JP5565723B2 - 抗ｄｃｄモノクローナル抗体 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトダームシジン（ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ：以下、ＤＣＤとする）を認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞、これらの製造方法および利用法に関する。

ＤＣＤは、Ｂｉｒｇｉｔ Ｓｈｉｔｔｅｋらによってヒト汗中から単離された１１０個のアミノ酸からなる抗菌ペプチドである（特許文献１、非特許文献１）。人間の汗と同じｐＨ、同じ塩濃度という条件下において、大腸菌、腸球菌、黄色ブドウ球菌、カンジダに対して抗菌作用を発揮することが確認されており、ヒト汗中に恒常的に分泌されていることから、炎症時に皮膚に発現する他の抗菌ペプチド（β−デフェンシンやカテリシジン等）に比べて、皮膚の微生物の感染をコントロールしている可能性が高く、微生物・ウイルスが関わる皮膚疾患の発症に強く関連していると推測されている。

また、アトピー性皮膚炎患者の汗中ＤＣＤ量が健常人に比べて少ないことが報告されており（非特許文献２）、アトピー性皮膚炎における黄色ブドウ球菌による皮膚症状の悪化と関係がある可能性が示唆されている。さらに、汗中にはＤＣＤの分解型のペプチドが数種存在し、分解型ＤＣＤの存在比に個人差があることが報告されており（非特許文献３）、分解型ＤＣＤの存在比が微生物の易感染性の個人差に影響を与えている可能性も考えられる。そこで、ＤＣＤの疾患への寄与度が明らかになれば、汗などの生体試料中のトータルＤＣＤ量または分解型ＤＣＤ量を測定することで皮膚への微生物の易感染性を評価し、感染性疾患の予防や治療に生かすことができる可能性が考えられる。

これまで生体試料中のＤＣＤの測定には、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法が多く使われているが、この方法は正確な濃度を求めることが困難であった。生体試料中のＤＣＤ量を測定する方法としては、ＤＣＤに特異的なアミノ酸配列を認識する抗体を用いた免疫学的測定方法が簡便かつ正確である。免疫学的測定方法としては、酵素免疫測定法や、抗体を結合させたビーズを複数用いて一度に多くのパラメータを高感度に検査する方法（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘサスペンションアレイシステム（ＢｉｏＲａｄ社製）などを例示することができる）などを挙げることができる。特に、後者は、少量の検体量で多数のパラメータを検査することができる優れた方法であり、抗原認識性の異なった複数の抗体を用いて、分解型ＤＣＤの存在比を検査することも可能となる。

抗ＤＣＤ抗体としては、これまでの技術では、ポリクローナル抗体が多く市販されている。ポリクローナル抗体は抗原認識において特異性に問題が生じる場合があり、より正確なＤＣＤの定量のためには、モノクローナル抗体の方が好ましい。モノクローナル抗体としては、和歌山県立医科大学の佐川らが作製したＩｇＭクラスの抗ＤＣＤモノクローナル抗体（Ｇ−８１）がある（非特許文献４）が、ＩｇＧクラスの抗体はまだ提供されていない。この理由は定かではないが、ＤＣＤ自身の抗原性が非常に弱く、単なる免疫とハイブリドーマスクリーニング手法では、ＩｇＧ抗体産生細胞を得ることができないと考えられている。しかし、ＩｇＧクラスの抗体の方が、一般的に特異性が高いものが多く、抗原の凝集や補体活性化の強さはＩｇＭクラスの抗体の方が強い等の理由から、ＤＣＤをより正確に検出するためには、ＩｇＧクラスの抗体の方が好ましい。特に、上述した複数の抗体とビーズを用いて多数のパラメータを一度に解析する方法には、ＩｇＧクラスの抗体の使用が適しており、ＩｇＭクラスの抗体では、この手法の性能、利点を活かすことが全くできないという問題がある。

米国特許第７３４８４０９号公報

Ｂｉｒｇｉｔ Ｓｈｉｔｔｅｋ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００１， ２（１２）：１１３３−１１３７． Ｓｉｅｇｂｅｒｔ Ｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，２００６，１２６：３５４−３６５． Ｓｉｅｇｂｅｒｔ Ｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５，１７４：８００３−８０１０． Ｋａｚｕｎｏｒｉ Ｓａｇａｗａ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ．Ｊ．Ｌｅｇａｌ．Ｍｅｄ．，２００３，１１７：９０−９５．

ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマおよび当該モノクローナル抗体の提供を課題とする。また、この抗体を用いた生体試料中のＤＣＤの検査方法の提供を課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ヒトＤＣＤを大腸菌に組換え発現して大量に作製し、それを抗原として免疫された動物から得られた抗体産生細胞と、骨髄腫細胞を細胞融合法により融合し、目的とする反応性を有する抗体産生能を有するハイブリドーマをスクリーニングすることで、ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマを樹立した。そしてこのハイブリドーマを培養することにより、ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体が製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は次の（１）〜（１０）のモノクローナル抗体等に関する。
（１）ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体。
（２）Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ヒトＤＣＤを抗原として得られる上記（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）配列表配列番号２、３、６のペプチド配列と反応し、配列表配列番号４、５のペプチド配列と反応しない、ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体。
（４）１０Ｃ−３株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１７９２）が産生する上記（１）に記載のモノクローナル抗体。
（５）ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ。
（６）上記（５）に記載のハイブリドーマである１０Ｃ−３株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１７９２）。
（７）上記（５）または（６）に記載のハイブリドーマを用いることを特徴とする、ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体の製造方法。
（８）上記（５）または（６）に記載のハイブリドーマを液体培地の中またはヒトを除く恒温動物（ハイブリドーマが免疫的に排除されない動物種）の腹腔内で増殖させ、モノクローナル抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体の製造方法。
（９）上記（１）に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするヒトＤＣＤの検査方法。
（１０）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体または標識したモノクローナル抗体を使用したヒトＤＣＤ検査キット。

本発明により、ヒトＤＣＤを高い感度で検出できるＩｇＧクラスのモノクローナル抗体の提供が可能となった。本発明によって提供されるモノクローナル抗体は、汗等の生体試料に含まれるＤＣＤ量の測定等に利用できる。

抗ＤＣＤモノクローナル抗体（１０Ｃ−３抗体）の抗原認識特異性を確認した図である（実施例）。 抗ＤＣＤモノクローナル抗体（１０Ｃ−３抗体）の汗中ＤＣＤへの反応性を確認示した図である（実施例）。 抗ＤＣＤモノクローナル抗体（１０Ｃ−３抗体）を用いたＤＣＤの定量方法における検量線を示した図である（実施例）。

本発明の「モノクローナル抗体」は、ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体であれば、いずれのモノクローナル抗体であってもよい。抗体分子全体のほかに、ヒトＤＣＤを認識できる抗体のフラグメントであってもよい。
ここで、「ヒトＤＣＤを認識する」とは、ヒトＤＣＤを抗原としてヒトＤＣＤに結合したり、結合することによって何らかの作用をしたりすることをいう。
抗原として認識されるヒトＤＣＤは、ヒトＤＣＤ全体であってもよく、その一部であってもよい。
このような「モノクローナル抗体」としては、配列表配列番号２、３、６のペプチド配列と反応し、配列表配列番号４、５のペプチド配列と反応しない、ヒトＤＣＤを認識するモノクローナル抗体や、１０Ｃ−３株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１７９２）が産生するモノクローナル抗体等が挙げられる。１０Ｃ−３株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１７９２）が産生するモノクローナル抗体は、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体であることから、ＩｇＭクラスの抗体と比較して特異性が高く、好ましい。ＤＣＤは立体構造をとらず、抗原認識性が低く、モノクローナル抗体を得ることが困難であることから、本発明の「モノクローナル抗体」は非常に有用である。

本発明の「ハイブリドーマ」は、ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマであれば、いずれのハイブリドーマであってもよい。このようなハイブリドーマとしては、１０Ｃ−３株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１７９２）等が挙げられる。
本発明の「ハイブリドーマ」は、ヒトＤＣＤを免疫抗原として用いることで、血清中の抗体価が十分に上昇したマウス、ラット等の脾臓から摘出した脾臓細胞と骨髄腫細胞等を融合し、融合細胞をＨＡＴ培地等で培養することで得ることが好ましい。ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を得るために、このマウス、ラット等への免疫は、血清中の抗体価を十分に上昇できる期間行うことが好ましい。
ハイブリドーマを得るための免疫抗原としては、ヒトＤＣＤや、Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ヒトＤＣＤ等が挙げられる。
また、ＤＣＤの免疫原性（抗原性）は非常に弱いため、ＩｇＧ抗体を産生するハイブリドーマは通常数のクローニングだけでは得ることができない。従って、ＤＣＤ認識ＩｇＧ抗体産生ハイブリドーマを得るためには、ハイブリドーマのスクリーニングにあたって、一般的に行われている１，０００クローン程度の検査ではなく、少なくとも１０，０００クローン以上、好ましくは１００，０００クローン以上スクリーニングする必要がある。

本発明の「モノクローナル抗体の製造方法」は、ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマを用いる製造方法であればいずれの製造方法も含まれる。
例えば、ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマを液体培地の中またはヒトを除く恒温動物の腹腔内で増殖させ、モノクローナル抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取する方法等が挙げられる。ここで「ヒトを除く恒温動物」としては、ヒト以外の恒温動物でハイブリドーマを免疫的に排除しない動物種、例えば、ミエローマ細胞と同系のマウス、ヌードマウス、ヌードラット等が挙げられる。

本発明の「ヒトＤＣＤの検査方法」は、ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を検査に用いる方法であれば、いずれの方法であってもよい。
例えば、本発明の検査方法において、ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を用いて酵素免疫測定法を行うことにより、汗等の試料に含まれるヒトＤＣＤの検出や定量等ができる。
また、本発明のヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体と、他の抗体とを組合せ、これらの抗体を結合させた複数のビーズを用いて一度に多くのパラメータを高感度に検査する方法（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘサスペンションアレイシステム（ＢｉｏＲａｄ社製）等）等を行うこともできる。この方法では、抗原認識性の異なった複数の抗体を用いることになるので、分解型ＤＣＤの存在比を検査することもできる。

本発明の「検査キット」は、ヒトＤＣＤを検査するためのキットのことをいい、ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を使用したキットであれば、いずれのキットであってもよい。例えば、ヒトＤＣＤを認識するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体と、標準試料である精製ヒトＤＣＤとを組み合わせて使用したキット等が挙げられる。このキットに含まれるモノクローナル抗体は、ヒトＤＣＤの検出や定量のために、標識されている抗体であることが好ましい。例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識された抗体等が挙げられる。この抗体の標識物質は従来知られているものであればいずれのものを用いることもできる。
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

ＤＣＤモノクローナル抗体の製造方法
１．抗原タンパクの作製
免疫抗原として、大腸菌において組換え発現させた約１６ｋＤａのポリヒスチジン（以下、Ｈｉｓ−ｔａｇと略す）とＤＣＤの融合タンパクを用いた。
組換え発現の手法は一般的な手法を用いた。すなわち、ヒト皮膚組織から抽出したトータルＲＮＡにランダムプライマー（ＧＥヘルスケアサイエンス社製）を用いた逆転写酵素反応を行い、ｃＤＮＡを作製した。
得られたｃＤＮＡをＴＡクローニングによって市販のプラスミドベクターであるｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し安定化した。このＤＣＤ挿入ｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒを鋳型にして、ヒトＤＣＤのｃＤＮＡ配列からシグナルシークエンス領域を除いた配列（配列表配列番号１）をＰＣＲ法により増幅し、市販のプラスミドベクターであるｐＥＴ２８（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、ＤＣＤ／ｐＥＴ２８プラスミドベクターを作製した。

このＤＣＤ／ｐＥＴ２８プラスミドベクターを大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）株）にトランスフォーメーションし、カナマイシン含有寒天培地上にコロニー形成させた。１個のコロニーを採取しカナマイシン含有培地中にて振とう培養し、対数増殖期にイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを添加することにより組換えタンパクの発現を誘導した。
遠沈した大腸菌をグアニジン塩酸塩含有トリス塩酸バッファーにより溶解した。溶解液を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて固定化金属アフィニティークロマトグラフィー法により精製した後、透析によりグアニジン濃度を徐々に下げて巻き戻しを行い、ポリヒスチジン融合タンパクを得た。ここで、目的物のＨｉｓ−ｔａｇ融合ＤＣＤに該当する約１６ｋＤａと異なる分子量のタンパクが少量混在していることが確認されたため、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、目的の分子量のバンドをゲルから切り出し、エレクトロエリューター（ＢｉｏＲａｄ製）を用いてゲルからタンパクを溶出した。
一般的に、抗原性を上げるために、抗原タンパクにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニンなどのキャリアプロテインを付加する手法がとられているが、本発明においては、キャリアプロテインに対する抗体の産生を防ぐ目的で、キャリアプロテインを付加せずに、Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＤＣＤをそのまま抗原として用いた。

２．ハイブリドーマの作製
上記１．で作製した抗原タンパクのＰＢＳ溶液（抗原タンパク濃度：３．５ｍｇ／ｍｌ）をアジュバンドのＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ社製）と等量混合し、Ｗ／Ｏミセルの状態で抗原量として１５０μｇ／匹をマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ、７週齢）の背部皮下に投与した。さらに同様にＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄと混合した抗原を１０〜１４日間隔で２回追加免疫した。最後の追加免疫から２週間後、抗原タンパクをＰＢＳ溶液に等量混合して腹腔内注射し最終免疫を行った。最終免疫の３日後に脾臓細胞を摘出した。なお、抗体価は、追加免疫の７日後、マウス眼下静脈叢から血液を採取し、下記の酵素免疫測定法にて血清中の抗体価を測定し、抗原に対する抗体が産生されていることを確認した。

抗体価はＨｉｓ−ｔａｇ融合ＤＣＤを固相とした酵素免疫測定法により確認した。まず、コーティングバッファー（炭酸―重炭酸緩衝液、ｐＨ１０）を用い、Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＤＣＤを１０μｇ／ｍｌに希釈し、９６穴ＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ）に分注（５０μＬ／ウェル）して４℃で一昼夜（約１４時間）インキュベートすることにより物理吸着させた。プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと略記する）で３回洗浄後、ブロッキング液（０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を１００μＬ／ウェル加え、室温で２時間ブロッキングした。

ブロッキング液除去後、１次抗体としてマウスから得られた血清（５０μｌ／ウェル）のＰＢＳによる段階希釈液を入れて、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ｍ）ヤギポリクローナル抗体（Ｔａｇｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を室温で１時間反応させた後、オルトフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ社製）を含むペルオキシダーゼ基質溶液を加え発色させた。１０分後、１．５Ｎ硫酸を加え発色を停止した後、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
本実施例において免疫したマウスでは、未感作のマウスから得た血清と比較して、吸光度の差が認められた。１０００倍希釈した血清を用いて測定した吸光度は、未感作のマウスでは０．０５以下であったが、免疫したマウスの血清は１．８であり、抗体価が上昇していることが確認された。この抗体価が十分上昇したマウスを抗体産生細胞の供給原として次の工程に用いた。

抗体価の十分高くなったマウスの脾臓から摘出した脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞（ＦＯ）（ＡＴＣＣ）とを５対１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール（分子量１４００〜１６００、Ｓｉｇｍａ社製）存在下にて細胞融合させた。
融合細胞は脾臓細胞として２×１０^６／ｍＬになるようにＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むＲＰＭＩ培地）に懸濁し、フィーダー細胞を播種しておいた９６穴培養プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に０．１ｍＬずつ分注した。これを５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて培養し、おおよそ２週間後に、ハイブリドーマの生育してきたウェルの培養上清について、上記抗体価の測定で示した酵素免疫測定法において１次抗体を培養上清に置き換えた実験により、Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＤＣＤに反応し、合成ポリヒスチジン（６×）に反応しない抗体の産生が有望な株を選択した。ＤＣＤは立体構造をとらず、抗原認識性が悪いため、１，０００クローンのスクリーニングでは目的のモノクローナル抗体が得られず、１０，０００クローンでスクリーニングを実施し、抗ＤＣＤモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを１１種樹立した。１１種のうち、１０種はＩｇＭクラスであり、１種がＩｇＧクラスであった。このＩｇＧクラスのハイブリドーマは、出願人によって独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に２００９年３月２４日に寄託手続がされ、受領番号（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１７９２）が付与されている。以下、このハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１７９２）が産生する抗ＤＣＤモノクローナル抗体を１０Ｃ−３抗体と示す。

３．モノクローナル抗体の生産
ハイブリドーマ投与の２週間前にプリスタン０．５ｍＬを腹腔内に注射しておいた１２週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、上記で得られたハイブリドーマを細胞数５×１０^６個の量で腹腔内に投与した。約１０日後に腹水を採取し、遠心処理して上清を得た。上清を等量の吸着用緩衝液（３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ−１．５ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ、ｐＨ８．５）と混和後、濾過した。この濾液を吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＡカラム（ファルマシア社製）に通して抗体をカラムに吸着させた後、０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でカラムより溶出させ、抗ＤＣＤモノクローナル抗体（１０Ｃ−３抗体）を精製した。

４．抗ＤＣＤモノクローナル抗体（１０Ｃ−３抗体）の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスの同定
上記３．で調製された１０Ｃ−３抗体の免疫グロブリンクラスを、Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ（Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）を用いて確認した。
０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて抗体を１．０μｇ／ｍｌに希釈し、キット付属のチューブに加え、チューブ内の試薬を溶解させた。ただちにキット付属のストリップをチューブに入れ、１０分後にストリップ上に現れるバンドの位置で免疫グロブリンクラスを判定した。その結果、１０Ｃ−３抗体の免疫グロブリンクラスが、本発明において望まれるＩｇＧ２ｂ、κ軽鎖であることが確認された。

以下、本発明によって得られた１０Ｃ−３抗体と、従来技術として得られているＩｇＭクラスの抗ＤＣＤマウスモノクローナル抗体（和歌山県立医科大学より供与されたハイブリドーマ培養上清、以下Ｇ−８１抗体とする）とを比較し、１０Ｃ−３抗体の抗原認識特異性の確認等を行った。

５．抗ＤＣＤモノクローナル抗体（１０Ｃ−３抗体）の抗原認識特異性の確認
上記３．で調製された１０Ｃ−３抗体の抗原認識の特異性を確認するため、ウェスタンブロット解析を行った。上記１．で作製したＨｉｓ−ｔａｇ融合ＤＣＤを還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開後、ＰＶＤＦ膜に転写し、０．１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ、ｐＨ７．４）で４℃にて一昼夜ブロッキング後、一次抗体として１０Ｃ−３抗体（３．３ｍｇ／ｍｌ）の８０００倍希釈液またはＧ−８１抗体の１０倍希釈液、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社製）を反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで洗浄後、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウムクロライド）およびＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート）の混合液を基質として加え、発色させた。
その結果、１０Ｃ−３抗体は、Ｇ−８１抗体と同様に、Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＤＣＤと反応することが確認された（図１）。なお、図１において、レーンＭは分子量マーカー、レーンＡはＨｉｓ−ｔａｇ融合ＤＣＤのＰＶＤＦ膜上におけるクーマシーブルー（ＣＢＢ）染色結果を表し、レーンＢは１０Ｃ−３抗体、レーンＣはＧ−８１抗体によるウェスタンブロット解析の結果を表す。

６．抗ＤＣＤモノクローナル抗体（１０Ｃ−３抗体）の認識エピトープの同定
上記３．で調製された１０Ｃ−３抗体の認識エピトープを確認するため、ＤＣＤの分解された型として汗中に存在することが知られているペプチド（非特許文献３）から表１に示したアミノ酸配列を選択して合成ペプチドを作製し（ＡｎｙＧｅｎ社製）、これらを抗原とした酵素免疫測定法により１０Ｃ−３抗体の反応性を確認した。これらの配列は、配列表配列番号２〜６に示した。

酵素免疫測定法は、以下の方法により実施した。
まず、各合成ペプチドを―ＰＢＳ（−）を用い１００ｐｍｏｌ／ｍｌ）に希釈し、９６穴ＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ）に分注（５０μＬ／ウェル）して室温で約１８時間インキュベートすることにより物理吸着させた。
プレートを滅菌蒸留水で１０回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を１００μＬ／ウェル加え、３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング液除去し滅菌蒸留水で１０回洗浄後、１次抗体として１０Ｃ−３抗体のハイブリドーマ培養上清またはＧ−８１抗体（５０μｌ／ウェル）を分注し、４℃で約１８時間インキュベートした。
プレートを滅菌蒸留水で１０回洗浄後、２次抗体として希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ｍ）ヤギポリクローナル抗体（Ｔａｇｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を３７℃で１時間反応させた後、オルトフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ社製）を含むペルオキシダーゼ基質溶液を加え発色させた。１０分後、１．５Ｎ硫酸を加え発色を停止した後、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果、１０Ｃ−３抗体およびＧ−８１抗体の合成ペプチドに対する反応性は、表２に示す結果となり、１０Ｃ−３抗体の認識エピトープはＧ−８１抗体と異なること、および、１０Ｃ−３抗体の認識エピトープとして必須の部位は、次に示すアミノ酸配列の範囲に存在することが明らかになった。
認識エピトープ範囲：ＥＳＶＧＫＧＡＶＨＤＶＫＤＶＬＤＳ（全長ＤＣＤのアミノ酸配列の９２番目〜１０８番目）
１０Ｃ−３抗体はＦｕｌｌ−ＤＣＤ、ＤＣＤ−１Ｌ（配列番号２）、ＳＳＬ−４６（配列番号３）、ＬＥＫ−４５（配列番号６）のペプチドと反応し、ＳＳＬ−２９（配列番号４）、ＳＳＬ−２５（配列番号５）のペプチドと反応しないモノクローナル抗体であった。
一方、Ｇ−８１抗体は、Ｆｕｌｌ−ＤＣＤ、ＤＣＤ−１Ｌ（配列番号２）、ＳＳＬ−４６（配列番号３）、ＳＳＬ−２９（配列番号４）、ＬＥＫ−４５（配列番号６）のペプチドと反応し、ＳＳＬ−２５（配列番号５）のペプチドと反応しないモノクローナル抗体であった。従って、１０Ｃ−３抗体とＧ−８１抗体は抗原認識性が異なるので、それらを併用することにより、ＤＣＤ断片の構造についての情報を得ることができる。
また、１０Ｃ−３抗体とＧ−８１抗体の認識エピトープが異なることから、サンドイッチイムノアッセイ法に応用できる可能性がある。

７．抗ＤＣＤモノクローナル抗体（１０Ｃ−３抗体）の汗中ＤＣＤに対する反応性
上記３．で調製された１０Ｃ−３抗体の生体試料中のＤＣＤに対する反応性を、汗検体を用いたウェスタンブロット解析により確認した。
汗検体は、運動負荷によりヒト（ｎ＝３）の顔面および背中に発生した汗を回収して得られた。汗検体をスペクトラ／ポアＣＥ透析用チューブ（ＭＷＣＯ：２０００、フナコシ製）に入れ、超純水中で透析を行った後、その溶液の一部を、遠心乾燥機を用いて１０倍濃縮した。濃縮および非濃縮サンプルを還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開後、ＰＶＤＦ膜に転写し、０．１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ、ｐＨ７．４）で４℃にて一昼夜ブロッキング後、一次抗体として１０Ｃ−３抗体（３．３ｍｇ／ｍｌ）の８０００倍希釈液またはＧ−８１抗体の１０倍希釈液を用いて反応させ、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体またはマウスＩｇＭ抗体（ともにＣＡＰＰＥＬ社製）をそれぞれ反応させた。

ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで洗浄後、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウムクロライド）およびＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート）の混合液を基質として加え、発色させた。その結果、１０Ｃ−３抗体は、Ｇ−８１抗体よりも汗検体中の多くのバンドを検出した（図２）。
特に、検体１、検体２および検体３の約１８ｋＤａのバンドと検体２の約３２ｋＤａのバンドは、Ｇ−８１抗体では検出されず、１０Ｃ−３抗体では検出された。この結果から、１０Ｃ−３抗体は、Ｇ−８１では検出できないＤＣＤ、ＤＣＤ複合体またはＤＣＤ結合タンパクを認識できることが明らかとなった。図２において、レーンＭは分子量マーカーを表し、レーンＰＣは本解析のポジティブコントロールとして用いたＨｉｓ−ｔａｇ融合ＤＣＤを表す。

８．抗ＤＣＤモノクローナル抗体（１０Ｃ−３抗体）を用いたＤＣＤの定量方法
１０Ｃ−３抗体を用いてＤＣＤを定量的に検出できることを、合成ペプチドを抗原とした酵素免疫測定法により確認した。
酵素免疫測定法は、上記２．の抗体価の測定と同様の方法にて確認した。
まず、純度９５％以上の合成ＤＣＤ−１Ｌ（ＡｎｙＧｅｎ社製）をコーティングバッファー（炭酸―重炭酸緩衝液、ｐＨ１０）を用いて０．０４〜５．０μｇ／ｍｌの濃度範囲において２段階希釈し、９６穴ＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ）に分注（５０μＬ／ウェル）して、４℃で一昼夜（約１４時間）インキュベートすることにより物理吸着させた。
プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと略記する）で３回洗浄後、ブロッキング液（０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を１００μＬ／ウェル加え、室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング液除去後、１次抗体として１０Ｃ−３抗体（３．３ｍｇ／ｍｌ）の８０００倍希釈液（５０μｌ／ウェル）を分注し、室温で２時間インキュベートした。
プレートをＰＢＳＴで４回洗浄後、２次抗体として希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ｍ）ヤギポリクローナル抗体（Ｔａｇｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を室温で１時間反応させた後、オルトフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ社製）を含むペルオキシダーゼ基質溶液を加え発色させた。１０分後、１．５Ｎ硫酸を加え発色を停止した後、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
得られた吸光度をタンパク量に対してプロットした結果、０．０４〜２．５μｇ／ｍｌの濃度範囲において、直線性が得られることを確認した（図３）。よって、酵素免疫測定法により、本発明の抗体を用いてＤＣＤ含有検体中のＤＣＤ量を定量できることが確認された。

本発明のヒトモノクローナル抗体（１０Ｃ−３抗体）は、ヒトＤＣＤに対して特異的に反応し得ることから、ヒトＤＣＤの検出に使用することができる。また、本発明のハイブリドーマにより、該抗体を細胞外に半永久的に継続して安定的に製造することができる。本発明のヒトモノクローナル抗体（１０Ｃ−３抗体）およびそれを産生するハイブリドーマは、ヒト生体試料中のＤＣＤ解析や、微生物由来の感染症の予防、治療等並びにそれらの研究に有用である。

Claims (3)

1. １０Ｃ−３株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１７９２）が産生するモノクローナル抗体。
2. 請求項１に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、試料中のヒトダームシジンの検出方法。
3. 請求項１に記載のモノクローナル抗体または標識した前記モノクローナル抗体を使用したヒトダームシジン検出キット。