓｃＦｖ遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって切り出した。ｐＢｌｕｅ／ＦｃからＦｃ遺伝子断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＨｉｎｄＩＩＩサイトへ上記切り出した２断片を挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｓｃＦｖ−Ｆｃを作製した。
５．ｐＢｌｕｅ／ｓｃＦｖ−Ｆｃからニワトリ一本鎖抗体可変領域にヒト抗体Ｈ鎖γ１・Ｆｃが連結した構造（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって処理したｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＨのベクター断片に連結した。ΔＡｃｔプロモーターと同方向にｓｃＦｖ−Ｆｃ遺伝子が連結された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃとした。
このように作製した複製能欠失型レトロウィルスベクターのベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃの構造を図１３に示した。
（実施例１３）ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体発現Ｇ０トランスジェニックキメラウズラの作製
実施例２に準じて、ベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃよりレトロウイルスベクターを調製した。このレトロウイルスベクターのタイターを測定したところ、１０^８ｃｆｕ／ｍｌ〜１０^９ｃｆｕ／ｍｌだった。
得られたウイルスベクター溶液を、実施例３に準じて孵卵後３６時間のウズラ受精卵心臓にマイクロインジェクションし、実施例１０に準じて孵化させることによりＧ０トランスジェスジェニックキメラウズラを誕生させた。
（実施例１４）血清中、卵中のｓｃＦｖ−Ｆｃ濃度の測定
実施例１３により誕生したＧ０トランスジェニックキメラウズラを１ヶ月間飼育して雛を成長させた。３０日後および６０日後、成長したＧ０トランスジェニックキメラウズラ（個体識別番号＃３３０３、＃３３０６、＃３３１０、＃３３１１、＃３３１３）の翼下静脈より採血を行い、血液サンプルを得た。得られた血液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清として得られる血清からｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体量の測定を行った。
孵化から１．５ヵ月後、産卵を始めた雌性トランスジェニックウズラ（個体識別番号＃３３１０）より採卵を行い、実施例７に準じて調製した卵白、卵黄中のｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体量を、実施例８に準じてＥＬＩＳＡ法により定量した。
標準検量線は精製したｓｃＦｖ−Ｆｃを用いて作製した。実施例１２で作製したベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ｓｃＦｖ−Ｆｃをリポフェクション法によりＧＰ２９３細胞に導入し、その培養上清を４℃、１０分間、３０００ｒｐｍで遠心して固形物を除去した。この上清を冷却しながら攪拌し、５０％飽和となるよう細かく砕いた硫酸アンモニウムを徐々に加え（３１３ｇ硫安／１０００ｍｌ水）、タンパク質を沈殿させた。これを４℃で一晩静置した後、４℃で１０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心して沈殿を完全に沈降させ、少量のＰＢＳで溶解した。２ＬのＰＢＳで３回透析して硫安を除去した。
精製用のプロテインＧカラム（パーゼプティブバイオシステムズ社製）の初期洗浄をＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮａＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ １．５６ｇ／ｌ、ＮａＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ７．１６ｇ／ｌ）１０ｍＬ、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（酢酸 ２０％、蒸留水８０％）１０ｍｌ、Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ１０ｍｌの順で行った（流速２ｍｌ／分）。ＰＢＳに溶解したタンパク質液を１ｍｌ／分で流し、ｓｃＦｖ−Ｆｃをカラムに吸着させた。Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ２０ｍｌを１．７ｍｌ／分で流して、不要なタンパク質を除去し、Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（グリシン ７．５０７ｇ／ｌ、２Ｎ ＨＣｌにてｐＨ２．５〜３．０に調製）を１．５ｍｌ／分で流して、ｓｃＦｖ−Ｆｃを溶出した。
溶出分画をＰＢＳ（２Ｌ）で３回透析し、精製ｓｃＦｖ−Ｆｃとし、波長２８０ｎｍの吸光度よりタンパク質濃度を定量した。
実施例１４で作製したＧ０トランスジェニックキメラウズラの３０日後、６０日後採血血清中のｓｃＦｖ−Ｆｃ量を図１４に示した。 ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体の発現遺伝子を導入されたＧ０トランスジェニックキメラウズラは、３０日目に約２ｍｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌの抗体を血清中に発現し、５羽のうち３羽が６０日後も同程度の発現量を示した。
Ｇ０トランスジェニックキメラウズラ（＃３３１０）が産卵を始めた日から、卵黄、卵白中のｓｃＦｖ−Ｆｃ量を図１５に示した。抗体は卵白、卵黄中に約５００μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ発現し、産卵開始から１７日目まで若干の変動はあるものの安定した発現量を維持した。
（実施例１５）ｓｃＦｖ−Ｆｃ構造の確認
実施例１３で作製したＧ０トランスジェニックキメラウズラ血清１ｍｌから実施例１０に準じて、硫安沈殿とプロテインＧカラムによりｓｃＦｖ−Ｆｃを精製した。精製したｓｃＦｖ−ＦｃをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、その結果を図１６に示した。未処理のレーンより、ｓｃＦｖ−Ｆｃの分子量約１２０ｋＤａが示された。還元処理したｓｃＦｖ−Ｆｃの分子量は未処理の場合のほぼ半分（約６０ｋＤａ）になっていることから、Ｇ０トランスジェニックキメラウズラにより産生されたｓｃＦｖ−ＦｃはＳ−Ｓ結合による２量体を形成していることがわかった。これらは、Ｓ−Ｓ結合に関与するシステイン残基をＦｃ部に有するｓｃＦｖ−Ｆｃの構造的特徴に符合し、Ｇ０トランスジェニックキメラウズラにより産生されたｓｃＦｖ−Ｆｃは正しい構造を保持していることが示唆された。
（実施例１６）ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク発現Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリの作製
実施例９に準じてＴＮＦＲ−Ｆｃ発現ベクターコンストラクトを作製し、実施例２に準じてレトロウイルスベクターを作製した。このレトロウイルスベクターのタイターは、１．７×１０^７ｃｆｕ／ｍｌだった。
得られたウイルスベクター溶液を、実施例４に準じて孵卵後５５時間のニワトリ受精卵心臓にマイクロインジェクションし、実施例１０に準じて孵化させることによりＧ０トランスジェニックキメラニワトリを誕生させた。
８個の受精卵にインジェクションしたところ４羽が孵化し、実施例１４に準じてその血清中のＴＮＦＲ−Ｆｃを定量したところ、最高で５０μｇ／ｍｌのＴＮＦＲ−Ｆｃが発現していた。
産業上利用の可能性
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類は、複製能欠失型レトロウイルスベクターで導入された遺伝子を不活性化することなく効率的に発現することができる。また、本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法は、キメラ抗体、例えばｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体の遺伝子を導入し、血中、卵中に抗体を効率的に発現することができる鳥類の作製を可能にする。更に、本発明の抗体生産法は、キメラ抗体、例えばｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体を産生するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製し、抗体を鳥類の血清、卵中から回収、精製することからなるので、効率よい抗体生産を可能にする。

Claims (5)

1. ニワトリ受精卵を孵卵し、孵卵開始から５０時間以降、かつ６０時間以前の初期胚の心臓内へ複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることからなるＧ０トランスジェニックキメラニワトリの作製法。
2. １×１０^７ｃｆｕ／ｍｌ以上のタイターを持つ複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションすることを特徴とする請求項１に記載のＧ０トランスジェニックキメラニワトリの作製法。
3. ニワトリβ−アクチンプロモーターにより制御される導入遺伝子が複製能欠失型レトロウイルスベクターに含有される、請求項１または２に記載のＧ０トランスジェニックキメラニワトリの作製法。
4. 孵卵開始から５５時間以降、かつ６０時間以前の初期胚の心臓内へ複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させることからなる、請求項１−３のいずれか１項に記載のＧ０トランスジェニックキメラニワトリの作製法。
5. 請求項１−４のいずれか１項に記載の方法で作製されたＧ０トランスジェニックキメラニワトリを、配偶型の同種鳥類と交配させ、その卵を孵化することよりなるトランスジェニックニワトリの作製法。

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