JP5581236B2

JP5581236B2 - 分注チップ及び核酸分析装置

Info

Publication number: JP5581236B2
Application number: JP2011010360A
Authority: JP
Inventors: 太朗中澤; 和俊大貫; 良仁伊名波; 正俊奈良原
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2011-01-21
Filing date: 2011-01-21
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2031-01-21
Also published as: JP2012147751A

Description

本発明は、核酸断片の配列情報を決定するときに用いる、分注チップ及び核酸分析装置に関する。

ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。

現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。

これに対し、近年、基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が提案されている。

非特許文献１では、ＤＮＡ断片を担持する媒体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子のサイズに穴径を合わせた数多くの穴を設けたプレートに、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を担持した微粒子を入れてパイロシーケンス方式で読み出している。

また、非特許文献２では、ＤＮＡ断片を担持する媒体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子をガラス基板上にばら撒いて固定し、ガラス基板上で酵素反応（ライゲーション）を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませて蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。

さらに、非特許文献３では、平滑基板上に、同一配列を有する多数のＤＮＡプローブを固定しておく。また、ＤＮＡ試料を切断後、ＤＮＡプローブ配列と相補鎖のアダプター配列を各ＤＮＡ試料断片の端に付加させる。これらを基板上でハイブリダイゼーションさせることにより、基板上にランダムに一分子ずつ試料ＤＮＡ断片を固定化させている。この場合、基板上でＤＮＡ伸長反応を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませた後、未反応基質の洗浄，蛍光検出を行い、試料ＤＮＡの配列情報を得ている。

以上のように、平滑基板上に、核酸断片試料を数多く固定することにより、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、実用化されつつある。

これらのシステムに用いられる核酸分析反応セルとしては、試料ＤＮＡまたは試料ＤＮＡを担持させた微粒子を固着させる検出領域は、より広い方が望ましい。また、シーケンス反応に必要な試料ＤＮＡ量と反応試薬量を低減するために、フローセル内の容量は、より少ない方が望ましい。さらに、検出領域外のデッドボリュームを低減するためには、試薬の流入口を狭める必要がある。

また、核酸分析反応セルは温度を伝えるため、また検出のためには薄い方が望ましい。
これらの方法に伴う化学的反応は、一般的に異なる試薬を用いた数多くのステップから成り立っており、ステップ毎に異なる試薬を含む溶液を供給する必要がある。前ステップで用いた試薬は、次ステップでの反応阻害要因や誤検出の原因となることも多く、ステップ間に洗浄工程を行い、前ステップで用いた試薬を完全に除去する必要がある。

また、使用される試薬を含む溶液は、高価な試薬であったり、貴重なＤＮＡサンプルを含む溶液であったりする事が多く、大量に使用することで反応ステップ毎に置換を行うことは望ましくない。すると一般的には液体を液体で置換するよりも気体を液体で置換する方が置換効率が良いため、これらの溶液でフローセル内を満たす際には、吸引するか、気体で押し流すかの工程を経て、前ステップで用いた試薬や洗浄液を完全に除去する必要がある。

さらに、想定した化学反応を正しく行うためには、反応ステップに使われる試薬やサンプルの溶液は気泡を含むことなくすべての検出領域に供給される必要がある。

これらを実現するためには、試薬やサンプルを含む溶液を漏れなくフローセルに供給でき、かつ気泡を含まず、さらには気体を押し流したり液体を吸引したりすることのできる機能を持った、試薬の供給，除去システムが必要となる。

但し、サンプルを含む溶液は使用者の意図によって毎回異なるサンプルであることも多いため、これらの作業は必ずしも自動化される事が効率的であるとは限らない。よって、実現されるべきシステムは自動化にも手作業にも対応したものが望ましく、手作業による微量溶液の注入が定量ピペットを使ったものが一般的であることを踏まえると、実現されるべきシステムもまた定量ピペットの使用を想定したものであることが望ましい。

ここで、特許文献１は、正確な量の液体の分配を可能とするピペットチップの構造を開示している。

特表２０１０−５１０４８８号公報

Nature 2005, Vol. 437, pp. 376-380 Science 2005, Vol. 309, pp. 1728-1732 Science 2008, Vol. 320, pp. 106-109 P.N.A.S. 2006, Vol. 103, pp. 19635-19640

一般的なピペットチップは、反応チューブのような底の深い容器から液体を吸引，注入することを目的としており、スライドガラスのような平面形状に正確な分量を滴下したり、これを全て吸引したりする作業には適応していない。

特許文献１はピペットチップより滴下される極めて微小な液体の量を正確に分配し得る構造であり、この構造を使用した場合には、試薬や溶液を正確な分量だけ平面形状に供給することはできる。

しかしながら、フローセルのような流路抵抗の高い狭流路構造に液体を漏れなく注入し、これを吸引することを実現しない。

例えば、チップの先端がフローセルの穴より小さければ穴から液が溢れる事を止められず、また気体を押し流したり液体を吸引したりすることはできない。

また、チップの先端がフローセルの穴よりも大きければ、チップの底面によってフローセルの穴を封止することはできるものの、穴を正確に封止するようチップの底面を押し当てる作業は極めて困難であり、またその構造の特徴であるピペットチップ底面の溝が充分に効果を発揮しない。結果として、その正確な分配能力は失われ、性能は一般的なピペットチップと何ら変わらない。

本発明は、上記問題点を解決するものであり、フローチップのように高い流路抵抗を持つ狭流路構造に対し、液体を漏れなく気泡なく注入し、またそれを漏らすことなく吸引し得る、手動または自動の定量ピペット類の使用を想定した、流入用チップまたは流入用チップアタッチメントを提供することを目的とする。

本発明の分注チップは、内部に液体または気体を収容する空間を有し、先端から該液体または気体を、流入または流出する分注チップにおいて、液体または気体が流入または吸引される流路の穴の周囲をシールする平面部を備えている。

流路の穴の周囲をシールする平面部を備えることで、分注チップから注入された液体または気体は漏れることなく流路に注入される。また、定量ピペットが吸引を行った際には、流路の液体または気体は定量ピペットによって吸引される。これらの効果を簡便な構造によって提供することができる。

本発明の構成の一例を説明するための図である。図１とは異なる本発明の構成の一例を説明するための図である。図１，図２とは異なる本発明の構成の一例を説明するための図である。図１，図２，図３とは異なる本発明の構成の一例を説明するための図である。図４の構成を説明する分解斜視図である。図４の一部の構成を説明する分解斜視図である。

〔第１の実施形態〕
本発明の実施例について、図１を使って説明する。図１の構成例では、本発明の定量ピペット用チップ（分注チップ１０１）は、内部に流路１０２を有し先端が平面の封止部１０３と、上記流路１０２と連続した穴（流出入口）１０６を有する先端部１０５が一体形成されている。封止部１０３は、図１に示すように、断面が円形で先端部１０５に近づくにつれて円の径が小さくなっている。また、分注チップ１０１側に外側に広がったつば部を有している。先端部１０５は、封止部１０３から突き出るように配置されている。

先端部１０５は図４に示すフローセル２０４の注入口２０１に吻合し、液体または気体はこの流出入口１０６を通ってフローセル２０４の流路２０２へと流入、または流路より吸引される（図５参照）。

繰り返しになるが、封止部１０３は流出入口１０６に近い側が平面となっている。先端部１０５がフローセル２０４の注入口２０１に吻合した際、この平面部分がフローセル２０４の注入口２０１の周囲をシールすることで、液体または気体が漏れることなくフローセル２０４の流路２０２内に流入、またはフローセル２０４の流路２０２より吸引される。

〔第２の実施形態〕
図２は、図１とは異なる本発明の構成の一例を説明するための図である。図２の構成例では、本発明は定量ピペット用のチップ１１０に吻合して使用するチップアタッチメント１１１の形態をとっている。

チップアタッチメント１１１は貫通穴１０７を備えており、この貫通穴１０７を分注チップ１０１が先端部１０５側から通る構成である。

このチップアタッチメント１１１は、図１に示す封止部１０３と同じく、先端が平面であり、断面が円形で先端部１０５に近づくにつれて円の径が小さくなっている。また、先端部１０５とは反対側に外側に広がったつば部を有している。

また、図２に示すように、チップアタッチメント１１１をチップ１１０に装着した状態で、チップ１１０の先端部１０５がチップアタッチメント１１１から突き出ている。

このような構成を採用することにより、先端部１０５がフローセル２０４の注入口２０１に吻合した際、この平面部分がフローセル２０４の注入口２０１の周囲をシールすることで、液体または気体が漏れることなくフローセル２０４の流路２０２内に流入、またはフローセル２０４の流路２０２より吸引される。

〔第３の実施形態〕
図３は、図１，図２とは異なる本発明の構成の一例を説明するための図である。図３の構成例では図２と同様に本発明はチップアタッチメントの形態をとっているが、図１のように一体成型をしても良い。但し、図２との違いは、先端部１０５がチップアタッチメント１１１から突き出ていない。

よって、フローセル２０４の注入口２０１に吻合することができないが、チップアタッチメント１１１の穴である流出入口１０６をフローセル２０４の注入口２０１に合わせることで流路が確保され、チップアタッチメント１１１の平面部分がシールすることで液体または気体が漏れることなくフローセル流路内に流入、またはフローセル流路内より吸引される。図１，図２の構成例に比べ、フローセル２０４の注入口２０１にチップの先端部１０５が入り込まないため、フローセル２０４の注入口２０１付近に損傷を与え難い。

ここで、図２，図３に類する構成例では、チップアタッチメント１１１を形成する素材は、軟性のエラストマーが適している。具体的には、耐油性，耐磨耗性，耐老化性に優れたニトリルゴム（ＮＢＲ）、ＮＢＲの耐熱性・耐候性を向上させた水素化ニトリルゴム（ＨＮＢＲ）、高い耐熱性と耐薬品性をもつフッ素ゴム（ＦＫＭ）、高い耐熱性と耐寒性をもつシリコーンゴム（ＶＭＱ）、耐老化性，耐オゾン性，耐候性，耐薬品性，耐磨耗性に優れたエチレンプロピレンゴム（ＥＰＤＭ）、耐候性，耐オゾン性，耐熱性，耐薬品性などに優れたクロロプレンゴム（ＣＲ）、高温における耐油性に優れたアクリルゴム（ＡＣＭ）、耐候性，耐オゾン性，対ガス透過性がよく極性溶剤に耐えるブチルゴム（ＩＩＲ）、力学的強度に優れたウレタンゴム（Ｕ）、耐老化性，耐オゾン性，耐薬品性，耐磨耗性に優れたクロロスルフォン化ポリエチレン（ＣＳＭ）、高温における耐油性がよく、耐ガス透過性，耐老化性がよいエピクロルヒドリンゴム（ＣＯ，ＥＣＯ）、耐磨耗性など機械的強度が大きく弾性の高い天然ゴム（ＮＲ）などが挙げられる。

分注チップ１０１および先端部１０５は耐熱，耐薬品性などに優れたフッ素樹脂（ＰＴＦＥ）や、機械的強度の観点からアルミなどの金属類、また耐薬品性に優れたガラスなどの部材が挙げられる。

図１に類する構成例では、全てが一体であるため、上記の図２，図３でチップアタッチメント１１１の構成素材として挙げた軟性のエラストマーで全てを形成することが望ましい。

〔第４の実施形態〕
図４は図１，図２，図３とは異なる本発明の構成の一例を説明するための図である。

第１〜３の実施形態では、チップ側に特徴を持たせて、液体の漏れ，気泡の注入を防止した。本実施の形態では、これに限らず、通常のチップ（例えば、図２（ａ）（ｂ）でアタッチメント１１１が装着されていないチップ）でもフローセル側に特徴を持たせて、同じような効果を奏するものである。

図４の構成例は、フローセルへの液体または気体の流入、またはフローセルからの吸引は注入口２０１，排出口２０５を通して行われるフローセル２０４を挟み込む形の核酸分析装置一例である。

図５は図４の構成を説明する分解斜視図である。図４の構成は、図５に記載したようにベース４０１にフローセル２０４が乗せられ、さらにカバー２０６が被せられ、止めネジ２０７を用いて固定されている。フローセル２０４を特定の位置にズレなく配置したい場合は、位置決め突起４０２などの手段を用いて位置決めを行う。

図６は図５におけるカバー２０６の構成を詳細に説明した分解斜視図である。カバー２０６はカバー上板２０８とカバー下板２０９の間にパッキン（封止部材）２１０を組み込み、それぞれには図４で注入口２０１，排出口２０５となる穴形状が存在する。カバー上板２０８とカバー下板２０９はカバー止めネジ２１１によって固定される。

フローセル２０４の流路に液体または気体が流れるには、フローセル２０４の穴の周囲にパッキン２１０が押し当てられ、パッキン２１０の平面部により周囲がシールされる。これによりパッキン２１０の穴とフローセル２０４の穴が連結され、図４における注入口２０１または排出口２０５より定量ピペットのチップを通して液体または気体が流入または吸引される。このような構造を採用することにより、通常のチップを用いた場合でも、液体の漏れ，気泡の注入を防止することができる。

注入口２０１または排出口２０５にテーパーをつけると、様々な種類のピペットチップを吻合することができる。

図４，図５，図６の構成において、パッキン２１０は上記に挙げた軟性エラストマーが望ましい。ベース２０３，カバー上板２０８，カバー下板２０９はＰＴＦＥ，アクリルなどの樹脂，アルミなどの金属，ガラスなどが部材として使用できる。

図１，図２，図３，図４は注入，吸引の動力として使う手動操作を前提に定量ピペットとピペットチップを使用するよう構成例を記載したが、自動化の際にはピペットチップを使用することのできるあらゆる注入または吸引装置が使用できる。

また、図２，図３の構成例においては、アタッチメントを吻合することができれば、ピペットチップに限らずノズルなどを使用することもできる。

また、図４の構成例においては、注入口２０１または排出口２０５に吻合できればピペットチップに限らずノズルなどを使用することもできる。

本発明は上述の実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは当業者に容易に理解されよう。

１０１分注チップ
１０２流路
１０３封止部
１０５先端部
１０６流出入口
１０７貫通穴
１１１チップアタッチメント
２０１注入口
２０２流路
２０４フローセル
２０５排出口
２０６カバー
２０７止めネジ
２０８カバー上板
２０９カバー下板
２１０パッキン
２１１カバー止めネジ
４０１ベース
４０２位置決め突起

Claims

内部に液体または気体を収容する空間を有し、先端から該液体または気体を、流入または流出する分注チップにおいて、
分注チップ本体部と、内部に流路を有し、先端が平面の封止部と、上記流路と連続した穴を有する先端部と、が一体形成されており、
上記先端部は、上記封止部から突き出るように配置されており、
上記封止部は、断面が円形で上記先端部に近づくにつれて円の径が小さくなっており、
上記封止部は、軟性エラストマーで成形されていることを特徴とする、分注チップ。