JP5534809B2 - 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法及び測定用キット - Google Patents

Description

本発明は、検体中に含まれる低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬという）中のコレステロール（以下、ＬＤＬ−Ｃと略記する。）の測定方法及び測定用キットに関する。

ＬＤＬは、末梢細胞にコレステロールを供給する役割を有し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の直接的因子である。ＬＤＬ−Ｃの増加は動脈硬化性疾患の主要な危険因子の１つであり、分別定量することは臨床上有用である。
従来からのＬＤＬ−Ｃの定量方法は、超遠心法、電気泳動法、フリードワルド（Friedewald）式による演算方法などが挙げられる。

超遠心法は、リポ蛋白の比重の差を利用し、超遠心分離機を用いてＬＤＬを分離したのち、そのコレステロール量を測定する方法である（非特許文献１）。
しかしながら、超遠心法による分離操作は煩雑で、迅速性、簡便性などの面で欠点がある。
電気泳動法は、リポ蛋白の電荷の差を利用し、アガロースゲルなどを支持体として分離する方法やリポ蛋白の粒子サイズの差を利用し、ポリアクリルアミドゲルを支持体として分離する方法などがある。しかしながら、電気泳動法は定量性に乏しく、簡便性、経済性などの面で問題がある。

フリードワルド式による演算方法では、総コレステロール（以下、Ｔ−Ｃと略記する。）、ＨＤＬ中のコレステロール（以下、ＨＤＬ−Ｃと略記する。）及び総トリグリセライド（以下、Ｔ−ＴＧと略記する。）の測定値から、次の計算式に従いＬＤＬ−Ｃ量を算出する（非特許文献２）。
（ＬＤＬ−Ｃ)＝(Ｔ−Ｃ)−（ＨＤＬ−Ｃ)−(Ｔ−ＴＧ)／５
しかし、この方法は、血清中のＴ−ＴＧの含有量や食事の影響を受けるため、正確性に問題がある。

また近年、超遠心法などの分離操作を必要とせず、汎用の自動分析機装置に搭載可能なＬＤＬ−Ｃの定量方法も報告されている。
それらの中でＬＤＬ−Ｃを定量する方法としては、以下の方法が知られている。
ＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することにより、被検試料中のＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びカイロミクロン中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、被検試料中の残存コレステロールを定量する第２工程とからなる被検試料中のＬＤＬ−Ｃの定量方法（特許文献１）。

血清に対し、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ばれる界面活性剤、並びにコレステロール測定用酵素試薬を添加し、リポ蛋白質のうちＨＤＬ中及びＶＬＤＬ中のコレステロールを優先的に反応させた後に、残りのコレステロールの反応量を測定するＬＤＬ−Ｃの定量方法（特許文献２）。

生体試料に対し、ポリオキシエチレン誘導体とポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、並びにコレステロール測定用酵素を添加し、リポ蛋白質のうちＬＤＬ−Ｃを選択的に測定する方法（特許文献３）。
生体試料に対し、ジメチル−α−シクロデキストリン又は／及びポリ−β−シクロデキストリンの存在下で測定を行うことを特徴とする、ＬＤＬ−Ｃの測定法（特許文献４）。

しかしながら、検体中のＬＤＬ−Ｃをより簡便かつ正確に測定する方法及びキットが求められている。
特開平１０−３８８８８号公報 特開平９−３１３２００号公報 ＷＯ００／１７３８８パンフレット 特開平１１−３０６１７号公報 アドバンスド・リピッド・リサーチ（Adv. Lipid Res.）、第６巻、１頁、１９６８年 クリニカル・ケミストリー（Clin. Chem.）、第１８巻、４９９頁、１９７２年

本発明の目的は、検体中のＬＤＬ−Ｃを簡便かつ正確に測定するための方法及びキットを提供することにある。

発明者はＬＤＬ−Ｃの測定方法について種々研究を重ねた結果、まず、コレステロール酸化酵素及びコレステロール脱水素酵素を共に含有しない水性媒体中でコレステロールエステル加水分解酵素と検体とを反応させた後、次いで、特定の界面活性剤の存在下で、当該反応で得られる反応液をコレステロール酸化酵素、又は、酸化型補酵素とコレステロール脱水素酵素との組み合わせと反応させることで、ＬＤＬ以外のリポ蛋白質中のコレステロールを消去することなく、また、リポ蛋白質の物理的な分画操作を行うことなく、検体中のＬＤＬ−Ｃを簡便かつ正確に測定できることを見出した。すなわち、本発明は、下記（１）〜（８）に関する。
（１） 以下の工程を順次行うことを特徴とする検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
［１］検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール酸化酵素を含有しない水性媒体中で反応させる工程；
［２］工程［１］で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤及びコレステロール酸化酵素、要すれば、さらにコレステロールエステル加水分解酵素を添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール酸化酵素、要すればコレステロールエステル加水分解酵素と反応させる工程；及び、
［３］工程［２］の反応により生成する物質又は工程［２］の反応により消費される物質を測定する工程。

（２） 以下の工程を順次行うことを特徴とする検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
［１］検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール脱水素酵素を含有せず、要すれば酸化型補酵素を含有する水性媒体中で反応させる工程；
［２］工程［１］で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素、要すれば、さらにコレステロールエステル加水分解酵素及び酸化型補酵素からなる群より選ばれる少なくとも１つを添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素、要すればコレステロールエステル加水分解酵素と反応させる工程；及び、
［３］工程［２］の反応により生成する物質又は工程［２］の反応により消費される物質を測定する工程。
（３） 工程［１］、工程［２］のいずれか又は両方の反応が、さらに、ポリアニオン存在下で行われる、（１）又は（２）記載の測定方法。

（４） コレステロールエステル加水分解酵素を含有し、コレステロール酸化酵素を含有しない第一試薬と、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤及びコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定するためのキット。
（５） コレステロールエステル加水分解酵素がさらに第二試薬に含有される（４）記載のキット。

（６） コレステロールエステル加水分解酵素を含有し、コレステロール脱水素酵素を含有しない第一試薬と、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤及びコレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定するためのキット。
（７） コレステロールエステル加水分解酵素がさらに第二試薬に含有される（６）記載のキット。
（８） ポリアニオンがさらに第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される（４）〜（７）のいずれかに記載のキット。

本発明により、簡便で、かつ、正確なＬＤＬ−Ｃの測定を可能とする方法及びキットが提供される。

本発明による検体中のＬＤＬ−Ｃの測定法は、遠心分離などの物理的方法によるリポ蛋白の分画操作を必要としない方法である。また、ＬＤＬ−Ｃの測定に先立って検体中のＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することなく、検体中のＬＤＬ−Ｃを測定する方法である。またＬＤＬ−Ｃの測定に先立ってＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを測定することなくＬＤＬ−Ｃを測定する方法である。

本発明の検体中のＬＤＬ−Ｃ測定方法は、以下の工程を順次行うことを特徴とする方法である。
［１］検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール酸化酵素を含有しない水性媒体中で反応させる工程；
［２］工程［１］で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤及びコレステロール酸化酵素、要すれば、さらにコレステロールエステル加水分解酵素を添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール酸化酵素、要すればコレステロールエステル加水分解酵素と反応させる工程；及び、
［３］工程［２］の反応により生成する物質又は工程［２］の反応により消費される物質を測定する工程。

また、本発明の検体中のＬＤＬ−Ｃ測定方法は、以下の工程を順次行うことを特徴とする方法である。
［１］検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール脱水素酵素を含有せず、要すれば酸化型補酵素を含有する水性媒体中で反応させる工程；
［２］工程［１］で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素、要すれば、さらにコレステロールエステル加水分解酵素及び酸化型補酵素からなる群より選ばれる少なくとも１つを添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素、要すればコレステロールエステル加水分解酵素と反応させる工程；及び、
［３］工程［２］の反応により生成する物質又は工程［２］の反応により消費される物質を測定する工程。

検体中のＬＤＬ−Ｃの測定に際しては、既知濃度のＬＤＬ−Ｃを含む試料を標準品として使用して作成した検量線と実際の測定値とから、検体中のＬＤＬ−Ｃ濃度を決定する。

本発明の測定方法において用いられるＬＤＬを含有する検体としては、例えば全血、血漿、血清等が挙げられるが、血漿及び血清が好ましい。

本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。

コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素も、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用することもできる。

市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステラーゼ（ＣＯＥ−３１１；東洋紡績社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ−３１１；東洋紡績社製）、コレステロールエステラーゼIII（ＣＨＥIII；天野製薬社製）等が挙げられる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。

コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾において当該酵素を修飾する基（化学修飾基）としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が挙げられる。

コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基又は構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等が挙げられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基又は構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル（α−ヨードエステル等）等が挙げられる。

化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とＮ−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトＶＦＭ−４１０１、サンブライトＭＥ−０５０ＡＳ、サンブライトＤＥ−０３０ＡＳ（いずれも日本油脂社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトＡＫＭシリーズ（例えば、サンブライトＡＫＭ−１５１０等）、サンブライトＡＤＭシリーズ、サンブライトＡＣＭシリーズ（いずれも日本油脂社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するＥＰＯＸ−３４００、Ｍ−ＥＰＯＸ−５０００（いずれもSheawater Polymers社製）、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ無水二酢酸（DTPA anhydride；同仁化学研究所社製）等が挙げられる。

コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができるが、本方法に限定されるものではない。まず、コレステロールエステル加水分解酵素をｐＨ８．０以上の緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ緩衝液）に溶解し、０〜５５℃で０．０１〜５００倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分間〜５時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。

本反応の方法に用いられるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．００１〜８００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０１〜３００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤＩ；協和発酵工業社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤＩ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯ−ＣＥ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ−３２１；東洋紡績社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。

コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本発明に用いられるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．００１〜８００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０１〜３００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。

本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールデヒドロゲナーゼ等も用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼ“Amano” 5 （ＣＨＤＨ５；天野エンザイム社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。コレステロール脱水素酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。

本発明に用いられるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．００１〜８００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０１〜３００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いた測定法においては、酸化型補酵素が使用される。酸化型補酵素としては、例えばＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオ（thio）−ＮＡＤ、チオ（thio）−ＮＡＤＰ等が挙げられる。

本発明において用いられる界面活性剤としては、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル（以下ＰＯＥ分岐アルキルエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＡ分岐アルキルエーテルと略記する）、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物（以下、ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物と略記する）及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルと略記する）が挙げられる。以下、これらの界面活性剤からなる群より選ばれる界面活性剤を化合物Ａと略記する。

ＰＯＥ分岐アルキルエーテルにおける分岐アルキルとしては炭素数６〜３０の例えば、イソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル、イソヘネイコシル、イソドデシル、イソトリコシル、イソテトラコシル、デシルテトラデシル、イソペンタコシル、イソヘキサコシル、ドデシルテトラデシル、イソヘプタコシル、イソオクタコシル、イソノナコシル、イソトリアコンシル等が挙げられるが、炭素数１０以上の分岐アルキルが好ましい。炭素数１０以上の分岐アルキルとしては、例えばイソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル、イソヘネイコシル、イソドデシル、イソトリコシル、イソテトラコシル、デシルテトラデシル、イソペンタコシル、イソヘキサコシル、ドデシルテトラデシル、イソヘプタコシル、イソオクタコシル、イソノナコシル、イソトリアコンシル等が挙げられる。

ＰＯＥ分岐アルキルエーテルのポリオキシエチレンのオキシエチレンの重合度としては、好ましくは２〜６０であり、より好ましくは４〜４０である。
ＰＯＥ分岐アルキルエーテルの具体例としては、ノイゲンＴＤＳ２００Ｄ、ノイゲンＴＤＳ−５００Ｆ、ノイゲンＳＤ１５０、ノイゲンＳＤ３００（以上、第一工業製薬社製）、ノニオンＩＣ２３５、ノニオンＩＣ２３０、ノニオンＩＣ２３５、ノニオンＯＤ２２５、ノニオンＯＤ２３０、ノニオンＯＤ２３５（以上、日本油脂社製）、ＥＭＡＬＥＸ １６１５、ＥＭＡＬＥＸ １６２５、ＥＭＡＬＥＸ １８１５、ＥＭＡＬＥＸ １８２０、ＥＭＡＬＥＸ １８２５、ＥＭＡＬＥＸ ＯＤ−１０、ＥＭＡＬＥＸ ＯＤ−１６、ＥＭＡＬＥＸ ＯＤ−２０、ＥＭＡＬＥＸ ＯＤ−２５、ＥＭＡＬＥＸ ＯＤ−２５ＪＪ、ＥＭＡＬＥＸ ２４２０、ＥＭＡＬＥＸ ２４２５（以上、日本エマルジョン社製）等が挙げられる。

ＰＯＥ・ＰＯＡ分岐アルキルエーテルにおける分岐アルキルとしては炭素数６〜３０の例えば、イソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、オクチルドデシル、イソイコシル、オクチルドデシル、イソヘネイコシル、イソドコシル、イソトリコシル、イソテトラコシル、デシルテトラデシル、イソペンタコシル、デシルペンタデシル、イソヘキサコシル、ドデシルテトラデシル、イソヘプタコシル、イソオクタコシル、イソノナコシル、イソトリアコンシル等が挙げられるが、炭素数１２以上の分岐アルキルが好ましい。炭素数１２以上の分岐アルキルとしては、例えばイソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、オクチルドデシル、イソイコシル、オクチルドデシル、イソヘネイコシル、イソドコシル、イソトリコシル、イソテトラコシル、デシルテトラデシル、イソペンタコシル、デシルペンタデシル、イソヘキサコシル、ドデシルテトラデシル、イソヘプタコシル、イソオクタコシル、イソノナコシル、イソトリアコンシル等が挙げられる。

ＰＯＥ・ＰＯＡ分岐アルキルエーテルにおけるポリオキシアルキレン（ＰＯＡ）としては、ポリオキシエチレン以外のポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。
ＰＯＥ・ＰＯＡ分岐アルキルエーテルのポリオキシエチレンのオキシエチレンの重合度としては、好ましくは２〜６０であり、より好ましくは４〜４０であり、ポリオキシアルキレンのオキシアルキレンの重合度としては、好ましくは１〜４０であり、より好ましくは１〜２０である。

なお、本発明に用いられるＰＯＥ・ＰＯＡ分岐アルキルエーテルにおけるＰＯＥ・ＰＯＡの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー等が挙げられる。
ＰＯＥ・ＰＯＡ分岐アルキルエーテルの具体例としては、ユニルーブＭＩＬ−０８２２Ｂ（以上、日本油脂社製）等が挙げられる。

ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物におけるポリオキシアルキレン（ＰＯＡ）としては、ポリオキシエチレン以外のポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。
ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物におけるポリオキシアルキレン（ＰＯＡ）の分子量としては、好ましくは５００〜６０００であり、より好ましくは１５００〜４０００である。
なお、本発明に用いられるＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物におけるＰＯＥ・ＰＯＡの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー等が挙げられる。

ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物としては、ポリオキシアルキレンの分子量が１，５００〜４，０００であるＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物が好ましい。ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物を用いる場合は、後述のＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルと組み合わせて用いることが好ましい。
ＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物の具体例としては、プルロニックＬ−１２１、プルロニックＰ−１０３、プルロニックＦ−１０８（以上、旭電化社製）、プロノンＢ−２０４、プロノンＢ−２０８(以上、日本油脂社製)等が挙げられる。

ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルにおけるアルキルとしては例えばオクチル、ノニル、ドデシルなどが挙げられ、ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルにおけるアリールとしてはフェニル等が挙げられる。
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルにおけるポリオキシアルキレン（ＰＯＡ）としては、ポリオキシエチレン以外のポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。

なお、本発明に用いられるＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルにおけるＰＯＥ・ＰＯＡの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー等が挙げられる。
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテルの具体例としては、エマルゲンＬ４０等（花王社製）等が挙げられる。

本発明のＬＤＬ−Ｃの測定においては、界面活性剤として、化合物Ａを１種用いることも、２種以上用いることもできる。
化合物Ａの濃度としては、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．０００１〜２０％であることが好ましく、０．００１〜５％がより好ましい。

本発明において用いられるポリアニオンとしては、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定を可能とするポリアニオンであれば特に制限はなく、例えばデキストラン硫酸もしくはその塩、ヘパリンもしくはその塩、リンタングステン酸又はその塩、硫酸化シクロデキストリン又はその塩、硫酸化オリゴ糖又はその塩等が挙げられるが、デキストラン硫酸もしくはその塩が好ましい。デキストラン硫酸としては、例えば分子量が４万、８万、２０万、５０万、１００万、２００万等のデキストラン硫酸が挙げられる。硫酸化オリゴ糖としては、例えば硫酸化アガロース、硫酸化トレハロース、コンドロイチン硫酸等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。また、本発明においては、ポリアニオンを２種以上用いてもよい。本発明のＬＤＬ−Ｃの測定におけるポリアニオンの濃度としては、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．０００５〜１０％であることが好ましく、０．００５〜１％がより好ましい。

本発明において用いられる水性媒体は、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等を含み、緩衝液が好ましい。
本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法におけるｐＨはＬＤＬ−Ｃの定量を妨げない範囲であればいずれでもよいが、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。

グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。

緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法のための反応温度は、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法を可能とする温度であれば特に制限はないが、１０〜５０℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。汎用の自動分析装置での設定は通常３７℃である。

本発明のＬＤＬ−Ｃの測定方法のための反応時間は、本発明のＬＤＬ−Ｃの測定を可能とする反応時間であれば特に制限はないが、１〜６０分間が好ましく、２〜３０分間がより好ましい。
本発明のＬＤＬ−Ｃの測定においては、工程［１］は、例えば１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で、１〜６０分間、好ましくは２〜３０分間行う。工程［２］は、例えば１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で、１〜６０分間、好ましくは２〜３０分間行う。

本発明のＬＤＬ−Ｃの測定において、工程［３］は、例えば反応により生成した過酸化水素や還元型補酵素を測定することにより行う。また、反応において消費される酸素量を測定することにより行ってもよい。

生成した過酸化水素の量は、例えば過酸化水素電極や過酸化水素測定用試薬を用いて測定することができる。過酸化水素測定用試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、発光等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化発色型色原体が挙げられる。検出可能な物質が発光の場合には、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。

過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を測定することにより、定量することができる。また、化学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素は、化学発光物質と反応してフォトンを生じ、生じたフォトンを測定することにより、定量することができる。

酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。ロイコ型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、ｏ−フェニレンジアミン、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。

酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。

アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）、Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（ＭＡＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（Ｅｔ−ＭＡＳＥ）等が挙げられる。

フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてペルオキシダーゼを用いる場合は、１〜１００ｋＵ／Ｌが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。

還元型補酵素の測定方法としては、例えば生成した還元型補酵素の吸光度を測定する方法、還元型補酵素測定用試薬を用いる方法等が挙げられる。還元型補酵素の吸光度を測定する方法における吸光度としては、３００〜５００ｎｍが好ましく、３３０〜４００ｎｍがより好ましく、３４０ｎｍ付近が特に好ましい。還元型補酵素測定用試薬は、生成した還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素等が挙げられる。検出可能な物質が色素の場合の還元型補酵素測定用試薬としては、例えばジアホラーゼ、電子キャリアー及び還元発色型色原体を含有する試薬が挙げられる。電子キャリアーとしては、例えば１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート等が挙げられる。還元型補酵素測定用試薬として、ジアホラーゼ、電子キャリアー及び還元発色型色原体を含有する試薬を用いる場合には、還元発色型色原体が変換されて生成した色素を測定することにより、定量することができる。

還元発色型色原体としては、例えば３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロミド（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）等が挙げられる。

（ＬＤＬ−Ｃ測定用キット）
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットは、本発明のＬＤＬ−Ｃ測定方法に用いることができ、保存、流通及び使用適した形態である。本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットとしては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられるが、第一試薬と第二試薬とからなる２試薬系が好ましい。

第一試薬と第二試薬とからなる２試薬系のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素は、第一試薬に含有され、要すれば第二試薬にも含有される。コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を用いるＬＤＬ−Ｃ測定に用いられる２試薬系のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおいては、コレステロール酸化酵素は第一試薬に含有されず、第二試薬に含有される。また、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素を用いるＬＤＬ−Ｃ測定に用いられる２試薬系のＬＤＬ−Ｃ測定用キットにおいては、コレステロール脱水素酵素は第一試薬に含有されず、第二試薬に含有され、酸化型補酵素は第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される。

第二試薬に配置される化合物Ａとしては、炭素数１０以上の分岐アルキルを持つＰＯＥ分岐アルキルエーテル、炭素数１２以上の分岐アルキルを持つＰＯＥ・ＰＯＡ分岐アルキルエーテル又はＰＯＥ・ＰＯＡ縮合物とＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーエルとの組み合わせが好ましい。
ポリアニオンは第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよい。

過酸化水素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カップリング型色原体の２つの化合物、すなわち、カプラーとアニリン類、又は、カプラーとフェノール類はそれぞれ別々の試薬に含有される態様が好ましい。還元性補酵素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、第一試薬、第二試薬の両方に含有されることが好ましい。

本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類等が挙げられる。

本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態の試薬を用いて検体中のＬＤＬ−Ｃを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用される。該水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。
本発明のＬＤＬ−Ｃ測定用キットとしては、例えば以下の態様のキットが挙げられるがこれらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。

キット１
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット２
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、過酸化水素測定用試薬、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット３
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット４
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、過酸化水素測定用試薬、ポリオニオン
第二試薬
コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）

キット５
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール酸化酵素、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット６
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール酸化酵素、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット７
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール酸化酵素、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット８
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリオニオン
第二試薬
コレステロール酸化酵素、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット９
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット１０
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット１１
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット１２
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）

キット１３
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット１４
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット１５
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット１６
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）

キット１７
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット１８
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット１９
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット２０
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）

キット２１
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット２２
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット２３
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット２４
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）

キット２５
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット２６
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット２７
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット２８
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）

キット２９
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット３０
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット３１
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物Ａ（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）
キット３２
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物Ａ、ポリアニオン（要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素）

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例、比較例及び試験例においては、下記メーカーの試薬、酵素及び界面活性剤を使用した。
試薬
ＭＯＰＳ（同仁化学研究所社製）
ＭＥＳ（同仁化学研究所社製）
ＥＭＳＥ（ダイトーケミックス社製）
硫酸ナトリウム（関東化学社製）
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）（フルカ社製）
４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）
イントラリピッド２０％（ＴＥＲＵＭＯ社製）
酵素
ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）
ＣＨＯＤＩ（コレステロール酸化酵素；キッコーマン社製）
ＬＰＬ−３１１（コレステロールエステル加水分解酵素；東洋紡績社製）

界面活性剤
ノニオンＫ２２０(ＰＯＥラウリルエーテル；日本油脂社製)
ニッコールＢＣ−２０ＴＸ（ＰＯＥセチルエーテル；ニッコール社製）
ノニオンＳ２２０（ＰＯＥステアリルエーテル；日本油脂社製）
ニッコールＢＢ−２０（ＰＯＥベヘニルエーテル；ニッコール社製）
ナイミーンＬ２０７（ＰＯＥドデシルアミン；日本油脂社製）
ポリスターＡ１０６０（高分子型陰イオン；日本油脂社製）
ノニオンＬＴ−２１１（ＰＯＥソルビタンモノラウレート；日本油脂社製）
化合物Ａ
ＰＯＥ分岐アルキルエーテル
ノイゲンＴＤＳ２００Ｄ(第一工業製薬社製)
ノイゲンＳＤ１５０ (第一工業製薬社製)
ノニオンＩＣ２３５（日本油脂社製）
ＥＭＡＬＥＸ ＯＤ２５（日本エマルジョン社製）
ＥＭＡＬＥＸ ＯＤ２５ＪＪ（日本エマルジョン社製）
ノニオンＯＤ２３５（日本油脂社製）
ＥＭＡＬＥＸ ２４２５（日本エマルジョン社製）
ＥＭＡＬＥＸ １６２５（日本エマルジョン社製）
ＰＯＥ・ＰＯＡ分岐アルキルエーテル
ユニルーブＭＩＬ−０８２２Ｂ（日本油脂社製）
ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物
プルロニックＬ１２１（旭電化社製）
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアリールエーテル
エマルゲンＬ４０（花王社製）

以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ａ１〜ａ７，ａ１２）からなるＬＤＬ−Ｃ測定用キット（キットＡａ１〜Ａａ７，Ａａ１２）を調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＭＥＳ（ｐＨ６．２） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１ ０．５ ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ１〜ａ７）
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ ３．０ ｋＵ／Ｌ
化合物Ａ ［第１表の化合物Ａ（第二試薬）の欄に示す種類と濃度］

比較例１
以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ａ０）からなるＬＤＬ−Ｃ測定用キット（キットＡａ０）を調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＭＥＳ（ｐＨ６．２） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１ ０．５ ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ０）
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ ３．０ ｋＵ／Ｌ

実施例１及び比較例１の各キットを用いて、ヒト血清３０検体中のＬＤＬ−Ｃを以下の手順により測定した。
（１）検量線の作成
標準液として、生理食塩水（ＬＤＬ−Ｃ濃度：０．０ｍｇ／ｄＬ）及び血清（ＬＤＬ−Ｃ濃度：１２２ｍｇ／ｄＬ）を、実施例１及び比較例１の各キットを用いて、それぞれ日立７１７０Ｓ形自動分析装置により、ＬＤＬ−Ｃ濃度と「吸光度」との間の関係を示す検量線を作成した。
ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された２つの吸光度（Ｅ１及びＥ２）を基に、Ｅ２からＥ１を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液（２μＬ）と第一試薬（０．１５ｍＬ）とを添加し３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に第二試薬（０．０５ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。

（２）ヒト血清検体と実施例１及び比較例１の各キットとの反応による当該検体における「吸光度」の測定
（１）の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体を用いる以外は（１）の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、当該検体に対する「吸光度」を測定した。
（３）ヒト血清検体中のＬＤＬ−Ｃ濃度の決定
（２）で測定出した「吸光度」と、（１）で作成した検量線とから、各検体中のＬＤＬ−Ｃ濃度を決定した。

次いで、キットとして市販されているＬＤＬ−Ｃ測定用キットであるデタミナーＬ ＬＤＬ−Ｃ（協和メデックス社製）を用いて、検体として同じヒト血清３０検体を用いて、上記と同様の手順により、それぞれの検体中のＬＤＬ−Ｃを測定した。
実施例１及び比較例１の各キットと、デタミナーＬ ＬＤＬ−Ｃキットとを用いた測定との間の相関係数を第１表に示す。

第１表より、化合物Ａを含有するキット（キットＡａ１〜Ａａ７，Ａａ１２）を用いた測定においては、化合物Ａを含有しないキット（キットＡａ０）を用いた測定に比較して、デタミナーＬ ＬＤＬ−Ｃを用いた測定との間に、より良い相関関係が認められることが判明した。

以下の第一試薬（試薬Ｂ）及び第二試薬（試薬ａ１，ａ２、ａ５，ａ１２）からなるＬＤＬ−Ｃ測定用キット（Ｂａ１、Ｂａ２、Ｂａ５，Ｂａ１２）を調製した。
第一試薬（試薬Ｂ）
ＭＥＳ（ｐＨ６．２） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １ ｇ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１ ０．５ ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ１，ａ２，ａ５，ａ１２）
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ ３．０ ｋＵ／Ｌ
化合物Ａ ［第２表の化合物Ａ（第二試薬）の欄に示す種類と濃度］

比較例２
以下の第一試薬（試薬Ｂ）及び第二試薬（試薬ａ０）からなるＬＤＬ−Ｃ測定用キット（Ｂａ０）を調製した。
第一試薬（試薬Ｂ）
ＭＥＳ（ｐＨ６．２） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １ ｇ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１ ０．５ ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ０）
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ ３．０ ｋＵ／Ｌ

キットとして、実施例２のＡａ１、Ａａ２、Ａａ５、Ａａ１２、実施例３、比較例１並びに比較例２の各キットを用いて、検体として、実施例２で使用した検体と同じヒト血清３０検体を用いて、実施例２と同様の方法により、デタミナーＬ ＬＤＬ−Ｃを用いた測定との相関係数を算出した。その結果を第２表に示す。

第２表より、ポリアニオンを含有するキットにおいても、デタミナーＬ ＬＤＬ−Ｃを用いた測定との間に良好な相関関係が認められることが判った。また、ポリアニオンを含有するキットは、ポリアニオンを含有しないキットと比較して、デタミナーＬ ＬＤＬ−Ｃを用いた測定との間に、より良好な相関関係が認められることが判った。

以下の第一試薬（試薬Ｃ）及び第二試薬（試薬ａ３，ａ７〜ａ１１）からなるＬＤＬ−Ｃ測定用キット（キットＣａ３、Ｃａ７〜Ｃａ１１）を調製した。
第一試薬（試薬Ｃ）
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １ ｇ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１ ０．５ ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ３，ａ７〜ａ１１）
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ ３．０ ｋＵ／Ｌ
化合物Ａ ［第３表の化合物Ａ（第二試薬）の欄に示す種類と濃度］

比較例３
以下の第一試薬（試薬Ｃ）及び第二試薬（試薬ｂ１〜ｂ４）からなるキット（キットＣｂ１〜Ｃｂ４）を調製した。
第一試薬（試薬Ｃ）
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １ ｇ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１ ０．５ ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｂ１〜ｂ４）
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ ３．０ ｋＵ／Ｌ
界面活性剤 ［第４表の界面活性剤の欄に示す種類と濃度］

実施例５及び比較例３のキットを用いて、ヒト血清４０検体中のＬＤＬ−Ｃを実施例２と同様な方法により測定した。
次いで、キットとして、ＬＤＬ−Ｃ測定用キットであるデタミナーＬ ＬＤＬ−Ｃ（協和メデックス社製）を用いて、検体として同じヒト血清４０検体を用いて、同様の手順により、それぞれの検体中のＬＤＬ−Ｃを測定した。

実施例としてキットＣａ３、Ｃａ７〜Ｃａ１１、比較例としてキットＣｂ１〜Ｃｂ４を用いた測定と、デタミナーＬ ＬＤＬ−Ｃを用いた測定との間の相関係数を第５表に示す。

第５表より、 ＰＯＥ分岐アルキルエーテルを含有する実施例５のキット（キットＣａ３、Ｃａ７〜Ｃａ１１）を用いた測定においては、ＰＯＥ直鎖アルキルエーテルを含有する比較例３のキット（キットＣｂ１〜Ｃｂ４）を用いた測定に比較して、デタミナーＬ ＬＤＬ−Ｃを用いた測定との間に、より良い相関関係が認められることが判明した。

比較例４
以下の第一試薬（試薬Ｃ）及び第二試薬（試薬ｂ５〜ｂ７）からなるキット（キットＣｂ５〜Ｃｂ７）を調製した。
第一試薬（試薬Ｃ）
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １ ｇ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１ ０．５ ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｂ５〜ｂ７）
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ ３．０ ｋＵ／Ｌ
界面活性剤 ［第６表の界面活性剤の欄に示す種類と濃度］

比較例５
比較例４のキットを用いて、ヒト血清４０検体中のＬＤＬ−Ｃを実施例２と同様な方法により測定した。
次いで、キットとして、ＬＤＬ−Ｃ測定用キットであるデタミナーＬ ＬＤＬ−Ｃ（協和メデックス社製）を用いて、検体として実施例６で用いたヒト血清４０検体を用いて、同様の手順により、それぞれの検体中のＬＤＬ−Ｃを測定した。
比較例としてキットＣｂ５〜Ｃｂ７を用いた測定と、デタミナーＬ ＬＤＬ−Ｃを用いた測定との間の相関係数を第６表に示す。

第６表より、ＰＯＥ分岐アルキルエーテルを含有する実施例５のキット（キットＣａ３、Ｃａ７〜Ｃａ１１）を用いた測定においては、化合物Ａ以外の界面活性剤を含有する比較例４のキット（キットＣｂ５〜Ｃｂ７）を用いた測定に比較して、デタミナーＬ ＬＤＬ−Ｃを用いた測定との間に、より良い相関関係が認められることが判明した。

以下の、コレステロールエステル加水分解酵素を含有する第一試薬（試薬Ｃ）及びコレステロールエステル加水分解酵素を含有しない第二試薬（試薬ａ３、ａ４、ａ６、ａ７）からなるＬＤＬ−Ｃ測定用キット（キットＣａ３、Ｃａ４、Ｃａ６、Ｃａ７）を調製した。
第一試薬（試薬Ｃ）
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １ ｇ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１ ０．５ ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ３、ａ４、ａ６、ａ７）
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ ３．０ ｋＵ／Ｌ
化合物Ａ ［第７表の化合物Ａ（第二試薬）の欄に示す種類と濃度］

比較例６
以下の、コレステロールエステル加水分解酵素を含有しない第一試薬（試薬Ｄ）及びコレステロールエステル加水分解酵素を含有する第二試薬（試薬ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ４）からなるＬＤＬ−Ｃ測定用キット（キットＤｄ１、Ｄｄ２、Ｄｄ３、Ｄｄ４）を調製した。
第一試薬（試薬Ｄ）
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １ ｇ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ４）
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ−３１１ １．５ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＤＩ ３．０ ｋＵ／Ｌ
化合物Ａ ［第８表の化合物Ａ（第二試薬）の欄に示す種類と濃度］

キットとして、実施例７及び比較例６のキットを用いて、検体として、実施例６で使用した検体と同じヒト血清４０検体を用いて、実施例６と同様の方法により、デタミナーＬ ＬＤＬ−Ｃを用いた測定との相関係数を算出した。その結果も合わせて第９表に示す。

第９表より、第一試薬にＬＰＬ−３１１を含有する実施例７のキット（キットＣａ３、Ｃａ４、Ｃａ６、Ｃａ７）を用いた測定においては、第二試薬にＬＰＬ−３１１を含有する比較例６のキット（キットＤｄ１、Ｄｄ２、Ｄｄ３、Ｄｄ４）を用いた測定に比較して、デタミナーＬ ＬＤＬ−Ｃを用いた測定との間に、より良い相関関係が認められることが判明した。

本発明により、動脈硬化などの疾患の診断に有用なＬＤＬ−Ｃの測定方法及び測定用キットが提供される。

Claims (11)

1. 以下の工程を順次行うことを特徴とする検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
   ［１］検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール酸化酵素を含有しない水性媒体中で反応させる工程；
   ［２］工程［１］で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤及びコレステロール酸化酵素を添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール酸化酵素と反応させる工程；及び、
   ［３］工程［２］の反応により生成する物質又は工程［２］の反応により消費される物質を測定する工程。
2. 以下の工程を順次行うことを特徴とする検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
   ［１］検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール酸化酵素を含有しない水性媒体中で反応させる工程；
   ［２］工程［１］で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤及びコレステロール酸化酵素、さらにコレステロールエステル加水分解酵素を添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール酸化酵素及びコレステロールエステル加水分解酵素と反応させる工程；及び、
   ［３］工程［２］の反応により生成する物質又は工程［２］の反応により消費される物質を測定する工程。
3. 以下の工程を順次行うことを特徴とする検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
   ［１］検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール脱水素酵素を含有しない水性媒体中で反応させる工程；
   ［２］工程［１］で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素を添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素と反応させる工程；及び、
   ［３］工程［２］の反応により生成する物質又は工程［２］の反応により消費される物質を測定する工程。
4. 以下の工程を順次行うことを特徴とする検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
   ［１］検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール脱水素酵素を含有しない水性媒体中で反応させる工程；
   ［２］工程［１］で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素、さらにコレステロールエステル加水分解酵素を添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、及び、コレステロールエステル加水分解酵素と反応させる工程；及び、
   ［３］工程［２］の反応により生成する物質又は工程［２］の反応により消費される物質を測定する工程。
5. 工程［１］の水性媒体が、酸化型補酵素を含有する水性媒体である、請求項３又は４記載の測定方法。
6. 工程［１］、工程［２］のいずれか又は両方の反応が、さらに、ポリアニオン存在下で行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の測定方法。
7. コレステロールエステル加水分解酵素を含有し、コレステロール酸化酵素を含有しない第一試薬と、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤及びコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定するためのキット。
8. コレステロールエステル加水分解酵素がさらに第二試薬に含有される請求項７記載のキット。
9. コレステロールエステル加水分解酵素を含有し、コレステロール脱水素酵素を含有しない第一試薬と、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤及びコレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定するためのキット。
10. コレステロールエステル加水分解酵素がさらに第二試薬に含有される請求項９記載のキット。
11. ポリアニオンがさらに第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される請求項７〜１０のいずれかに記載のキット。