JP5568806B2 - 糖尿病または糖尿病合併症予防剤 - Google Patents
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本発明の糖尿病または糖尿病合併症の予防または治療剤には、カフェー酸(3,4−ジヒドロキシケイ皮酸)またはその誘導体とキナ酸またはその誘導体との結合体(例えば、カフェオイルキナ酸)が含まれる。カフェー酸およびキナ酸は、それぞれ以下の式:
本発明において、甘藷「茎葉」とは、甘藷の栽培時における地上部の茎および/または葉をいう。特に、地上から5cm以上、好ましくは10cm以上、より好ましくは20cm以上に成長した茎葉が用いられ得る。さらに、緑色を保持している茎葉を用いることが好ましい。予め、茎部と葉部とに篩別してもよい。
上記茎葉は、通常、まず、加熱処理を行う。加熱処理としては、ブランチング処理(湯通し)、乾熱処理、マイクロウェーブ処理、赤外線や遠赤外線処理、水蒸気処理などが挙げられる。これらの中でもブランチング処理、水蒸気処理が好ましい。
本発明の糖尿病または糖尿病合併症の予防または治療剤あるいは食品組成物に含まれる結合体は、上記のように、キナ酸またはその誘導体1分子に対して、カフェー酸またはその誘導体1〜3分子が結合している。本発明の予防または治療剤あるいは食品組成物に含有される上記結合体の量は、特に制限されないが、好ましくは0.000001質量%〜60質量%、より好ましくは0.00001質量%〜50質量%、さらに好ましくは0.0001質量%〜30質量%である。この結合体は、抗糖尿病または抗糖尿病合併症効果(例えば、アルドースレダクターゼ阻害効果、血糖値上昇抑制効果、インスリン分泌促進効果など)を示す。II型糖尿病に特有のインスリンの感受性が低下した状態においても、血糖値の上昇抑制効果または血糖値低下効果を発揮する。この結合体は、上記のように、甘藷茎葉などの植物体からの精製物、または化学合成物であり得る。このような結合体の摂取量は、特に制限されない。上記の生理作用を得る目的では、成人一日当たり、キナ酸に2分子のカフェー酸が結合しているジカフェオイルキナ酸を0.1mg〜4000mgまたはキナ酸に3分子のカフェー酸が結合しているトリカフェオイルキナ酸を0.001mg〜300mg、好ましくは0.01mg〜300mg摂取することが好ましい。結合体全量としては、0.2mg〜5000mg、好ましくは0.5mg〜3000mg、より好ましくは1mg〜5000mg、最も好ましくは2mg〜3000mgである。
すいおうの種芋を植え込み、栽培して、地上から30cm程度に成長した茎葉を刈り取り、水で2回洗浄して、付着した土などを取り除き、30kgの甘藷茎葉を得た。
上記甘藷茎葉を用いて、以下のようにして、クロロゲン酸、ジカフェオイルキナ酸およびトリカフェオイルキナ酸を分離した。まず甘藷茎葉3kgを凍結乾燥し、乾燥粉末150gを100%(v/v)メタノール2Lに懸濁し、25℃で一晩攪拌して抽出した後、上清を回収した。さらに、残渣へ再度2Lの100%(v/v)メタノールを加え、同様に抽出して上清を回収した。回収した上清を合わせて減圧濃縮乾固して、500mLの蒸留水に溶解した。この溶液に、さらに等容量のヘキサンを添加して攪拌した後、水層画分を回収した。得られた水層画分をMCI gelCHP20Pカラム(50×350mm:三菱化学株式会社製)へ吸着させ、20、40、60、80、および100%(v/v)メタノールの各1000mLを順にカラムへ通液し、カラムからの溶出液をそれぞれ回収した。このうち60%(v/v)メタノール水溶液で溶出した画分をクロマトレックスODSカラム(25×140mm:フジシリシア製)に吸着させ、水−メタノールの20%−70%のグラジエントによりカラムから吸着成分を溶出させた。得られた画分から、400mgのクロロゲン酸(ChA)、21mgの4,5−ジカフェオイルキナ酸(4,5−diCQA)、60mgの3,5−ジカフェオイルキナ酸(3,5−diCQA)、2mgの3,4−ジカェオイルキナ酸(3,4−diCQA)、および2mgの3,4,5−トリカフェオイルキナ酸(3,4,5−triCQA)を得た。なお、各成分の測定方法については、Md. Shahidul Islamらの方法(Journal of Agricultural and Food Chemistry、第50巻、第13号、3718頁〜3722頁)に従って行った。
上記甘藷茎葉1kgをpH8.0に調整した熱水(97℃)に1分間浸漬し、ブランチング処理を行った。ブランチング処理後、直ちに20℃の水へ浸漬して冷却し、熱風乾燥を行い、ダイサーで長径が1mm程度になるように粉砕した。加圧蒸気殺菌機で殺菌後、ハンマーミルを用いて80gの微粉末を得た(甘藷茎葉微粉末1とする)。得られた微粉末について、フォーリンチオカルト法にてポリフェノール含有量を測定したところ、微粉末1g当たり10mgのポリフェノール(カテキン量に換算して1質量%)が含まれていることがわかった。なお、フォーリンチオカルト法によるポリフェノールの測定は、甘藷茎葉1gを20mLの80容量%エタノール水溶液に混合し、加熱還流して抽出した抽出液を用いて行った。
上記実施例1にて得られた各成分を30μMとなるように70%(v/v)エタノール水溶液に溶解し、この溶液から3倍希釈系列を調製し(10、3.3、1.1、0.37、0.12、0.04、および0.01μMの計7つ)、これらを検体として以下のようにして、アルドースレダクターゼ阻害効果を評価した。なお、比較のためにカフェー酸(CA)、キナ酸(QA)、およびクェルセチンについてもそれぞれ30〜0.01μMの希釈系列を調製し、検体とした。
上記甘藷茎葉を用いて、以下のようにして甘藷茎葉のアルドースレダクターゼ阻害効果について検討した。まず、甘藷茎葉100gを凍結乾燥し、乾燥粉末50mgを80%(v/v)エタノール5mLに懸濁して、100℃で5分間抽出した。次いで、その上清を回収して、減圧濃縮乾固し、精製水1mLを加えて溶解し、甘藷茎葉粗抽出液とした。また、アントシアニンを含有するアヤムラサキの塊根部より、甘藷茎葉粗抽出液と同様に抽出して得たアヤムラサキ粗抽出液も調製した。これらの抽出液を、実施例3と同様に希釈して検体を調製し、甘藷茎葉抽出物の50%阻害濃度(IC50)を算出した。結果を表2に示す。
ラット膵β細胞を用いて、上記実施例1にて得られた各成分、CA、QA、およびインスリン分泌促進効果を有することが知られているフェルラ酸(和光純薬株式会社製)をそれぞれ検体として、これらのインスリン分泌促進作用について検証した。まず、ラット膵β細胞(RIN-5F:ATCCより分与)を、24穴プレートに1穴あたり2.0×105個/mLとなるように10%(v/v)非動化ウシ胎児血清を含有するRPM1640培地1mL中で培養した。培養後、1%(v/v)非動化ウシ胎児血清を含有するRPM1640培地1mLに交換した。この培地に、所定の濃度(甘藷茎葉粗抽出液の場合は甘藷茎葉乾燥粉末換算量)の各検体を含有する70%(v/v)エタノール水溶液の10μLを添加して培養した。培養開始から3時間後に培地を回収し、ラットインスリン測定キット(商品名:ラットインシュリンELISAキット、Mercodia社製)を用いて、各培養液中に含有されるインスリン濃度を測定した。結果を表3に示す。なお、表中のコントロールとは、標準培地のみで培養したときの培地中に含まれるインスリンの値を示す。
6週齢の雄性のSDラット(九動株式会社)25匹を標準飼料(MF、オリエンタル酵母工業株式会社)で1週間馴化した。馴化後、ストレプトゾトシンを30mg/kg体重となるように尾静脈から投与し、4日後に眼窩静脈より血液を採取し、この血液中の血糖値が200mg/dL以上となった20匹を選定し、試験用ラット(I型糖尿病モデル)とした。さらにこの20匹のラットを血糖値の平均値が同等(431〜433mg/dL)になるように4群に分けた。このうちの3群を試験群とし、これらのラット群に以下の試験液を1日1回の割合で強制経口投与した。残りの1群のラットには、0.5%Tween生理食塩水を強制経口投与した(対照群)。なお、試験中は、標準飼料を自由摂食とし、水についても自由飲水とした。
6週齢の雄性のSDラット(日本チャールス・リバー株式会社)20匹を標準飼料(MF、オリエンタル酵母工業株式会社)で1週間馴化した。馴化後、ストレプトゾトシンを35mg/kg体重となるように尾静脈から投与し、4日後に尾静脈より採血し、摂食時における血糖値を測定し、血糖値が200mg/dL以上となった10匹を選定し、試験用ラット(I型糖尿病モデル)とした。さらにこの10匹を血糖値の平均値が同等になるように2群に分けた。このうち1群を試験群とし、実施例2で得られた甘藷茎葉微粉末1を3質量%となるように標準飼料に混合した試験飼料を自由摂取させた。また、残りの1群は対照群とし、試験飼料の代わりに標準飼料を与えた。試験飼料摂取開始から21日目に採血し、血液中のインスリン濃度を実施例5と同様にして測定した。結果を表5に示す。
実施例6の試験群2(甘藷茎葉微粉末1000mg/kg体重投与)、試験群3(グァバ葉抽出物1000mg/kg体重投与)、および対照群(非投与)と同様に、強制経口投与を16日間行った3群のラットについて、16日目の強制投与の後から16時間の絶食を行い、絶食後にラットの腹腔にインスリンを0.5ユニット/kg体重となるように投与し、投与前、投与30分後、および投与60分後に眼窩静脈より血液を採取し、血糖値を測定し、平均値を求めた。結果を表6に示す。
実施例6の試験群2(甘藷茎葉微粉末1000mg/kg体重投与)、試験群3(グァバ葉抽出物1000mg/kg体重投与)、および対照群(非投与)と同様に、強制経口投与を18日間行った3群のラットについて、18日目の強制投与の後から16時間の絶食を行い、絶食後にショ糖を1.5g/kg体重となるように強制経口投与した。そして、投与前、投与60分後、および投与120分後に眼窩眼窩静脈より血液を採取し、血糖値を測定した。測定して得られた値から、投与前の血糖値を100%としたときの各時間の変化率(%)を求め、平均値を算出した。結果を表7に示す。
(1)甘藷茎葉微粉末の調製
すいおうの種芋を植え込み、栽培して、地上から30cm程度に成長した茎葉を刈り取り、水で2回洗浄して、付着した土などを取り除き、30kgの甘藷茎葉を得た。この甘藷茎葉1kgをpH8.0に調整した熱水(97℃)に1分間浸漬し、ブランチング処理を行った。ブランチング処理後、直ちに20℃の水へ浸漬して冷却し、熱風乾燥を行い、ダイサーで長径が1mm程度になるように粉砕した。加圧蒸気殺菌機で殺菌後、ハンマーミルを用いて80gの微粉末を得た(甘藷茎葉微粉末2とする)。得られた甘藷茎葉1gを20mLの99.5容量%エタノール水溶液に混合し、加熱還流して抽出した抽出液を用いるフォーリンチオカルト法にてポリフェノール含有量を測定したところ、1gの微粉末あたり1mgのポリフェノール(カテキン量に換算して0.1質量%)が含まれていることがわかった。なお、同じ甘藷茎葉微粉末を、99.5容量%エタノール水溶液の代わりに80容量%エタノール水溶液を用い、フォーリンチオカルト法にてポリフェノール含有量を測定したところ、1gあたり、9.5mgのポリフェノール(カテキン量に換算して0.95質量%)が含まれていることがわかり、実施例1と同等の甘藷茎葉微粉末であることが解った。
上記の甘藷茎葉微粉末2を用いて、以下のようにしてII型糖尿病予防および治療効果を評価した。まず、5週齢の雄性のII型糖尿病モデルマウス(KK−Ayマウス)(日本チャールズリバー社)28匹を標準飼料(MF、オリエンタル酵母工業株式会社)で1週間馴化した。馴化後、眼底より採血を行い、血糖値を測定し(グルテストセンサー、三和科学社製)、血糖値の平均値が均一になるように(257〜258mg/dL)4群に分けた。このうちの3群を試験群とし、以下の試験飼料を自由摂取させた。残りの1群のラットには、標準飼料を摂取させた(対照群)。なお、試験中、水については自由飲水とした。
上記実施例2にて得られた甘藷茎葉微粉末1を用いて、ヒトにおける血糖値上昇抑制効果について検討した。まず、朝食を抜いた被験者2名(健常人)において空腹時の血糖値を測定した。次いで、25質量%ブドウ糖溶液(標準液とする)を200mL摂取させ、摂取後30分の血糖値を測定した。そして、得られた値から、以下の式により、血糖値上昇率を算出した:
血糖値上昇率(%)=((糖摂取時血糖値/空腹時血糖値)−1)×100
上記実施例2にて得られた甘藷茎葉微粉末1、青汁の原料に用いられるケール加工粉末(株式会社東洋新薬)、および桑葉加工粉末(こだま食品株式会社)を、それぞれ3gを水100mLに溶解し、飲料(青汁)を調製した。この飲料を10名のパネラーに内容物を開示せずにランダムに試飲させて、下記評価項目にて評価させた。結果を表10に示す。
感じられない : 2点
やや感じられる : 1点
感じられる : 0点
やや強く感じられる : −1点
強く感じられる : −2点
好ましい : 2点
どちらかといえば好ましい : 1点
どちらともいえない : 0点
どちらかといえば好ましくない : −1点
好ましくない : −2点
Claims (1)
- キナ酸またはその塩類1分子とカフェー酸もしくはフェルラ酸、またはそれらの塩類3分子との結合体を含む、糖尿病または糖尿病合併症の予防または治療剤。
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