JP5583311B2 - プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 - Google Patents
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Description
本発明は５’−イノシン酸および５’−グアニル酸を代表とするプリンヌクレオチド、並びにこれらの合成原料として重要な物質であるイノシンおよびグアノシン等のプリンヌクレオシド、などのプリン系物質の製造法に用いられるバチルス属細菌に関する。プリン系物質は、調味料、医薬並びにそれらの原料等として有用である。
発酵法によるイノシンおよびグアノシンの生産に関しては、アデニン要求株、またはそれにプリンアナログをはじめとする各種の薬剤に対する耐性を付与したバチルス属の微生物（特許文献１〜８参照）、およびブレビバクテリウム属の微生物（特許文献９，１０又は非特許文献１参照）等を用いる方法が知られている。
このような変異株を取得するには、従来、紫外線照射やニトロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）処理などの変異誘起処理を行い、適当な選択培地を用いて、目的とする変異株を取得するという方法が行われてきた。
このような変異株を取得するには、従来、紫外線照射やニトロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）処理などの変異誘起処理を行い、適当な選択培地を用いて、目的とする変異株を取得するという方法が行われてきた。
一方で、遺伝子工学技術を用いたプリン系物質生産株の育種もバチルス属の微生物（特許文献１１〜２０参照）、ブレビバクテリウム属の微生物（特許文献２１参照）、およびエシェリヒア属の微生物（特許文献２２参照）で行われている。具体的には、例えば、プリンオペロンのリプレッサータンパク質遺伝子（purR）が破壊されたバチルス属細菌を用いて、ヒポキサンチン、ウラシル、グアニン及びアデニン等の核酸系物質を効率よく製造する方法（特許文献２３参照）が開示されている。
バチルス・ズブチリスでは、前記リプレッサータンパク質は、プリンオペロンの遺伝子群の他に、ＡＭＰ生合成に関与するｐｕｒＡ遺伝子（非特許文献２参照）、ホルミルテトラヒドロ葉酸生合成に関与するｇｌｙＡ遺伝子（非特許文献３参照）およびヒポキサンチン／グアニンのトランスポーターをコードするｐｂｕＧ遺伝子（非特許文献４参照）などの発現を調節することが知られている。
バチルス・ズブチリスでは、前記リプレッサータンパク質は、プリンオペロンの遺伝子群の他に、ＡＭＰ生合成に関与するｐｕｒＡ遺伝子（非特許文献２参照）、ホルミルテトラヒドロ葉酸生合成に関与するｇｌｙＡ遺伝子（非特許文献３参照）およびヒポキサンチン／グアニンのトランスポーターをコードするｐｂｕＧ遺伝子（非特許文献４参照）などの発現を調節することが知られている。
さらに、ｐｕｒＲ遺伝子破壊に加えて、サクシニル−ＡＭＰシンターゼ遺伝子（purA）を破壊してアデニン要求性を付与すること、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（deoD）を破壊して、イノシンのヒポキサンチンへの分解を抑制することによって、イノシンを効率的に製造する方法が開示されている（特許文献８参照）。
酸化的ペントースリン酸経路は、グルコースがグルコースキナーゼによりリン酸化されてグルコース−６−リン酸が生合成され、該グルコース−６−リン酸が酸化的にリボース−５−リン酸へ転換される経路である。この経路とプリン系物質の生合成経路との関係はあまり知られておらず、微生物の酸化的ペントースリン酸経路を改変してプリン系物質生産菌を育種するという試みはなされていなかった。
特公昭３８−２３０９９号公報
特公昭５４−１７０３３号公報
特公昭５５−２９５６号公報
特公昭５５−４５１９９号公報
特公昭５７−１４１６０号公報
特公昭５７−４１９１５号公報
特開昭５９−４２８９５号公報
特開２００４−２４２６１０号公報
特公昭５１−５０７５号公報
特公昭５８−１７５９２号公報
特開昭５８−１５８１９７号公報
特開昭５８−１７５４９３号公報
特開昭５９−２８４７０号公報
特開昭６０−１５６３８８号公報
特開平１−２７４７７号公報
特開平１−１７４３８５号公報
特開平３−５８７８７号公報
特開平３−１６４１８５号公報
特開平５−８４０６７号公報
特開平５−１９２１６４号公報
特開昭６３−２４８３９４号公報
国際公開第９９／０３９８８号パンフレット
米国特許第６，２８４，４９５号
Agric.Biol.Chem., 1978, 42, 399-405
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 7455-7459
J. Bacteriol., 2001, 183, 6175-6183
J. Bacteriol., 2003, 185, 5200-5209,
本発明は、発酵法によってプリンヌクレオシド及び/又はプリンヌクレオチドなどのプリン系物質を製造するために好適なバチルス属細菌を創製すること、及び同細菌を用いたプリン系物質の製造法を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、バチルス属細菌において、酸化的ペントース−リン酸経路の酵素活性、特にグルコース−６−リン酸−脱水素酵素、又はリボース−５−リン酸イソメラーゼの活性を増強することによって、プリンヌクレオシドやプリンヌクレオチドの生産能が向上することを見出した。さらに、ホスホリボシルピロリン酸（PRPP）シンセターゼ、あるいはプリンヌクレオチド生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が上昇するように改変すること、またはプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が低減するように改変することによって、さらにバチルス属細菌のプリン系物質生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）プリン系物質生産能を有し、酸化的ペントースリン酸経路の酵素の活性が上昇するように改変されたことを特徴とするバチルス属細菌。
（２）前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである（１）のバチルス属細菌。
（３）前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、アデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである（１）のバチルス属細菌。
（４） 前記酸化的ペントースリン酸経路の酵素が、グルコース−６−リン酸−脱水素酵素、又はリボース５−リン酸イソメラーゼである（１）〜（３）のいずれかのバチルス属細菌。
（５）前記酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより酸化的ペントースリン酸経路の酵素活性が増強した（１）〜（４）のいずれかのバチルス属細菌。
（６）前記酵素がグルコース−６−リン酸−脱水素酵素であり、該グルコース−６−リン酸−脱水素酵素をコードする遺伝子が下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子である（５）のバチルス属細菌。
（Ａ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース−６−リン酸−脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（７）前記酵素がリボース５−リン酸イソメラーゼであり、該リボース５−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子が下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードする遺伝子である（５）のバチルス属細菌
（Ｅ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、リボース５−リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。
（８）前記数個が１〜２０個である、（６）と（７）のいずれかのバチルス属細菌。
（９）前記酵素がグルコース−６−リン酸−脱水素酵素であり、該グルコース−６−リン酸−脱水素酵素をコードする遺伝子が下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（５）のバチルス属細菌。
（ａ）配列番号４７に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号４７に記載の塩基配列の相補配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、グルコース−６−リン酸−脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１０）前記酵素がリボース５−リン酸イソメラーゼであり、該リボース５−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子が下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡである（５）のバチルス属細菌。
（ｅ）配列番号４９に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｆ）配列番号４９に記載の塩基配列の相補配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、リボース５−リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１１）さらにホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性が上昇するように改変されたことを特徴とする（１）〜（１０）のいずれかのバチルス属細菌。
（１２）さらに、プリンオペロンの発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかのバチルス属細菌。
（１３）プリンオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子であるｐｕｒＲ遺伝子が破壊されたこと、あるいは、プリンオペロンのアテニュエーター領域の一部が除去されたことによりプリンオペロンの発現量が上昇したことを特徴とする（１２）のバチルス属細菌。（１４）さらに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする（１）〜（１３）のいずれかのバチルス属細菌
（１５）（１）〜（１４）のいずれかのバチルス属細菌を培地に培養して、プリン系物質を蓄積せしめ、プリン系物質を回収することを特徴とするプリン系物質の製造法。
（１６）プリン系物質がプリンヌクレオシドまたはプリンヌクレオチドである、（１５）の製造法。
（１７）上記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである（１６）の製造法。
（１８）上記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、アデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである（１６）の製造法。
（１９）（１７）の方法によりプリンヌクレオシドを製造し、該プリンヌクレオシドに、ポリ燐酸、フェニル燐酸、カルバミル燐酸からなる群より選択された燐酸供与体と、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物または酸性フォスファターゼを作用させて、プリンヌクレオチドを生成せしめ、該プリンヌクレオチドを採取するこ
とを特徴とするプリンヌクレオチドの製造法。
（１）プリン系物質生産能を有し、酸化的ペントースリン酸経路の酵素の活性が上昇するように改変されたことを特徴とするバチルス属細菌。
（２）前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである（１）のバチルス属細菌。
（３）前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、アデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである（１）のバチルス属細菌。
（４） 前記酸化的ペントースリン酸経路の酵素が、グルコース−６−リン酸−脱水素酵素、又はリボース５−リン酸イソメラーゼである（１）〜（３）のいずれかのバチルス属細菌。
（５）前記酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより酸化的ペントースリン酸経路の酵素活性が増強した（１）〜（４）のいずれかのバチルス属細菌。
（６）前記酵素がグルコース−６−リン酸−脱水素酵素であり、該グルコース−６−リン酸−脱水素酵素をコードする遺伝子が下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子である（５）のバチルス属細菌。
（Ａ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース−６−リン酸−脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（７）前記酵素がリボース５−リン酸イソメラーゼであり、該リボース５−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子が下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードする遺伝子である（５）のバチルス属細菌
（Ｅ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、リボース５−リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。
（８）前記数個が１〜２０個である、（６）と（７）のいずれかのバチルス属細菌。
（９）前記酵素がグルコース−６−リン酸−脱水素酵素であり、該グルコース−６−リン酸−脱水素酵素をコードする遺伝子が下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（５）のバチルス属細菌。
（ａ）配列番号４７に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号４７に記載の塩基配列の相補配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、グルコース−６−リン酸−脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１０）前記酵素がリボース５−リン酸イソメラーゼであり、該リボース５−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子が下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡである（５）のバチルス属細菌。
（ｅ）配列番号４９に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｆ）配列番号４９に記載の塩基配列の相補配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、リボース５−リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１１）さらにホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性が上昇するように改変されたことを特徴とする（１）〜（１０）のいずれかのバチルス属細菌。
（１２）さらに、プリンオペロンの発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかのバチルス属細菌。
（１３）プリンオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子であるｐｕｒＲ遺伝子が破壊されたこと、あるいは、プリンオペロンのアテニュエーター領域の一部が除去されたことによりプリンオペロンの発現量が上昇したことを特徴とする（１２）のバチルス属細菌。（１４）さらに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする（１）〜（１３）のいずれかのバチルス属細菌
（１５）（１）〜（１４）のいずれかのバチルス属細菌を培地に培養して、プリン系物質を蓄積せしめ、プリン系物質を回収することを特徴とするプリン系物質の製造法。
（１６）プリン系物質がプリンヌクレオシドまたはプリンヌクレオチドである、（１５）の製造法。
（１７）上記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである（１６）の製造法。
（１８）上記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、アデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである（１６）の製造法。
（１９）（１７）の方法によりプリンヌクレオシドを製造し、該プリンヌクレオシドに、ポリ燐酸、フェニル燐酸、カルバミル燐酸からなる群より選択された燐酸供与体と、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物または酸性フォスファターゼを作用させて、プリンヌクレオチドを生成せしめ、該プリンヌクレオチドを採取するこ
とを特徴とするプリンヌクレオチドの製造法。
本発明のバチルス属細菌を用いることによりプリンヌクレオシドやプリンヌクレオチドなどのプリン系物質を効率よく製造することができる。
＜１＞本発明のバチルス属細菌
（I）プリン系物質生産能の付与
本発明のバチルス属細菌は、プリン系物質生産能を有し、酸化的ペントース−リン酸経路の酵素の活性が増強するように改変されたバチルス属細菌である。
（I）プリン系物質生産能の付与
本発明のバチルス属細菌は、プリン系物質生産能を有し、酸化的ペントース−リン酸経路の酵素の活性が増強するように改変されたバチルス属細菌である。
「プリン系物質」としてはプリン骨格を含む物質をいうが、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチドなどが挙げられる。ここでプリンヌクレオシドとは、イノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンなどを意味し、プリンヌクレオチドとは、プリンヌクレオシドの５’−燐酸エステル、例えばイノシン酸（イノシン−５’−リン酸 以下「IMP」ともいう）、キサンチル酸（キサントシン−５’−リン酸 以下「XMP」ともいう）、グアニル酸（グアノシン−５’−モノリン酸、以下「GMP」ともいう）、アデニル酸（アデノシン−５’−モノリン酸以下「AMP」ともいう）などを意味する。
「プリン系物質生産能」とは、本発明のバチルス属細菌を培地中で培養したときに、プリン系物質を細胞又はまたは培地から回収できる程度に細胞内または培地中に分泌、生成、蓄積できる能力をいう。なお、本発明のバチルス属細菌は、上記プリン系物質のうちの２種類以上の生産能を有するものであってもよい。
「プリン系物質生産能」とは、本発明のバチルス属細菌を培地中で培養したときに、プリン系物質を細胞又はまたは培地から回収できる程度に細胞内または培地中に分泌、生成、蓄積できる能力をいう。なお、本発明のバチルス属細菌は、上記プリン系物質のうちの２種類以上の生産能を有するものであってもよい。
プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌としては、本来的にプリン系物質生産能を有するものであってもよいが、以下に示すようなバチルス属細菌を、変異法や組換えＤＮＡ法を利用して、プリン系物質生産能を有するように改変することによって得られるものでもよい。また、後述するようにして酸化的ペントースリン酸合成経路の酵素活性が上昇するように改変することによってプリン系物質生産能が付与されたバチルス属細菌であってもよい。
本発明のバチルス属細菌を得るために用いられるバチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス等が挙げられる。
バチルス・ズブチリスとしては、バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇ（ATCC6051）、バチルス・ズブチリスＰＹ７９（Plasmid, 1984, 12, 1-9）等が、バチルス・アミロリケファシエンスとしては、バチルス・アミロリケファシエンスＴ（ATCC23842）、及びバチルス・アミロリケファシエンスＮ（ATCC23845）等が挙げられる。
バチルス・ズブチリスとしては、バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇ（ATCC6051）、バチルス・ズブチリスＰＹ７９（Plasmid, 1984, 12, 1-9）等が、バチルス・アミロリケファシエンスとしては、バチルス・アミロリケファシエンスＴ（ATCC23842）、及びバチルス・アミロリケファシエンスＮ（ATCC23845）等が挙げられる。
イノシン生産能を有するバチルス属細菌は、上記のようなバチルス属細菌に、例えば、アデニン要求性、又はさらにプリンアナログ等の薬剤に対する耐性を付与することにより、取得することが出来る。（特公昭３８−２３０９９、特公昭５４−１７０３３、特公昭５５−４５１９９、特公昭５７−１４１６０、特公昭５７−４１９１５、特公昭５９−４２８９５、US2004-0166575A参照）。栄養要求性及び薬剤耐性を持つバチルス属細菌は、Ｎ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）、もしくはＥＭＳ(エタンメタンスルフォネート)等の通常の変異処理に用いられている変異剤による処理によって取得することが出来る。
バチルス属に属するイノシン生産株の具体例として、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１
６株を使用することができる。同菌株は、プリンオペロンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子の欠損（purR::spc）、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子の欠損（purA::erm）、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子の欠損（deoD::kan）が導入された、既知のバチルス・ズブチリスｔｒｐＣ２株（168 Marburg）の誘導体である。（特開２００４−２４２６１０）また、バチルス・ズブチリス菌株ＡＪ３７７２（ＦＥＲＭ Ｐ−２５５５）（特開昭６２−０１４７９４）等を使用することもできる。また、バチルス・ズブチリスの６−エトキシプリン耐性株（US2004-0166575A）やIMP脱水素酵素（IMPデヒドロゲナーゼ）（EP273660）を弱化した菌株も使用することが出来る。
６株を使用することができる。同菌株は、プリンオペロンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子の欠損（purR::spc）、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子の欠損（purA::erm）、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子の欠損（deoD::kan）が導入された、既知のバチルス・ズブチリスｔｒｐＣ２株（168 Marburg）の誘導体である。（特開２００４−２４２６１０）また、バチルス・ズブチリス菌株ＡＪ３７７２（ＦＥＲＭ Ｐ−２５５５）（特開昭６２−０１４７９４）等を使用することもできる。また、バチルス・ズブチリスの６−エトキシプリン耐性株（US2004-0166575A）やIMP脱水素酵素（IMPデヒドロゲナーゼ）（EP273660）を弱化した菌株も使用することが出来る。
グアノシン生産能を有するバチルス属細菌としては、ＩＭＰデヒドロゲナーゼの活性が上昇したバチルス属細菌（特開平３−５８７８７）、プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性遺伝子が組み込まれているベクターをアデニン要求性変異株に導入したバチルス属細菌（特公平４−２８３５７）等が挙げられる。
またプリンヌクレオチドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。
イノシン酸生産菌としては、バチルス・ズブチリスのフォスファターゼ活性が弱化したイノシン生産株が報告されている（Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805、Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259）。グアニル酸生産菌としては、アデニン要求性を有しさらにデコイニンまたはメチオニンスルフォキシドに耐性を有し、かつ５’−グアニル酸（グアノシン−５’−モノリン酸、以下「GMP」ともいう）生産能を有するバチルス属の変異株が挙げられる。（特公昭５６−１２４３８号公報）
イノシン酸生産菌としては、バチルス・ズブチリスのフォスファターゼ活性が弱化したイノシン生産株が報告されている（Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805、Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259）。グアニル酸生産菌としては、アデニン要求性を有しさらにデコイニンまたはメチオニンスルフォキシドに耐性を有し、かつ５’−グアニル酸（グアノシン−５’−モノリン酸、以下「GMP」ともいう）生産能を有するバチルス属の変異株が挙げられる。（特公昭５６−１２４３８号公報）
また、プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌を育種する方法として、以下の方法が挙げられる。プリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドに共通のプリン生合成に関与する酵素、すなわちプリン生合成酵素の細胞内での活性を上昇させる方法が挙げられる。該酵素の細胞内での活性は、バチルス属細菌の非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌よりも上昇させることが好ましい。「活性が上昇する」とは、例えば、細胞当たりの酵素分子の数が増加した場合や、酵素分子当たりの比活性が上昇した場合などが該当する。例えば、前記酵素の遺伝子の発現量を上昇させることにより活性を上昇させることができる。
前記プリン生合成に関与する酵素としては、たとえばホスホリボシル酸ピロリン酸（PRPP）アミドトランスフェラーゼ、ＰＲＰＰシンセターゼなどが挙げられる
ペントース−リン酸系に取り込まれたグルコースなどの糖源が代謝により生成したカタボライトの一部は、リブロース−５−リン酸を経由して、リボース−５−リン酸となる。生合成されたリボース−５−リン酸より、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成の不可欠な前駆物質であるＰＲＰＰが生成される。具体的には、リボース−５−リン酸は、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ（PRPP synthetase [EC:2.7.6.1]）によりＰＲＰＰに転換される。したがって、ＰＲＰＰシンセターゼの活性が上昇するように改変することにより、バチルス属細菌にプリン系物質生産能を付与することができ、ペントース−リン酸系生合成系酵素の強化と組み合わせるとより効果的である。
「ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が増強される」とは、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増加していることをいう。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性は例えば、Ｓｗｉｔｚｅｒ等の方法（Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11）、Ｒｏｔｈ等の方法（Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17）により、測定することができる。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ
の活性が増強されたバチルス属細菌は、例えば、特開２００４−２４２６１０号公報に記載の方法と同様にして、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子をバチルス属細菌で高発現させることにより作製することができる。本発明に利用出来るホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子は、配列番号５７に記載のバチルス属細菌由来のｐｒｓ遺伝子 (Genbank Accession No. X16518)が挙げられるが、他の細菌由来の遺伝子、動植物由来の遺伝子でもバチルス属でホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば、何れも用いることが出来る。
の活性が増強されたバチルス属細菌は、例えば、特開２００４−２４２６１０号公報に記載の方法と同様にして、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子をバチルス属細菌で高発現させることにより作製することができる。本発明に利用出来るホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子は、配列番号５７に記載のバチルス属細菌由来のｐｒｓ遺伝子 (Genbank Accession No. X16518)が挙げられるが、他の細菌由来の遺伝子、動植物由来の遺伝子でもバチルス属でホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば、何れも用いることが出来る。
一方、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成に不可欠な前駆物質であるＰＲＰＰが生成されると、その一部は、プリン生合成に関与する酵素群によりプリンヌクレオシド、プリンヌクレオチドへと変換される。そのような酵素群をコードする遺伝子としては、バチルス・ズブチリスのｐｕｒＥＫＢ−ｐｕｒＣ（ｏｒｆ）ＱＬＦ−ｐｕｒＭＮＨ（Ｊ）−ｐｕｒＤオペロンの遺伝子（Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87）（現在では、purEKBCSQLFMNHDとも呼ばれる：Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press,
Washington D.C., 2002）、およびエシェリヒア・コリのｐｕｒレギュロンの遺伝子（Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）が例示される。
したがって、これらの遺伝子の発現を増強することにより、プリン系物質生産能を付与することもできる。なお、本発明に用いることが出来るプリンオペロン遺伝子はこれらのものには限定されず、他の微生物や動植物由来の遺伝子も利用することも出来る。
Washington D.C., 2002）、およびエシェリヒア・コリのｐｕｒレギュロンの遺伝子（Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）が例示される。
したがって、これらの遺伝子の発現を増強することにより、プリン系物質生産能を付与することもできる。なお、本発明に用いることが出来るプリンオペロン遺伝子はこれらのものには限定されず、他の微生物や動植物由来の遺伝子も利用することも出来る。
プリンオペロンの発現量を増大させる方法としては、後述の酸化的ペントースリン酸経路の酵素活性を増大させると同様に、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、プリンオペロン遺伝子をバチルス属細菌で高発現させる方法が挙げられる。
プリンオペロンの発現量を増大させる第２の方法として、プリンオペロン固有のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することや、固有のプロモーターの−３５、−１０領域をコンセンサス配列に置換することが挙げられる。
例えば、バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）では、プリンオペロンの−３５配列はコンセンサス配列（TTGACA）であるが、−１０配列はＴＡＡＧＡＴであり、コンセンサス配列ＴＡＴＡＡＴとは異なっている（Ebbole, D. J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274−8287）。したがって、−１０配列（ＴＡＡＧＡＴ）をコンセンサス配列ＴＡＴＡＡＴ、あるいはコンセンサス配列と近似する配列ＴＡＴＧＡＴ、ＴＡＡＡＡＴとなるように改変することで、プリンオペロンの転写活性を上昇させることができる。なお、プロモーター配列の置換は、下記の遺伝子置換と同様の方法で行うことが出来る。
例えば、バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）では、プリンオペロンの−３５配列はコンセンサス配列（TTGACA）であるが、−１０配列はＴＡＡＧＡＴであり、コンセンサス配列ＴＡＴＡＡＴとは異なっている（Ebbole, D. J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274−8287）。したがって、−１０配列（ＴＡＡＧＡＴ）をコンセンサス配列ＴＡＴＡＡＴ、あるいはコンセンサス配列と近似する配列ＴＡＴＧＡＴ、ＴＡＡＡＡＴとなるように改変することで、プリンオペロンの転写活性を上昇させることができる。なお、プロモーター配列の置換は、下記の遺伝子置換と同様の方法で行うことが出来る。
プリンオペロンの発現量を増大させる第３の方法として、プリンオペロンのリプレッサーの発現量を低下させる方法も挙げられる。（ＵＳ６，２８４，４９５号）
プリンリプレッサーの発現量を低下させるためには、例えば、バチルス属細菌を紫外線照射またはＮＴＧもしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、プリンリプレッサーの発現量が低下した変異株を選択する方法を採用することができる。
また、プリンリプレッサーの発現量が低下したバチルス属細菌は、変異処理の他に、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202）により、染色体上のプリンリプレッサーをコードする遺
伝子（purR；GenBank Accession NC_000964 配列番号５１）を、正常に機能しない遺伝子（以下、「破壊型遺伝子」ということがある）で置換することによって得ることができる。
破壊型遺伝子で、宿主染色体上の正常遺伝子を置換するには、例えば以下のようにすればよい。なお、以下の例では、ｐｕｒＲ遺伝子を例として説明するが、他の遺伝子、例えば後述のｐｕｒＡ又はｄｅｏＤ遺伝子についても、同様にして遺伝子破壊を行うことができる。
また、プリンリプレッサーの発現量が低下したバチルス属細菌は、変異処理の他に、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202）により、染色体上のプリンリプレッサーをコードする遺
伝子（purR；GenBank Accession NC_000964 配列番号５１）を、正常に機能しない遺伝子（以下、「破壊型遺伝子」ということがある）で置換することによって得ることができる。
破壊型遺伝子で、宿主染色体上の正常遺伝子を置換するには、例えば以下のようにすればよい。なお、以下の例では、ｐｕｒＲ遺伝子を例として説明するが、他の遺伝子、例えば後述のｐｕｒＡ又はｄｅｏＤ遺伝子についても、同様にして遺伝子破壊を行うことができる。
相同組換えは、染色体上の配列と相同性を有する配列を持ち、バチルス属細菌内で複製できないプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体が染色体上に組み込まれる。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により破壊された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより、染色体上の正常なｐｕｒＲ遺伝子が破壊型ｐｕｒＲ遺伝子に置換された菌株を取得することができる。
このような相同組換えによる遺伝子破壊技術は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法、温度感受性プラスミドを用いる方法等が利用できる。また、薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたｐｕｒＲ遺伝子を含み、かつ、目的とする微生物細胞内で複製できないプラスミドを用いることによっても、ｐｕｒＲ遺伝子の破壊を行うことができる。すなわち、前記プラスミドで形質転換され、薬剤耐性を獲得した形質転換体は、染色体ＤＮＡ中にマーカー遺伝子が組み込まれている。このマーカー遺伝子は、その両端のｐｕｒＲ遺伝子配列と染色体上のｐｕｒＲ遺伝子との相同組換えによって組み込まれる可能性が高いため、効率よく遺伝子破壊株を選択することができる。
遺伝子破壊に用いる破壊型ｐｕｒＲ遺伝子は、具体的には、制限酵素消化及び再結合によりｐｕｒＲ遺伝子の一定領域を欠失させたり、ｐｕｒＲ遺伝子へ他のＤＮＡ断片（マーカー遺伝子等）を挿入したり、部位特異的変異法（Kramer, W. and Fritz, H. J., Methods Enzymol., 1987, 154, 350-367）またはリコンビナントＰＣＲ法（PCR Technology, Stockton Press (1989)）や次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理（Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75, 2170-2174）によって、ｐｕｒＲ遺伝子のコーディング領域またはプロモーター領域等の塩基配列の中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせたりして、コードされるリプレッサーの活性が低下又は消失したか、又はｐｕｒＲ遺伝子の転写が低下または消失したものを選択することにより、取得することができる。これらの態様の中では、制限酵素消化及び再結合によりｐｕｒＲ遺伝子の一定領域を欠失させる方法、又はｐｕｒＲ遺伝子へ他のＤＮＡ断片を挿入する方法が、確実性及び安定性の点から好ましい。
なお、ｐｕｒＲ遺伝子は、プリンオペロンを持つ微生物の染色体ＤＮＡから、公知のｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によって取得することができる。また、プリンオペロンを持つ微生物の染色体ＤＮＡライブラリーから、公知のｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、ｐｕｒＲ遺伝子を取得することができる。バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇ株では、ｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列が報告されている（GenBank accession No.D26185（コード領域は塩基番号118041〜118898）、NC_000964(コード領域は塩基番号54439〜55296)）。ｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列及び同遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を、配列表の配列番号５１及び５２に示す（特開２００４−２４２６１０号参照）。
ｐｕｒＲ遺伝子を得るためのＰＣＲに用いるプライマーとしては、ｐｕｒＲ遺伝子の一部を増幅することができるものであればよく、具体的には配列番号５９（GAAGTTGATGATCAAAA）及び配列番号６０（ACATATTGTTGACGATAAT）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。
ｐｕｒＲ遺伝子を得るためのＰＣＲに用いるプライマーとしては、ｐｕｒＲ遺伝子の一部を増幅することができるものであればよく、具体的には配列番号５９（GAAGTTGATGATCAAAA）及び配列番号６０（ACATATTGTTGACGATAAT）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。
破壊型遺伝子の作製に用いるｐｕｒＲ遺伝子は、必ずしも全長を含む必要はなく、遺伝子破壊を起こすのに必要な長さを有していればよい。また、各遺伝子の取得に用いる微生物は、同遺伝子が、遺伝子破壊株の創製に用いるバチルス属細菌のｐｕｒＲ遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していれば特に制限されない。しかし、通常は、目的とするバチルス属細菌と同じ細菌に由来する遺伝子を用いることが好ましい。
バチルス属細菌のｐｕｒＲ遺伝子と相同組換えを起こし得るＤＮＡは、配列番号５２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡであってもよい。前記「数個」は、例えば１〜５０個、好ましくは、１〜３０個、より好ましくは１〜１０個である。
バチルス属細菌のｐｕｒＲ遺伝子と相同組換えを起こし得るＤＮＡは、配列番号５２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡであってもよい。前記「数個」は、例えば１〜５０個、好ましくは、１〜３０個、より好ましくは１〜１０個である。
前記バチルス属細菌のｐｕｒＲ遺伝子と相同組換えを起こし得るＤＮＡとしては具体的には、配列番号５１に示す塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。ストリンジェントな条件としては、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄が行われる条件が挙げられる。
前記マーカー遺伝子としては、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のスペクチノマイシン耐性遺伝子は、バチルス ジェネチック ストック センター（BGSC）より市販されているエシェリヒア・コリ ＥＣＥ１０１株から、プラスミドｐＤＧ１７２６を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。また、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のエリスロマイシン耐性遺伝子は、バチルス ジェネチック ストック センター（BGSC）より市販されているエシェリヒア・コリＥＣＥ９１株から、プラスミドｐＤＧ６４６を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。さらに、カナマイシン耐性遺伝子は、ストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus faecalis）由来カナマイシン耐性遺伝子は、バチルス ジェネチック ストック センター（BGSC）より市販されているエシェリヒア・コリ ＥＣＥ９４株から、プラスミドｐＤＧ７８３を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いる場合は、該遺伝子をプラスミド中のｐｕｒＲ遺伝子の適当な部位に挿入し、得られるプラスミドで微生物を形質転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択すれば、ｐｕｒＲ遺伝子破壊株が得られる。染色体上のｐｕｒＲ遺伝子が破壊されたことは、サザンブロッティングやＰＣＲ法により、染色体上のｐｕｒＲ遺伝子又はマーカー遺伝子を解析することによって、確認することができる。前記スペクチノマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれたことの確認は、これらの遺伝子を増幅することができるプライマーを用いたＰＣＲにより、行うことができる。
また、プリンオペロンの発現はプロモーター下流に位置するｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ−ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列（以下、アテニュエーター配列と称する）に制御されていることが知られている（Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1987, 262,
8274−8287、Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1988, 263, 10894−10902、Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Bacteriol., 1989, 171, 2136−2141）（図１参照）。したがって、アテニュエーター配列を欠損させることで、プリンオペロンの発現量を上昇させることができる。アテニュエーター配列の欠損はｐｕｒＲ破壊と同様の方法で行うことが出来る。
8274−8287、Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1988, 263, 10894−10902、Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Bacteriol., 1989, 171, 2136−2141）（図１参照）。したがって、アテニュエーター配列を欠損させることで、プリンオペロンの発現量を上昇させることができる。アテニュエーター配列の欠損はｐｕｒＲ破壊と同様の方法で行うことが出来る。
なお、プリンオペロン転写をさらに増大させるためには、上記方法を組み合わせてもよく、例えば、ｐｕｒＲ遺伝子を破壊し、さらに、アテニュエーター配列を欠損させたプリンオペロンをプラスミドで増幅するか、あるいは、このようなプリンオペロンを染色体上で多コピー化させてもよい。
また、プリン生合成に関与する酵素の活性増強は、プリン生合成に関与する酵素の調節を解除すること、例えば、前記酵素のフィードバック阻害を解除する方法によっても行うことができる（ＷＯ９９／０３９８８）。
さらに、プリン系物質の細胞内へ取り込みを弱化することによっても、プリン系物質生産能を強化することができる。例えば、プリンヌクレオシドの細胞内へ取り込みは、プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応を遮断することによって弱化することができる。上記プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応は、たとえばヌクレオシドパーミアーゼに触媒される反応である。
さらに、プリン系物質生産能を増強させるためにプリン系物質を分解する酵素の活性を低下させてもよい。このような酵素として、例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼが挙げられる。
ＰＲＰＰから、プリン生合成に関与する酵素群により生合成されたプリンヌクレオチドは、脱リン酸化されて、プリンヌクレオシドをつくる。プリンヌクレオシドを効率的に蓄積せしめるためには、プリンヌクレオシドを更に分解してヒポキサンチン等とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼの活性を低下させることが好ましい。すなわち、イノシンをはじめとするプリンヌクレオシドを基質とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼを弱化、あるいは欠損させるように改変することが望ましい。
具体的には、バチルス属細菌でプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子とｐｕｐＧ遺伝子を破壊することによって達成することができる。本発明のバチルス属細菌は、上記のようなｄｅｏＤ遺伝子とｐｕｐＧ遺伝子を単独、または同時に破壊するように改変されたものであってもよい。ｄｅｏＤ遺伝子、ｐｕｐＧ遺伝子は、例えばバチルス属由来の遺伝子（deoD;Genbank Accession No. NC_000964（配列番号５５）,pupG;Genbank Accession No. NC_000964（配列番号５３））が利用でき、上記ｐｕｒＲ遺伝子破壊と同様の方法で遺伝子破壊株を取得出来る。
さらに、プリン系物質生産能を増強させるために、イノシンモノリン酸（IMP）脱水素酵素の活性を低下させてもよい。ＩＭＰ脱水素酵素をコードする遺伝子としては、ｇｕａＢ遺伝子が挙げられる。ｇｕａＢ遺伝子としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．NC_000964(15913..17376)で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる（配列番号６１）。
ＰＲＰＰから、プリン生合成に関与する酵素群により生合成されたプリンヌクレオチドは、脱リン酸化されて、プリンヌクレオシドをつくる。プリンヌクレオシドを効率的に蓄積せしめるためには、プリンヌクレオシドを更に分解してヒポキサンチン等とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼの活性を低下させることが好ましい。すなわち、イノシンをはじめとするプリンヌクレオシドを基質とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼを弱化、あるいは欠損させるように改変することが望ましい。
具体的には、バチルス属細菌でプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子とｐｕｐＧ遺伝子を破壊することによって達成することができる。本発明のバチルス属細菌は、上記のようなｄｅｏＤ遺伝子とｐｕｐＧ遺伝子を単独、または同時に破壊するように改変されたものであってもよい。ｄｅｏＤ遺伝子、ｐｕｐＧ遺伝子は、例えばバチルス属由来の遺伝子（deoD;Genbank Accession No. NC_000964（配列番号５５）,pupG;Genbank Accession No. NC_000964（配列番号５３））が利用でき、上記ｐｕｒＲ遺伝子破壊と同様の方法で遺伝子破壊株を取得出来る。
さらに、プリン系物質生産能を増強させるために、イノシンモノリン酸（IMP）脱水素酵素の活性を低下させてもよい。ＩＭＰ脱水素酵素をコードする遺伝子としては、ｇｕａＢ遺伝子が挙げられる。ｇｕａＢ遺伝子としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．NC_000964(15913..17376)で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる（配列番号６１）。
また、プリン系物質生産能を増強させる方法として、プリン系物質を排出する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を増幅することが考えられる。このような遺伝子が増幅された細菌としては、例えば、ｒｈｔＡ遺伝子を増幅したバチルス属細菌が挙げられる。（特開２００３−２１９８７６）
また、本発明に用いる微生物は、さらにヌクレオシダーゼやヌクレオチダーゼをコードする遺伝子を欠損させれば、各々に対応するヌクレオシド又はヌクレオチドを蓄積させることができ、又イノシンの要求性を付与すれば、これらの生合成系経路上の前駆体及びそ
の関連物質を蓄積させることができる。
また、本発明に用いる微生物は、さらにヌクレオシダーゼやヌクレオチダーゼをコードする遺伝子を欠損させれば、各々に対応するヌクレオシド又はヌクレオチドを蓄積させることができ、又イノシンの要求性を付与すれば、これらの生合成系経路上の前駆体及びそ
の関連物質を蓄積させることができる。
（II）酸化的ペントースリン酸経路の酵素活性を上昇させるための改変
本発明のバチルス属細菌は、上述のようなプリン系物質生産能を有する菌株を酸化的ペントースリン酸経路の酵素活性を上昇するように改変することによって取得することが出来る。ただし、改変の順は問わず、酸化的ペントースリン酸経路の酵素活性を上昇するように改変したのちにプリンヌクレオチド生産能を付与してもよい。
本発明のバチルス属細菌は、上述のようなプリン系物質生産能を有する菌株を酸化的ペントースリン酸経路の酵素活性を上昇するように改変することによって取得することが出来る。ただし、改変の順は問わず、酸化的ペントースリン酸経路の酵素活性を上昇するように改変したのちにプリンヌクレオチド生産能を付与してもよい。
ここで「酸化的ペントースリン酸経路」とは、細胞内にとりこまれたグルコースが、グルコースキナーゼによりリン酸化され、グルコース−６−リン酸が生合成され、グルコース−６−リン酸は、酸化的にリボース−５−リン酸へ転換される経路を意味する。酸化的ペントースリン酸経路の酵素とは具体的には、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（EC:1.1.1.49）、６−リン酸−グルコン酸脱水素酵素（EC：1.1.1.44）、または、リボース−５−リン酸イソメラーゼ(EC:5.3.1.6)などの酵素を意味し、本発明のバチルス属細菌は、これらの酵素のうちグルコース−６−リン酸−脱水素酵素とリボース−５−リン酸イソメラーゼのいずれかの活性が上昇するように改変されたものであってもよい。
酸化的ペントースーリン酸経路の酵素活性は、野生株又は非改変株の活性よりも上昇していることが好ましい。酵素活性の上昇は、以下のような方法で測定出来る。例えば、グルコース−６−リン酸−脱水素酵素の酵素活性は実施例６の（１）に記載したようなＮＡＤＰＨの生成を測定する方法で、または、リボース−５−リン酸イソメラーゼの酵素活性は実施例６の（２）に記載したようなリブロース− ５−リン酸の生成を測定する方法で測定出来る。
酸化的ペントースリン酸経路の酵素活性が上昇するように改変するには、例えば、酸化的ペントースリン酸経路の酵素をコードする遺伝子を増幅させればよい。用いることのできる遺伝子は酸化的ペントースリン酸経路の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である限り特に限定されないが、例えばバチルス属由来の遺伝子が挙げられる。
バチルス・ズブチリスのグルコース−６−リン酸脱水素酵素（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）は配列番号４８に示す４８９個のアミノ酸から構成されるものが挙げられ、該タンパク質をコードする遺伝子、好ましくは配列番号４７（zwf遺伝子；Genbank
Accession No. NC_000964）の塩基配列を有する遺伝子を改変に用いることができる。なお、ｚｗｆ遺伝子は、バチルス・ズブチリス染色体上の２１２度に存在する。
バチルス・ズブチリスのグルコース−６−リン酸脱水素酵素（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）は配列番号４８に示す４８９個のアミノ酸から構成されるものが挙げられ、該タンパク質をコードする遺伝子、好ましくは配列番号４７（zwf遺伝子；Genbank
Accession No. NC_000964）の塩基配列を有する遺伝子を改変に用いることができる。なお、ｚｗｆ遺伝子は、バチルス・ズブチリス染色体上の２１２度に存在する。
また、リボース−５−リン酸イソメラーゼとしては、配列番号５０に示す１４９個のアミノ酸から構成されるタンパク質が挙げられ、該タンパク質をコードする遺伝子、好ましくは配列番号４９の塩基配列を有する遺伝子（ywlF遺伝子；Genbank Accession No. NC_000964）を改変に用いることができる。なお、ｙｗｌＦ遺伝子は、バチルス・ズブチリス染色体上３２４度に、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするｇｌｙＡ遺伝子に近接して存在する。なお、リボース−５−リン酸イソメラーゼはリボース−５−リン酸エピメラーゼと呼ばれているものも含む。
また、バチルス属以外の細菌、例えば他の微生物又は動植物由来の酸化的ペントースリン酸経路の酵素をコードする遺伝子も使用することもできる。微生物または動植物由来の酸化的ペントースリン酸経路の酵素をコードする遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、またはそれらの塩基配列とのホモロジー等に基いて酸化的ペントースリン酸経路の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によりそのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域
を増幅することによって、取得することができる。配列情報はＧｅｎｂａｎｋ等のデータベースを利用出来る。
を増幅することによって、取得することができる。配列情報はＧｅｎｂａｎｋ等のデータベースを利用出来る。
バチルス属細菌において、これらの目的とする酵素の細胞内の活性を上昇させるには、同酵素をコードする遺伝子の発現を増強することによって達成される。同遺伝子の発現量の増強は、同遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、前記酵素をコードする遺伝子断片を、バチルス属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えＤＮＡを作製し、これをバチルス属細菌宿主に導入して形質転換すればよい。
導入する遺伝子は、バチルス属細菌由来の遺伝子、およびバチルス属細菌で機能する限り、エシェリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。
目的とする遺伝子は、例えば、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet., 1989, 5, 185-189参照）によって、取得することができる。染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 1963, 72, 619-629、生物工学実験書、日本生物工学会編、97〜98頁、培風館、1992年参照）等により調製することができる。ＰＣＲ用プライマーは、バチルス属細菌の公知の遺伝子配列に基づいて、又は他の細菌等で配列が公知の遺伝子間で保存されている領域の情報に基づいて、調製することができる。
バチルス属細菌に目的遺伝子を導入するための自律複製可能なベクターとしては、例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４等が挙げられる。また、染色体ＤＮＡに目的遺伝子を組み込むためのベクターとしては、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（Stratagene）等のＥ．ｃｏｌｉ用ベクター等が挙げられる。
目的遺伝子とバチルス属細菌で機能するマーカーを搭載したベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、目的遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結はＴ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
導入する遺伝子は、バチルス属細菌由来の遺伝子、およびバチルス属細菌で機能する限り、エシェリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。
目的とする遺伝子は、例えば、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet., 1989, 5, 185-189参照）によって、取得することができる。染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 1963, 72, 619-629、生物工学実験書、日本生物工学会編、97〜98頁、培風館、1992年参照）等により調製することができる。ＰＣＲ用プライマーは、バチルス属細菌の公知の遺伝子配列に基づいて、又は他の細菌等で配列が公知の遺伝子間で保存されている領域の情報に基づいて、調製することができる。
バチルス属細菌に目的遺伝子を導入するための自律複製可能なベクターとしては、例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４等が挙げられる。また、染色体ＤＮＡに目的遺伝子を組み込むためのベクターとしては、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（Stratagene）等のＥ．ｃｏｌｉ用ベクター等が挙げられる。
目的遺伝子とバチルス属細菌で機能するマーカーを搭載したベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、目的遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結はＴ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
前記バチルス属で機能するマーカー遺伝子として、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のスペクチノマイシン耐性遺伝子は、バチルス ジェネチック ストック センター（BGSC）より市販されているエシェリヒア・コリ ＥＣＥ１０１株から、プラスミドｐＤＧ１７２６を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。また、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のエリスロマイシン耐性遺伝子は、バチルス ジェネチック ストック センター（BGSC）より市販されているエシェリヒア・コリＥＣＥ９１株から、プラスミドｐＤＧ６４６を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。さらに、カナマイシン耐性遺伝子は、ストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus faecalis）由来カナマイシン耐性遺伝子は、バチルス ジェネチック
ストック センター（BGSC）より市販されているエシェリヒア・コリ ＥＣＥ９４株から、プラスミドｐＤＧ７８３を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。
ストック センター（BGSC）より市販されているエシェリヒア・コリ ＥＣＥ９４株から、プラスミドｐＤＧ７８３を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。
上記のように調製した組換えＤＮＡをバチルス属細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Dubnau, D., and Davidoff-Abelson, R., J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）、又は、宿主細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang, S. and Cohen, S.N., Molec. Gen. Genet., 1979, 168, 111-115）が挙げられる。
目的遺伝子のコピー数を高めることは、同遺伝子をバチルス属細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。バチルス属細菌の染色体ＤＮＡ上に目的遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、トランスポゾン、繰返し配列、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピート等が利用できる。
目的酵素の活性の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上またはプラスミド上の目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。プロモーターの強度は、ＲＮＡ合成開始の頻度により定義される。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。また、国際公開Ｗ０００／１８９３５に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られている。これら発現調節配列の改変は、目的遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
例えば、バチルスで機能するプロモーターとしては、ｖｅｇプロモーター、ｓｐａｃプロモーター、ｘｙｌプロモーター等が挙げられる。
例えば、バチルスで機能するプロモーターとしては、ｖｅｇプロモーター、ｓｐａｃプロモーター、ｘｙｌプロモーター等が挙げられる。
なお、本発明の微生物において活性を上昇させる酸化的ペントースリン酸経路の酵素は、それぞれの酵素活性が損なわれない限り、配列番号４８または５０の配列において１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む酵素タンパクであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には１から３０個、好ましくは、１から２０個、より好ましくは１から１０個である。
上記の酸化的ペントースリン酸経路の酵素タンパクの変異は、酵素活性が維持されるような保存的変異である。置換は、アミノ酸配列中の少なくとも１残基が除去され、そこに他の残基が挿入される変化である。酵素タンパクの元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。
上記のような酸化的ペントースリン酸経路の酵素タンパクと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように、これら酵素をコードするの塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異処理前のＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることにより、酸化的ペントースリン酸経路の酵素と実質的に同一のタンパク質をコードする
ＤＮＡが得られる。また、変異を有する酸化的ペントースリン酸経路の酵素をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号４７、または４９に記載の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酸化的ペントースリン酸経路の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
ＤＮＡが得られる。また、変異を有する酸化的ペントースリン酸経路の酵素をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号４７、または４９に記載の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酸化的ペントースリン酸経路の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
プローブとして、配列番号４７、４９の塩基配列の相補配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号４７、４９の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号４７、４９の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
酸化的ペントースリン酸経路の酵素と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号４８、５０に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ酸化的ペントースリン酸経路の酵素産物活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
＜２＞プリン系物質の製造法
本発明のバチルス属細菌はプリン系物質を効率よく生産する。したがって、本発明のバチルス属細菌を好適な培地で培養することによって、培地中にプリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドなどのプリン系物質を生成蓄積せしめることができる。
本発明に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可能なものならばよい。
炭素源としてはグルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、キシロース、トレハロース、リボース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類、グリセロールやマンニトールなどのアルコール類が使用され、その他、グルコン酸、酢酸、クエン酸、マレイン酸、フマール酸、コハク酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩または大豆加水分解物などの有機窒素等が使用される。
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸やヌクレオシド等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
本発明のバチルス属細菌はプリン系物質を効率よく生産する。したがって、本発明のバチルス属細菌を好適な培地で培養することによって、培地中にプリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドなどのプリン系物質を生成蓄積せしめることができる。
本発明に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可能なものならばよい。
炭素源としてはグルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、キシロース、トレハロース、リボース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類、グリセロールやマンニトールなどのアルコール類が使用され、その他、グルコン酸、酢酸、クエン酸、マレイン酸、フマール酸、コハク酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩または大豆加水分解物などの有機窒素等が使用される。
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸やヌクレオシド等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養条件は、用いるバチルス属細菌の種類によるが、例えばバチルス・ズブチリスでは、発酵温度２０〜５０℃、ｐＨを４〜９に制御しつつ通気培養を行う。培養中にｐＨが低下する場合にはアンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして４０時間〜３日間程度培養することにより、培養液中にプリンヌクレオシドが蓄積される。
培養終了後、培養液中に蓄積されたイノシンなどのプリン系物質を採取する方法としては公知の方法に従って行えばよい。例えば、沈殿法、またはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。
培養終了後、培養液中に蓄積されたイノシンなどのプリン系物質を採取する方法としては公知の方法に従って行えばよい。例えば、沈殿法、またはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。
さらに、本発明の方法により製造されたイノシンあるいはグアノシンに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびホスホリボシルトランスフェラーゼを作用させることにより、５'−イノシン酸あるいは５'−グアニル酸が得られる。
また、本発明の微生物を用いて生産されたプリンヌクレオシドに、ポリ燐酸、フェニル燐酸、カルバミル燐酸からなる群より選択された燐酸供与体と、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物や、酸性フォスファターゼを作用させることによって、プリンヌクレオチド（ヌクレオシド−５’−燐酸エステル）を生産することも可能である。ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物は、プリンヌクレオシドをプリンヌクレオチドに変換する能力を有するものであれば特に制限されないが、例えば、国際公開パンフレットＷＯ９６３７６０３号に記載されたような微生物が挙げられる。 また、特開平０７−２３１７９３に開示されているようなEscherichia blattae JCM 1650、Serratia ficaria ATCC 33105、Klebsiella planticola IFO 14939 (ATCC
33531)、Klebsiella pneumoniae IFO 3318 (ATCC 8724)、Klebsiella terrigena IFO 14941 (ATCC 33257)、Morganella morganii IFO 3168、Enterobacter aerogenes IFO 12010、Enterobacter aerogenes IFO 13534 (ATCC 13048)、Chromobacterium fluviatile IAM 13652、Chromobacterium violaceum IFO 12614、Cedecea lapagei JCM 1684、Cedecea davisiae JCM 1685、Cedecea neteri JCM 5909などを用いることもできる。
酸性フォスファターゼ（EC 3.1.3.2）としては、例えば、特開２００２−０００２８９、 US6,010,851, US6,015,697, WO01/18184に開示されているようなものを用いることができ、より好ましくはヌクレオシドに対する親和性が上昇した酸性フォスファターゼ（特開平１０−２０１４８１参照）やヌクレオチダーゼ活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ（ＷＯ９６３７６０３参照）、燐酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ（US6,010,851）などを用いることができる。
33531)、Klebsiella pneumoniae IFO 3318 (ATCC 8724)、Klebsiella terrigena IFO 14941 (ATCC 33257)、Morganella morganii IFO 3168、Enterobacter aerogenes IFO 12010、Enterobacter aerogenes IFO 13534 (ATCC 13048)、Chromobacterium fluviatile IAM 13652、Chromobacterium violaceum IFO 12614、Cedecea lapagei JCM 1684、Cedecea davisiae JCM 1685、Cedecea neteri JCM 5909などを用いることもできる。
酸性フォスファターゼ（EC 3.1.3.2）としては、例えば、特開２００２−０００２８９、 US6,010,851, US6,015,697, WO01/18184に開示されているようなものを用いることができ、より好ましくはヌクレオシドに対する親和性が上昇した酸性フォスファターゼ（特開平１０−２０１４８１参照）やヌクレオチダーゼ活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ（ＷＯ９６３７６０３参照）、燐酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ（US6,010,851）などを用いることができる。
［実施例］
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
＜プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損株の構築と培養評価＞
（１）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（pupG）欠損株の構築
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（deoD）を欠損した組換え体KMBS16（特開２００４−２４２６１０号）に、pupG遺伝子欠損を導入した菌株の作製を、以下のようにして行った。
（１）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（pupG）欠損株の構築
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（deoD）を欠損した組換え体KMBS16（特開２００４−２４２６１０号）に、pupG遺伝子欠損を導入した菌株の作製を、以下のようにして行った。
（ｉ）pupGの5'側領域のクローニング
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、以下の塩
基配列を有するそれぞれ20 mer、29 merのPCR用プライマーを作製した。
ATTGCACGGCCGTTCGTCGG（配列番号１）
cgcagatctCCGGATTTTCGATTTCGTCC（小文字の塩基はBglIIサイトを含むタグを示す、配列番号２）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、pupG遺伝子翻訳開始コドン上流の約610 bpとその下流約120 bpを含む増幅断片を得た。
PCR増幅断片は、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、Perfectly Blunt Cloning Kit（NOVAGEN）を用いて、付属のpT7Blueプラスミドにクローニングした。本プラスミドのマルチクローニングサイトの両端は、EcoRIとHindIIIであり、pupG遺伝子上流域がEcoRI側にあるプラスミドpKM48を得た。
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、以下の塩
基配列を有するそれぞれ20 mer、29 merのPCR用プライマーを作製した。
ATTGCACGGCCGTTCGTCGG（配列番号１）
cgcagatctCCGGATTTTCGATTTCGTCC（小文字の塩基はBglIIサイトを含むタグを示す、配列番号２）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、pupG遺伝子翻訳開始コドン上流の約610 bpとその下流約120 bpを含む増幅断片を得た。
PCR増幅断片は、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、Perfectly Blunt Cloning Kit（NOVAGEN）を用いて、付属のpT7Blueプラスミドにクローニングした。本プラスミドのマルチクローニングサイトの両端は、EcoRIとHindIIIであり、pupG遺伝子上流域がEcoRI側にあるプラスミドpKM48を得た。
（ii）pupGの3'側領域のクローニング
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有する、それぞれ20 mer、29 merのPCR用プライマーを作製した。
CAAAGATCTGTCCAGCCTGG（配列番号３）
cgcctgcagTGCCTTTATCTAAAGCTTCC（小文字の塩基はPstIサイトを含むタグを示す、配列番号４）
B. subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、pupG遺伝子翻訳終止コドン上流の約340 bpとその下流約400 bpを含む増幅断片を得た。
pupGの5'側領域のクローニングの場合と同様にして、pT7Blueプラスミドにクローニングし、pupG遺伝子下流域がEcoRI側にあるプラスミドpKM49を得た。
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有する、それぞれ20 mer、29 merのPCR用プライマーを作製した。
CAAAGATCTGTCCAGCCTGG（配列番号３）
cgcctgcagTGCCTTTATCTAAAGCTTCC（小文字の塩基はPstIサイトを含むタグを示す、配列番号４）
B. subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、pupG遺伝子翻訳終止コドン上流の約340 bpとその下流約400 bpを含む増幅断片を得た。
pupGの5'側領域のクローニングの場合と同様にして、pT7Blueプラスミドにクローニングし、pupG遺伝子下流域がEcoRI側にあるプラスミドpKM49を得た。
（iii）DpupG断片のクローニング
pKM49をSpeIで処理後、Klenow fragmentにより平滑化し、さらにPstIで処理して、約740 bpのDNA断片を切り出した。この断片をpKM48をBglIIで処理、Klenow fragmentにより平滑化した後、PstIで処理したプラスミド断片とT4 DNAリガーゼを用いて連結させ、pKM75を得た。このプラスミドは、pupG構造遺伝子内で約360 bpが欠損したpupG欠損DNAを含む約1470 bpのインサートを保持する。
pKM49をSpeIで処理後、Klenow fragmentにより平滑化し、さらにPstIで処理して、約740 bpのDNA断片を切り出した。この断片をpKM48をBglIIで処理、Klenow fragmentにより平滑化した後、PstIで処理したプラスミド断片とT4 DNAリガーゼを用いて連結させ、pKM75を得た。このプラスミドは、pupG構造遺伝子内で約360 bpが欠損したpupG欠損DNAを含む約1470 bpのインサートを保持する。
（iv）pupG破壊用プラスミドの構築
pKM75をSacIとPstIで処理してインサートを切り出し、この断片を、同酵素で処理した染色体組換え用ベクターpJPM1（Mueller et. al., J. Bacteriol., 1992, 174, 4361-4373）とT4 DNAリガーゼを用いて連結させ、pKM76を得た。
得られたプラスミドpKM76を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS16株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した（1回組換え株）。
得られた1回組換え株をクロラムフェニコール含有LB培地10 mlに植菌し、37℃で継第培養を数日間実施し、LB寒天培地上でクロラムフェニコール感受性となったコロニーをスクリーニングした。得られたクロラムフェニコール感受性コロニーから染色体DNAを調製し、配列番号５と６のプライマーを用いて上記と同様にしてPCRを行い、染色体上のpupG遺伝子が、内部が欠損したpupG遺伝子（DpupG）と２回組換えにより置換した菌株（purR::spc purA::erm deoD::kan DpupG）を同定した。このようにして得られた２回組換え株の内の一株を、KMBS93と名づけた。
GGTCTGAGCTTTGCGAACC（配列番号５）
CGCCTGCAGTGCCTTTATCTAAAGCTTCC（配列番号６）
pKM75をSacIとPstIで処理してインサートを切り出し、この断片を、同酵素で処理した染色体組換え用ベクターpJPM1（Mueller et. al., J. Bacteriol., 1992, 174, 4361-4373）とT4 DNAリガーゼを用いて連結させ、pKM76を得た。
得られたプラスミドpKM76を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS16株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した（1回組換え株）。
得られた1回組換え株をクロラムフェニコール含有LB培地10 mlに植菌し、37℃で継第培養を数日間実施し、LB寒天培地上でクロラムフェニコール感受性となったコロニーをスクリーニングした。得られたクロラムフェニコール感受性コロニーから染色体DNAを調製し、配列番号５と６のプライマーを用いて上記と同様にしてPCRを行い、染色体上のpupG遺伝子が、内部が欠損したpupG遺伝子（DpupG）と２回組換えにより置換した菌株（purR::spc purA::erm deoD::kan DpupG）を同定した。このようにして得られた２回組換え株の内の一株を、KMBS93と名づけた。
GGTCTGAGCTTTGCGAACC（配列番号５）
CGCCTGCAGTGCCTTTATCTAAAGCTTCC（配列番号６）
（２）バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）を欠損した組換え体KMBS13（特開２００４−２４２６１０号公報）に、pupG遺伝子欠損を導入した菌株の作製を、以下のようにして行った。
pKM76を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS13株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した（1回組換え株）。
得られた1回組換え株をクロラムフェニコール含有LB培地10 mlに植菌し、37℃で継第培養を数日間実施し、LB寒天培地上でクロラムフェニコール感受性となったコロニーをスクリーニングした。得られたクロラムフェニコール感受性コロニーから染色体DNAを調製し、配列番号５と６のプライマーを用いて上記と同様にしてPCRを行い、染色体上のpupG遺伝子が、内部が欠損したpupG遺伝子（DpupG）と２回組換えにより置換した菌株（purR::spc purA::erm DpupG）を同定した。このようにして得られた２回組換え株の内の一株を、KMBS113と名づけた。
pKM76を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS13株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した（1回組換え株）。
得られた1回組換え株をクロラムフェニコール含有LB培地10 mlに植菌し、37℃で継第培養を数日間実施し、LB寒天培地上でクロラムフェニコール感受性となったコロニーをスクリーニングした。得られたクロラムフェニコール感受性コロニーから染色体DNAを調製し、配列番号５と６のプライマーを用いて上記と同様にしてPCRを行い、染色体上のpupG遺伝子が、内部が欠損したpupG遺伝子（DpupG）と２回組換えにより置換した菌株（purR::spc purA::erm DpupG）を同定した。このようにして得られた２回組換え株の内の一株を、KMBS113と名づけた。
（３）pupG遺伝子欠損株のプリンヌクレオシド生産
pupG遺伝子欠損株（KMBS93株とKMBS113）およびコントロール株であるKMBS16を、PS培地プレート（Soluble starch 30 g/L、Yeast extract 5 g/L、Polypeptone 5 g/L、Agar 20 g/L、KOHでpH 7.0に調整）上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後100時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した。コントロール株であるKMBS16株では、培養液中に多量のヒポキサンチンが検出されたが、pupG遺伝子欠損株であるKMBS93株とKMBS113のヒポキサンチン蓄積は、非常に低い量であり、HPLCのピークとして明確に検出できなかった（表１）。また、KMBS93株とKMBS113のイノシンの蓄積は、コントロール株であるKMBS16株のそれよりも高かった。
pupG遺伝子欠損株（KMBS93株とKMBS113）およびコントロール株であるKMBS16を、PS培地プレート（Soluble starch 30 g/L、Yeast extract 5 g/L、Polypeptone 5 g/L、Agar 20 g/L、KOHでpH 7.0に調整）上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後100時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した。コントロール株であるKMBS16株では、培養液中に多量のヒポキサンチンが検出されたが、pupG遺伝子欠損株であるKMBS93株とKMBS113のヒポキサンチン蓄積は、非常に低い量であり、HPLCのピークとして明確に検出できなかった（表１）。また、KMBS93株とKMBS113のイノシンの蓄積は、コントロール株であるKMBS16株のそれよりも高かった。
[発酵培地組成]
グルコース 80 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃（T-N）* 1.35 g/L
DL-メチオニン 0.3 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
GD113 0.01 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム 50 g/L
*：蛋白加水分解物
グルコース 80 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃（T-N）* 1.35 g/L
DL-メチオニン 0.3 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
GD113 0.01 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム 50 g/L
*：蛋白加水分解物
（１）変異型guaB遺伝子の導入
上述のバチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損した組換え体KMBS1113に、IMP脱水素酵素遺伝子guaBにおけるguaB（A1）変異を導入した菌株の作製を、以下のようにして行った。なお、guaB（A1）変異とは、配列番号６２の226位のアラニンがバリンに置換されたリーキー変異（IMPデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異）である。
（ｉ）B. subtilis 168 Marburg由来株のguaB遺伝子中央にカナマイシン耐性遺伝子が挿入された菌株の作製
guaB遺伝子上流域の増幅では、遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01547）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ34 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。
cgcggatccGGCTTAACGTTCGACGATGTGCTGC（小文字の塩基はBamHIサイトを含むタグ−配列番号７）
gctttgcccattctatagatatattGAGTCATTGTATCGCCAGTTACACC（小文字の塩基はpDG783（BGSC）上にクローニングされているカナマイシン耐性遺伝子（kan）のプロモーター上流域の配列、配列番号８）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、guaB遺伝子5'側領域の増幅断片（約710 bp）を得た。
guaB遺伝子３'側領域の増幅では、遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01547）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、34 merのPCR用プライマーを作製した。
cctagatttagatgtctaaaaagctGTGATTGTTATCGATACAGCTCACG（配列番号９；小文字の塩基はpDG783（BGSC）上にクローニングされているカナマイシン耐性遺伝子（kan）の構造遺伝子下流域の配列）
cgcgaattcGTAATCTGTACGTCATGCGGATGGC（小文字の塩基はEcoRIサイトを含むタグ、配列番号１０）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、guaB遺伝子３'側領域の増幅断片（約730 bp）を得た。
kan遺伝子の３'側領域のPCR法による増幅では、遺伝子データバンク（GenBank Accession No.V01277および NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。
ggtgtaactggcgatacaatgactcAATATATCTATAGAATGGGCAAAGC（小文字の塩基はguaB上流域の配列で配列番号８の3'末端領域と相補するようにデザインされている、配列番号１１）
cgtgagctgtatcgataacaatcacAGCTTTTTAGACATCTAAATCTAGG（小文字の塩基はguaB下流域の配列で配列番号９の3'末端領域と相補するようにデザインされている、配列番号１２）
カナマイシン耐性遺伝子（kan）が搭載されているプラスミド、例えばpDG783など、の
プラスミドDNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃,
1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、kan遺伝子を含む約1150 bpの増幅断片を得た。
kan遺伝子を挿入したguaB領域のリコンビナントPCR法による増幅では、上記のようにして増幅した3種のDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号７および１０を用いて、PCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、kan遺伝子を挿入したguaB領域の増幅断片を得た。
取得したkan遺伝子を挿入したguaB領域(guaB::kan)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis標準株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのカナマイシンと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、、配列番号７および１０を用いたPCR法により、染色体上のguaB領域が、内部がカナマイシン耐性遺伝子で置換されたguaB領域（guaB::kan）と２回組換えにより置換した菌株を同定した。このようにして得られた組換え株はグアニン要求株となっており、これらの内の一株をKMBS193と名づけた。
上述のバチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損した組換え体KMBS1113に、IMP脱水素酵素遺伝子guaBにおけるguaB（A1）変異を導入した菌株の作製を、以下のようにして行った。なお、guaB（A1）変異とは、配列番号６２の226位のアラニンがバリンに置換されたリーキー変異（IMPデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異）である。
（ｉ）B. subtilis 168 Marburg由来株のguaB遺伝子中央にカナマイシン耐性遺伝子が挿入された菌株の作製
guaB遺伝子上流域の増幅では、遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01547）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ34 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。
cgcggatccGGCTTAACGTTCGACGATGTGCTGC（小文字の塩基はBamHIサイトを含むタグ−配列番号７）
gctttgcccattctatagatatattGAGTCATTGTATCGCCAGTTACACC（小文字の塩基はpDG783（BGSC）上にクローニングされているカナマイシン耐性遺伝子（kan）のプロモーター上流域の配列、配列番号８）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、guaB遺伝子5'側領域の増幅断片（約710 bp）を得た。
guaB遺伝子３'側領域の増幅では、遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01547）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、34 merのPCR用プライマーを作製した。
cctagatttagatgtctaaaaagctGTGATTGTTATCGATACAGCTCACG（配列番号９；小文字の塩基はpDG783（BGSC）上にクローニングされているカナマイシン耐性遺伝子（kan）の構造遺伝子下流域の配列）
cgcgaattcGTAATCTGTACGTCATGCGGATGGC（小文字の塩基はEcoRIサイトを含むタグ、配列番号１０）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、guaB遺伝子３'側領域の増幅断片（約730 bp）を得た。
kan遺伝子の３'側領域のPCR法による増幅では、遺伝子データバンク（GenBank Accession No.V01277および NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。
ggtgtaactggcgatacaatgactcAATATATCTATAGAATGGGCAAAGC（小文字の塩基はguaB上流域の配列で配列番号８の3'末端領域と相補するようにデザインされている、配列番号１１）
cgtgagctgtatcgataacaatcacAGCTTTTTAGACATCTAAATCTAGG（小文字の塩基はguaB下流域の配列で配列番号９の3'末端領域と相補するようにデザインされている、配列番号１２）
カナマイシン耐性遺伝子（kan）が搭載されているプラスミド、例えばpDG783など、の
プラスミドDNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃,
1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、kan遺伝子を含む約1150 bpの増幅断片を得た。
kan遺伝子を挿入したguaB領域のリコンビナントPCR法による増幅では、上記のようにして増幅した3種のDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号７および１０を用いて、PCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、kan遺伝子を挿入したguaB領域の増幅断片を得た。
取得したkan遺伝子を挿入したguaB領域(guaB::kan)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis標準株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのカナマイシンと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、、配列番号７および１０を用いたPCR法により、染色体上のguaB領域が、内部がカナマイシン耐性遺伝子で置換されたguaB領域（guaB::kan）と２回組換えにより置換した菌株を同定した。このようにして得られた組換え株はグアニン要求株となっており、これらの内の一株をKMBS193と名づけた。
（ｉｉ）B. subtilis 168 Marburg由来株のguaB変異（A1）が挿入された菌株の作製
guaB遺伝子5'側領域の増幅では、遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ25 mer、46 merのPCR用プライマーを作製した。
CATAAAATGTACGCATAGGCCATTC（配列番号１３）
TTGTATCGCCAGTTACACCAACTaCCGCGCCAACGATCAGGCGGCC（小文字の塩基は変異点を示している、配列番号１４）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、guaB遺伝子5'末端領域および上流域の増幅断片（約1210 bp）を得た。
次にguaB遺伝子３'側領域を増幅した。遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ46 mer、26 merのPCR用プライマーを作製した。
GGCCGCCTGATCGTTGGCGCGGtAGTTGGTGTAACTGGCGATACAA（小文字の塩基は変異点を示している、配列番号１４プライマーと相補する、配列番号１５）
CCTTGATCAATTGCTTCCAATAACAG（配列番号１６）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、guaB遺伝子3'末端領域および下流域の増幅断片（約1220 bp）を得た。
guaB変異（A1）を導入したguaB領域のリコンビナントPCR法による増幅では、上記のようにして増幅した2種のDNA断片を、アガロース電気泳動後、目的とするDNA断片を精製した。両DNA断片の適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号１３および１６を用いて、PCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、guaB変異（A1）が導入されたguaB領域の増幅断片を得た。
取得したguaB変異（A1）が導入されたguaB領域(guaB（A1）)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS193のコンピテントセルを形質転換し、最小培地寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、、配列番号１３および
１６を用いたPCR法により、染色体上のguaB::kan領域が、guaB（A1）変異を含むguaB領域と２回組換えにより置換した菌株を同定した。このようにして得られた組換え株はグアニン非要求株となっており、これらの内の一株をYMBS9と名づけた。
guaB遺伝子5'側領域の増幅では、遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ25 mer、46 merのPCR用プライマーを作製した。
CATAAAATGTACGCATAGGCCATTC（配列番号１３）
TTGTATCGCCAGTTACACCAACTaCCGCGCCAACGATCAGGCGGCC（小文字の塩基は変異点を示している、配列番号１４）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、guaB遺伝子5'末端領域および上流域の増幅断片（約1210 bp）を得た。
次にguaB遺伝子３'側領域を増幅した。遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ46 mer、26 merのPCR用プライマーを作製した。
GGCCGCCTGATCGTTGGCGCGGtAGTTGGTGTAACTGGCGATACAA（小文字の塩基は変異点を示している、配列番号１４プライマーと相補する、配列番号１５）
CCTTGATCAATTGCTTCCAATAACAG（配列番号１６）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、guaB遺伝子3'末端領域および下流域の増幅断片（約1220 bp）を得た。
guaB変異（A1）を導入したguaB領域のリコンビナントPCR法による増幅では、上記のようにして増幅した2種のDNA断片を、アガロース電気泳動後、目的とするDNA断片を精製した。両DNA断片の適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号１３および１６を用いて、PCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、guaB変異（A1）が導入されたguaB領域の増幅断片を得た。
取得したguaB変異（A1）が導入されたguaB領域(guaB（A1）)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS193のコンピテントセルを形質転換し、最小培地寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、、配列番号１３および
１６を用いたPCR法により、染色体上のguaB::kan領域が、guaB（A1）変異を含むguaB領域と２回組換えにより置換した菌株を同定した。このようにして得られた組換え株はグアニン非要求株となっており、これらの内の一株をYMBS9と名づけた。
（ｉｉｉ）イノシン生産菌KMBS113にguaB変異（A1）が導入された菌株の作製
KMBS193（guaB::kan）の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS113株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのカナマイシンと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このような菌株はグアニン要求となっており、これらの内の一株をYMBS6（purR::spc purA::erm DpupG guaB::kan trpC2）と名づけた。
次に、YMBS9（guaB（A1））の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、YMBS6株のコンピテントセルを形質転換し、20 μg/mlのアデニンを含む最小培地寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このような菌株はグアニンリーキー要求となっており、これらの内の一株をYMBS2（purR::spc purA::erm guaB(A1) DpupG trpC2）と名づけた。
KMBS193（guaB::kan）の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS113株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのカナマイシンと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このような菌株はグアニン要求となっており、これらの内の一株をYMBS6（purR::spc purA::erm DpupG guaB::kan trpC2）と名づけた。
次に、YMBS9（guaB（A1））の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、YMBS6株のコンピテントセルを形質転換し、20 μg/mlのアデニンを含む最小培地寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このような菌株はグアニンリーキー要求となっており、これらの内の一株をYMBS2（purR::spc purA::erm guaB(A1) DpupG trpC2）と名づけた。
（２）guaB変異を導入したイノシン生産菌株のプリン系核酸生産
guaB変異（A1）導入したイノシン生産菌株（YMBS2株）およびコントロール株であるKMBS113を、PS培地プレート（Soluble starch 30 g/L、Yeast extract 5 g/L、Polypeptone 5 g/L、Agar 20 g/L、KOHでpH 7.0に調整）上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後96時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した。
[発酵培地組成]
グルコース 60 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃（T-N）* 1.35 g/L
DL-メチオニン 0.3 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
GD113 0.01 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム 50 g/L
*：蛋白加水分解物
guaB変異（A1）導入したイノシン生産菌株（YMBS2株）およびコントロール株であるKMBS113を、PS培地プレート（Soluble starch 30 g/L、Yeast extract 5 g/L、Polypeptone 5 g/L、Agar 20 g/L、KOHでpH 7.0に調整）上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後96時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した。
[発酵培地組成]
グルコース 60 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃（T-N）* 1.35 g/L
DL-メチオニン 0.3 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
GD113 0.01 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム 50 g/L
*：蛋白加水分解物
＜プリンオペロン増幅株の作製＞
（１）＜Ppur破壊株の作製＞
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンプロモーター（Ppur）を破壊した菌株の作製を、以下のようにして行った。
（１）＜Ppur破壊株の作製＞
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンプロモーター（Ppur）を破壊した菌株の作製を、以下のようにして行った。
（ｉ）Ppur上流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ34 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。
cgcggatccTTATTTAGCGGCCGGCATCAGTACG（配列番号１７；小文字の塩基はBamHIサイトを含むタグ）
cgtttgttgaactaatgggtgctttATGGATAATGTCAACGATATTATCG（配列番号１８；小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）のプロモーター上流域の配列）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、Ppur-35配列と上流の約730 bpを含む増幅断片を得た。
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ34 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。
cgcggatccTTATTTAGCGGCCGGCATCAGTACG（配列番号１７；小文字の塩基はBamHIサイトを含むタグ）
cgtttgttgaactaatgggtgctttATGGATAATGTCAACGATATTATCG（配列番号１８；小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）のプロモーター上流域の配列）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、Ppur-35配列と上流の約730 bpを含む増幅断片を得た。
（ｉｉ）Ppur下流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、34 merのPCR用プライマーを作製した。
acagctccagatccatatccttcttCCTCATATAATCTTGGGAATATGGC（配列番号１９；小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）の構造遺伝子下流域の配列）
cgcggatccTCTCTCATCCAGCTTACGGGCAAGG（配列番号２０；小文字の塩基はBamHIサイトを含むタグ）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、purE遺伝子翻訳開始コドン上流の約230 bpとその下流約440 bpを含む増幅断片を得た。
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、34 merのPCR用プライマーを作製した。
acagctccagatccatatccttcttCCTCATATAATCTTGGGAATATGGC（配列番号１９；小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）の構造遺伝子下流域の配列）
cgcggatccTCTCTCATCCAGCTTACGGGCAAGG（配列番号２０；小文字の塩基はBamHIサイトを含むタグ）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、purE遺伝子翻訳開始コドン上流の約230 bpとその下流約440 bpを含む増幅断片を得た。
（ｉｉｉ）cat遺伝子のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No.V01277および NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。
cgataatatcgttgacattatccatAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACG（配列番号２１；小文字の塩基はPpur上流域の配列で配列番号１８の3'末端領域と相補するようにデザインされている）
gccatattcccaagattatatgaggAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT（配列番号２２；小文字の塩基はpurE遺伝子翻訳開始コドン上流域の配列で配列番号１９の3'末端領域と相補するようにデザインされている）
クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）が搭載されているプラスミド、例えばpC194など、のプラスミドDNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分;
72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子を含む約980 bpの増幅断片を得た。
遺伝子データバンク（GenBank Accession No.V01277および NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。
cgataatatcgttgacattatccatAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACG（配列番号２１；小文字の塩基はPpur上流域の配列で配列番号１８の3'末端領域と相補するようにデザインされている）
gccatattcccaagattatatgaggAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT（配列番号２２；小文字の塩基はpurE遺伝子翻訳開始コドン上流域の配列で配列番号１９の3'末端領域と相補するようにデザインされている）
クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）が搭載されているプラスミド、例えばpC194など、のプラスミドDNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分;
72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子を含む約980 bpの増幅断片を得た。
（ｉｖ）cat遺伝子を挿入したPpur領域のリコンビナントPCR法による増幅
（ｉ）から（ｉｉｉ）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号１７および２０を用いて、PCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子を挿入したPpur領域の増幅断片を得た。
（ｉ）から（ｉｉｉ）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号１７および２０を用いて、PCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子を挿入したPpur領域の増幅断片を得た。
（ｖ）Ppurを破壊した菌株の作製
（ｉｖ）で取得したcat遺伝子を挿入したPpur領域(Ppur::cat)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis標準株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のPpur領域が、内部がクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換されたPpur領域（Ppur::cat）と２回組換えにより置換した菌株を同定した。このようにして得られた組換え株はアデニン要求株となっており、これらの内の一株をKMBS198と名づけた。
（ｉｖ）で取得したcat遺伝子を挿入したPpur領域(Ppur::cat)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis標準株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のPpur領域が、内部がクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換されたPpur領域（Ppur::cat）と２回組換えにより置換した菌株を同定した。このようにして得られた組換え株はアデニン要求株となっており、これらの内の一株をKMBS198と名づけた。
（２）＜プリンオペロンプロモーター変異株の作製＞
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、Ppurの-10配列をコンセンサス配列TATAAT（Ppur1）、あるいはTATGAT（Ppur3）、TAAAAT（Ppur5）となるように改変した菌株の作製を、以下のようにして行った。
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、Ppurの-10配列をコンセンサス配列TATAAT（Ppur1）、あるいはTATGAT（Ppur3）、TAAAAT（Ppur5）となるように改変した菌株の作製を、以下のようにして行った。
（ｉ）-10配列改変を含むPpur上流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有する配列番号４２に示した25 merのPCR用プライマー、3種の改変型Ppur配列を含む、38 merの改変用プライマーを作製した。
AATAGATATAAAGAGGTGAGTCTGC（配列番号４２）
＜Ppur1改変用＞
TTTTGATTTCATGTTTattataACAACGGACATGGATA（配列番号２３；小文字の塩基はPpur1配列を示す）
＜Ppur3改変用＞
TTTTGATTTCATGTTTatcataACAACGGACATGGATA（配列番号２４；小文字の塩基はPpur3配列を示す）
＜Ppur5改変用＞
TTTTGATTTCATGTTTattttaACAACGGACATGGATA（配列番号２５；小文字の塩基はPpur5配列を示す）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、Ppurとその上流配列（約1060 bp）を含む増幅断片を得た。
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有する配列番号４２に示した25 merのPCR用プライマー、3種の改変型Ppur配列を含む、38 merの改変用プライマーを作製した。
AATAGATATAAAGAGGTGAGTCTGC（配列番号４２）
＜Ppur1改変用＞
TTTTGATTTCATGTTTattataACAACGGACATGGATA（配列番号２３；小文字の塩基はPpur1配列を示す）
＜Ppur3改変用＞
TTTTGATTTCATGTTTatcataACAACGGACATGGATA（配列番号２４；小文字の塩基はPpur3配列を示す）
＜Ppur5改変用＞
TTTTGATTTCATGTTTattttaACAACGGACATGGATA（配列番号２５；小文字の塩基はPpur5配列を示す）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、Ppurとその上流配列（約1060 bp）を含む増幅断片を得た。
（ｉｉ）-10配列改変を含むPpur下流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有する配列番号２６に示した25 merのPCR用プライマー、3種の改変型Ppur配列を含む、38 merの改変用プライマーを作製した。
GGGTAATAAGCAGCAGCTCACTTCC（配列番号２６）
＜Ppur1改変用＞
TATCCATGTCCGTTGTtataatAAACATGAAATCAAAA（配列番号２７；小文字の塩基はPpur1配列を示しており、配列番号２３で示したプライマーと相補する）
＜Ppur3改変用＞
TATCCATGTCCGTTGTtatgatAAACATGAAATCAAAA（配列番号２８；小文字の塩基はPpur3配列を示しており、配列番号２４で示したプライマーと相補する）
＜Ppur5改変用＞
TATCCATGTCCGTTGTtaaaatAAACATGAAATCAAAA（配列番号２９；小文字の塩基はPpur5配列を示しており、配列番号２５で示したプライマーと相補する）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パー
キンエルマー社製））を行い、Ppur −10配列とその下流配列（約1070 bp）を含む増幅断片を得た。
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有する配列番号２６に示した25 merのPCR用プライマー、3種の改変型Ppur配列を含む、38 merの改変用プライマーを作製した。
GGGTAATAAGCAGCAGCTCACTTCC（配列番号２６）
＜Ppur1改変用＞
TATCCATGTCCGTTGTtataatAAACATGAAATCAAAA（配列番号２７；小文字の塩基はPpur1配列を示しており、配列番号２３で示したプライマーと相補する）
＜Ppur3改変用＞
TATCCATGTCCGTTGTtatgatAAACATGAAATCAAAA（配列番号２８；小文字の塩基はPpur3配列を示しており、配列番号２４で示したプライマーと相補する）
＜Ppur5改変用＞
TATCCATGTCCGTTGTtaaaatAAACATGAAATCAAAA（配列番号２９；小文字の塩基はPpur5配列を示しており、配列番号２５で示したプライマーと相補する）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パー
キンエルマー社製））を行い、Ppur −10配列とその下流配列（約1070 bp）を含む増幅断片を得た。
（ｉｉｉ）-10配列改変を含むPpur領域のPCR法による増幅
（ｉ）および（ｉｉ）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号４２および２６を用いて、PCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、-10配列がPpur1、Ppur3、あるいはPpur5と改変されたPpur領域の増幅断片を得た。
（ｉ）および（ｉｉ）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号４２および２６を用いて、PCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、-10配列がPpur1、Ppur3、あるいはPpur5と改変されたPpur領域の増幅断片を得た。
（ｉｖ）-10配列がPpur1、Ppur3、あるいはPpur5と改変された菌株の作製
（ｉｉｉ）で取得した-10配列改変を含むPpur領域(Ppur1、Ppur3、あるいはPpur5)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS198株のコンピテントセルを形質転換し、最小培地寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｉｉ）に示したPCR法により、染色体上のPpur::cat領域が、Ppur1、Ppur3、あるいはPpur5と２回組換えにより置換した菌株を同定した。このようにして得られた組換え株はアデニン非要求株となっており、これらの内の一株をそれぞれKMBS210、KMBS211、KMBS222と名づけた。
（ｉｉｉ）で取得した-10配列改変を含むPpur領域(Ppur1、Ppur3、あるいはPpur5)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS198株のコンピテントセルを形質転換し、最小培地寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｉｉ）に示したPCR法により、染色体上のPpur::cat領域が、Ppur1、Ppur3、あるいはPpur5と２回組換えにより置換した菌株を同定した。このようにして得られた組換え株はアデニン非要求株となっており、これらの内の一株をそれぞれKMBS210、KMBS211、KMBS222と名づけた。
（３）プリンオペロンのアテニュエーター配列欠損株の作製
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、Ppur下流に位置するアテニュエーター配列を欠損した菌株の作製を、以下のようにして行った。図１に欠損した配列を示した。
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、Ppur下流に位置するアテニュエーター配列を欠損した菌株の作製を、以下のようにして行った。図１に欠損した配列を示した。
（ｉ）部分欠損したアテニュエーター配列とその上流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、配列番号１７に示したPCR用プライマーと、以下の塩基配列を有する配列番号３０に示した52 merのプライマーを作製した。
GCTTTTGTTTTCAGAAAATAAAAAATAcgATATATCCATGTCAGTTTTATCG（配列番号３０；小文字の塩基はアテニュエーター配列の部分配列（75 bp）欠損により新しくつくられたジャンクション）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 53℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、部分欠損したアテニュエーター配列とその上流配列（約840 bp）を含む増幅断片を得た。
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、配列番号１７に示したPCR用プライマーと、以下の塩基配列を有する配列番号３０に示した52 merのプライマーを作製した。
GCTTTTGTTTTCAGAAAATAAAAAATAcgATATATCCATGTCAGTTTTATCG（配列番号３０；小文字の塩基はアテニュエーター配列の部分配列（75 bp）欠損により新しくつくられたジャンクション）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 53℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、部分欠損したアテニュエーター配列とその上流配列（約840 bp）を含む増幅断片を得た。
（ｉｉ）部分欠損したアテニュエーター配列とその下流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、配列番号２６に示したPCR用プライマーと、以下の塩基配列を有する配列番号３１に示した52 merのプライマーを作製した。
CGATAAAACTGACATGGATATATcgTATTTTTTATTTTCTGAAAACAAAAGC（配列番号３１；小文字の塩基はアテニュエーター配列の部分配列（75 bp）の欠損により新しくつくられたジャンクションで、このプライマーは配列番号３０に示したプライマーと相補する）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 53℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、部分欠損したアテニュエーター配列とその下流配列（約850 bp）を含む増幅断片を得た。
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、配列番号２６に示したPCR用プライマーと、以下の塩基配列を有する配列番号３１に示した52 merのプライマーを作製した。
CGATAAAACTGACATGGATATATcgTATTTTTTATTTTCTGAAAACAAAAGC（配列番号３１；小文字の塩基はアテニュエーター配列の部分配列（75 bp）の欠損により新しくつくられたジャンクションで、このプライマーは配列番号３０に示したプライマーと相補する）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 53℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、部分欠損したアテニュエーター配列とその下流配列（約850 bp）を含む増幅断片を得た。
（ｉｉｉ）アテニュエーター配列部分欠損を含むPpur領域のPCR法による増幅
（ｉ）および（ｉｉ）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号１７および２６を用いて、PCR（94℃, 30秒; 53℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、アテニュエーター配列部分欠損を含むPpur領域の増幅断片を得た。
（ｉ）および（ｉｉ）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号１７および２６を用いて、PCR（94℃, 30秒; 53℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、アテニュエーター配列部分欠損を含むPpur領域の増幅断片を得た。
（ｉｖ）アテニュエーター配列が部分欠損した菌株の作製
（ｉｉｉ）で取得したアテニュエーター配列部分欠損を含むPpur領域(Ppur−Datt)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS198株のコンピテントセルを形質転換し、最小培地寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｉｉ）に示したPCR法により、染色体上のPpur::cat領域が、Ppur−Dattと２回組換えにより置換した菌株を同定した。このようにして得られた組換え株はアデニン非要求株となっており、これらの内の一株をKMBS252と名づけた。
（ｉｉｉ）で取得したアテニュエーター配列部分欠損を含むPpur領域(Ppur−Datt)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS198株のコンピテントセルを形質転換し、最小培地寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｉｉ）に示したPCR法により、染色体上のPpur::cat領域が、Ppur−Dattと２回組換えにより置換した菌株を同定した。このようにして得られた組換え株はアデニン非要求株となっており、これらの内の一株をKMBS252と名づけた。
（４）バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、Ppurの-10配列がコンセンサス配列TATAAT（Ppur1）となるように改変され、かつアテニュエーター配列を部分欠損した菌株の作製を、以下のようにして行った。
（ｉ）-10配列改変（Ppur1）を含むPpur上流域のPCR法による増幅
（３）で作製したアテニュエーター配列を部分欠損した菌株、例えばKMBS252の染色体DNAを鋳型とし、遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき作製した、配列番号４２および配列番号２３に示したプライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、Ppur1を含むPpur上流域の増幅断片（約1060 bp）を得た。
（３）で作製したアテニュエーター配列を部分欠損した菌株、例えばKMBS252の染色体DNAを鋳型とし、遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき作製した、配列番号４２および配列番号２３に示したプライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、Ppur1を含むPpur上流域の増幅断片（約1060 bp）を得た。
（ｉｉ）Ppur1および部分欠損したアテニュエーター領域とその下流域のPCR法による増幅(３)で作製したアテニュエーター配列を部分欠損した菌株、例えばKMBS252の染色体DNAを鋳型とし、遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき作製した、配列番号２６および配列番号２７に示したプライマーを用いてPCR（94℃, 30秒;
55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、Ppur1および部分欠損したアテニュエーター配列とその下流域の増幅断片（約990 bp）を得た。
55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、Ppur1および部分欠損したアテニュエーター配列とその下流域の増幅断片（約990 bp）を得た。
（ｉｉｉ）Ppur1およびアテニュエーター配列の部分欠損を含むPpur領域のPCR法による増幅
（ｉ）および（ｉｉ）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号４２および２６を用いて、PCR（94℃, 30秒; 55℃, 2分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、Ppur1およびアテニュエーター配列の部分欠損を含むPpur領域の増幅断片を得た。
（ｉ）および（ｉｉ）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号４２および２６を用いて、PCR（94℃, 30秒; 55℃, 2分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、Ppur1およびアテニュエーター配列の部分欠損を含むPpur領域の増幅断片を得た。
（ｉｖ）-10配列がPpur1となるように改変され、かつアテニュエーター配列を部分欠損した菌株の作製
（ｉｉｉ）で取得したPpur1およびアテニュエーター配列の部分欠損を含むPpur領域(Ppur1−Datt)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS198株のコンピテントセルを形質転換し、
最小培地寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｉｉ）に示したPCR法により、染色体上のPpur::cat領域が、Ppur1−Dattと２回組換えにより置換した菌株を同定した。このようにして得られた組換え株はアデニン非要求株となっており、これらの内の一株をKMBS261と名づけた。
（ｉｉｉ）で取得したPpur1およびアテニュエーター配列の部分欠損を含むPpur領域(Ppur1−Datt)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS198株のコンピテントセルを形質転換し、
最小培地寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｉｉ）に示したPCR法により、染色体上のPpur::cat領域が、Ppur1−Dattと２回組換えにより置換した菌株を同定した。このようにして得られた組換え株はアデニン非要求株となっており、これらの内の一株をKMBS261と名づけた。
（５）プリンオペロン転写活性測定用プラスミドの構築
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ29 merのPCR用プライマーを作製した。
cgcaagcttTATTTTCTGAAAACAAAAGC（配列番号３２；小文字の塩基はHindIIIサイトを含むタグ）
cgcggatccTTTCTCTTCTCTCATCCAGC（配列番号３３；小文字の塩基はBamHIサイトを含むタグ）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、purE構造遺伝子の一部（445 bp）、およびその上流のSD配列を含む領域（40 bp）を増幅断片を得た。
PCR増幅断片は、MinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）によりクリーンアップし、HindIIIとBamHIで制限処理した。精製したDNA断片を、同酵素で処理したpMutin4（Vagner, V., et. al., Microbiology, 1998, 144, 3097−3104）のlacZの上流に、T4 DNAリガーゼを用いて連結させ、pKM191を得た。このpKM191 はpurE構造遺伝子の一部(445 bp)とそのSD配列を含む上流域(40 bp) を含む。
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ29 merのPCR用プライマーを作製した。
cgcaagcttTATTTTCTGAAAACAAAAGC（配列番号３２；小文字の塩基はHindIIIサイトを含むタグ）
cgcggatccTTTCTCTTCTCTCATCCAGC（配列番号３３；小文字の塩基はBamHIサイトを含むタグ）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、purE構造遺伝子の一部（445 bp）、およびその上流のSD配列を含む領域（40 bp）を増幅断片を得た。
PCR増幅断片は、MinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）によりクリーンアップし、HindIIIとBamHIで制限処理した。精製したDNA断片を、同酵素で処理したpMutin4（Vagner, V., et. al., Microbiology, 1998, 144, 3097−3104）のlacZの上流に、T4 DNAリガーゼを用いて連結させ、pKM191を得た。このpKM191 はpurE構造遺伝子の一部(445 bp)とそのSD配列を含む上流域(40 bp) を含む。
（６）プリンオペロン転写活性測定用菌株の作製
プリンオペロン転写活性測定用菌株の構築を以下のようにして行った。
（ｉ）Ppur破壊を導入した菌株の作製
KMBS198（Ppur::cat）の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、purR欠損(purR::spc)をもつKMBS4株（特開２００４−２４２６１０）を形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このようにして得られた組換え株はpurR欠損、かつアデニン要求株となっており、これらの内の一株をKMBS278と名づけた。
プリンオペロン転写活性測定用菌株の構築を以下のようにして行った。
（ｉ）Ppur破壊を導入した菌株の作製
KMBS198（Ppur::cat）の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、purR欠損(purR::spc)をもつKMBS4株（特開２００４−２４２６１０）を形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このようにして得られた組換え株はpurR欠損、かつアデニン要求株となっており、これらの内の一株をKMBS278と名づけた。
（ｉｉ）purR欠損および改変型Ppur領域を有する菌株の作製
KMBS210、KMBS211、KMBS222、KMBS252、KMBS261株の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS278株のコンピテントセルを形質転換し、最小培地寒天プレート上で生育し、かつLB寒天プレート上でスペクチノマイシン耐性であるコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（１）（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のPpur::catが、改変型Ppur領域と２回組換えにより置換した菌株を同定した。これらの内の一株をそれぞれKMBS283、KMBS284、KMBS285、KMBS286、KMBS287と名づけた。
KMBS210、KMBS211、KMBS222、KMBS252、KMBS261株の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS278株のコンピテントセルを形質転換し、最小培地寒天プレート上で生育し、かつLB寒天プレート上でスペクチノマイシン耐性であるコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（１）（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のPpur::catが、改変型Ppur領域と２回組換えにより置換した菌株を同定した。これらの内の一株をそれぞれKMBS283、KMBS284、KMBS285、KMBS286、KMBS287と名づけた。
（ｉｉｉ）pKM191を導入した菌株の作製
プリンオペロン転写活性測定用プラスミドpKM191を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、B. subtilis 168 Marburg株、KMBS4、KMBS283、KMBS284、KMBS285、KMBS286、KMBS287のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このようにして得られたコロニーは、pKM191のlacZ遺伝子を含むpurE遺伝子が野生型purE遺伝子と置換した1回組換え株であり、PpurによってlacZが発現され、80 μg/mlのX-Galを含むLB寒天プレート上でブルーコロニーとなる。これらの内の一株をそれぞれKMBS292、KMBS295、KMBS296、KMBS297、KMBS298、KMBS299、KMBS300と名づけた。
プリンオペロン転写活性測定用プラスミドpKM191を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、B. subtilis 168 Marburg株、KMBS4、KMBS283、KMBS284、KMBS285、KMBS286、KMBS287のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このようにして得られたコロニーは、pKM191のlacZ遺伝子を含むpurE遺伝子が野生型purE遺伝子と置換した1回組換え株であり、PpurによってlacZが発現され、80 μg/mlのX-Galを含むLB寒天プレート上でブルーコロニーとなる。これらの内の一株をそれぞれKMBS292、KMBS295、KMBS296、KMBS297、KMBS298、KMBS299、KMBS300と名づけた。
（７）プリンオペロン転写活性測定
（６）（ｉｉｉ）で作製した菌株を用いて、lacZによるPpur転写活性測定を実施した。すなわち、コントロール株は、168 Marburg株のバックグランドをもつKMBS292、あるいはプリンオペロンリプレッサーPurR遺伝子欠損のバックグランドをもつKMBS295である。他の株はpurR欠損のバックグランドで、-10配列を改変した菌株（KMBS296、KMBS297、KMBS298）、アテニュエーター配列が部分欠損した菌株（KMBS299）、-10配列のコンセンサス配列化（Ppur1）とアテニュエーター配列の部分欠損が同時に導入された菌株（KMBS300）である。
これらの6株をグアニン（20 mg/L）を含むLB培地（20 ml）中、37℃で対数増殖後期（OD600=1.1-1.4）まで培養し、適量の培養液をサンプリングし、b-galacosidase活性測定を実施した。b-galacotosidase活性測定は、Fouet 等（Fouet, A. and Sonenshein, A. L. J. Bacteriol., 1990, 172, 835−844）の方法にしたがった。結果を図２に示した。168M株と比較し、DpurR株では活性が約4.5倍に増加した。さらに、-10配列をPpur1となるように改変することで、約3倍に増加した。また、アテニュエーター配列の部分欠損により、活性は約15倍となり、双方の変異を有する株では、26.5倍まで活性が増加した。
（６）（ｉｉｉ）で作製した菌株を用いて、lacZによるPpur転写活性測定を実施した。すなわち、コントロール株は、168 Marburg株のバックグランドをもつKMBS292、あるいはプリンオペロンリプレッサーPurR遺伝子欠損のバックグランドをもつKMBS295である。他の株はpurR欠損のバックグランドで、-10配列を改変した菌株（KMBS296、KMBS297、KMBS298）、アテニュエーター配列が部分欠損した菌株（KMBS299）、-10配列のコンセンサス配列化（Ppur1）とアテニュエーター配列の部分欠損が同時に導入された菌株（KMBS300）である。
これらの6株をグアニン（20 mg/L）を含むLB培地（20 ml）中、37℃で対数増殖後期（OD600=1.1-1.4）まで培養し、適量の培養液をサンプリングし、b-galacosidase活性測定を実施した。b-galacotosidase活性測定は、Fouet 等（Fouet, A. and Sonenshein, A. L. J. Bacteriol., 1990, 172, 835−844）の方法にしたがった。結果を図２に示した。168M株と比較し、DpurR株では活性が約4.5倍に増加した。さらに、-10配列をPpur1となるように改変することで、約3倍に増加した。また、アテニュエーター配列の部分欠損により、活性は約15倍となり、双方の変異を有する株では、26.5倍まで活性が増加した。
＜改変型Ppur領域導入株の構築と評価＞
（１）バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損し、IMP脱水素酵素遺伝子（guaB）にグアニンリーキー要求変異guaB(A1)を導入した組換え体YMBS2を用いて、プリンオペロンプロモーターを改変かつアテニュエーター配列を部分欠損した菌株の作製を、以下のようにして行った。
B. subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS113株（purR::spc purA::erm DpupG trpC2）のコンピテントセルを形質転換し、最小培地寒天プレート上で生育し(すなわちアデニン非要求)、かつLB寒天プレート上でスペクチノマイシン耐性であるコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、実施例１（１）（ｉｖ）に示したPCR法により、DpupGである菌株を同定した。これらの内の一株をKMBS180（purR::spc DpupG trpC2）と名づけた。
次に、KMBS198株の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS180株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、実施例３（１）（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のPpur領域が、Ppur::catと２回組換えにより置換した菌株を同定した。このような菌株はアデニン要求となっており、これらの内の一株をKMBS216（Ppur::cat purR::spc DpupG trpC2）と名づけた。
次に、KMBS252（Ppur-Datt）の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS216株のコンピテントセルを形質転換し、最小培地寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、実施例３（１）（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のPpur::catが、Ppur-Datt領域と２回組換えにより置換した菌株を同定した。このような菌株はアデニン非要求となっており、これらの内の一株をKMBS264（Ppur-Datt purR::spc DpupG trpC2）と名づけた。Ppur1-Dattが導入された菌株KMBS261についても、同様な手順に従って取得した。
次に、KMBS9（purA::erm trpC2; 特開２００４−２４２６１０号）の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-2
21）により調製した、KMBS264株あるいはKMBS261株のコンピテントセルを形質転換し、0.5 μg/mlのエリスロマイシンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このような菌株はアデニン非要求となっており、これらの内の一株をKMBS265（Ppur-Datt purR::spc purA::erm DpupG trpC2）とKMBS267（Ppur1-Datt purR::spc purA::erm DpupG trpC2）と名づけた。
次に、KMBS193（guaB::kan）の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS265株あるいはKMBS267株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのカナマイシンと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このような菌株はグアニン要求となっており、これらの内の一株をKMBS270（Ppur-Datt purR::spc purA::erm guaB::kan DpupG trpC2）とKMBS271（Ppur1-Datt purR::spc purA::erm guaB::kan DpupG trpC2）と名づけた。
最後に、YMBS2 (guaB(A1))の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS270株あるいはKMBS271株のコンピテントセルを形質転換し、20 μg/mlのアデニンを含む最小培地寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このような菌株はグアニンリーキー要求となっており、これらの内の一株をKMBS279（Ppur-Datt purR::spc purA::erm guaB(A1) DpupG trpC2）とKMBS280（Ppur1-Datt purR::spc purA::erm guaB(A1) DpupG trpC2）と名づけた。
（１）バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損し、IMP脱水素酵素遺伝子（guaB）にグアニンリーキー要求変異guaB(A1)を導入した組換え体YMBS2を用いて、プリンオペロンプロモーターを改変かつアテニュエーター配列を部分欠損した菌株の作製を、以下のようにして行った。
B. subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS113株（purR::spc purA::erm DpupG trpC2）のコンピテントセルを形質転換し、最小培地寒天プレート上で生育し(すなわちアデニン非要求)、かつLB寒天プレート上でスペクチノマイシン耐性であるコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、実施例１（１）（ｉｖ）に示したPCR法により、DpupGである菌株を同定した。これらの内の一株をKMBS180（purR::spc DpupG trpC2）と名づけた。
次に、KMBS198株の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS180株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、実施例３（１）（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のPpur領域が、Ppur::catと２回組換えにより置換した菌株を同定した。このような菌株はアデニン要求となっており、これらの内の一株をKMBS216（Ppur::cat purR::spc DpupG trpC2）と名づけた。
次に、KMBS252（Ppur-Datt）の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS216株のコンピテントセルを形質転換し、最小培地寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、実施例３（１）（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のPpur::catが、Ppur-Datt領域と２回組換えにより置換した菌株を同定した。このような菌株はアデニン非要求となっており、これらの内の一株をKMBS264（Ppur-Datt purR::spc DpupG trpC2）と名づけた。Ppur1-Dattが導入された菌株KMBS261についても、同様な手順に従って取得した。
次に、KMBS9（purA::erm trpC2; 特開２００４−２４２６１０号）の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-2
21）により調製した、KMBS264株あるいはKMBS261株のコンピテントセルを形質転換し、0.5 μg/mlのエリスロマイシンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このような菌株はアデニン非要求となっており、これらの内の一株をKMBS265（Ppur-Datt purR::spc purA::erm DpupG trpC2）とKMBS267（Ppur1-Datt purR::spc purA::erm DpupG trpC2）と名づけた。
次に、KMBS193（guaB::kan）の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS265株あるいはKMBS267株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのカナマイシンと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このような菌株はグアニン要求となっており、これらの内の一株をKMBS270（Ppur-Datt purR::spc purA::erm guaB::kan DpupG trpC2）とKMBS271（Ppur1-Datt purR::spc purA::erm guaB::kan DpupG trpC2）と名づけた。
最後に、YMBS2 (guaB(A1))の染色体DNAを調製し、これを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS270株あるいはKMBS271株のコンピテントセルを形質転換し、20 μg/mlのアデニンを含む最小培地寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このような菌株はグアニンリーキー要求となっており、これらの内の一株をKMBS279（Ppur-Datt purR::spc purA::erm guaB(A1) DpupG trpC2）とKMBS280（Ppur1-Datt purR::spc purA::erm guaB(A1) DpupG trpC2）と名づけた。
（２）改変型Ppur領域を有する菌株のプリンヌクレオシド生産の確認
改変型Ppur領域を有する菌株（KMBS279株とKMBS280）およびコントロール株であるYMBS2を、PS培地プレート（Soluble starch 30 g/L、Yeast extract 5 g/L、Polypeptone 5 g/L、Agar 20 g/L、KOHでpH 7.0に調整）上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後96時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した。
[発酵培地組成]
グルコース 60 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃（T-N）* 1.35 g/L
DL-メチオニン 0.3 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
グアニン 0.05 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
GD113 0.01 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム 50 g/L
*：蛋白加水分解物
改変型Ppur領域を有する菌株（KMBS279株とKMBS280）およびコントロール株であるYMBS2を、PS培地プレート（Soluble starch 30 g/L、Yeast extract 5 g/L、Polypeptone 5 g/L、Agar 20 g/L、KOHでpH 7.0に調整）上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後96時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した。
[発酵培地組成]
グルコース 60 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃（T-N）* 1.35 g/L
DL-メチオニン 0.3 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
グアニン 0.05 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
GD113 0.01 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム 50 g/L
*：蛋白加水分解物
＜PRPP synthetase 活性増強株の作製＞
（１）バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）にguaB変異（A1）が導入され、かつプリンオペロンプロモーター領域を改変した組換え体KMBS280を用いて、PRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列を改変した菌株の作製を、以下のようにして行った。
（１）バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）にguaB変異（A1）が導入され、かつプリンオペロンプロモーター領域を改変した組換え体KMBS280を用いて、PRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列を改変した菌株の作製を、以下のようにして行った。
（ｉ）SD配列改変を含むSD配列上流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有する配列番号３４に示した34 merのPCR用プライマー、3種の改変型Ppur配列を含む、46 merの改変用プライマーを作製した。
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、prs開始コドン上流配列（約1040 bp）と下流配列（10 bp）を含む増幅断片を得た。
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有する配列番号３４に示した34 merのPCR用プライマー、3種の改変型Ppur配列を含む、46 merの改変用プライマーを作製した。
（ｉｉ）SD配列改変を含むSD配列下流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有する配列番号３８に示した34 merのPCR用プライマー、3種の改変型SD配列を含む、46 merの改変用プライマーを作製した。
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、prs開始コドン上流配列（36 bp）と下流配列（約960 bp）を含む増幅断片を得た。
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有する配列番号３８に示した34 merのPCR用プライマー、3種の改変型SD配列を含む、46 merの改変用プライマーを作製した。
（ｉｉｉ）改変型SD配列を含む領域のPCR法による増幅
（ｉ）および（ｉｉ）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号３４および３８を用いて、PCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、SD配列が改変SD配列1、2、あるいは3（SD1, SD2, SD3）と改変されたDNAの増幅断片を得た。
（ｉ）および（ｉｉ）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号３４および３８を用いて、PCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、SD配列が改変SD配列1、2、あるいは3（SD1, SD2, SD3）と改変されたDNAの増幅断片を得た。
（ｉｖ）改変型SD配列を含む領域のクローニング
改変型SD配列（SD1、SD2、SD3）を含む領域のDNA断片をクリーンアップし、BamHIで処理したDNA断片を、同酵素で処理し、Calf intestinal phosphataseにより脱リン酸化した染色体組換え用ベクターpJPM1（Mueller et. al., J. Bacteriol., 1992, 174, 4361-4373）とT4 DNAリガーゼを用いて連結させ、pKM196（SD1）、pKM197（SD2）、pKM198（SD3）を得た。
改変型SD配列（SD1、SD2、SD3）を含む領域のDNA断片をクリーンアップし、BamHIで処理したDNA断片を、同酵素で処理し、Calf intestinal phosphataseにより脱リン酸化した染色体組換え用ベクターpJPM1（Mueller et. al., J. Bacteriol., 1992, 174, 4361-4373）とT4 DNAリガーゼを用いて連結させ、pKM196（SD1）、pKM197（SD2）、pKM198（SD3）を得た。
（ｖ）改変型SD配列を導入したイノシン生産菌株の作製
得られたプラスミドpKM196（SD1）、pKM197（SD2）、あるいはpKM198（SD3）を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS280株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した（1回組換え株）。
得られた1回組換え株をLB培地10 mlに植菌し、37℃で継第培養を数日間実施し、LB寒天培地上でクロラムフェニコール感受性となったコロニーをスクリーニングした。得られたクロラムフェニコール感受性コロニーから染色体DNAを調製し、配列番号３４と３８のプライマーを用いて上記と同様にしてPCRを行い、DNAシークエンスを解析することで、染色体上のprs遺伝子のSD配列が、改変型SD配列と２回組換えにより置換した菌株を同定した。このようにして得られた２回組換え株の内の一株を、KMBS310（SD1）、KMBS318（SD2）、KMBS322（SD3）と名づけた。
得られたプラスミドpKM196（SD1）、pKM197（SD2）、あるいはpKM198（SD3）を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS280株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した（1回組換え株）。
得られた1回組換え株をLB培地10 mlに植菌し、37℃で継第培養を数日間実施し、LB寒天培地上でクロラムフェニコール感受性となったコロニーをスクリーニングした。得られたクロラムフェニコール感受性コロニーから染色体DNAを調製し、配列番号３４と３８のプライマーを用いて上記と同様にしてPCRを行い、DNAシークエンスを解析することで、染色体上のprs遺伝子のSD配列が、改変型SD配列と２回組換えにより置換した菌株を同定した。このようにして得られた２回組換え株の内の一株を、KMBS310（SD1）、KMBS318（SD2）、KMBS322（SD3）と名づけた。
（２）改変型SD配列を導入したイノシン生産菌株のプリンヌクレオシド生産
改変型SD配列SD1、SD2あるいはSD3を導入したイノシン生産菌株（KMBS310株、KMBS318株とKMBS322株）およびコントロール株であるKMBS280を、PS培地プレート（Soluble starch 30 g/L、Yeast extract 5 g/L、Polypeptone 5 g/L、Agar 20 g/L、KOHでpH 7.0に調
整）上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後120時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した。
[発酵培地組成]
グルコース 60 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃（T-N）* 1.35 g/L
DL-メチオニン 0.3 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
グアノシン 0.075 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
GD113 0.01 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム 50 g/L
*：蛋白加水分解物
改変型SD配列SD1、SD2あるいはSD3を導入したイノシン生産菌株（KMBS310株、KMBS318株とKMBS322株）およびコントロール株であるKMBS280を、PS培地プレート（Soluble starch 30 g/L、Yeast extract 5 g/L、Polypeptone 5 g/L、Agar 20 g/L、KOHでpH 7.0に調
整）上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後120時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した。
[発酵培地組成]
グルコース 60 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃（T-N）* 1.35 g/L
DL-メチオニン 0.3 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
グアノシン 0.075 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
GD113 0.01 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム 50 g/L
*：蛋白加水分解物
酸化的ペントース−リン酸経路の酵素活性を上昇させた菌株の構築
（１）グルコース−６−リン酸−デヒドロゲナーゼ活性増幅株の構築
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupGとdeoD）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）にguaB変異（A1）が導入され、かつプリンオペロンプロモーター領域およびPRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列を改変した組換え体を用いて、酸化的ペントース−リン酸経路のグルコース−６−リン酸−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子zwfを搭載したプラスミドを導入した菌株の作製を、以下のようにして行った。
（１）グルコース−６−リン酸−デヒドロゲナーゼ活性増幅株の構築
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupGとdeoD）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）にguaB変異（A1）が導入され、かつプリンオペロンプロモーター領域およびPRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列を改変した組換え体を用いて、酸化的ペントース−リン酸経路のグルコース−６−リン酸−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子zwfを搭載したプラスミドを導入した菌株の作製を、以下のようにして行った。
（ｉ）zwf構造遺伝子およびその上流域のPCRによる増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964 CAB14317. glucose-6-phospha...[gi:2634820]）の情報に基づき、以下の塩基配列を有する、それぞれ29 merのPCR用
プライマーを作製した。
cgcggatccGCCTCTGAAAAGAACAATCC（配列番号４３；小文字の塩基はBamHIサイトを含むタグ）
cgcggatccAAGCTCTTAAGCTTTGGGGG（配列番号４４；小文字の塩基はBamHIサイトを含むタグ）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、zwf構造遺伝子およびその上流域（約160 bp）を含む増幅断片を得た。
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964 CAB14317. glucose-6-phospha...[gi:2634820]）の情報に基づき、以下の塩基配列を有する、それぞれ29 merのPCR用
プライマーを作製した。
cgcggatccGCCTCTGAAAAGAACAATCC（配列番号４３；小文字の塩基はBamHIサイトを含むタグ）
cgcggatccAAGCTCTTAAGCTTTGGGGG（配列番号４４；小文字の塩基はBamHIサイトを含むタグ）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 2分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、zwf構造遺伝子およびその上流域（約160 bp）を含む増幅断片を得た。
（ｉｉ）zwf構造遺伝子およびその上流域のクローニング
zwf構造遺伝子およびその上流域のDNA断片をクリーンアップし、BamHIで処理したDNA断片を、同酵素で処理し、Calf intestinal phosphataseにより脱リン酸化したE. coli−BacillusのシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト社製）とT4 DNAリガーゼを用いて連結させ、zwf遺伝子増幅用プラスミドを取得した。
zwf構造遺伝子およびその上流域のDNA断片をクリーンアップし、BamHIで処理したDNA断片を、同酵素で処理し、Calf intestinal phosphataseにより脱リン酸化したE. coli−BacillusのシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト社製）とT4 DNAリガーゼを用いて連結させ、zwf遺伝子増幅用プラスミドを取得した。
（ｉｉｉ）zwf遺伝子増幅用プラスミドを導入したイノシン生産菌株の作製
得られたプラスミド、あるいはコントロールのpHY300PLKベクターを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS321株のコンピテントセルを形質転換し、12.5 μg/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。zwfを搭載したプラスミドが導入された株の内の１つをTABS125、pHY300PLKが導入された株のうち１つをTABS100と名づけた。
なお、KMBS321株は以下のようにして作製された株である。
KMBS16（purR::spc purA::erm deoD::kan；US2004-0166575A）より、FouetとSonensheinの方法（J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844）により調製したゲノムDNAを用いて、B. subtilis 168 Marburg株のコンピテントセルを形質転換し、5μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このようにして得られたいくつかのコロニーの中でスペクチノマイシン耐性又はエリスロマイシン耐性となっていないコロニーを選択し、それらの内の一株を、KMBS5（deoD::kan）と名づけた。
KMBS5（deoD::kan）より、FouetとSonensheinの方法（J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844）により調製したゲノムDNAを用いて、上記KMBS310株のコンピテントセルを形質転換し、5μg/mlのカナマイシンと20μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このようにして得られたいくつかのコロニーを選択し、野生型deoD遺伝子がdeoD::kanで置換されており、かつKMBS310由来のすべての変異が野生型配列と置換されていないことが確認できた形質転換体の内の一株を、KMBS321と名づけた。
グルコース−６−リン酸−デヒドロゲナーゼが上昇したことの確認は、以下のような方法で行った。
得られたプラスミド、あるいはコントロールのpHY300PLKベクターを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、KMBS321株のコンピテントセルを形質転換し、12.5 μg/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。zwfを搭載したプラスミドが導入された株の内の１つをTABS125、pHY300PLKが導入された株のうち１つをTABS100と名づけた。
なお、KMBS321株は以下のようにして作製された株である。
KMBS16（purR::spc purA::erm deoD::kan；US2004-0166575A）より、FouetとSonensheinの方法（J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844）により調製したゲノムDNAを用いて、B. subtilis 168 Marburg株のコンピテントセルを形質転換し、5μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このようにして得られたいくつかのコロニーの中でスペクチノマイシン耐性又はエリスロマイシン耐性となっていないコロニーを選択し、それらの内の一株を、KMBS5（deoD::kan）と名づけた。
KMBS5（deoD::kan）より、FouetとSonensheinの方法（J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844）により調製したゲノムDNAを用いて、上記KMBS310株のコンピテントセルを形質転換し、5μg/mlのカナマイシンと20μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このようにして得られたいくつかのコロニーを選択し、野生型deoD遺伝子がdeoD::kanで置換されており、かつKMBS310由来のすべての変異が野生型配列と置換されていないことが確認できた形質転換体の内の一株を、KMBS321と名づけた。
グルコース−６−リン酸−デヒドロゲナーゼが上昇したことの確認は、以下のような方法で行った。
glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase (zwf遺伝子産物)活性測定法
反応溶液
50 mM Tris-HCl (pH7.6)
10 mM MgSO4・7H2O
0.3 mM NADP
4 mM Glucose 6-phosphate
酵素溶液
上記の反応溶液（1 ml）を調製し、37℃で反応を開始した。生成するNADPHの濃度変化を340 nmの吸収を測定した。
反応溶液
50 mM Tris-HCl (pH7.6)
10 mM MgSO4・7H2O
0.3 mM NADP
4 mM Glucose 6-phosphate
酵素溶液
上記の反応溶液（1 ml）を調製し、37℃で反応を開始した。生成するNADPHの濃度変化を340 nmの吸収を測定した。
（ｉｖ）zwfを搭載したプラスミドを導入したイノシン生産菌株のプリン系核酸生産
TABS100またはTABS125を、12.5 μg/mlのテトラサイクリンを含むPS培地プレート（Soluble starch 30 g/L、Yeast extract 5 g/L、Polypeptone 5 g/L、Agar 20 g/L、KOHでpH
7.0に調整）上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養する。培養開始後120時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した（表5）。このような方法でプリンヌクレオシド生産能の向上した菌株を取得することが出来た。
[発酵培地組成例]
グルコース 60 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃（T-N）* 1.35 g/L
Yeast Extract 1 g/L
DL-メチオニン 0.3 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
グアノシン 0.075 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
GD113 0.01 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム 50 g/L
*：蛋白加水分解物
TABS100またはTABS125を、12.5 μg/mlのテトラサイクリンを含むPS培地プレート（Soluble starch 30 g/L、Yeast extract 5 g/L、Polypeptone 5 g/L、Agar 20 g/L、KOHでpH
7.0に調整）上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養する。培養開始後120時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した（表5）。このような方法でプリンヌクレオシド生産能の向上した菌株を取得することが出来た。
[発酵培地組成例]
グルコース 60 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃（T-N）* 1.35 g/L
Yeast Extract 1 g/L
DL-メチオニン 0.3 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
グアノシン 0.075 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
GD113 0.01 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム 50 g/L
*：蛋白加水分解物
（２）リボース−5−リン酸イソメラーゼ活性増強株の構築
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupGとdeoD）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）にguaB変異（A1）が導入され、かつプリンオペロンプロモーター領域およびPRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列を改変した組換え体を用いて、酸化的ペントース−リン酸経路遺伝子ywlFを搭載したプラスミドを導入した菌株の作製を、以下のようにして行った。
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupGとdeoD）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）にguaB変異（A1）が導入され、かつプリンオペロンプロモーター領域およびPRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列を改変した組換え体を用いて、酸化的ペントース−リン酸経路遺伝子ywlFを搭載したプラスミドを導入した菌株の作製を、以下のようにして行った。
（ｉ）ywlF構造遺伝子およびその上流域のPCRによる増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964 CAB15709. [gi:2636217]）の情報に基づき、以下の塩基配列を有する、それぞれ34 merのPCR用プライマーを作製した。
cgcgaattcGTAGATAAGTTGTCAGAAAATCTGC（配列番号４５；小文字の塩基はEcoRIサイトを含むタグ）
cgcgaattcTGTTTCAACTCATTCATTAAACAGC（配列番号４６；小文字の塩基はEcoRIサイトを含むタグ）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、ywlF構造遺伝子およびその上流域（約160 bp）を含む増幅断片を得た。
遺伝子データバンク（GenBank Accession No. NC_000964 CAB15709. [gi:2636217]）の情報に基づき、以下の塩基配列を有する、それぞれ34 merのPCR用プライマーを作製した。
cgcgaattcGTAGATAAGTTGTCAGAAAATCTGC（配列番号４５；小文字の塩基はEcoRIサイトを含むタグ）
cgcgaattcTGTTTCAACTCATTCATTAAACAGC（配列番号４６；小文字の塩基はEcoRIサイトを含むタグ）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（94℃, 30秒; 55℃, 1分; 72℃, 1分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、ywlF構造遺伝子およびその上流域（約160 bp）を含む増幅断片を得た。
（ｉｉ）ywlF構造遺伝子およびその上流域のクローニング
ywlF構造遺伝子およびその上流域のDNA断片をクリーンアップし、EcoRIで処理したDNA断片を、同酵素で処理し、Calf intestinal phosphataseにより脱リン酸化したE. coli−BacillusのシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト社製）とT4 DNAリガーゼを用いて連結させ、ywlF遺伝子増幅用プラスミドを取得した。
ywlF構造遺伝子およびその上流域のDNA断片をクリーンアップし、EcoRIで処理したDNA断片を、同酵素で処理し、Calf intestinal phosphataseにより脱リン酸化したE. coli−BacillusのシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト社製）とT4 DNAリガーゼを用いて連結させ、ywlF遺伝子増幅用プラスミドを取得した。
（ｉｉｉ）ywlF遺伝子増幅用プラスミドを導入したイノシン生産菌株の作製
得られたプラスミド、あるいはコントロールのpHY300PLKベクターを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、上記KMBS321株のコンピテントセルを形質転換し、12.5 μg/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。ywlFを搭載したプラスミドが導入された株の内の１つをTABS102と名づけた。
リボース−5−リン酸イソメラーゼ活性が上昇したことの確認は、以下のような方法で行った。
得られたプラスミド、あるいはコントロールのpHY300PLKベクターを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製した、上記KMBS321株のコンピテントセルを形質転換し、12.5 μg/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。ywlFを搭載したプラスミドが導入された株の内の１つをTABS102と名づけた。
リボース−5−リン酸イソメラーゼ活性が上昇したことの確認は、以下のような方法で行った。
Ribose 5-phosphate isomerase (ywlF遺伝子産物)活性測定法
反応溶液
50 mM HEPES (pH7.5)
0.1 M NaCl
10 mM Ribose 5-phosphate
酵素溶液
上記の反応溶液（1 ml）を調製し、37℃で反応を開始した。生成するRibulose 5-phosphate の濃度変化を290 nmの吸収を測定した。
反応溶液
50 mM HEPES (pH7.5)
0.1 M NaCl
10 mM Ribose 5-phosphate
酵素溶液
上記の反応溶液（1 ml）を調製し、37℃で反応を開始した。生成するRibulose 5-phosphate の濃度変化を290 nmの吸収を測定した。
（ｉｖ）ywlFを搭載したプラスミドを導入したイノシン生産菌株のプリン系核酸生産
TABS100またはTABS102を、12.5 μg/mlのテトラサイクリンを含むPS培地プレート（Soluble starch 30 g/L、Yeast extract 5 g/L、Polypeptone 5 g/L、Agar 20 g/L、KOHでpH
7.0に調整）上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後120時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した（表6）。リボース−5−リン酸イソメラーゼ活性増強株は、非改変株と比べ、イノシン生産能が向上した。
[発酵培地組成例]
グルコース 60 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃（T-N）* 1.35 g/L
Yeast Extract 1 g/L
DL-メチオニン 0.3 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
グアノシン 0.075 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
GD113 0.01 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム 50 g/L
*：蛋白加水分解物
TABS100またはTABS102を、12.5 μg/mlのテトラサイクリンを含むPS培地プレート（Soluble starch 30 g/L、Yeast extract 5 g/L、Polypeptone 5 g/L、Agar 20 g/L、KOHでpH
7.0に調整）上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後120時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した（表6）。リボース−5−リン酸イソメラーゼ活性増強株は、非改変株と比べ、イノシン生産能が向上した。
[発酵培地組成例]
グルコース 60 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃（T-N）* 1.35 g/L
Yeast Extract 1 g/L
DL-メチオニン 0.3 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
グアノシン 0.075 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
GD113 0.01 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム 50 g/L
*：蛋白加水分解物
本発明のバチルス属細菌を用いることにより、プリンヌクレオシド及び/又はプリンヌクレオチドの生産効率を向上させることが出来る。
Claims (9)
- バチルス・ズブチリス、バチルス・プミルスおよびバチルス・アミロリケファシエンスから選択されるバチルス属細菌を培地に培養してイノシンまたはグアノシンを蓄積せしめ、イノシンまたはグアノシンを培地から回収することを特徴とするイノシンまたはグアノシンの製造法であって、
前記バチルス属細菌が、培地中で培養したときに、イノシンまたはグアノシンを培地から回収できる程度に培地中に分泌、蓄積できる能力を有するバチルス属細菌であって、グルコース−６−リン酸−脱水素酵素又はリボース５−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子のプロモーターを置換することによりグルコース−６−リン酸−脱水素酵素又はリボース５−リン酸イソメラーゼの活性が増強したことにより前記イノシンまたはグアノシンを培地から回収できる程度に培地中に分泌、蓄積できる能力がさらに向上したバチルス属細菌であることを特徴とする方法。 - グルコース−６−リン酸−脱水素酵素をコードする遺伝子が下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子である請求項１に記載の方法。
（Ａ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース−６−リン酸−脱水素酵素活性を有するタンパク質。 - リボース５−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子が下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードする遺伝子である請求項１に記載の方法。
（Ｅ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、リボース５−リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。 - グルコース−６−リン酸−脱水素酵素をコードする遺伝子が下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項１に記載の方法。
（ａ）配列番号４７に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号４７に記載の塩基配列の相補配列と６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳに相当する条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、グルコース−６−リン酸−脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - リボース５−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子が下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡである請求項１に記載の方法。
（ｅ）配列番号４９に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｆ）配列番号４９に記載の塩基配列の相補配列と６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度の条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、リボース５−リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 前記バチルス属細菌が、さらにホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子のプロモーターを置換することによりホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性が上昇するように改変されたことを特徴とする請求項１〜５のいずれか1項に記載の方法。
- 前記バチルス属細菌が、さらに、プリンオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子であるｐｕｒＲ遺伝子が破壊されたこと、あるいは、プリンオペロンのアテニュエーター領域の一部が除去されたことによりプリンオペロンの発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バチルス属細菌が、さらに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子および／またはｐｕｐＧ遺伝子を破壊することによってプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする請求項１〜７のいずれか1
項に記載の方法。 - 請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法によりイノシンまたはグアノシンを製造し、該イノシンまたはグアノシンに、ポリ燐酸、フェニル燐酸、カルバミル燐酸からなる群より選択された燐酸供与体と、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物または酸性フォスファターゼを作用させて、イノシン酸またはグアニル酸を生成せしめ、該イノシン酸またはグアニル酸を採取することを特徴とするイノシン酸またはグアニル酸の製造法。
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