JP5659698B2 - 試料流入装置、試料流入チップ及び試料流入方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞を搬送する搬送流体が流通する流路内に、患者等からサンプリングされた、細胞を含む試料流体を流入させる試料流入装置等の技術に関する。

生命科学、医学研究の分野、あるいは臨床検査等の医療分野において、フローサイトメトリという分析方法が用いられている。フローサイトメトリは、個々に遊離した細胞を含む溶液を試料とする。この試料は、希薄化されて流路内を流通される。流路の途中で細胞の信号検出が実行される。この信号を分析することで、試料に含まれる細胞種を識別したり、細胞の数を測定したりすることができる。

下記特許文献１には、細胞の複素誘電率に基づいて細胞を分析する誘電サイトメトリ装置が開示されている。この誘電サイトメトリ装置は、水流形成系ユニットと、測定系ユニットと、分種系ユニットと、制御系ユニットとを含む。

水流系ユニットは、流路に細胞を含む溶液を噴出する。測定系ユニットは、流路を流れる細胞の複素誘電率を求め、複素誘電率から誘電パラメータを算出する。誘電パラメータは、細胞の種類ごとに異なるので、溶液中に含まれる細胞種を識別したり、細胞の数を算出したりすることができる。分種系ユニットは、測定系ユニットの流路から流出される溶液を、廃液と、標的細胞含有液とに分別する。制御系ユニットは、入力インターフェイスを介して入力された設定情報に基づいて、水流系ユニット、測定系ユニット及び分種系ユニットに対して、各種の設定値を設定する。

測定系ユニットは、流入流路部と、流出流路部と、流入流路部及び流出流路部との間に設けられた狭窄部とを有する流路デバイスを含む。流入流路部及び流出流路部には、それぞれ電極が配置されている。流入口を介して流入流路部へ流入した細胞は、狭窄部を個々に通過し、流出流路部を流れて流出口へ向かう。測定系ユニットは、一対の電極を流れる電流を測定し、測定結果に基づいて、狭窄部を通過する個々の細胞ごとに複素誘電率を算出し、複素誘電率から誘電パラメータを算出する。

特開２０１０−１８１３９９号公報（段落[００４１]〜［００４８］、［００６５］〜［００７１］図３、図４）

特許文献１に記載の誘電サイトメトリ装置の狭窄部は、流路の内部に設けられている。このように、狭窄部が流路の内部に設けられている場合、細胞を含む溶液が狭窄部を通過する流量が小さいために、細胞が流路内で沈降してしまい、流路内で細胞が停留してしまうといった問題がある。

以上のような事情に鑑み、本発明の目的は、細胞が流路内で停留してしまうことを防止することができる試料流入装置等の技術を提供することにある。

上記目的を達成するため、本発明の一形態に係る試料流入装置は、流路と、狭窄孔とを具備する。
前記流路は、細胞を搬送する搬送流体を流通させる。
前記狭窄孔は、前記流路に連通し、単一の細胞が通過可能であり、前記細胞を含む試料流体を前記流路に流入させる。

この試料流入装置では、狭窄孔は、搬送流体が流通する流路の内部に設けられていない。従って、搬送流体が流路を流通する流量が狭窄孔の径の制限を受けない。これにより、細胞が流路内で沈降し、流路内で停留してしまうことを防止することができる。

上記試料流入装置は、圧力調整部をさらに具備していてもよい。
前記圧力調整部は、前記搬送流体を流通させるための圧力を調整することで、前記搬送流体が前記流路を流通する流量と、前記試料流体が前記狭窄孔を介して前記流路に流入される流量とを調整する。

この試料流入装置では、搬送流体が流路を流通する流量（主流流量）と、試料流体が狭窄孔を介して前記流路に流入される流量（試料流入流量）とを任意に調整することができる。

上記試料流入装置は、第１の電極対を有する測定部をさらに具備していてもよい。
前記第１の電極対は、前記狭窄孔の位置に交流電場を形成する。
前記測定部は、前記第１の電極対に交流電圧を印加して前記交流電場を形成することにより、前記狭窄孔を通過する前記細胞ごとに、前記細胞に依存する複素誘電率を測定する。

測定部により測定された複素誘電率は、例えば、異常細胞を検出したり、後に細胞を分取したりする等の様々な用途に用いられる。ここで、上記したように、試料流入装置では、試料流体が狭窄孔を介して流路に流入される流量が調整可能である。これにより、単一の細胞が狭窄孔を通過する際に、複素誘電率を測定するための適切な速度で狭窄孔を通過させることができる。

上記試料流入装置において、前記流路は、前記狭窄孔の位置より下流側に設けられ、前記細胞を分取するための分岐路を有していてもよい。
この場合、上記試料流入装置は、第２の電極対を有する分取部をさらに具備していてもよい。
前記第２の電極対は、前記狭窄孔の位置より下流側であって前記分岐路より上流側の前記流路に電場を形成する。
前記分取部は、前記測定部により測定された前記複素誘電率に基づいて、前記第２の電極対に電圧を印加して前記電場を形成することにより、前記分岐路を利用して前記細胞を分取する。

この試料流入装置では、狭窄孔を介して流路内に流入された細胞を、測定部によって測定された複素誘電率に基づいて、分取部によって分取することができる。ここで、上記したように、試料流入装置は、主流流量と、試料流入流量とを任意に調整することが可能である。この主流流量と、試料流入流量とを調整することで、第２の電極対により電場が形成される位置での細胞の位置のばらつきを抑制したり、分取速度を任意に調整したりすることができる。

上記試料流入装置は、前記狭窄孔を介して前記流路に流入する前の、前記狭窄孔上の前記試料流体を攪拌する攪拌部をさらに具備していてもよい。

この試料流入装置では、攪拌部により、試料流体内の細胞を攪拌することができるので、細胞が試料流体内で沈降してしまうことを防止することができる。

上記試料流入装置において、前記攪拌部は、前記試料を攪拌する気流を発生させてもよい。

本発明の一形態に係る試料流入チップは、基板と、流路と、狭窄孔とを具備する。
前記流路は、前記基板に設けられ、細胞を搬送する搬送流体を流通させる。
前記狭窄孔は、前記基板に設けられ、前記流路に連通し、単一の細胞が通過可能であり、前記細胞を含む試料流体を前記流路に流入させる。

本発明の一形態に係る試料流入方法は、細胞を搬送する搬送流体を流路に流通させることを含む。
前記流路に連通する、単一の細胞が通過可能な狭窄孔を介して、前記細胞を含む試料流体が前記流路に流入される。

以上説明したように、本発明の一形態によれば、細胞が流路内で停留してしまうことを防止することができる試料流入装置等の技術を提供することができる。

本発明の一実施形態に係る誘電サイトメトリ装置（試料流入装置）を示す概念図である。 誘電サイトメトリ装置の圧力調整部及びマイクロ流路チップ（試料流入チップ）を示す図である。 マイクロ流路チップを示す斜視図である。 マイクロ流路チップの投入部近傍の断面図である。 流入部及び流出部の搬送流体の圧力ＦＰ１、ＦＰ２の差圧と、主流流量Ｑとの関係を示す図である。 狭窄孔の直下位置ｓの静圧Ｐｓと、試料流入流量Ｑｓとの関係を示す図である。

以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。
＜誘電サイトメトリ装置の全体構成＞
図１は、本発明の一実施形態に係る誘電サイトメトリ装置１００（試料流入装置）を示す概念図である。

図１に示すように、誘電サイトメトリ装置１００は、マイクロ流路２（以下、単に「流路２」）と、投入部３と、測定部４と、分取部５と、細胞取出部６、７と、圧力調整部１１０と有する。

流路２は、細胞Ｃを搬送する搬送流体Ｆが流通される。搬送流体Ｆは、典型的には、投入部３へ投入される試料流体Ｓの媒質と同様の性質を有する流体とされる。流路２は、搬送流体Ｆが流入される流入部９と、搬送流体Ｆ（細胞Ｃを含む）が分岐される分岐流路２ａ、２ｂと、搬送流体Ｆが流出される流出部１０とを有している。

流入部９へは、圧力調整部１１０の高圧流体タンク１１３ａ（図２参照）内に貯留された搬送流体Ｆが流入される。流出部１０から流出した搬送流体Ｆは、流路２の下流側に配置された、圧力調整部１１０の低圧流体タンク１１３ｂ（図２参照）へ貯留される。

投入部３へは、例えば、患者などからサンプリングされた血液などの試料流体Ｓ（細胞懸濁液）がピペット８（図４参照）等により滴下されて投入される。投入部３は、搬送流体Ｆが流通する流路２に連通する狭窄孔１を有する。狭窄孔１の径は、試料流体Ｓに含まれる細胞Ｃ（例えば、赤血球、白血球等）が単一で通過することが可能な程度の大きさとされる。流路２は、狭窄孔１において大気に開放されているが、その他の部分では、大気には開放されていない。

試料流体Ｓが投入部３に投入されると、試料流体Ｓは、狭窄孔１を介して、搬送流体Ｆが流れる流路２内に引き込まれる。このとき、試料流体Ｓに含まれる細胞Ｃは、狭窄孔１を個々に通過する。

図１に示すように、狭窄孔１は、搬送流体Ｆが流通する流路２の内部に設けられていない。従って、搬送流体Ｆが流路２を流通する流量が狭窄孔１の径の制限を受けない。これにより、細胞Ｃが流路２内で沈降し、流路２内で停留してしまうことを防止することができる。

測定部４は、第１の電極対４ｂ、４ｃと、測定制御部４ａとを有する。第１の電極対４ｂ、４ｃは、投入部３において狭窄孔１を挟み込む位置に配置される。第１の電極対４ｂ、４ｃのうち、一方の電極４ｂは、流路２の内部に配置され、他方の電極４ｃは、流路２の外部に配置される。なお、このように２つの電極４ｂ、４ｃが、狭窄孔１を挟み込んで狭窄孔１の上下方向に配置されることで、狭窄孔１の位置に集中して電位差を発生させることができる。

図１では、図面を見やすく表示するため、狭窄孔１の大きさと、第１の電極対４ｂ、４ｃとの大きさ（面積）の比率が、実際の比率と異なって表示されている。実際には、第１の電極対対４ｂ、４ｃの大きさ（面積）は、狭窄孔１に比べて十分に大きく設定されている。なお、後述の図４においても同様である。

測定制御部４ａは、第１の電極対４ｂ、４ｃに交流電圧を印加することで、狭窄孔１の位置に交流電場を形成する。この場合、測定制御部４ａは、狭窄孔１を通過する一個一個の細胞Ｃに対して、細胞Ｃの誘電緩和現象が起こる周波数範囲（例えば０．１ ＭＨｚから５０ ＭＨｚ）の多点周波数（３点以上、典型的には１０から２０点程度）に亘って交流電圧の周波数を変化させる。

そして、測定制御部４ａは、第１の電極対４ｂ、４ｃに流れる電流を測定することで、電極間の複素抵抗を得て、この複素抵抗から、多周波数点での細胞Ｃの複素誘電率を求める。なお、複素誘電率を求める方法は、どのような方法が用いられてもよい。測定された複素誘電率は、例えば、細胞Ｃを分取したり、異常細胞Ｃを検出したり、誘電スペクトルを表示したりする等の様々な用途に用いられる。

分取部５は、狭窄孔１を介して流路２内に流入した複数種類の細胞Ｃのうち、所望とする細胞Ｃを細胞取出部６に、それ以外の細胞Ｃを細胞取出部７に分取する。分取部５は、第２の電極対５ｂ、５ｃと、分取制御部５ａとを有する。第２の電極対５ｂ、５ｃは、流路２を挟み込む位置に設けられる。第２の電極対５ｂ、５ｃは、狭窄孔１が設けられた位置よりも下流側であって、分岐流路２ａ、２ｂよりも上流側の位置に配置される。

分取制御部５ａは、測定部４により測定された複素誘電率に基づいて、分取すべき細胞Ｃかを判断する。そして、分取制御部５ａは、分取すべき細胞Ｃの場合には、第２の電極対５ｂ、５ｃが配置された位置をその細胞Ｃが通過するタイミングで、第２の電極対５ｂ、５ｃに電圧を印加し、流路２内に電場を発生させる。

第２の電極対５ｂ、５ｃにより電場が印加されている状態で、第２の電極対５ｂ、５ｃが配置された位置を通過した細胞Ｃは、分岐流路２ａを通り細胞取出部６に流れる。一方、第２の電極対５ｂ、５ｃにより電場が印加されていない状態で、第２の電極対５ｂ、５ｃが配置された位置を通過した細胞Ｃは、分岐流路２ｂを通り細胞取出部７に流れる。

圧力調整部１１０は、搬送流体Ｆの圧力を調整する圧力調整機構１１２と、圧力調整機構１１２を制御する圧力制御部１１１とを有する。圧力調整部１１０は、搬送流体Ｆを流通させるための圧力を調整することで、搬送流体Ｆが流路２を流通する流量と、試料流体Ｓが狭窄孔１を介して流路２に流入される流量とを調整する。

＜圧力調整部及びマイクロ流路チップ＞
次に、誘電サイトメトリ装置１００の圧力調整部１１０及びマイクロ流路チップ１１（試料流入チップ）について説明する。

図２は、誘電サイトメトリ装置１００の圧力調整部１１０及びマイクロ流路チップ１１を示す図である。図２には、誘電サイトメトリ装置１００の各箇所でのゲージ圧も示されている。図３は、マイクロ流路チップ１１を示す斜視図である。図４は、マイクロ流路チップ１１の投入部３近傍の断面図である。

図２に示すように、誘電サイトメトリ装置１００は、搬送流体Ｆを流路２内で流通させるための圧力を調整する圧力調整部１１０と、誘電サイトメトリ装置１００から着脱可能なマイクロ流路チップ１１（以下、単に「流路チップ１１」）とを有する。

圧力調整部１１０は、流路２の上流側で搬送流体Ｆの圧力を調整する第１の圧力調整機構１１２ａと、流路２の下流側で搬送流体Ｆの圧力を調整する第２の圧力調整機構１１２ｂとを有する。また、圧力調整部１１０は、第１の圧力調整機構１１２ａ及び第２の圧力調整機構１１２ｂを制御する圧力制御部１１１とを有する。

第１の圧力調整機構１１２ａは、高圧流体タンク１１３ａと、第１のコンプレッサ１１５ａと、高圧流体タンク１１３ａ及び第１のコンプレッサ１１５ａの間に配置された第１のエアーバルブ１１６ａとを含む。同様に、第２の圧力調整機構１１２ｂは、低圧流体タンク１１３ｂと、第２のコンプレッサ１１５ｂと、低圧流体タンク１１３ｂ及び第２のコンプレッサ１１５ｂの間に配置された第２のエアーバルブ１１６ｂとを含む。第１のエアーバルブ１１６ａ及び第２のエアーバルブ１１６ｂは、図２に示す例では、３ポート２位置方向電磁弁とされている。

高圧流体タンク１１３ａは、流路２に搬送流体Ｆを供給するために内部に搬送流体Ｆを貯留している。低圧流体タンク１１３ｂは、流路２から排出された搬送流体Ｆを内部に貯留する。高圧流体タンク１１３ａ及び低圧流体タンク１１３ｂには、それぞれ内部の気圧を検出する気圧センサ１１４ａ、１１４ｂが設けられている。

高圧流体タンク１１３ａの下流側には、第１のバルブ１１７ａが設けられており、低圧流体タンク１１３ｂの上流側には、第２のバルブ１１７ｂが設けられている。第１のバルブ１１７ａ及び第２のバルブ１１７ｂは、図２に示す例では、３ポート２位置方向電磁弁とされている。

第１のバルブ１１７ａの下流側には、流量計１１８が設けられている。また、流路チップ１１の流入部９及び流出部１０には、搬送流体Ｆの圧力を検出する圧力センサ１１９ａ、１１９ｂが設けられている。

圧力制御部１１１は、ターミナルブロック１２１及びＡ／Ｄコンバータ１２２を介して、圧力調整機構１１２に含まれる各部や、流量計１１８、圧力センサ１１９ａ、１１９ｂ等と電気的に接続されている。

圧力制御部１１１は、第１のコンプレッサ１１５ａの駆動を制御したり、第１のエアーバルブ１１６ａの位置を制御（バルブの開閉を制御）したりすることで、高圧流体タンク１１３ａ内の気圧を制御する。同様に、圧力制御部１１１は、第２のコンプレッサ１１５ｂの駆動を制御したり、第２のエアーバルブ１１６ｂの位置を制御（バルブの開閉を制御）したりすることで、低圧流体タンク１１３ｂ内の気圧を制御する。これにより、流路２の上流側及び下流側において、搬送流体Ｆの圧力が調整される。

また、圧力制御部１１１は、第１のバルブ１１７ａ及び第２のバルブ１１７ｂの位置を制御（バルブの開閉を制御）することで、高圧流体タンク１１３ａからの搬送流体Ｆの流出と、低圧流体タンク１１３ｂへの搬送流体Ｆの流入とを制御する。第１のバルブ１１７ａ及び第２のバルブ１１７ｂは、流路チップ１１が誘電サイトメトリ装置１００から着脱される場合等、必要に応じて切り替えられる。

流路チップ１１は、図示しないチップ格納治具に対して着脱可能に形成されており、これにより、流路チップ１１は、誘電サイトメトリ装置１００に対して着脱可能とされる。流路チップ１１は、測定対象とされる細胞Ｃの大きさや、チップ洗浄等、必要に応じて取り替えることができる。

図３及び図４を参照して、流路チップ１１は、基板１２及び高分子膜等からなるシート状の部材１３を有する。基板１２には、流入部９、流路２、分岐流路２ａ、２ｂ、細胞取出部６、７、流出部１０が設けられている。これらは、基板１２の表面に溝などを形成し、その表面をシート状の部材１３で覆うことで構成される。

投入部３は、シート状の部材１３の表面において、他の部分よりも一段低く形成されている。これにより、血液などの試料流体Ｓがピペット８（図４参照）等により投入部３へ投入されたときに、試料流体Ｓが投入部３からはみ出してしまうことを防止することができる。

狭窄孔１は、投入部３の略中央に設けられる。狭窄孔１は、シート状の部材１３に、上下方向に貫通する微細孔を形成することで形成される。

誘電サイトメトリ装置１００は、投入部３へ投入された試料流体Ｓを攪拌する攪拌部（図示せず）を有していてもよい。攪拌部は、気流を発生し、発生した気流を、狭窄孔１を通過する前の試料流体Ｓに対して吹きつける（図４参照）。これにより、試料流体Ｓに含まれる細胞Ｃが気流により攪拌されるので、細胞Ｃが試料流体Ｓ内で沈降してしまうことを防止することができる。

測定部４の第１の電極対４ｂ、４ｃは、投入部３において狭窄孔１を挟み込む位置に配置される。第１の電極対４ｂ、４ｃのうち、一方の電極４ｂがシート状の部材１３の裏面に設けられ、他方の電極４ｃはシート状の部材１３の表面に設けられる。

第１の電極対４ｂ、４ｃは、配線１７及び電極パッド１４を介して、測定制御部４ａと電気的に接続される。第１の電極対４ｂ、４ｃは、測定制御部４ａの制御に応じて狭窄孔１の位置に交流電場を形成する。

分取部５の第２の電極対５ｂ、５ｃは、シート状の部材１３の裏面に設けられており、２つの電極５ｂ、５ｃは、流路２の幅方向で流路２を挟み込む位置に配置される。第２の電極対５ｂ、５ｃは、配線１８及び電極パット１５を介して、分取制御部５ａと電気的に接続される。第２の電極対５ｂ、５ｃは、分取制御部５ａの制御に応じて流路２内に電場を形成し、搬送流体Ｆによって流路２を搬送される細胞Ｃに誘電泳動力を発生させて、所望の細胞Ｃを細胞取出部６側に流す。

細胞取出部６、７はその上部がシート状の部材１３により覆われているが、シート状の部材１３にピペット８を刺しこむことで、ピペット８を介して細胞Ｃを取り出すことが可能とされている。

流路チップ１１には、流路チップ１１を上下方向に貫通する複数の穴２６が形成されている。この穴２６は、流路チップ１１をチップ格納治具に着脱する際の位置決め用の穴２６である。

（搬送流体Ｆの圧力の調整による、主流流量及び試料流入流量の調整）
次に、搬送流体Ｆの圧力の調整による、主流流量Ｑ及び試料流入流量Ｑｓの調整について説明する。主流流量Ｑは、搬送流体Ｆが流路２を流通する流量であり、試料流入流量Ｑｓは、試料流体Ｓが狭窄孔１を介して流路２内に流入する流量である。なお、ここでの説明では、主に上述の図２及び図４を参照して説明する。

まず、投入部３に試料流体Ｓが投入されておらず、狭窄孔１の上方（大気側）に試料流体Ｓが存在しない場合を想定する。高圧流体タンク１１３ａ、低圧流体タンク１１３ｂ内の圧力がそれぞれＡＰ１、ＡＰ２（ＡＰ１＞ＡＰ２）に保持されると、搬送流体Ｆは、高圧流体タンク１１３ａから流出し、流路２を通過して低圧流体タンク１１３ｂへと流入する。このときの搬送流体Ｆの流量が主流流量Ｑである。

流路チップ１１の流入部９及び流出部１０において測定される圧力をＦＰ１、ＦＰ２とする。この圧力ＦＰ１、ＦＰ２から、狭窄孔１の直下位置ｓにおける静圧Ｐｓが決定される。この静圧Ｐｓは、流路チップ１１内の流路２の形状を反映した管路抵抗に起因する圧力損失を基に決定される。

なお、このとき、静圧Ｐｓの大きさが比較的小さい範囲では、狭窄孔１の上方（大気側）に試料流体Ｓが存在しない限り、表面張力のために搬送流体Ｆは狭窄孔１からは流出しない。また、流路２内部への気体の流入もない。

ここで、血液等の試料流体Ｓ（細胞懸濁液）が、投入部３へ１０μＬ程度滴下された場合を想定する。この場合、試料流体Ｓは大気に依然として接しており、かつその高さは、1mm程度であるために、狭窄孔１の上方にある試料流体Ｓの静圧は、大気圧と同じくゼロであるとみなせる。また、狭窄孔１での表面張力は最早存在しない。そのため、狭窄孔１の直下位置ｓの静圧はＰｓであるから、（０−Ｐｓ）の圧力差によって試料流体Ｓは、流路２内に流入する。狭窄孔１の直下位置ｓの静圧Ｐｓを負に保てば、試料流体Ｓは、流路チップ１１の流路２内に引き込まれる。

ここで、静圧Ｐｓは、一般に管路抵抗の関数であるため、以下の式（１）が成立する。
Ｐｓ＝ｆ（ＦＰ１、ＦＰ２）・・・（１）

従って、試料流入流量Ｑｓは、レイノルズ数が十分小さい限り、Ｒｓを比例定数として以下の式（２）で表わすことができる。
Ｑｓ＝Ｒｓｆ（ＦＰ１−ＦＰ２）・・・（２）

なお、流路チップ１１内の流路２について、狭窄孔１の直下位置ｓを境に上流側、下流側が流体力学的対称に作成された場合、位置ｓでの静圧Ｐｓは簡略化され、以下の式（３）で表される。
Ｐｓ＝（ＦＰ１＋ＦＰ２）／２・・・（３）

また、この場合、試料流入流量Ｑｓは、以下の式（４）で表される。
Ｑｓ＝Ｒｓ（ＦＰ１＋ＦＰ２）／２・・・（４）

また、主流流量Ｑも、ＦＰ１及びＦＰ２から、主流に関する管路抵抗Ｒを用いて、以下の式（５）によって表される。
Ｑ＝Ｒ（ＦＰ１−ＦＰ２）・・・（５）

以上より、高圧流体タンク１１３ａ内の圧力ＡＰ１及び低圧流体タンク１１３ｂ内の圧力ＡＰ２を調整し、流路２の上流側及び下流側で搬送流体Ｆの圧力（ＦＰ１、ＦＰ２）を適切に調整することで、主流流量Ｑ及び試料流入流量Ｑｓを任意に制御可能であることが分かる。また、ＡＰ１及びＡＰ２の調整によるＦＰ１及びＦＰ２の調整により、主流流量Ｑ及び試料流入流量Ｑｓをそれぞれ独立して制御可能であることが分かる。

本発明者らは、流路２の中央に狭窄孔１を有する流路チップ１１を作成した。そして、本発明者らは、高圧流体タンク１１３ａ内の圧力ＡＰ１及び低圧流体タンク１１３ｂ内の圧力ＡＰ２を調整することで、流入部９及び流出部１０での搬送流体Ｆの圧力ＦＰ１、ＦＰ２を調整しながら、主流流量Ｑ及び試料流入流量Ｑｓを測定した。なお、流路チップ１１の流路２の長さは、２２ｍｍとされ、幅は、２００μｍとされ、高さは１００μｍとされた。また、搬送流体Ｆ及び試料流体Ｓは、代用として純水が使用された。

図５及び図６は、そのときの実験結果を示す図である。図５には、ＦＰ１及びＦＰ２の差圧と、主流流量Ｑとの関係が示されている。図６には、狭窄孔１の直下位置ｓの静圧Ｐｓと、試料流入流量Ｑｓとの関係が示されている。

図５に示すように、ＦＰ１及びＦＰ２の差と、主流流量Ｑとの間には、実際に線形性が確認された。また、図６に示すように、狭窄孔１の直下位置ｓの静圧Ｐｓと、試料流入流量Ｑｓとの間には、実際に線形性が確認された。なお、図５及び図６に示す実験では、ＦＰ１及びＦＰ２を調整することで、実際に、主流流量Ｑ及び試料流入流量Ｑｓを独立して制御することができた。

図２には、流路２内での搬送流体Ｆのゲージ圧が示されている。実線のグラフでは、ＦＰ１及びＦＰ２の差が適切であり、かつ、Ｐｓの大きさが適切であることから、主流流量Ｑ及び試料流入流量Ｑｓが適切である場合が示されている。一方、一点鎖線のグラフでは、Ｐｓが適切であるものの、ＦＰ１及びＦＰ２の差が不適切であるため、主流流量Ｑが小さすぎる（主流の流速が遅すぎる）場合が示されている。また、二点鎖線のグラフでは、ＦＰ１及びＦＰ２の差が適切であるものの、Ｐｓが大きすぎるため、試料流入流量Ｑｓが大きすぎる（試料流体Ｓの流入速度が速すぎる）場合が示されている。

なお、図２からも、流路２の上流側及び下流側で搬送流体Ｆの圧力（ＦＰ１、ＦＰ２）を適切に制御することで、主流流量Ｑ及び試料流入流量Ｑｓを任意に、独立して制御可能であることが分かる。

ここで、狭窄孔１を介して流路２内に進入した細胞Ｃは、方向を代えて流出部１０の方向へ向かう。このとき、流路２内に進入した細胞Ｃが、流路２の幅方向で整列する度合は、主流流量Ｑ及び試料流入流量Ｑｓによって決定される。本発明者らは、図５及び図６の実験で使用した流路チップ１１を用いて、流路２内に進入した細胞Ｃの幅方向での整列度を測定した。この実験では、細胞Ｃの代わりに、直径１０μｍのポリスチレンビーズが用いられた。本発明者らは、流路２内に進入したビーズが１００個／ｓの速度で流路２を通過し、分取部５において１００個／ｓの分取速度となるように、主流流量Ｑ及び試料流入流量Ｑｓを調整した。そして、本発明者らは、狭窄孔１の位置から流出部１０側に０ｍｍ、５ｍｍの各箇所で、ビーズの幅方向での整列度を測定した。その結果、０ｍｍ、５ｍｍのいずれの箇所においても、ビーズは、幅方向で±１０μｍの範囲にその中心を保っていた。

＜作用等＞
以上説明したように、本実施形態では、狭窄孔１は、搬送流体Ｆが流通する流路２の内部に設けられていない。従って、搬送流体Ｆが流路２を流通する流量が狭窄孔１の径の制限を受けない。これにより、細胞Ｃが流路２内で沈降し、流路２内で停留してしまうことを防止することができる。

ここで、比較例として、流路２の内部に狭窄路を形成した場合を想定する。この場合、流路２内での細胞Ｃの沈降を防止するために、高速液クロマトグラフィー等を使用する方法も考えられる。この場合、試料流体Ｓと搬送流体Ｆとの間に異種流体（例えば、空気）が挟み込まれて、異種流体界面（空気の場合、気液界面）が形成され、搬送流体Ｆにより試料流体Ｓ（細胞Ｃ）が搬送される。

しかしながら、この場合、試料流体Ｓと搬送流体Ｆとの間に異種流体界面を形成するために、液送シーケンスが複雑化し、誘電サイトメトリ装置１００の構造が複雑化するといった問題がある。また、異種流体として空気を用いた場合、流路２内に気泡が停留する可能性があり、この気泡が狭窄路に存在すると、細胞Ｃの複素誘電率が正確に測定することができないといった問題も生じる。

一方、本実施形態では、搬送流体Ｆが流通する流路２に連通する狭窄孔１を形成することで、流路２内での細胞Ｃの沈降を防止することができる。このように、本実施形態では、単純な構造であるため、液送シーケンスが複雑化することもなく、コストも削減される。また、気泡が狭窄孔１に存在するようなこともないので、細胞Ｃの複素誘電率を正確に測定することができる。

本実施形態では、搬送流体Ｆの圧力（ＦＰ１、ＦＰ２）を調整することで、試料流入流量Ｑｓを任意に調整することができる。これにより、狭窄孔１を１つずつ通過する細胞Ｃの速度を任意に調整することができるので、狭窄孔１において、多周波数点で細胞Ｃの複素誘電率を測定するために、適切な速度で細胞Ｃを通過させることができる。

本実施形態では、搬送流体Ｆの圧力（ＦＰ１、ＦＰ２）を調整することで、主流流量Ｑを任意に調整することができる。これにより、流路２内へ流れ込んだ細胞Ｃの流速を任意に調整することができる。これにより、分取部５による分取速度を任意に調整することができる。

本実施形態では、搬送流体Ｆの圧力（ＦＰ１、ＦＰ２）を調整し、主流流量Ｑ及び試料流入流量Ｑｓを調整することで、狭窄孔１を介して流路２内に進入した細胞Ｃのバラつきを抑制することができる。また、本実施形態では、主流流量Ｑ及び試料流入流量Ｑｓを調整することにより、細胞Ｃの分取速度と、細胞Ｃの整列度とを個別に最適化可能である。

Ｃ…細胞
Ｆ…搬送流体
Ｓ…試料流体
Ｑ…主流流量
Ｑｓ…試料流入流量
１…狭窄孔
２…流路
３…投入部
４…測定部
５…分取部
１１…マイクロ流路チップ
１００…誘電サイトメトリ装置
１１０…圧力調整部

Claims (7)

1. 細胞を搬送する搬送流体を流通させる流路と、
   前記細胞を含む試料流体が滴下される投入部と、
   前記流路に連通し、単一の細胞が通過可能であり、前記投入部に滴下されてその表面が大気にさらされる試料流体を前記流路に流入させる狭窄孔と、
   前記搬送流体を流通させるための圧力を前記狭窄孔の上流側及び下流側で調整することで、前記搬送流体が前記流路を流通する流量と、前記試料流体が前記狭窄孔を介して前記流路に流入される流量とをそれぞれ独立して制御する圧力調整部と
   を具備する試料流入装置。
2. 請求項１に記載の試料流入装置であって、
   前記狭窄孔の位置に交流電場を形成する第１の電極対を有し、前記第１の電極対に交流電圧を印加して前記交流電場を形成することにより、前記狭窄孔を通過する前記細胞ごとに、前記細胞に依存する複素誘電率を測定する測定部をさらに具備する
   試料流入装置。
3. 請求項２に記載の試料流入装置であって、
   前記流路は、前記狭窄孔の位置より下流側に設けられ、前記細胞を分取するための分岐路を有し、
   前記試料流入装置は、前記狭窄孔の位置より下流側であって前記分岐路より上流側の前記流路に電場を形成する第２の電極対を有し、前記測定部により測定された前記複素誘電率に基づいて、前記第２の電極対に電圧を印加して前記電場を形成することにより、前記分岐路を利用して前記細胞を分取する分取部をさらに具備する
   試料流入装置。
4. 請求項１に記載の試料流入装置であって、
   前記狭窄孔を介して前記流路に流入する前の、前記狭窄孔上の前記試料流体を攪拌する攪拌部をさらに具備する
   試料流入装置。
5. 請求項４に記載の試料流入装置であって、
   前記攪拌部は、前記試料を攪拌する気流を発生させる
   試料流入装置。
6. 基板と、
   前記基板に設けられ、細胞を搬送する搬送流体を流通させる流路と、
   前記基板に設けられ、前記細胞を含む試料流体が滴下される投入部と、
   前記基板に設けられ、前記流路に連通し、単一の細胞が通過可能であり、前記投入部に滴下されてその表面が大気にさらされる試料流体を前記流路に流入させる狭窄孔と、
   前記搬送流体を流通させるための圧力を前記狭窄孔の上流側及び下流側で調整することで、前記搬送流体が前記流路を流通する流量と、前記試料流体が前記狭窄孔を介して前記流路に流入される流量とをそれぞれ独立して制御する圧力調整部と
   を具備する試料流入チップ。
7. 細胞を搬送する搬送流体を流路に流通させ、
   前記細胞を含む試料流体を投入部に滴下し、
   前記流路に連通する、単一の細胞が通過可能な狭窄孔を介して、前記投入部に滴下されてその表面が大気にさらされる試料流体を前記流路に流入させ、
   前記搬送流体を流通させるための圧力を前記狭窄孔の上流側及び下流側で調整することで、前記搬送流体が前記流路を流通する流量と、前記試料流体が前記狭窄孔を介して前記流路に流入される流量とをそれぞれ独立して制御する
   試料流入方法。

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