JP5583401B2 - セレン含有化合物並びにこれを含有する植物及び栄養剤 - Google Patents

Description

本発明は、セレン含有化合物並びにこれを含有する植物及び栄養剤に関する。

大根やセイヨウカラシナ等ある種のアブラナ科の植物は、セレン含有アミノ酸（以下「セレノアミノ酸」という。）及びその誘導体を植物体内に多く蓄積することが知られている。

セレノアミノ酸は動物にとって一般に毒性が低く、利用しやすい形態であり、生体必須元素であるセレンの栄養剤（例えば栄養補助食品）として利用可能なだけでなく、セレノアミノ酸の中には抗がん作用を有しているものもあるため、がんの予防や抗がん剤等の医薬品としての使用も期待されている。

植物に蓄積されているセレノアミノ酸由来の主な二次代謝産物としては、メチルセレノシステイン（ｍｅｔｈｙｌｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）及びガンマグルタミルメチルセレノシステイン（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｍｅｔｈｙｌｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）が今までに同定されている。

しかしながら、セレンは微量元素であり、極めて微量しか存在しないセレン代謝物の構造を同定することは非常に困難であり、植物中に蓄積されているセレノアミノ酸又はその由来物としては上記二種類程度しかないというのが現状である。

そこで、本発明は、上記課題を鑑み、より有用な新規セレン含有化合物並びにこれを含有する植物及び栄養剤を提供することを目的とする。

本発明の一形態は、下記式（１）で示されるセレノホモランチオニン若しくはそのエステル又はそれらの塩である。

上記式（１）で示されるセレノホモランチオニンのエステルとは、下記式（１）とアルコールとが脱水縮合されることにより得られる化合物であり、限定されるわけではないが、炭素数１以上１０以下のアルコールであることは好ましい一態様である。また、セレノホモランチオニン若しくはそのエステルの塩としては、適宜選択可能であり限定されるわけではないが、酸付加塩であっても塩基性塩であってもよい。酸付加塩としては、限定されるわけではないが、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等の無機酸との塩、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩が好ましい。また塩基性塩としては、限定されるわけではないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム等の無機塩基との塩、カフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジン等の有機塩基との塩が好ましい。これは以下の態様においても同様である。

本発明の他の一形態にかかる植物は、下記式（１）で示されるセレノホモランチオニン若しくはそのエステル又はそれらの塩の少なくともいずれかを含有する。

なお、本形態において、限定されるわけではないが、辛味大根であることは特に好ましい一態様である。

また、本発明の他の一形態に係る栄養剤は、下記式（１）で示されるセレノホモランチオニン若しくはそのエステル又はそれらの塩の少なくともいずれかを含有する。

以上、本発明により、より有用な新規セレン含有化合物並びにこれを含有する植物及び栄養剤を提供することを目的となる。

以下、本発明の実施形態について図面を用いて詳細に説明するが、本発明は多くの異なる実施形態を有し、以下に具体的に示す実施形態にのみ限定されるものではない。

（実施形態）
本実施形態に係るセレン含有化合物（以下「本セレン含有化合物」ともいう。）は、下記式（１）で示される。本セレン含有化合物は、下記式（１）で示されるとおり、セレノアミノ酸誘導体である。

本実施形態に係るセレン含有化合物は、微量必須栄養成分であるセレンの栄養素として利用することができる。近年、栄養補助剤としてセレンが販売されているが、セレンの生体による利用効率や安全性は化学形に依存している。現在セレン剤として利用されているセレンの化学形はセレノメチオニンをはじめとするセレノアミノ酸誘導体であるが、これらは無機の亜セレン酸やセレン酸に比べて安全性は高いものの、セレノメチオニンはメチオニンと区別なくポリペプチド鎖に取り込まれるなど利用効率の点で、不利な面を持っている。これに対して、本セレン含有化合物は、利用効率についてもポリペプチド鎖に取り込まれることがないため、セレノアミノ酸よりも高いことが期待できる。また本実施形態に係るセレン含有化合物は、従来同定されているセレノアミノ酸よりもより細胞毒性が低く、より有効なセレン含有化合物として栄養剤、医薬品として利用が可能となる。なおこの化合物を栄養補助食品、医薬品とする場合は、常法を用いて製剤化することが可能であり、栄養補助食品とする場合は添加剤として食品等に添加することが可能である。

またセレン含有化合物は、合成によって得ることもでき、植物から精製することにより得ることもできる。なお植物の場合、上記化合物を得ることができる限りにおいて限定されるわけではないが、辛味大根から効率よく得ることができ特に好ましい。

辛味大根から得る方法としては、上記化合物を得ることができる限りにおいて限定されるわけではないが、例えば培地に無機セレン化合物を含有させて公知の品種の辛味大根を栽培及び収穫し、抽出することで得ることができる。なおこの場合における無機セレンとしては、上記化合物を得ることができる限りにおいて適宜選択可能であり限定されるわけではないが、例えばセレン酸バリウム、亜セレン酸バリウム、セレン酸ナトリウム及び亜セレン酸ナトリウムの少なくともいずれかを挙げることができる。無機セレン化合物を散布する時期としては、種子を植える前であっても、ある程度（１〜２ヶ月程度）辛味大根が育った後でも良いが、植物へのセレンの蓄積を考慮すると収穫よりできる限り早期であることが好ましい。無機セレン化合物を散布する量としては、１００ｍｇ／ｍ^２以上１００００ｍｇ／ｍ^２以下であることが好ましく、より好ましくは２００ｍｇ／ｍ^２以上５０００ｍｇ／ｍ^２以下である。なお種子を植える前に無機セレン化合物を散布する場合は５００ｍｇ／ｍ^２以上１０００ｍｇ／ｍ^２以下であることが更に好ましく、ある程度辛味大根が育った後では２００ｍｇ／ｍ^２以上５０００ｍｇ／ｍ^２以下であることがより好ましい。なおある程度辛味大根が育った後では上記量を複数回散布することがより好ましい。

以上、本セレン含有化合物は細胞毒性が低くより有用なセレン化合物となり、これを含む有用な植物も提供可能となる。

本発明者らは、新規セレン化合物を探索すべく、実際に辛味大根を栽培し、その評価を行った。以下に説明する。

（実施例１）
（辛味大根の収穫）
まず、縦１０ｍ、横１５ｍ、深さ１ｍのコンクリート躯体に小石、砂、黒土を順に入れて栽培槽とした。次に、この栽培槽と地下水槽とはパイプでつなぎ浸透水を貯蔵した。そして更に、栽培槽中の土の表面にセレン酸バリウム及びセレン酸ナトリウムをそれぞれ５００ｍｇ／ｍ^２を散布し、肥料とともによく混和した。そしてその後ここに幅５０ｃｍ、高さ１０ｃｍの畝を立て、辛味大根（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ． ｖａｒ． ｌｏｎｇｉｐｉｎｎａｔｕｓ Ｌ． Ｈ． Ｂａｉｌｅｙ Ｃｕｌｔｉｖａｒ ‘Ｙｕｋｉｂｉｊｉｎ’）の種子を播種した。雑草の除去、防除などを行い４ヵ月後、成長したセレン強化辛味大根を収穫した。

（セレン濃度の確認）
収穫したセレン強化辛味大根のセレン濃度について誘導結合プラズマ質量分析法により測定したところ、辛味大根１ｇあたり約３０μｇ（測定回数３回の平均）含まれていることを確認した。なお、辛味大根収穫後の地下水槽中におけるセレン濃度についても同様の測定を行ったところ、水１ｇあたり約１μｇ（測定回数３回の平均）含まれていることを確認した。

（セレン化合物の確認試験）
収穫されたセレン強化辛味大根５ｇをおろし金ですりおろし、更に４倍量の精製水を加え、ホモジナイザーを用いて十分にホモジナイズした。これを冷却遠心法により６６００ｇの上清を得、更にその上清を０．２２μｍフィルターに通し、抽出液を得た。

この抽出液２０μｌを高性能クロマトグラフ用カラム（Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−３２０ ＨＱ、昭和電工社製）に入れ、溶出バッファーとして５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）を用いて流速０．６ｍｌ／分の条件下で抽出した。なお、この溶出物は直接、コリジョンセルを有する誘導結合プラズマ質量分析装置（Ａｇｉｌｅｎｔ７５００、アジレントテクノロジー社製）に導入し、ｍ／ｚ＝８２でセレンを検出した。

この結果、３種類のセレン化合物の溶出を観測した（図１参照）。これら３種類の化合物のうち、保持時間１５．４分のセレン化合物はセレン酸であり、保持時間１９．９分の化合物はメチルセレノシステインであることが確認できたが、保持時間１７．８分のセレン化合物は既知のセレン化合物とは一致しなかった。

そこで、この検出された保持時間１７．８分のセレン化合物を同定するため、先ほど取得した抽出液を９５℃、１０分間熱処理し、上清２００μｌを高性能クロマトグラフ用カラム（Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−３２０ ＨＱ、昭和電工社製）に入れ、溶出バッファーとして５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）を用いて流速０．６ｍｌ／分の条件下で溶出し、保持時間１７．５分から１８．８分の溶出液を分取した。そして更にその溶出液２００μｌを他の高性能クロマトグラフ用カラム（ＰＲＰ Ｘ−１００、Ｈａｍｉｌｔｏｎ社製）に入れ、溶出バッファーとして１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ９．０）及び２００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ９．０）を用いて流速１．２ｍｌ／分の条件下でグラジエント溶出し、保持時間９．５分から１０．５分の溶出液を分取した。なおこの操作は５回繰り返した。

集められたこの溶出液を凍結乾燥法により粉末とした後、少量の水に再溶解し、エレクトロスプレーイオン化質量分析装置（ＡＰＩ３０００、アプライドバイオシステムズ社製）により測定を行った。その結果、一段目の質量分析計で検出された親イオンのマススペクトルにおいて、ｍ／ｚ＝２８５付近にのみセレンの同位体比に相当するマスパターンが検出された（図２参照）。更に、タンデムマス法により検出されるフラグメント・イオンのマススペクトルは、全てセレノホモランチオニンに由来するものと帰結でき、本実施例において収穫されたセレン強化辛味大根中に存在する未知のセレン化合物がセレノホモランチオニンであると同定した（図３参照）。

（セレノホモランチオニンの合成）
ここで、上記セレン強化辛味大根から得られたセレン化合物がセレノホモランチオニンであることを確認すべく、実際にセレノホモランチオニンを合成し、これらについて比較を行なった。

まず、下記（２）に示す２−アミノ−４−ブロモ酪酸と、水素化ホウ素ナトリウムにより還元した元素状セレンを反応させることで、上記式（１）に示すセレノホモランチオニンを合成した。なお、合成したセレノホモラチオニン（以下「合成品」という。）についてプロトン核磁気共鳴装置を用いて測定した結果、下記表で示されるスペクトルを得ることができた。この結果、目的とする化合物が合成できていることを確認した（表１参照）。

（エレクトロスプレーイオン化質量分析装置による比較）
上記辛味大根から抽出されたセレン化合物（以下「抽出品」ともいう。）に行なったのと同様に、合成品を少量の水に溶かし、上記エレクトロスプレーイオン化質量分析装置（ＡＰＩ３０００、アプライドバイオシステムズ社製）により測定を行った。この結果、タンデムマス法により検出されるフラグメント・イオンのマススペクトルが合成品と抽出品との間で完全に一致した（図３参照）。

（高性能クロマトグラフィー誘導結合プラズマ質量分析装置による比較）
抽出品を含む水溶液に合成品を２．０μｇセレン／ｍｌとなるように加え、その２０μｌを高性能クロマトグラフィーカラム（Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−３２０ ＨＱ、昭和電工社製）に入れ、溶出バッファーとして５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）を用いて流速０．６ｍｌ／分の条件下で溶出し、この溶出物を高性能クロマトグラフィー誘導結合プラズマ質量分析装置に導入し、ｍ／ｚ＝８２でセレンをモニターした。

一方、先ほどと同様の水溶液２０μｌを改めて作製し、他の高性能クロマトグラフ用カラム（ＰＲＰ Ｘ−１００、Ｈａｍｉｌｔｏｎ社製）に入れ、溶出バッファーとして１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）及び２００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）を用いて流速１．２ｍｌ／分の条件下でグラジエント溶出し、この溶出物を高性能クロマトグラフィー誘導結合プラズマ質量分析装置に導入し、ｍ／ｚ＝８２でセレンをモニターした。

この結果、いずれも両者の保持時間は完全に一致していることを確認した。

（細胞毒性の評価）
合成品を用いて人由来培養細胞に対する細胞毒性の評価を行なった。毒性評価は、ヒト由来培養細胞ＨＬ６０を１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０倍地にセレン濃度として０〜１０００μＭとなるように合成品又は陽性対象としてのセレノメチオニンを添加して７２時間培養することで行なった。この結果、合成品は陽性対象としてのセレノメチオニンよりも細胞毒性が低いことが確認できた。すなわち、セレノホモランチオニンはセレノメチオニンよりも細胞毒性が低いことを確認した。

以上、本実施例により、より有用な新規セレン化合物を提供することができるとともに、それを含有する植物を提供することができることを確認した。

本発明に係るセレン化合物は、いわゆる栄養補助食品や医薬品の分野において利用可能であり、また、この化合物を含む植物は栽培可能であり、農業の分野において利用可能性がある。

図１は、高性能液体クロマトグラフィー−誘導結合プラズマ質量分析装置によるセレン強化辛味大根抽出液中のセレン化合物の分布を示す図である。 図２は、高性能液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化質量分析装置によるセレン強化辛味大根抽出液中のセレン化合物の分子量を示す図である。 図３は、高性能液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化質量分析装置によるセレン強化辛味大根抽出液中のセレン化合物の分子構造を示す図である。

Claims (2)

1. 下記式（１）で示されるセレノホモランチオニン若しくはそのエステル又はそれらの塩。
   
2. 下記式（１）で示されるセレノホモランチオニン若しくはそのエステル又はそれらの塩の少なくともいずれかを必須栄養成分とする、辛味大根から抽出された栄養剤。