JP5592080B2 - 細胞培養方法、細胞培養システム - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養を無菌状態で行うシステム、特に移植医療のためのヒト細胞組織を培養するに好適な細胞培養方法及び細胞培養システムに関する。

複数の細胞培養を順次行う場合における交叉汚染を防止する方法の一例が特許文献１に開示されている。この特許文献１に記載の無菌培養装置は、アイソレータ型の作業室と、同じくアイソレータ型の複数の培養器（インキュベータ）と、それらの間で培養容器を橋渡しする密封移送容器とを備える。作業室は遠心機や顕微鏡などの機器を備える。密封移送容器と、作業室や培養器は、互いに無菌状態を保ったまま接離可能な接続ポートを備える。作業室で原料組織試料の前処理を行い、得られた被培養物（細胞）を培養容器に格納し、密封移送容器を用いて培養容器を培養器へ移送し、培養器内で細胞培養を行う。ある細胞に関する培養操作を完了後、作業室と、使用した培養器及び密封移送容器とをガス滅菌したうえで、次の細胞の培養操作を開始することにより、複数種類の細胞試料の相互間の交叉汚染を防止している。

また、培養容器の汚染防止法の一例が特許文献２に記載されている。この特許文献２に記載のキャニスタは、複数の培養容器を収納可能な箱であり、通気と透湿のためのフィルタを備え、それ以外は密閉可能な構造とすることにより交叉汚染を防止し、また細胞観察のための透明な壁面を有する。

更に、滅菌済みの消耗品等をクリーン度の高いエリアに入庫する方法が特許文献３に記載されている。この特許文献３に記載の入庫方法では、エリアを、そのクリーン度が外部から内部に向かうに従い上昇する様に段階的なクリーン度をもつ複数のエリアに分割し、エリア同士の接続部にパスボックスを設ける。滅菌袋などを用いて滅菌物に多重包装を施し、滅菌物をクリーン度の高いエリアに入庫する際、各パスボックスにおいて滅菌物の包装(滅菌袋)を外側から廃棄する。これにより、滅菌物に施した包装の外面に付着した環境由来の汚染がクリーン度の高いエリアに混入することを防止している。

特開２００５−２７８５６５号公報 実用新案登録第３１３４０３４号公報 特開２００８−２３９１６８号公報

上述の各特許文献に代表される従来技術には以下の課題が考えられる。まず、特許文献１のごとく、無菌の作業室の内部に遠心機や顕微鏡などの機器類を設置して用いると、この作業室をガス滅菌する際に滅菌ガス（酸化力の高い過酸化水素ガス）がこれら機器類を腐食して性能を劣化させ、誤動作を引き起こし、寿命を縮めるという課題がある。

また、特許文献２のごとく、無菌培養室の外部にインキュベータや顕微鏡などの機器類を設置して用いると、細胞試料の汚染を防止するために、大型で取り扱いが困難なキャニスタが必要となる。また、このキャニスタは遠心分離には対応できないという課題がある。

更に、特許文献２と特許文献３を組合せ、特許文献２におけるキャニスタを、特許文献３に記載の包装類に置き換える方法も考えられる。即ち、遠心分離機用の容器（遠沈管）や細胞培養容器などの容器を滅菌袋で包装した上で外部装置を用いた操作を行うことにより、外部装置からの汚染を包装の外部表面に留め、容器を無菌培養室の内部に入庫する際、包装(滅菌袋)を廃棄することにより、外部からの汚染を包装と共に除去し、無菌培養室の汚染を防止する可能性が期待される。しかしながら、特許文献２と特許文献３を組み合わせただけでは必ずしも汚染を防止できない場合がある。即ち、特に遠心分離を行った容器を無菌培養室の内部に戻すと、例え前述の包装を行っても、例えば容器の外面が容器内の細胞試料によって汚染されて(後述)、無菌培養室が汚染される場合があるという課題がある。

上記課題について更に検討する。例えば、無菌培養室などの無菌領域の外（以下無菌領域外）に遠心機や顕微鏡を設置すると、これら機器類は、その無菌性が必ずしも保証されないため、微生物や他の細胞などで汚染される可能性がある。細胞試料が遠沈管や培養容器などの容器に収納され、この細胞試料を収納した容器を無菌領域外に搬出して遠心操作や顕微鏡観察などを行うと、これら機器類から、微生物や他の細胞などが容器外壁等に付着する可能性がある。この容器を無菌領域内に搬入すると、容器外壁等に付着した汚染が無菌領域内に持ち込まれ、無菌領域内を汚染する危険性がある。そして、無菌領域で容器を解放系で（蓋などを開けて）取り扱う際、汚染が更に容器内部に波及し、結果として細胞試料が汚染されるリスクもある。このリスクは、前述の方法、即ち無菌領域内から無菌領域外に容器を搬出する際に特許文献３に倣って包装を施し、無菌領域外から無菌領域内に容器を搬入する際に包装を破棄することにより、原理的には防止することが可能である。

一方、上述の方法だけでは汚染を防止し切れないケースについて詳細に検討する。つまり、特に遠沈管を用いて遠心分離を行った場合、容器の内容物が容器の外に極微量漏出する現象が確認された。この場合、容器の外に漏出した内容物は包装の内壁ばかりでなく、容器の外壁にも付着しうる。容器を無菌領域外から無菌領域内に持ち込む際、包装を破棄することにより包装の内壁の汚染は除去されるものの、容器の外壁の汚染は除去されない。従って、容器外壁等に付着した汚染が無菌領域内に持ち込まれ、それが無菌領域内を汚染すると考えられる。以降、このような容器内の細胞試料自体に由来する汚染を内因性汚染と呼ぶ。また無菌領域外に由来する汚染を外因性汚染と呼ぶ。

上述のような容器の内容物が極微量容器の外に漏出する原因について検討した結果、以下のメカニズムが想定された。即ち、遠沈管などの容器は蓋を備える。蓋と容器本体との間の密閉性は必ずしも完全ではない場合がある。また、蓋の開閉や細胞試料の蓋への付着が繰り返されると、蓋と容器本体との間の空間を細胞試料が徐々に外周方向に拡散し、容器本体と蓋によって形成される容器内の空間の外に細胞試料が漏れ出す場合がある。遠心機などにより高い加速度が作用すると、細胞試料が蓋のネジ部分などを経由して、容器内部から容器外部へ移動するリスクが想定される。

この結果、内因性汚染が容器外壁等から無菌領域内に波及して無菌領域内を汚染するリスクが確認された（内因性汚染による無菌領域内の汚染）。特に、複数の細胞試料を取り扱う場合には、第１の細胞試料による内因性汚染が第２の細胞試料へ波及すると、交叉汚染の原因になることも考えられる（内因性汚染による交叉汚染）。

本発明の目的は、上述の事情を考慮してなされたものであり、高純度で安全な医薬品や細胞等を迅速かつ低コストに提供できる細胞培養方法、細胞培養システムを提供することにある。

上記目的を達成するため、本発明に係る細胞培養方法は、細胞試料を収納する容器を、無菌領域内と無菌領域外との間で搬送する細胞培養方法において、前記容器を前記無菌領域外へ搬送する際に、菌不透過性のシート状材料を用いた第１包装を前記容器に施して包装し、この容器を前記無菌領域内へ搬送する際に前記第１包装を取り除くとともに、前記容器内の細胞試料による汚染を防止する汚染防止部材を、前記容器の外面に施すことを特徴とする。

そして、上記方法を具現化する、本発明に係る細胞培養システムは、第１には、細胞試料を収納する容器を、無菌領域内と無菌領域外との間で搬送する細胞培養システムにおいて、前記容器を前記無菌領域外へ搬送する際に、菌不透過性のシート状材料を用いた第１包装を前記容器に施して包装し、この容器を前記無菌領域内へ搬送する際に前記第１包装を取り除く第１取扱手段が設けられると共に、前記容器内の細胞試料による汚染を防止する汚染防止部材を、前記容器の外面に施す第２取扱手段が設けられたことを特徴とする。

第２には、前記第１取扱手段は、前記容器に第１包装を施す包装機構と、前記第１包装を開梱して取り除く開梱機構とを備えるとともに、前記第２取扱手段は、前記容器に対し汚染防止部材を付加する付加機構と、前記汚染防止部材を除去する除去機構との少なくとも一方を備えたことを特徴とする。

第３には、前記汚染防止部材が、容器を無菌領域内に搬送する際に、菌不透過性のシート状材料を用いて前記容器外面に密着して施される第２包装であることを特徴とする。

第４には、前記汚染防止部材が、前記容器を無菌領域外に搬送する際に、菌不透過性のシート状材料を用いて前記容器外面に密着して施されるとともに前記第１包装と共に前記容器に包装され、前記容器を無菌領域内に搬送する際に、前記第１包装と共に前記容器から取り除かれる第２包装であることを特徴とする。

第５には、前記汚染防止部材が、容器を無菌領域外に搬送する際に、前記第１包装内に封入され、前記容器から漏出した細胞試料を滅菌可能な殺菌剤であることを特徴とする。

第６には、前記無菌領域外に遠心分離機を備え、前記容器が遠沈管であり、前記第１包装が、菌不透過性の材料を用いて構成されたことを特徴とする。
第７には、前記無菌領域外にインキュベータを備え、前記容器が細胞培養容器であり、前記第１包装が、菌不透過性且つガス透過性のシート状材料を用いて構成されたことを特徴とする。

本発明に係る細胞培養方法及び細胞培養システムによれば、第１には、容器に第１包装を施して無菌領域外で細胞試料を操作することで、容器内の細胞試料に由来する内因性汚染による無菌領域外の汚染を防止でき、また、容器を無菌領域内に搬送する際に第１包装を取り除くことで、容器外からの外因性汚染による無菌領域内の汚染を防止できる。更に、容器の外面に汚染防止部材を施すことで、容器内の細胞試料に由来する内因性汚染による無菌領域内の汚染を防止できる。これらのことから、無菌領域内外の清浄度を高度に維持できるので、細胞培養システムにおける交叉汚染のリスクを排除でき、高純度で安全な医薬品や細胞等を提供できる。

また、細胞試料に操作を付与する装置・機器類が無菌領域外に備えられたので、これらの装置・機器類を高頻度に滅菌する必要がなく、従って、これらの装置・機器類の滅菌ガス等による損傷を防止できる。このため、細胞培養システムの稼働率が上昇し、処理能力が向上して、医薬品や細胞等を迅速且つ低コストに提供できる。

第２には、第１取扱手段が容器に第１包装を施す包装機構と、第１包装を開梱して取り除く開梱機構とを備え、第２取扱手段が、前記容器に対し汚染防止部材を付加する付加機構と、汚染防止部材を除去する除去機構との少なくとも一方を備えることにより、作業者による手作業を無くすことによる作業者由来の汚染の防止及び作業効率を向上させるとともに、内因性汚染及び外因性汚染を抑制することができる。

第３には、細胞試料に由来の内因性汚染が試料容器の外壁に付着していた場合でも、それを第２包装により隠蔽して封じ込めることができ、第２包装を施した試料容器の外表面に対して内因性汚染を防止できる。

第４には、外因性汚染により第１包装の外表面が汚染されたとしても、この第１包装が廃棄されるため、無菌領域内や試料容器に対する外因性汚染を防止することができるとともに、上述同様に内因性汚染も防止できる。

第５には、第１包装内に殺菌剤を封入することにより、試料容器外部に露出した細胞を殺菌して内因性汚染を防止することができる。
第６には、試料容器として遠沈管を用いることにより、内因性汚染、外因性汚染を防止しつつ細菌を移し変えることなく遠心分離を行うことができるので作業効率が向上する。

第７には、容器を細胞培養容器とし、第１包装が菌不透過性且つガス透過性のシート状材料を用いて構成したことにより、第１包装を施したまま細胞培養を行うことができる。

本発明に係る細胞培養システムの第１の実施の形態の全体構成を模式的に示す概略図である。 図１のパスボックスの一つを代表して、その構成を模式的に示す概略図である。 本発明に係る細胞培養システムの第２の実施の形態におけるパスボックスの一つを代表して、その構成を模式的に示す概略図である。 本発明に係る細胞培養システムの第３の実施の形態におけるパスボックスの一つを代表して、その構成を模式的に示す概略図である。

以下、本発明を実施するための最良の形態を、図面に基づき説明する。
本発明は、細胞試料を収納する容器を、無菌領域内と無菌領域外との間で搬送する細胞培養方法において、前記容器を前記無菌領域外へ搬送する際に、菌不透過性のシート状材料を用いた第１包装を前記容器に施して包装し、この容器を前記無菌領域内へ搬送する際に前記第１包装を取り除くとともに、前記容器内の細胞試料による当該容器の外面の汚染を防止する汚染防止部材を、前記容器の前記外面に施すものであり、以下の実施の形態により具現化される。

［Ａ］第１実施の形態（図１、図２）
図１は、本発明に係る細胞培養システムの第１の実施の形態の全体構成を模式的に示す概略図である。細胞培養システム１１は、クリーンルーム１２の内部に無菌操作装置１３、遠心分離機（以下、遠心機と称する）１４、炭酸ガスインキュベータ（以下、インキュベータと称する）１５、及び搬送装置１６が設置されて構成される。無菌操作装置１３は複数のパスボックス１７を備え、パスボックス１７のうち幾つかは、搬送装置１６を介して遠心機１４やインキュベータ１５など、細胞試料に操作を付与する装置・機器類（以下外部装置）に接続されている。クリーンルーム１２や無菌操作装置１３は、ＨＥＰＡフィルタによる清浄空気供給機構（不図示）を備え、また紫外線殺菌灯やガス滅菌機構など（不図示）を備えてもよい。

後に詳説するが、無菌操作装置１３の内部が無菌領域内であり、それ以外のクリーンルーム１２、遠心機１４、インキュベータ１５、搬送装置１６が無菌領域外であり、細胞試料を収納する試料容器１８（図２）は、無菌領域の内外間で搬送される。

次に、図２を用いて無菌操作装置１３が備える一以上のパスボックス１７の典型的な構成の一例を説明する。パスボックス１７は、資材搬入ポート１９、試料搬出ポート２０、試料搬入ポート２１、試料調整ポート２２、資材搬出ポート２３を備える。資材搬入ポート１９は搬入扉２４及び搬出扉２５、２６を備え、パスボックス１７の他の各ポート２０、２１、２２、２３も同様に、例えば以下に示すように搬出入扉を備える。パスボックス１７の各ポート１９〜２３は、ＨＥＰＡフィルタ等に基づく空気清浄機構（不図示）を備え、また紫外線殺菌灯やガス滅菌機構などを備えてもよい。

資材搬入ポート１９は、搬入扉２４を通してクリーンルーム１２と連通し、資材搬出ポート２３も、搬出扉２７を通してクリーンルーム１２と連通する。試料搬出ポート２０は搬出扉２８、また試料搬入ポート２１は搬入扉２９を通して搬送装置１６と連通し、更に搬送装置１６を介して外部装置（遠心機１４やインキュベータ１５など；図２に不図示）と連通する。試料搬出ポート２０は搬入扉３０、試料調整ポート２２は搬出扉３１を通して無菌操作装置１３の内部と連通する。試料搬入ポート２１は、搬入扉３２を介して試料調整ポート２２に連通する。

次に、細胞培養システム１１の動作の概略を説明する。
クリーンルーム１２、無菌操作装置１３、パスボックス１７は空気清浄機構や滅菌機構、手作業による滅菌などにより所定の清浄度を維持し、それらの内部で取り扱う細胞試料を汚染から守る。クリーンルーム１２よりもパスボックス１７、パスボックス１７よりも無菌操作装置１３の方がより高度な清浄度を維持し、特に無菌操作装置１３の内部は無菌領域であり、細胞試料を解放系で取り扱うことを可能としている。つまり、クリーンルーム１２内は、必要な清浄度と、清浄度維持にかかるコストや労力とのバランスを考慮し、場所によって清浄度レベルの差別化を行っている。本実施形態では、無菌操作装置１３の内部を無菌領域内、それ以外は無菌領域外として取り扱う。即ち遠心機１４、インキュベータ１５、搬送装置１６、クリーンルーム１２などは無菌領域外である。

細胞培養システム１１の使用に先立ち、試料容器１８などの消耗品類や、図示しない細胞試料や試薬類などを、資材搬入ポート１９の搬入扉２４や搬出扉２６を通して、必要に応じて滅菌した上で無菌操作装置１３の内部に搬入する。無菌操作装置１３は、細胞に対して培地交換や継代などの操作を自動的に行う。継代操作において、酵素液などを用いて培養容器から細胞を剥離し、細胞懸濁液を得て、遠心分離により細胞を酵素液から分離する工程がある。この工程を例にとって以下詳述する。

細胞懸濁液を無菌操作装置１３の外部に設けた遠心機１４へ持ち出すにあたり、まず細胞懸濁液を試料容器１８に収納して密栓する。資材搬入ポート１９から搬入した第１包装資材３３を用いて、試料搬出ポート２０において試料容器１８を包装し、第１包装３４を施した試料容器３５の形とする。ここで、包装は、菌類を通さない第１包装資材３３を用いて密閉包装することにより、菌不透過性包装とする。その上で試料容器３５を、搬送装置１６などを経由して遠心機１４などの外部装置などへ搬出する。

試料容器３５は第１包装３４を施してあるため、例え搬送装置１６や遠心機１４などの清浄度が不十分で、外因性汚染の影響を受ける場合でも、外因性汚染は第１包装３４の外部に留まり、内部の試料容器１８は汚染されない。逆に、例え遠心分離や搬送など大きな加速度や振動が加わる操作によって、試料容器１８に内容物(細胞試料)に由来する内因性汚染が生じたとしても、それは第１包装３４の内部に留まるため、外部の搬送装置１６や遠心機１４などの外部装置、即ち無菌領域外を内因性汚染により汚染しない。従って、異なる種類の細胞試料を引き続き培養する場合においても、第１の細胞試料に由来の細胞や微生物類などが、外部の搬送装置１６や遠心機１４などの外部装置を介して、第２の細胞試料へ交叉汚染することが無い。このため、無菌領域外を滅菌ガスなどの侵襲性の高い方法で高頻度に滅菌する必要がない。

遠心分離終了後、遠心機１４から試料容器３５を無菌操作装置１３へ持ち込む際は、試料搬入ポート２１において試料容器３５の第１包装３４を解き（開梱）、試料容器１８を得る。開梱により生じた第１包装３４の廃材３６は、資材搬出ポート２３を経由して排出する。これにより、外因性汚染によって第１包装３４の外表面が汚染されていたとしても、この第１包装３４が廃棄されるため、無菌操作装置１３の内部、即ち無菌領域内や試料容器１８に外因性汚染が混入しない。内因性汚染による第１包装３４の内表面の汚染についても同様である。

次に、試料調整ポート２２により、第２包装資材３７を試料容器１８に密着させて包装し、第２包装３８を施した試料容器３９の形とした上で、無菌操作装置１３の内部に持ち込む。ここで第２包装３８も菌不透過性包装とした。これにより、例え細胞試料に由来の内因性汚染が試料容器１８の外壁に付着していた場合でも、それを第２包装３８により遮蔽して封じ込めることができ、換言すると、第２包装３８を施した試料容器３９の外表面には内因性汚染が存在しない。

従って、無菌操作装置１３の内部で試料容器３９を搬送等する際、無菌操作装置１３の内部、即ち無菌領域内を内因性汚染により汚染することが無い。このため、異なる種類の細胞試料を引き続き培養する場合でも、第１の細胞試料に由来の細胞や微生物類などが、第２の細胞試料へ交叉汚染するリスクを低く維持でき、細胞試料の切り替えに際して無菌領域内を全面的にガス滅菌する必要は必ずしもない。試料容器１８の蓋を開けるなどして細胞試料を解放系で取り扱う場所については、局所滅菌などにより対応可能である。

次に、第１取扱手段としての包装機構４０及び開梱機構４１について説明する。
包装機構４０は、試料容器１８を無菌領域内である無菌操作装置１３内から遠心機１４、インキュベータ１５などの無菌領域外へ搬出する際に、第１包装３４を試料容器１８に施し、この試料容器１８を包装して試料容器３５とするものである。また、開梱機構４１は、試料容器３５を無菌領域外から無菌領域内へ搬入する際に、試料容器３５の第１包装３４を開梱して取り除くものである。これらを用いることにより作業効率を向上させるとともに内因性汚染及び外因性汚染を抑制することができる。包装機構４０は試料搬出ポート２０内に設置され、開梱機構４１は試料搬入ポート２１内に設置される。

特に、包装機構４０としては、製袋包装（Ｐａｃｋａｇｅ・ｆｏｒｍ・ｆｉｌｌ・ｓｅａｌ）装置が採用される。この装置は、試料容器１８の形状に適合する第１包装３４を第１包装資材３３を用いて形成し、試料容器１８を第１包装３４の内部に完全に入れ、ヒートシールにより第１包装３４を閉じて密閉することにより、第１包装３４を施した試料容器３５とする機能を備える。試料搬出ポート２０の包装機構４０としては、上記製袋包装のほか、ブリスターパック法やブローフィルシール(ｂｌｏｗ−ｆｉｌｌ−ｓｅａｌ)法などを利用した、容器の形状に応じた各種の密閉包装用装置が採用可能である。

第１包装資材３３としては、微生物や細胞に関し透過性を持たない、即ち菌不透過性の材料を用いた。本実施形態で試料容器１８として遠沈管を用いた場合には、第１包装資材３３として、菌不透過性と、試料容器１８に作用する遠心力に耐える機械的強度とを兼備するポリプロピレン製のシートを採用した。第１包装資材３３の材質としてポリプロピレンのほか、ポリエチレン、ポリスチレン、ＰＥＴなど、各種の菌不透過性の合成樹脂材料を滅菌した上で使用できる。このように試料容器１８として遠沈管を用いることにより、内因性汚染、外因性汚染を防止しつつ細胞を移し変えることなく遠心分離を行うことができるので作業効率が向上する。

第１包装３４の形状としては、試料容器１８の形状に合わせて任意に選択可能であるが、コスト効果と廃棄物削減、操作性向上のために、単純な形状でしかも必要最小限の材料を用いた包装が好ましい。例えば、第１包装３４の形状として、遠心機のバケットとの形状適合性の高い円筒形状を採用した。また、切り込みやテープなどの構造や部材を設けることにより、後の開梱工程を容易化することもできる。袋を閉じる方法としてはヒートシール以外に、接着テープや接着剤なども使用可能である。

本実施形態では、十分な強度をもつシート状のプラスチック材料からなる材料を第１包装資材３３として用いて包装したため、第１包装３４を施した試料容器３５の外形寸法や重量を小さく抑えることができる。その結果、第１包装３４を施した試料容器３５は、搬送や遠心分離などに耐える十分な機械的強度と高い操作性とを両立する。

次に、第２取扱手段としての付加機構４２について説明する。
この付加機構４２は、試料容器１８内の細胞試料による当該試料容器１８の外面の汚染を防止する汚染防止部材としての第２包装３８を、菌不透過性の第２包装資材３７を用いて試料容器１８の外面に密着して施すものである。この付加機構４２は、試料調整ポート２２に設置される。

また、第２包装３８の様態は、試料容器１８の外壁表面に第２包装資材３７を密着させている。これにより、例え試料容器１８に由来の内因性汚染が試料容器１８の外壁に付着していた場合でも、菌不透過性の第２包装３８により試料容器１８の外面を密着して覆うことで汚染の拡散を防止し、内因性汚染を遮蔽して封じ込めることが可能になる。この結果、無菌操作装置１３の内部、即ち無菌領域内への内因性汚染の拡散を防止できる。

試料調整ポート２２に設置された付加機構４２は包装装置であり、この包装装置としては、密着包装に好適な各種包装方法が採用可能である。例えば、袋状或いは円筒状の熱収縮性包装材料を用いたシュリンクラップ方式や、パラフィルムなどの高伸長性シートを用いたシール法、粘着シートを用いたシール法、ヒートシール法、ｂｌｏｗ−ｆｉｌｌ−ｓｅａｌ法などを利用した包装装置が採用可能である。

内因性汚染の拡散の可能性をより一層効果的に抑制するために、第１包装３４を開梱後で、第２包装３８を施す前に、試料容器１８の外面を、紫外線殺菌灯や殺菌剤など各種公知の方法で除染することもできる。試料容器１８としての遠沈管に対し紫外線殺菌法を適用する場合、例えば細胞試料のペレットが存在する領域（遠沈管下端部）を紫外線不透過性材料で遮蔽し、試料容器１８の外面のみ、特に汚染されやすい蓋部分に、例えば遠沈管を中心軸周りに回転させながら重点的に紫外線を照射する。これにより、細胞試料に対する紫外線の悪影響を防止しつつ、試料容器１８の外面を除染する。

第２包装３８の様態に関連して、本実施形態では、試料容器１８として蓋等にセプタムを備えたものを採用する。ここで、セプタムとは、真空採血管などに採用されている、注射針状のノズルなどで穿刺可能（ピアサブル）な弾性材料からなる部材である。このセプタムを備えた試料容器１８を採用し、且つこの試料容器１８の容器本体及び蓋に第２包装３８を施し、この第２包装３８の第２包装資材３７もノズルなどで穿刺可能な材料を採用する。これにより、第２包装３８と試料容器１８のセプタムとを介して、蓋を開閉せずに試料容器３９の内容物を取り扱うことが可能になる。つまり、第２包装３８を施したままで細胞試料を取り扱えるため、内因性汚染の発生と拡散を更に高水準に防止できる。

本実施形態の変形形態として、第２包装３８の様態に関して以下の構成を採用することも可能である。即ち、試料容器１８の容器本体及び蓋を第２包装資材３７の内部に完全に入れる代わりに、例えば半袋状に形成した第２包装資材３７に、試料容器１８を中途まで（蓋部を除く容器本体のみを）入れてシュリンクラップ法などにより密着して封じる。つまり第２包装３８を半密閉方式とする。これにより、第２包装３８を施した試料容器３９は、内因性汚染のリスクが最も高い蓋部より下方の容器本体の側面を第２包装３８により封じ込めつつ、蓋の開閉や容器本体内の内容物の取り出しには支障を来さない効果がある。この場合、蓋にセプタムは不要である。この変形形態に好適な第２包装３８の様態としては、前述と同様に、粘着シートの巻き付けやシュリンクラップ法などを採用できる他、試料容器１８の容器本体（蓋部を除く）の外面に密着して収納可能な半容器（蓋のない容器）を包装として用い、試料容器１８の容器本体をその半容器に収納するという簡易な方式も採用できる。

ところで、外部装置として遠心機１４を用いる場合以外に、外部装置としてインキュベータ１５を適用する場合には、試料容器１８として細胞培養容器が用いられ、この場合には第１包装資材３３の特性として、菌不透過性以外にガス透過性が必要となる。両特性を兼備した材料としては、テフロン（登録商標）、セルロース、ポリオレフィン、ポリアセタール、ポリアミド、ポリエステル、ポリサルファイド、超高分子量ポリエチレン多孔質フィルム、滅菌紙、グラシン紙、不織布、高密度ポリエチレン繊維製シート、タイベック（Ｒ）、ファインポーラスフィルム、メンブレンフィルタ等の微多孔性素材がある。この微多孔性素材からなるシートなどを単独で、或いは他の菌不透過性材料と組み合わせ、必要に応じ滅菌した上で第１包装資材３３として用いる。また例えば、ガス透過性ポリエチレンフィルムを不織布にコーティングしたウイルスバリア性の高い材料などの各種複合材料も、第１包装資材３３として選択可能である。

菌不透過性且つガス透過性を兼備した微多孔性素材を採用することにより、酸素や炭酸ガスなどを透過できるため、第１包装３４を施したまま細胞培養を行うことが可能になる。更に透明度の高い素材を選択或いは併用することにより、第１包装３４を施したまま試料容器１８中の細胞観察も可能になる。

以上のことから、本実施の形態によれば、次の効果（１）及び（２）を奏する。
（１）試料容器１８に第１包装３４を施して無菌領域外で細胞試料を操作（例えば遠心分離など）することで、試料容器１８内の細胞試料に由来する内因性汚染による無菌領域外の汚染を防止できる。また、試料容器１８を無菌領域内（無菌操作装置１３内）に搬入する際に第１包装３４を取り除くことで、試料容器１８外に由来する外因性汚染による無菌領域内の汚染を防止できる。更に、試料容器１８の外面に第２包装３８を施すことで、この試料容器１８内の細胞試料に由来する内因性汚染による無菌領域内の汚染を防止できる。これらのことから、無菌領域内外の洗浄度を高度に維持できるので、細胞培養システム１１における交叉汚染のリスクを排除でき、高純度で安全な医薬品や細胞等を提供できる。

（２）細胞試料に操作を付与する装置・機器類が無菌領域外に外部装置として備えられたので、これらの装置・機器類を高頻度に滅菌する必要がなく、従って、これらの装置・機器類の滅菌ガス等による損傷を防止できる。このため、細胞培養システム１１の稼働率が上昇し、処理能力が向上して、医薬品や細胞等を迅速かつ低コストに提供できる。

［Ｂ］第２の実施の形態（図３）
図３は、本発明に係る細胞培養システムの第２の実施の形態におけるパスボックスの一つを代表して、その構成を模式的に示す概略図である。この第２の実施の形態において、前記第１の実施の形態と同様な部分については、同一の符号を付すことにより説明を簡略化し、または省略する。

本実施の形態の細胞培養システム５１が前記実施の形態と異なる点は、パスボックス５２の試料調整ポート５３の構成と試料容器５５とである。
具体的には、試料容器１８内の細胞試料による当該試料容器１８の外面の汚染を防止する第２包装５４が、菌不透過性のシート状材料を用いて試料容器１８の外面に予め密着して施され、この試料容器１８は、第２包装５４が施された試料容器５５の形となっている。また、試料調整ポート５３には、付加機構４２が設置されず（従って第２包装資材３７が用いられず）、試料容器５５の第２包装５４を除去する除去機構５６が、第２取扱手段として設置されている。付加機構４２及び除去機構５６を備えることにより、作業効率を向上させるとともに内因性汚染及び外因性汚染を抑制することができる。

第２包装５４が施された試料容器５５は、パスボックス５２の試料搬出ポート２０における包装機構４０によって、遠心機１４などの無菌領域外へ搬出される際に、第１包装３４により包装されて試料容器５７の形となる。また、この試料容器５７が無菌領域外から無菌領域内（無菌操作装置１３内）に搬入される際には、まず、パスボックス５２の試料搬入ポート２１において開梱機構４１により第１包装３４が開梱されて取り除かれ、次に、試料調整ポート５３において除去機構５６により第２包装５４が開梱されて取り除かれ、試料容器１８のみが無菌操作装置１３内へ搬入される。

本実施形態の細胞培養システム５１の動作は、試料容器１８の容器本体を包装する点において第１の実施形態の変形形態と同様であるが、以下の点が異なる。つまり、試料容器１８に第２包装５４を密着して施した試料容器５５の形で、滅菌後、資材搬入ポート１９を通して無菌操作装置１３の内部に搬入する。そして、この試料容器５５に試料を入れて密栓後、試料搬出ポート２０において、包装機構４０により第１包装３４を用いて密閉包装する。具体的には、第２包装５４の上に更に第１包装３４を施した試料容器５７の形とした上で、無菌操作装置１３の外部へ搬出する。

遠心機１４など外部装置(無菌領域外)での処理終了後、この無菌領域外から試料容器５７を無菌操作装置１３へ持ち込む際は、まず、試料搬入ポート２１において開梱機構４１により第１包装３４を開梱し、第２包装５４を施した試料容器５５を得る。次に、試料調整ポート５３において除去機構５６により第２包装５４を開梱し、試料容器１８のみとした状態で無菌操作装置１３の内部に持ち込む。開梱により生じた第２包装５４の廃材５８や第１包装３４の廃材３６は、資材搬出ポート２３から排出する。

上述の動作により、遠心機１４など外部装置での処理の過程で、試料容器５５の内容物(細胞試料)に由来する内因性汚染が生じていたとしても、それは第２包装５４のみの汚染であり、試料調整ポート５３において第２包装５４が廃材５８として取り除かれて資材搬出ポート２３から排出されれば、試料容器１８は汚染されていないので、無菌操作装置１３の内部に汚染は混入しない。従って、無菌操作装置１３の内部で試料容器１８を搬送等しても、無菌操作装置１３の内部、即ち無菌領域内は内因性汚染により汚染されない。

この試料容器５５における第２包装５４として、例えば粘着シートを用い、試料容器１８に密着して巻き付ける様態を採用することができる。更に好適には、切り取りのためのパーフォレーションを円周以上の間隔で施した粘着シートを複数回巻き付け、無菌領域に搬入する際に粘着シートをパーフォレーションの間隔の長さ分だけ取り除く構成とすることも可能である。後者の構成により、第２包装５４を施した試料容器５５を複数回開梱して1つの試料容器５５の表面に繰り返し清浄面を露出させることが可能になり、この場合、1つの試料容器５５を繰り返し外部に搬出入することができる。また、パーフォレーションの間隔を円周以上とすることにより、次の切り取りのためのパーフォレーションが外周面に露出しないため、第２包装５４による包装の完全性を高く維持できる。切り取りを容易にする方法としては、パーフォレーション以外に引きひもやテープを接着する方法、切り取り部分のシートの厚さを薄くする方法、など各種公知の方法が採用可能である。

以上のことから、本実施の形態によれば、前記第１の実施の形態の効果（１）及び（２）と同様な効果を奏するほか、次の効果（３）を奏する。
（３）第２包装資材(不図示)を用いて試料容器１８に対し予め第２包装５４を密着して施しておくことにより、試料調整ポート５３においては、除去機構５６により第２包装５４を開梱するだけで足り、包装の作業が不要になるため、操作が簡単で、工程時間を短縮できる。

［Ｃ］第３の実施の形態（図４）
図４は、本発明に係る細胞培養システムの第３の実施の形態におけるパスボックスの一つを代表して、その構成を模式的に示す概略図である。この第３の実施の形態において、前記第１の実施の形態と同様な部分については、同一の符号を付すことにより説明を簡略化し、または省略する。

本実施の形態の細胞培養システム６１が前記第１の実施の形態と異なる点は、パスボックス６２における試料搬出ポート６３に包装機構４０と共に、付加機構としての殺菌剤封入機構６４が設置され、また、試料搬入ポート６５に開梱機構４１と共に、除去機構としての殺菌剤除去機構６６が設置され、パスボックス６２には試料調整ポート２２が設けられていない点である。

殺菌剤封入機構６４は、試料容器１８を遠心機１４等の無菌領域外へ搬出する際に、包装機構４０により試料容器１８に施された第１包装３４と試料容器１８との間に殺菌剤６７を封入するものである。また、殺菌剤除去機構６６は、試料容器１８を無菌領域内（無菌操作装置１３内）へ搬入する際に、第１包装３４と試料容器１８との間から殺菌剤６７を除去するものである。殺菌剤は、試料容器１８から外部に漏出した細胞試料を殺菌するものである。

本実施形態の細胞培養システム６１の動作は、基本的に第１の実施形態と同様であるが、以下の点が主に異なる。つまり、試料容器１８は第１実施形態と同様に、資材搬入ポート１９を通して無菌操作装置１３の内部に搬入される。この試料容器１８に細胞試料を入れて密栓後、試料搬出ポート６３において、包装機構４０及び殺菌剤封入機構６４を用いて、試料容器１８を殺菌剤６７と共に第1包装３４により密閉包装する。具体的には、まず、試料搬出ポート６３において試料容器１８を包装機構４０により、第１包装資材３３を用いて開口部を一部残した状態で包装する。次に、この開口部を通して、殺菌剤封入機構６４により殺菌剤６７（本実施形態では７０％エタノール水溶液のミスト）を第１包装３４の中に吹き込んだ後、開口部を封じて密閉包装する。このように、殺菌剤６７を封入した第１包装３４を試料容器１８に施して試料容器６８の形とした上で、無菌操作装置１３の外部へ搬出する。

遠心機１４などの外部装置(無菌領域外)での処理終了後、試料容器６８を無菌領域外から無菌操作装置１３へ持ち込む際は、試料搬入ポート６５において開梱機構４１により第１包装３４を開梱し、更に殺菌剤６７であるエタノールを風乾或いは拭き取り、または殺菌剤除去機構６６により抜き取って除去することにより試料容器１８を得る。開梱により生じた第１包装３４の廃材３６や、エタノールを含む空気や布巾は、資材搬出ポート２３から排出する。

上述の動作により、遠心機１４などの外部装置での処理の過程で試料容器１８の内容物である細胞試料が漏出して、試料容器１８の外面に内因性汚染が生じていたとしても、それは殺菌剤６７であるエタノールの作用により殺菌され除染されるため、無菌操作装置１３の内部に汚染は混入しない。従って、無菌操作装置１３の内部で試料容器１８を搬送等しても、無菌操作装置１３の内部、即ち無菌領域内は内因性汚染により汚染されない。

尚、殺菌剤６７をミストとして第１包装３４の内部に吹き込む例を説明したが、殺菌剤６７の導入方法はこれに限らない。例えば、エタノール水溶液を試料容器１８と第１包装３４との隙間に直接注入して、それから発生するエタノール蒸気の殺菌作用を用いることも可能であるし、或いは、殺菌剤６７を不織布に含浸させたものを試料容器１８と第１包装３４との間に挟むこともできる。

また、殺菌剤６７の種類もエタノール水溶液に限定されず、例えば過炭酸ナトリウム液（酸素系消毒液）、ポピドンヨード液、塩素系消毒液など、各種公知の消毒液を用いることもできる。また、オゾンや過酸化水素などの各種滅菌ガスも、好ましくは必要最小限の濃度にて使用可能である。この滅菌ガスを用いる場合には、滅菌ガス分解機構を試料搬入ポート６５に備えることが好ましい。一方、殺菌剤６７として銅や銀などの殺菌作用のある固体材料を含むフィルムを、試料容器１８と第１包装３４との間に挟むこともできる。更には、第１包装資材３３として殺菌作用を有するフィルムを用いることにより、第１包装３４と殺菌剤６７とを兼用させてもよい。

以上のことから、本実施の形態によれば、前記第１の実施の形態の効果（１）及び（２）と同様な効果を奏するほか、次の効果（４）を奏する。
（４）本実施形態は、第２包装資材３７や試料調整ポート２２が不要であり、また無菌操作装置１３内において試料容器１８を無包装の様態で使用可能であるため、細胞培養システム６１の構成が簡単で、無菌操作装置１３内での操作が簡便である。

以上、本発明を上記各実施の形態に基づいて説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、各実施形態においては、無菌操作装置１３として細胞培養における培地交換や継代などの操作を自動的に行う自動化装置を例にとって説明したが、無菌操作装置１３として採用可能な装置の目的は細胞培養に限定されず、例えば移植用細胞組織や動植物組織、抗体、ワクチン、血清等の各種の生物由来製剤などを研究、開発、生産するために無菌操作を自動的に行う自動化装置についても同様に適用可能である。また、一般の化学合成医薬品や食品の研究開発や生産など、無菌操作を必要とする自動化装置にも適用可能である。もちろん、上記各種目的のための自動化装置だけでなく、半自動或いは手動の装置にも同様に適用可能である。

１１………細胞培養システム、１３………無菌操作装置（無菌領域内）、１４………遠心機（無菌領域外）、１５………インキュベータ（無菌領域外）、１６………搬送装置（無菌領域外）、１７………パスボックス（無菌領域外）、１８………試料容器、３４………第１包装、３８………第２包装（汚染防止部材）、４０………包装機構（第１取扱手段）、４１………開梱機構（第１取扱手段）、４２………付加機構（第２取扱手段）、５１………細胞培養システム、５３………試料調整ポート、５５………試料容器、５４………第２包装（汚染防止部材）、５６………除去機構（第２取扱手段）、６１………細胞培養システム、６４………殺菌剤封入機構（付加機構、第２取扱手段）、６６………殺菌剤除去機構（除去機構、第２取扱手段）。

Claims (8)

1. 細胞試料を収納する容器を、無菌領域内と無菌領域外との間で搬送する細胞培養方法において、
   前記容器を前記無菌領域外へ搬送する際に、菌不透過性のシート状材料を用いた第１包装を前記容器に施して包装し、この容器を前記無菌領域内へ搬送する際に前記第１包装を取り除くとともに、
   前記容器内の細胞試料による汚染を防止する汚染防止部材を、前記容器の外面に施すことを特徴とする細胞培養方法。
2. 細胞試料を収納する容器を、無菌領域内と無菌領域外との間で搬送する細胞培養システムにおいて、
   前記容器を前記無菌領域外へ搬送する際に、菌不透過性のシート状材料を用いた第１包装を前記容器に施して包装し、この容器を前記無菌領域内へ搬送する際に前記第１包装を取り除く第１取扱手段が設けられると共に、
   前記容器内の細胞試料による汚染を防止する汚染防止部材を、前記容器の外面に施す第２取扱手段が設けられたことを特徴とする細胞培養システム。
3. 前記第１取扱手段は、前記容器に第１包装を施す包装機構と、前記第１包装を開梱して取り除く開梱機構とを備えるとともに、
   前記第２取扱手段は、前記容器に対し汚染防止部材を付加する付加機構と、前記汚染防止部材を除去する除去機構との少なくとも一方を備えたことを特徴とする請求項２に記載の細胞培養システム。
4. 前記汚染防止部材が、容器を無菌領域内に搬送する際に、菌不透過性のシート状材料を用いて前記容器外面に密着して施される第２包装であることを特徴とする請求項２または３に記載の細胞培養システム。
5. 前記汚染防止部材が、前記容器を無菌領域外に搬送する際に、菌不透過性のシート状材料を用いて前記容器外面に密着して施されるとともに前記第１包装と共に前記容器に包装され、前記容器を無菌領域内に搬送する際に、前記第１包装と共に前記容器から取り除かれる第２包装であることを特徴とする請求項２または３に記載の細胞培養システム。
6. 前記汚染防止部材が、容器を無菌領域外に搬送する際に、前記第１包装内に封入され、前記容器から漏出した細胞試料を滅菌可能な殺菌剤であることを特徴とする請求項２に記載の細胞培養システム。
7. 前記無菌領域外に遠心分離機を備え、前記容器が遠沈管であり、前記第１包装が、菌不透過性の材料を用いて構成されたことを特徴とする請求項２乃至６のいずれか１項に記載の細胞培養システム。
8. 前記無菌領域外にインキュベータを備え、前記容器が細胞培養容器であり、前記第１包装が、菌不透過性且つガス透過性のシート状材料を用いて構成されたことを特徴とする請求項２乃至６のいずれか１項に記載の細胞培養システム。