JP5555846B2 - 急性中枢神経障害の予後判定方法 - Google Patents

Description

本発明は、急性中枢神経障害の予後を判定する方法に関し、急性中枢神経障害患者の血液や脳脊髄液などの生体液中に発現しているＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ−ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｋｅ ３（ＳＨ３ＢＧＲＬ３）を測定するための特異抗体、該抗体を用いた急性中枢神経障害の予後を判定する方法、さらに判定のために利用するキットに関する。

近年、急性中枢神経障害患者の増加と、臓器移植の問題が絡まって、急性中枢神経障害患者の予後の判断を科学的に証明できるシステムが切望されてきている。ヒトの死の定義は、生存に最も重要な機能を持つ、心（循環）、肺（呼吸）、脳（中枢）の不可逆的停止とされており、日本では、従来から特に心停止を重視していたが、生命維持装置の発達により心臓が停止していても生きられるようになり、現在は、脳の停止(死)をヒトの死とする考えが一般化しつつある。しかしながら、脳死判定も難しく、深昏睡、瞳孔散大、脳幹反射の消失、脳波の平坦化、自発呼吸停止を脳死としているが、これだけで脳機能が全て不可逆的停止と確認できるかなど問題が多い。

急性中枢神経障害とは、心肺停止に伴う脳虚血や、心拍再開後の虚血再灌流に伴う急性期の脳障害で、心臓疾患患者に起る心原性のほか、くも膜下出血、低酸素、窒息中毒、溺水、外傷などによる心肺停止が原因としてあげられる。重症急性中枢神経障害では、社会復帰できる患者は数％〜３０％程度しかなく、これは、早期に病態を把握し、適切な治療を提供することが重要な意味を持つことを表している。従来、頭部画像検査や電気生理学的検査における異常所見、脳血流量や酸素飽和度の低下などから中枢神経障害の診断が行われている。しかしながら、これらの判定方法は、病態や予後を必ずしも反映していない。意識障害に関しては、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｃｏｍａ Ｓｃａｌｅ（ＧＣＳ）という、開眼、言語反応、運動反応の３つについて点数化して表し、点数が低いものほど、意識障害が重いことを示す判定基準はあるが、予後を判定するものではない。また６ヵ月後の患者を対象に予後判定を行うＧｌａｓｇｏｗ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｓｃａｌｅ（ＧＯＳ）は、発症急性期のものでなく、現実的には遅すぎる状況である。

心筋梗塞の患者について、高危険度あるいは予後不良を判定して、より適切に処置するための方法として、神経ホルモンマーカーであるＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ（プロＢＮＰのＮ末端断片）、虚血マーカーであるトロポニンＴ、炎症マーカーであるＣＲＰ（Ｃ−反応性タンパク質）の３種類のマーカーを測定し解析する方法が開示されている（特許文献１）。

ＳＨ３ＢＧＲＬ３は、腫瘍壊死因子感受性細胞に対する腫瘍壊死因子α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α：ＴＮＦα）の細胞溶解活性や細胞増殖抑制活性を阻害するタンパク質として、ヒト線維芽細胞内より見出された（特許文献２）。このタンパク質は、ＳＨ３ＢＧＲＬ３として、第１染色体上のｐ３４．３−３５に位置する遺伝子であることが明らかにされ、９３個のアミノ酸を有することも明らかにされている（非特許文献１）。
特許第３７８３００２号公報 特開平６−２５６３９７号公報 Ｍａｚｚｏｃｃｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８５：５４０−５４５，２００１

従来、急性中枢神経障害患者の脳障害の予後判定は、６ヶ月後に行われている。しかしながら、適切な治療を行うためには、早期に病態を把握することが必要である。このような状況から、急性中枢神経障害患者の神経学的予後予測のための早期マーカーを検索し、科学的に予後を判定する方法を提供することをその主な課題とする。

本発明者等は、ＴＮＦαの細胞溶解活性や細胞増殖抑制活性を阻害するタンパク質として、ヒト線維芽細胞より見出されたＳＨ３ＢＧＲＬ３が、急性中枢神経障害患者の神経学的予後予測のための早期マーカーになり得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供する。

（１）急性中枢神経障害の予後を判定する方法であって、心肺停止蘇生後４８時間以内に採取した患者の生体液中のＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量を測定することを特徴とする、予後判定方法。

（２）生体液中のＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量を、ＳＨ３ＢＧＲＬ３と特異的に結合する抗体を用いて測定することを特徴とする、上記（１）に記載の予後判定方法。

（３）生体液中のＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量を、５段階に分類して、ＧＯＳに基づき、障害の予後を５段階に予測することを特徴とする、上記（１）または（２）に記載の予後判定方法。

（４）生体液が脳脊髄液である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の予後判定方法。

（５）ＧＯＳにおけるｇｏｏｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ（ＧＲ）またはｍｏｄｅｒａｔｅ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ（ＭＤ）を予後良好とし、ＧＯＳにおけるｓｅｖｅｒｅ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ（ＳＤ）、ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｓｔａｔｅ（ＰＶＳ）または ｄｅａｔｈ（Ｄ）を予後不良であるとする、心肺停止蘇生３〜６ヶ月後の神経学的予後を、心肺停止蘇生１週間以内の急性期に判定することを特徴とする、上記（３）に記載の予後判定方法。

（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の予後の判定方法に用いるためのキットであって、ＳＨ３ＢＧＲＬ３抗体が含まれていることを特徴とする、心肺停止蘇生後を含む急性中枢神経障害患者の予後判定用キット。

本発明により、急性中枢神経障害患者のその後の日常生活での介助の必要性や社会復帰の可能性を含めた神経学的予後予測が早期に可能となるため、予後良好な患者には適切な治療を行うことができ、早期の社会復帰が可能となる。あるいは、移植医療が抱える問題点であるドナーの脳死判定の科学的根拠の１つとなり得るため、今後の臓器移植問題の解決に大きな貢献をすることができる。

〔発明の実施の形態〕
本発明は、急性中枢神経障害の予後を判定する方法であって、心肺停止蘇生後４８時間以内に採取した患者の生体液中のＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量を測定することを特徴とする、予後判定方法を提供する。
ＳＨ３ＢＧＲＬ３の遺伝子に関する情報は、ヒトＳＨ３ＢＧＲＬ３として公知であり、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の遺伝子データベースにおいて、アクセッションナンバーＮＭ＿０３１２８６として塩基配列が登録されており、そのアミノ酸配列は、アクセッションナンバーＮＰ＿１１２５７６として登録されている。ヒトＳＨ３ＢＧＲＬ３は、第１染色体上のｐ３４．３−３５に位置する遺伝子であり、グルタレドキシン（ＧＲＸ）ファミリーに属する配列番号１に示す９３個のアミノ酸からなる低分子量のタンパク質である。そして、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＴＩＰ−Ｂ１）と同じアミノ酸配列を有する(Ｘｕ，Ｃ． ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５７９：２７８８−２７９４，２００５)。

本発明者らは、生命現象に関るプロテオーム研究を行っており、その中で、心肺停止蘇生後の急性中枢神経障害患者の生体液中に存在するタンパク質を見出した。

プロテオーム研究では、大規模タンパク質の解析が重要な課題である。その解決のために、ナノフロー液体クロマトグラフィーと質量分析装置が直結された機器が良く用いられている。本発明に関る特異タンパク質も、前記機器による分離・解析手法により見出したものである。ナノフロー液体クロマトグラフィーは、微小なカラム（例えば、内径１００〜２００μｍで、かつ出口の内径が０．２〜０．５μｍと細くなっているもの）に、１〜５μｍのビーズを充填したものを使用することが望ましい。例えば市販されている装置として、全自動ナノフロー液体クロマトグラフィー（ナノ・ソリューション社製）がある。カラムから溶出させる速度は、１０〜２００ｎｌ／ｍｉｎが好ましいが、より好ましくは、３０〜１００ｎｌ／ｍｉｎである。この流速は、目的とするタンパク質や、カラムに充填するビーズの種類、また溶出液により最適な条件にすることが望ましい。

溶出したペプチドは、直結した質量分析装置により逐次連続的に検出する。質量分析装置では、タンパク質の種類と各タンパク質の発現量を、試料ごとに比較することができる。例えば、急性中枢神経障害患者と健常者の生体液中のタンパク質のパターンを比較して、患者にしか見られないタンパク質や、発現量に大きな差があるタンパク質を検出することが可能である。

急性中枢神経障害患者の生体液中に特異的に発現するタンパク質群からは、予後予測のバイオマーカーを選択することができる。バイオマーカーの生体液中の発現量の測定は、該バイオマーカーに特異的に結合する抗体を用いる免疫学的手法が望ましいと考えられる。バイオマーカーのひとつであるＳＨ３ＢＧＲＬ３の生体液中の発現量は、ＳＨ３ＢＧＲＬ３の抗原決定部位のアミノ酸配列を基に作製したペプチドを用い、当該ペプチドに特異的に結合する抗体を作製し、当該抗体と生体液中のＳＨ３ＢＧＲＬ３の結合体を、免疫学的手法により測定することにより行うことができる。免疫原とするペプチドは、少なくとも８アミノ酸以上、好ましくは１０アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。

抗体を作製するためのペプチドは、例えば、配列番号２のアミノ酸配列、あるいは配列番号３のアミノ酸配列を有する。前記配列において、１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたペプチドであってもよい。このような変異体は、配列表の配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列と、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

本発明の抗体は、上記ペプチドを認識する抗体であり、生体液中のＳＨ３ＢＧＲＬ３と特異的に結合し、ＳＨ３ＢＧＲＬ３を測定することができる抗体である。

本発明の抗体は、公知の方法を用いて作製することができる。かかる抗体は、一般的な抗血清から得られるポリクローナル抗体、ハイブリドーマを利用して作製されるモノクローナル抗体、あるいは、遺伝子組み換え技術やタンパク質発現技術を利用して得た抗体のいずれであってもよい。遺伝子組み換え技術やタンパク質発現技術を利用して得る抗体は、以下の方法で作製することができる。すなわち、免疫した動物からリンパ球を得て、リンパ球中のｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを調製し、該ｃＤＮＡを増幅して適切なベクターに挿入したものを、大腸菌などに組み込んで抗体タンパク質を発現させて作製する方法である。また、ＳＨ３ＢＧＲＬ３を認識する特性を失わない限り、低分子化抗体や、修飾された抗体などの抗体フラグメント、ファージディスプレイなどの遺伝子組み換え技術や試験管内での無細胞系タンパク質発現技術などを利用して人工的に作製した抗体であってもよい。

本発明の抗体は、上記ペプチドを、必要に応じて適当なアジュバントを用いて、動物の皮下あるいは腹腔内に投与して感作し、感作した動物から血液を採取し、この血液から公知の方法により血清を分離して得られる。免疫に使用する動物としては、ウサギ、ラット、マウス、サル、ヒツジ、ニワトリなどの哺乳類や鳥類等が例示されるが、その他の動物を用いても良く、特に限定されるものではない。抗体として、分離した血清をそのまま抗ＳＨ３ＢＧＲＬ３血清として使用することができるが、さらに、分離した血清を、ＳＨ３ＢＧＲＬ３の抗原決定部位を含むペプチドを固定化したカラムに、特異抗体を吸着させ単離するＡｆｆｉｎｉｔｙ法で精製して得ることもできる。

本発明は、ＳＨ３ＢＧＲＬ３に特異的に結合する抗体を用いて、生体液中のＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量を測定するものであるが、測定方法は、公知のタンパク質の測定方法に従って行うことができる。例えば、ウェスタンブロッティング法、ドットブロット法や、免疫沈降法、酵素免疫測定法 （ＥＩＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、蛍光抗体法（ＦＩＡ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、免疫細胞染色等の免疫学的測定法が挙げられる。

上記測定法においては、ＳＨ３ＢＧＲＬ３と特異的に結合する抗体やそれを認識する二次抗体を検出可能な物質で標識して行う。直接的に検出が可能な標識としては、放射性同位体やＦＩＴＣ、ローダミン等の蛍光標識、間接的に検出を行う標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素標識、ビオチン、アビジン等のアフィニティー標識、オリゴヌクレオチド等があげられる。標識の間接的検出には標識酵素の反応を利用した発色法、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）による化学発光法、ポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅法などがあげられる。そのような標識法、および検出法は組み合わせても良く、標識、および検出を行う方法は、すでによく知られている方法で行うことができる。

本発明の方法は、急性中枢神経障害患者から採取された試料においてＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量を測定する工程を含む。試料として用いる生体液は、血液、尿、脳脊髄液、リンパ液、唾液、汗等があげられる。採取した試料は、早急に冷凍あるいは低温保存することが望ましい。
本発明において「予後を判定する」とは、「心肺停止蘇生後から患者治療計画における所定の期間の予後を示す」と言い換えることもできる。

急性中枢神経障害患者の神経学的予後判定は、心肺停止蘇生１週間以内、好ましくは４８時間以内の生体液を採取して、該採取試料中のＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量を測定した結果をもとに行う。本発明の予後判定方法においては、心肺停止蘇生１週間以内、好ましくは４８時間以内に採取された生体液をもとに判定が行われれば、最終的な神経学的予後判定結果を出すまでの期間は特に限定されないが、心肺停止蘇生後１週間以内の急性期に行われることが好ましい。
本発明の方法によって判定される予後とは、心肺停止蘇生後の３〜１２ヵ月後の患者の状態をいい、最も適切には６ヶ月後の患者の状態である。本発明において患者の状態とは、脳障害の後遺症の状態を示す。
本発明の予後判定は、本発明のＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量の測定に加え、医師が他の臨床所見を含め総合的に予後判定結果を出すことを含んでもよい。

判定のための評価は、生体液中のＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量で行う。ＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量をＧＯＳという脳障害の後遺症分類に対応させて、予後判定を行うことが有効である。ＧＯＳとは脳障害の後遺症を簡潔に表現する方法として、１９７５年、Ｊｅｎｎｅｔｔ，Ｂ．ら（Ｊａｎｎｅｔｔ，Ｂ．， Ｌａｎｃｅｔ １：４８０，１９７５）によって提唱された。脳障害の後遺症を客観的に評価するには、身体的、精神的、リハビリテーション、家庭および社会の受け入れなど多くの要素が関連するため、詳細な分け方ではなく、実行可能な評価の方法がとられていることが特徴である。表１のごとく５段階に分類されるが、本発明では、急性中枢神経障害患者について、ＧＯＳがＧＲとＭＤの状態を予後良好とし、ＧＯＳがＳＤ、ＰＶＳ、Ｄの状態を予後不良としている。
本発明の方法において具体的には、患者生体液中のＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量を１〜５段階に分類し、発現量に応じてＧＯＳの各分類と対応させることができる。本発明においては、ＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量が多い場合には急性中枢神経障害の後遺症がより重症であり、予後が不良であると判定できる。本発明の判定においてより好ましくは、ＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量の測定において、ＳＨ３ＢＧＲＬ３が検出される場合には予後不良、ＳＨ３ＢＧＲＬ３が検出されない場合には予後良好であると判定することができる。

被験者がヒトである場合、疾患の診断は、通常、医師（医師の指示を受けた者も含む。以下同じ。）によって行われるが、本発明の検査方法によって得られるＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量に関するデータは、医師による診断に役立つものである。よって、本発明の検査方法は、医師による診断に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。

本発明は、ＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量を測定するための試薬を含む、急性中枢神経障害の予後を判定するための検出試薬に関する。このような検出試薬には、上記に記載のＳＨ３ＢＧＲＬ３量の測定工程に使用されるものを含みうる。例えば、ＳＨ３ＢＧＲＬ３量の測定に必要とされる抗体、染色液等を挙げることができる。
さらに、本発明の判定方法の基準となるＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量測定のための試薬を、その他の要素と予め組み合わせてキット化することもできる。該キットには、特異抗体のほか、固定化担体、標識物質、標識の検出に用いられる基質化合物、その他、蒸留水、塩、緩衝液、タンパク質安定剤、保存剤等を含めることもできる。さらに、測定操作を説明するための指示書をキットに添付することもできる。

本発明者らは、ＳＨ３ＢＧＲＬ３などのタンパク質が、予後不良の急性中枢神経障害患者の生体液中に特異的に発現することを明らかにしている。これらの知見から、特異タンパク質の発現を抑制する物質など、治療・創薬のターゲットとすることも可能である。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

ＳＨ３ＢＧＲＬ３タンパク質由来ペプチドの質量スペクトルを示す図面である。 ｃＤＮＡ配列より予想されるＳＨ３ＢＧＲＬ３タンパク質のアミノ酸配列と２ヶ所の抗原部位を示す図面である。なお、ヒト配列（ＮＰ＿１１２５７６， ＮＭ＿０３１２８６、配列番号：１）、マウス配列（ＮＰ＿５４２１２６， ＮＭ＿０８０５５９、配列番号：４）、ラット配列（ＮＰ＿００１１００１５８， ＮＭ＿００１１０６６８８、配列番号：５）である。 免疫後のウサギ由来抗血清の抗体価のグラフを示す図面である。 アフィニティー精製後の抗ＳＨ３ＢＧＲＬ３ ＩｇＧの抗体価のグラフを示す図面である。 抗ＳＨ３ＢＧＲＬ３抗血清を使用した患者脳脊髄液試料のウエスタンブロッティングを示した図面に代わる写真である。分子量２４ｋＤａのＳＨ３ＢＧＲＬ３タンパク質（矢印）が予後不良患者検体にのみ特異的に検出されていることを表す。

以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。

＜急性中枢神経障害患者検体のタンパク質解析＞

試料：心肺蘇生患者脳脊髄液検体は、蘇生後４８時間に採取されたものを用いた。コントロール脳脊髄液検体は、神経学的健常者の腰椎麻酔時に採取されたものを用いた。

試料調製：脳脊髄液に４倍量の冷アセトンを加え、沈殿したタンパク質を遠心分離により回収した。減圧乾燥後、沈殿を、８Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液に溶解し、２ｍＭ ジチオトレイトールにより室温で１時間還元、さらに５ｍＭ ヨードアセトアミドにより室温で１時間アルキル化した。反応液を水で４倍に希釈し、ブタ由来トリプシン（酵素−基質比１対５０）にて３７度で１６時間消化した。

ナノフロー液体クロマトグラフィー・質量分析：酵素消化物中のペプチドの分離と精密質量測定は全自動ナノフロー液体クロマトグラフィー（ナノ・ソリューション社製）とＱ−ｔｏｆ質量分析装置（マイクロマス社製）よりなるタンパク質解析システムにより行った。ペプチドの分離は内径１５０μｍ、長さ５０ｍｍのフューズドシリカキャピラリーにオクタドデシルシリカビーズ（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ−Ｃ１８、関東化学）を充填した逆相カラムを使用し、試料を負荷後、０．１％ギ酸を含む溶離液（流速１００ｎｌ／ｍｉｎ）にてアセトニトリル濃度を０％から８０％まで上昇させて行った。溶出されたペプチドはオンラインでＱ−ｔｏｆ質量分析装置に導入され、親イオンおよび内部断片イオンの精密質量を測定した。

配列データベース検索およびタンパク質同定：得られた質量データは配列検索ソフトウエアＭＡＳＣＯＴ（マトリックスサイエンス社製）を利用してアミノ酸配列データベース（ＲｅｆＳｅｑ ｈｕｍａｎ、米国ＮＣＢＩ）に対して検索を行い、９５％以上の信頼性をともなってペプチド配列が決定された検索結果のみをタンパク質へ帰属し同定リストを作成した。コントロール、予後良好、および予後不良患者試料からのリストを比較し、同定タンパク質を三者に共通して同定されたタンパク質群（グループＩ）、いずれかの二者で共通して同定されたタンパク質群（グループＩＩ）、各者に特異的に同定されたタンパク質群（グループＩＩＩ）の３つに分類し、グループＩＩＩで予後不良患者に特異的な同定タンパク質を中枢神経障害マーカー候補タンパク質とした。

＜結果１＞
質量分析を利用した脳脊髄液試料のタンパク質解析から、予後不良特異的タンパク質のひとつとして、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＳＨ３ＢＧＲＬ３タンパク質が同定された（図１）。

＜ＳＨ３ＢＧＲＬ３抗血清の作製＞

抗原作製：遺伝子配列（Ｍａｚｚｏｃｃｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８５：５４０−５４５，２００１：非特許文献１）から予想されるヒトＳＨ３ＢＧＲＬ３タンパク質（全長９３アミノ酸残基：配列番号１）の部分配列（Ａｒｇ_５１−Ｉｌｅ_６４：配列番号２、およびＳｅｒ_８−Ｇｌｎ_２１：配列番号３）を含む以下の２種類のペプチドを合成、リンカーを介してキャリアタンパク質ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に共有結合後、混合し免疫原とした（図２）。
ペプチド１：（Ｃｙｓ）−Ｓｅｒ_８−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ_２１
ペプチド２：Ａｒｇ_５１−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ_６４−（Ｃｙｓ）
上記（Ｃｙｓ）は、キャリア結合用システインを表す。

免疫方法：ＫＬＨ結合ペプチド（各ペプチド２００μｇ相当、合計４００μｇ／回１羽）４００μｌとアジュバント４００μｌ（初回；Ｆｒｅｕｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ， ２回目以降；Ｆｒｅｕｎｄ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）をまぜ、エマルジョンにして、ウサギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｗｈｉｔｅ（日本白色種）１４〜２０週齢（３ｋｇ前後）雌２羽）の背部皮内に２０〜３０箇所に免疫した。免疫スケジュールは、第１週に免疫前チェック採血を行い１回目の免疫、次いで、第３週に２回目の免疫、第４週に３回目の免疫、第６週に４回目の免疫、第７週に５回目の免疫、第８週にチェック採血、力価確認後、６回目の免疫を行った。第１０週に、血清分離剤の入ったカルチャーチューブに全採血を行い、遠心分離して血清を得た。

抗血清力価確認：ＥＬＩＳＡ法による（５回免疫後チェック採血時、および全採血時に実施）。ペプチドをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１μｇ／ｍｌ（各０．５μｇ／ｍｌ）に希釈後、感作用プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌで分注し、４℃一晩静置した。感作後、抗原溶液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ブロッキング溶液（ＭＢＬ製）を２００μｌ／ｗｅｌｌで分注し、４℃一晩静置する。免疫前ウサギ血清と免疫後のウサギ抗血清の希釈系列を１００倍、５００倍、２５００倍、１２５００倍、６２５００倍、ｂｌａｎｋとし、ＰＢＳで希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。洗浄後、抗ウサギＩｇＧ−ＰＯＤ標識（ＭＢＬ製品）を希釈緩衝液（ＭＢＬ製）で８，０００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。洗浄後、発色液（ＭＢＬ製）を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え３〜１０分間発色させ、２Ｎ硫酸を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、反応を停止した。反応停止後、測定波長４５０ｎｍ、参照波長６２０ｎｍで吸光度を測定した。

＜結果２＞
２羽のウサギ由来抗血清の抗体価のグラフを図３に示したが、免疫前のウサギ血清と比較して十分に高い抗体価を有する抗体であることが分かる。

＜抗ＳＨ３ＢＧＲＬ３特異抗体の作製＞

抗原ペプチド固定化カラムの作製：ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用した。ゲル２ｍｌをカラムに充填し、８ｍｌのカップリング緩衝液で洗浄した。抗原ペプチド各１ｍｇ、計２ｍｇをカップリング緩衝液２ｍｌに溶解後、カラムへ負荷し、室温で１５分間、ローテーターで攪拌した。さらに室温で３０分間の静置後、カラムを８ｍｌのカップリング緩衝液にて洗浄した。続いて２ｍｌのシステイン（７．９ｍｇ／ｍｌ）をカラムに負荷し、室温で１５分間、ローテーターで攪拌した。さらにカラムを室温で３０分間静置し、６ｍｌの洗浄用緩衝液にて洗浄後、アフィニティー吸着用緩衝液に置換し、４℃で保存した。固定化反応効率は反応前後のペプチド溶液中のＳＨ基をエルマン試薬により定量し確認した。

特異抗体の精製：カラムをＰＢＳで平衡化し、ウサギＮｏ．０２の抗血清１０ｍｌを負荷した。カラムをＰＢＳで洗浄後、カラム体積の４倍量の０．１Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ２．３）により抗体を溶出した。溶出した抗体は、氷上で速やかに１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．０）で中和した。抗体を含む画分を５０％ グリセロール／ＰＢＳに対して透析し、抗ＳＨ３ＢＧＲＬ３特異抗体とした。

精製特異抗体の力価確認：ＥＬＩＳＡ法による。すなわち、ペプチドをＰＢＳで１μｇ／ｍｌ（各０．５μｇ／ｍｌ）に希釈後、感作用プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌで分注し、４℃ 一晩静置した。感作後、抗原溶液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ製）を２００μｌ／ｗｅｌｌで分注し、４℃一晩静置した。正常ウサギＩｇＧと精製ウサギＩｇＧの希釈系列を１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０１６μｇ／ｍｌ、ブランクとし、ＰＢＳで希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。洗浄後、抗ウサギＩｇＧ−ＰＯＤ標識（ＭＢＬ製品）を希釈緩衝液（ＭＢＬ製）で８，０００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。洗浄後、発色液（ＭＢＬ製）を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え３〜１０分間発色させ、２Ｎ硫酸を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、反応を停止した。反応停止後、測定波長４５０ｎｍ、参照波長６２０ｎｍで吸光度を測定した。

＜結果３＞
アフィニティー精製により、高い抗体価を有するＩｇＧの抗体が得られたことが、図４のグラフから明らかである。

＜患者脳脊髄液のウエスタンブロッティング＞

ウエスタンブロッティング：脳脊髄液試料は等量の試料調製液（４％ ＳＤＳ，１０％２−メルカプトエタノール、２０％グリセロール、０．２％ ブロモフェノールブルー）と混合し、１００℃、３分間加熱処理をした。分離には１０％ポリアクリルアミドゲルを使用し、１検体あたり、２〜５μｌの試料を負荷後、０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス−１９２ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ８．３）中で２０ｍＡで９０分間電気泳動した。泳動後のゲルを転写装置に移し、２０％メタノールを含む２５ｍＭトリス−１９２ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ８．３）で平衡化したポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に５０ｍＡで９０分間電気泳動的に転写した。

抗体染色：転写後のＰＶＤＦ膜は５％スキムミルクを含む緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ：１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で４℃一晩ブロッキングした。膜をＴＢＳ−Ｔで洗浄後、１／５００に希釈した抗ＳＨ３ＢＧＲＬ３抗血清あるいは特異抗体を添加し、室温で１時間インキュベーション、さらにＴＢＳ−Ｔで洗浄後、１／２０００に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を添加し、室温で１時間インキュベーションした。ＳＨ３ＢＧＲＬ３タンパク質の視覚化は化学発光試薬（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ、ＧＥヘルスサイエンス社製）を膜に添加し、Ｘ線フィルムに感光することで行った。

＜結果４＞
抗ＳＨ３ＢＧＲＬ３抗血清を使用した患者脳脊髄液試料のウエスタンブロッティングで分子量２４ｋＤａ（未特定の翻訳後修飾を含む）のＳＨ３ＢＧＲＬ３タンパク質が予後不良患者検体にのみに特異的に検出された（図５）。
ＳＨ３ＢＧＲＬ３発現と各患者の症状との関係は以下の通りである。
正常コントロール患者脳脊髄液 ウエスタンブロット陽性 ０例／９例中
予後良好群患者脳脊髄液 ウエスタンブロット陽性 １例／５例中
予後不良群患者脳脊髄液 ウエスタンブロット陽性 ６例／７例中

本発明により、早期に、急性中枢神経障害患者の神経学的予後予測が可能となり、予後良好の判定が得られた患者には適切な治療を行うことにより、社会復帰の可能を高めることができる。あるいは、予後不良の判定となった患者については、移植医療が抱える問題点であるドナーの脳死判定の科学的根拠の１つとなり得るため、臓器移植提供の協力要請を早期に行うことができる。

Claims (6)

1. 急性中枢神経障害の予後を判定する方法であって、心肺停止蘇生後４８時間以内に採取した患者の生体液中のＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量を測定することを特徴とする、予後判定方法。
2. 生体液中のＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量を、ＳＨ３ＢＧＲＬ３と特異的に結合する抗体を用いて測定することを特徴とする、請求項１に記載の予後判定方法。
3. 生体液中のＳＨ３ＢＧＲＬ３発現量を、５段階に分類して、Ｇｌａｓｇｏｗ
   Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｓｃａｌｅ（ＧＯＳ）に基づき、障害の予後を５段階に予測することを特徴とする、請求項１または２に記載の予後判定方法。
4. 生体液が脳脊髄液である、請求項１〜３のいずれかに記載の予後判定方法。
5. ＧＯＳにおける、ｇｏｏｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ（ＧＲ）またはｍｏｄｅｒａｔｅ
   ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ（ＭＤ）を予後良好とし、ＧＯＳにおける、ｓｅｖｅｒｅ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ（ＳＤ）、ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｓｔａｔｅ（ＰＶＳ）または
   ｄｅａｔｈ（Ｄ）を予後不良であるとする、心肺停止蘇生３〜６ヶ月後の神経学的予後を、心肺停止蘇生１週間以内の急性期に判定することを特徴とする、請求項３に記載の予後判定方法。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の予後の判定方法に用いるためのキットであって、ＳＨ３ＢＧＲＬ３抗体が含まれていることを特徴とする、心肺停止蘇生後を含む急性中枢神経障害患者の予後判定用キット。

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