JP5718329B2 - 適応光学系を有する顕微鏡検査法 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年７月９日に出願された「Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｏｐｔｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｐｉｌ Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ」と題する米国仮特許出願第６１／２２４，１０２号明細書、２００９年１０月１日に出願された「Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｏｐｔｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｐｉｌ Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ」と題する米国仮特許出願第６１／２４７，９２９号明細書、２００９年１１月２３日に出願された「Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｏｐｔｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｐｉｌ Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ」と題する米国仮特許出願第６１／２６３，６１４号明細書、及び、２００９年１１月３０日に出願された「Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｏｐｔｉｃｓ ｉｎ Ｗｉｄｅｆｉｅｌｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」と題する米国仮特許出願第６１／２６５，２２５号明細書との優先権を主張する。これらの先に出願された出願の各々の主題は参照によって本明細書に組み込まれる。

本開示は、顕微鏡検査法に関し、特に、適応光学系を有する顕微鏡検査法に関する。

光学顕微鏡法は、数世紀前の発明以来、注目すべきコントラスト機構およびハードウェアの実現とともに多くの段階を通じて進化してきた。しかしながら、その使用に関する基本的な動機、すなわち、裸眼で識別できない造りを解像することができることは変わっていない。結果として、より高い分解能への動きが近年における光学顕微鏡開発の焦点になっており、従来の光学顕微鏡法の回折限界を打ち破るためにいくつかの方法が示されている。こうした努力にもかかわらず、多くの場合に正当に評価されない１つの事実が残っており、すなわち、多くの生物サンプルでは、高性能な研究用顕微鏡の場合でさえも回折限界の分解能が実現されることは稀である。光学顕微鏡の理想的な画像性能では、設定された浸漬媒体の光学特性と同じ光学特性を有するサンプルに励起光および放射光の両方あるいはどちらか一方を通す必要があり、このような条件からのずれがあると、収差として知られる光学的歪みが生じて、信号、画像忠実度、および分解能の損失をもたらす。実際に、生物サンプルは、不均質な光学特性を有しており、したがって、画像は生物組織内の深さが増すにつれて次第に画質が低下する。

天文学で使用される光学望遠鏡の場合にも同様の課題が存在する。遠方の星からとらえられる光は、まず地球の擾乱大気を横断しなければならず、擾乱大気が光学的歪みを与えて画像品質を著しく低下させる。適応光学系（「ＡＯ」）と総称される、このような歪みを積極的に補正する方法によって、地上望遠鏡では地球外物体の回折限界画像が得られるようになった。天文学における適応光学系は概念的に簡単であり、すなわち結像面の近くに配置されるセンサーが歪んだ波面を直接測定し、可変鏡などの能動光学素子がこの波面をフィードバックループで修正して回折限界性能を回復させる。しかしながら、顕微鏡検査法における適応光学系は、収差のある波面を直接的に測定することが困難であるためにさほど容易でなく、結局のところ、試料内に波面センサーを配置することができることは稀である。試料からの後方散乱光はこのような直接波面センシングに使用されてきたが、このような方法は、結像面に対する収差と結像面からの収差のいずれをも激しく変化させる可能性があり、多重散乱光によってさらに複雑化する。

Ｐａｎａｇｏｐｏｕｌｏｕ，Ｓ．Ｉ．，Ｎｅａｌ，Ｄ．Ｒ．，「Ｚｏｎａｌ ｍａｔｒｉｘ ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｗａｖｅｆｒｏｎｔ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ，」Ｊ．Ｒｅｆｒａｃｔ．Ｓｕｒｇ．２１，Ｓ５６３−Ｓ５６９（２００５）

本開示では、光学系の後瞳がセグメント化され、セグメントが波面変調デバイスによって個々に制御され、光学系内の励起ビームまたは放射ビームの個々のビームレットの方向および位相を制御し、サンプルおよびシステムによって誘発される収差に対する適応光学系補正を行う顕微鏡検査技術を説明する。

一般的な態様では、サンプルの画像を形成する方法は、サンプル内の焦点にビームの断面が個々のビームレットを含む、光源からの励起光のビームを収束させるステップと、焦点をサンプル内の複数の異なる位置まで走査するステップとを含む。個々のビームレットの角度は焦点が複数の異なる位置にあるときに独立に制御されて焦点における励起光の収差を低減させる。個々のビームレットの角度を独立に制御するステップは、他のビームレットがオフの間に個々のビームレットをオンにし、サンプルを画像化して記ビームレットに対する角度を決定するステップと、個々のビームレットに対応する個々の小区域を含む波面変調素子で前記励起ビームを変調するステップと、個々の小区域内で、対応する個々のビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために対応するビームレットに小区域によって与えられる位相値のプロファイルを制御するステップと、を含む。さらに、この方法は、焦点が複数の異なる位置にあるときに、焦点において個々のビームレットが互いに建設的に干渉するように、個々のビームレットの相対位相を独立に制御するステップと、焦点が複数の異なる位置にあるときに焦点から放射された放射光を検出するステップと、焦点の複数の異なる位置から検出された放射光に基づいてサンプルの画像を作成するステップと、を含む。
実施形態は、以下の特徴の１つまたは複数を含むことができる。例えば、複数の異なる位置はサンプルの平面内に位置してもよく、平面はサンプル内の励起ビームの軸に対して垂直または非垂直であってよい。励起光は第１の波長を有していてもよく、放射光は第１の波長よりも小さい（例えば、第１の波長のおよそ半分の）第２の波長を有する。波面変調素子は、空間光変調器を含んでいてもよく、空間光変調器の活性層から反射される光にグローバルな位相ランプを適用して、空間光変調器の前面から反射される光と活性層から反射される光との間に非ゼロ角度を誘導するステップをさらに含むことができる。

位相値のプロファイルが決定されうる。一実施形態では、位相値を決定するステップは、励起ビームの複数の異なる個々のビームレットをサンプル内の参照物体に照射するステップを含んでいてもよく、複数の異なる個々のビームレットが波面変調素子の種々の対応する小区域によって変調される。参照物体からの放射光は参照物体に複数の異なる個々のビームレットが照射されるときに検出されてもよく、サンプル内の参照物体の位置は参照物体に複数の異なるビームレットが照射されるときに検出される放射光に基づいて決定されてもよい。決定された位置に基づいて、対応するビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために、ビームレットが位相に空間的勾配を含むときに位置が互いに実質的に等しくなるように、小区域の対応するビームレットに各小区域によって与えられる位相値のビームレット−角度−補正プロファイルについての決定がなされうる。別の実施形態では、位相値を決定するステップは、複数のビームレットにおいて、波面変調素子の小区域に対応する各ビームレットに対して（ａ）ビームレットをサンプル内の参照物体に照射し、複数のビームレットの他のビームレットで参照物体を照射しないステップと、（ｂ）参照物体にビームレットが照射されるときで参照物体が複数のビームレットの他のビームレットで照射されないときにサンプル内の参照物体から放射光を検出するステップと、（ｃ）検出された放射光に基づいてサンプル内の参照物体の位置を決定するステップとを含むことができる。この後、決定された位置に基づいて、ビームレットが位相に空間的勾配を含むとき、ビームレットが位相に空間的勾配を含まないときに形成される焦点よりも小さいサイズを有するサンプル内の焦点で交差するように、対応するビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために、小区域の対応するビームレットに各小区域によって与えられる位相値のビームレット−角度−補正プロファイルについての決定がなされうる。参照物体は蛍光ビーズであってもよい。

位相値のプロファイルを決定するステップは、位相値のビームレット−角度−補正プロファイルに基づいて、焦点におけるビームレット間に建設的干渉をもたらすことになる波面変調素子でビームレット間の相対位相を決定するステップをさらに含むことができる。位相値のプロファイルを決定するステップは、波面変調素子の参照小区域によって変調される参照ビームレットをサンプル内の参照物体に照射するステップと、他の複数のビームレットが参照物体を照射していないときに、参照物体を照射するために波面変調素子の異なる個々の小区域によって複数の異なるビームレットを連続的に変調させるステップとをさらに含むことができる。各ビームレットに対して、焦点におけるビームレットと参照ビームレットとの間に建設的干渉をもたらすことになるビームレットと参照ビームレットの間の相対位相を誘導するために、ビームレットの対応する小区域によってビームレットに与えられる位相値のプロファイルについての決定をすることができる。

別の一般的な態様では、顕微鏡システムは、励起光を放射するように構成された光源と、サンプル内の焦点にその断面が個々のビームレットを含む励起光ビームを収束させるように構成された収束素子と、サンプル内の複数の異なる位置で焦点を走査するように構成された走査素子と、焦点が複数の異なる位置にあるときに励起光を変調して個々のビームレットの角度および相対位相を独立に制御して、焦点が複数の異なる位置にあるときに焦点における励起光の収差を低減させるするように構成された波面変調素子であって、角度の制御は他のビームレットがオフの間に個々のビームレットをオンにしてサンプルを画像化してビームレットに対する角度を決定することを含んでおり、個々のビームレットの相対位相を制御して焦点において個々のビームレットが互いに建設的に干渉するように構成されており、波面変調素子は、個々のビームレットに対応する波面変調素子の個々の小区域内で、個々の対応するビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために対応するビームレットに小区域によって与えられる位相値のプロファイルを制御することによって、個々のビームレットの角度を制御するように構成されている、波面変調素子と、焦点が複数の異なる位置にあるときに焦点から放射された放射光を検出するように構成された検出器と、焦点の複数の異なる位置からの検出された放射光に基づいてサンプルの画像を作成するように構成されたプロセッサとを含む。

実施形態は、以下の特徴の１つまたは複数を含むことができる。例えば、複数の異なる位置はサンプルの平面内にあり、平面はサンプル内の励起ビームの軸に垂直または非垂直であることができる。励起光は第１の波長を有していてもよく、放射光は第１の波長よりも小さい第２の波長を有する。波面変調素子は、空間光変調器の前面から反射された光と活性層から反射された光との間に非ゼロ角度を誘導するために、空間光変調器の活性層から反射された光にグローバルな位相ランプを適用するように構成された空間光変調器を含むことができる。

波面変調素子は、サンプルに達しない方向に個々のビームレットの方向を変調し、サンプル内の参照物体に励起ビームの残りの異なる個々のビームレットが照射され、複数の異なるビームレットは波面変調素子の種々の対応する小区域によって変調されて、参照物体に複数の異なるビームレットが照射されるときにサンプル内の参照物体からの放射光が検出されうるように、さらに構成されることができる。１つまたは複数のプロセッサが含まれることができ、参照物体はサンプルに到達しない個々のビームレットによって照射されないときで、参照物体に複数の異なる残りのビームレットが照射されるときに検出される放射光に基づいてサンプル内の参照物体の位置を決定し、決定された位置に基づいて、位置が実質的に互いに等しくなるように対応するビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために、小区域の対応するビームレットに各小区域によって与えられる位相値のビームレット−角度−補正プロファイルを決定することによって位相値のプロファイルを決定するように構成されることができる。波面変調素子とサンプルとの間の励起ビームの経路に沿って位置する視野絞りが含まれることができ、サンプルに達しない方向に変調される励起光のビームレットを阻止するように構成されることができる。

位相値のプロファイルを決定するステップは、位相値のビームレット−角度−補正プロファイルに基づいて、焦点におけるビームレット間に建設的干渉をもたらすことになる波面変調素子でビームレット間の相対位相を決定するステップをさらに含むことができる。波面変調素子は、サンプルに達しない方向に個々のビームレットの方向を変調し、サンプル内の参照物体に励起ビームの残る異なる個々のビームレットが照射されて、複数の異なるビームレットが波面変調素子の種々の対応する小区域によって変調され、参照物体に複数の異なるビームレットが照射されるときにサンプル内の参照物体からの放射光が検出されうるように、さらに構成されてもよい。１つまたは複数のプロセッサを含むことができ、各異なる個々のビームレットに対して、個々のビームレットと参照ビームレットの間の焦点に建設的干渉をもたらすことになるビームレットと参照ビームレットの間に相対位相を誘導するために、ビームレットの対応する小区域によってビームレットに与えられる位相値のプロファイルを決定することによって、位相値のプロファイルを決定するように構成されることができる。

別の一般的な態様では、サンプルの画像を形成する方法は、サンプルに励起光を照射するステップと、サンプルによって放射される光を対物レンズの焦点面で集めるステップと、この集められた光を検出器上で画像化するステップと、集められた光のビームを波面変調素子によって変調するステップであって、その変調された光のビームの断面が個々のビームレットを含んでおり、各ビームレットは焦点面から波面変調素子までの経路により定まる量だけ収差を受けている、ステップと、個々のビームレットが波面変調素子の異なる個々の小区域によって反射される角度を独立に制御するステップであって、あるビームレットが反射される角度は、焦点面におけるそのビームレットの収差を補償して、集められた光のビームは検出器上に平面波として画像化されるように制御され、個々のビームレットの角度を独立に制御するステップは、他のビームレットがオフになっている間に個々のビームレットをオンにし、サンプルを画像化してビームレットに対する角度を決定するステップと、個々のビームレットに対応する波面変調素子の個々の小区域内で、個々の対応するビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために、対応するビームレットに小区域によって与えられる位相値のプロファイルを制御するステップを含む、ステップと、波面変調素子によって変調される光を画像化するステップと、を含む。

実施形態は、以下の特徴の１つまたは複数を含むことができる。例えば、ビームレットが個々の小区域によって変調される位相値のプロファイルは、（ａ）波面変調素子にフレネルレンズのパターンを与え、その際に、種々のフレネルレンズが波面変調素子の複数の異なる小区域に与えられるステップと、（ｂ）励起光をサンプル内の参照物体に照射するステップと、（ｃ）フレネルレンズのパターンが波面変調素子に与えられている状態で参照物体によって放射される光を集めるステップと、（ｄ）変調されて集められた光のビームの断面が個々のビームレットを含んでおり、フレネルレンズのパターンが与えられる状態で波面変調素子で集められた光のビームを変調するステップと、（ｅ）集められて変調された光を画像化するステップと、（ｆ）画像化された光の参照物体の画像のパターンの位置の特徴を参照物体の画像の理想パターンの位置の特徴と比較するステップと、（ｇ）比較に基づいて、２つのパターン間の差異を減らすことになる位相値のプロファイルを決定するステップと、によって決定されうる。

波面変調素子は空間光変調器を含むことができ、空間光変調器の前面から反射される光と活性層から反射される光との間に非ゼロ角度を誘導するために、グローバルな位相ランプが空間光変調器の活性層から反射される光に適用されてもよい。

別の一般的な態様では、顕微鏡システムは、サンプルを照射するように構成された励起光の光源と、光を画像化するように構成された検出器と、集光光学系の焦点面におけるサンプルによって放射される光を集めるように、且つ、検出器上に集められた光を画像化するように構成された集光光学系と、集められた光のビームを変調するように構成された波面変調素子であって、反射された光のビームの断面が個々のビームレットを含み、各ビームレットは焦点面から波面変調素子までの経路により定まる量だけ収差を受けており、波面変調素子は、個々のビームレットが波面変調素子の異なる個々の小区域から反射される角度を独立に制御するように構成されており、あるビームレットが反射される角度は、そのビームレットの収差を補償して、集められた光のビームは検出器上に平面波として画像化されるように制御され、個々のビームレットの角度を波面変調素子による独立の制御は、他のビームレットがオフになっている間に個々のビームレットをオンにし、サンプルを画像化してビームレットに対する角度を決定するステップと、個々のビームレットに対応する波面変調素子の個々の小区域内で、個々の対応するビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために、対応するビームレットに小区域によって与えられる位相値のプロファイルを制御するステップとを含む、波面変調素子とを含むことができる。

実施形態は、以下の特徴の１つまたは複数を含むことができる。例えば、波面変調素子は、空間光変調器の前面から反射される光と活性層から反射される光との間に非ゼロ角度を誘導するために、空間光変調器の活性層から反射される光にグローバルな位相ランプを適用するように構成される空間光変調器を含むことができる。

１つまたは複数のプロセッサが含まれることができ、小区域によって与えられる位相値のプロファイルを決定するように構成されることができて、決定するステップは、（ａ）波面変調素子にフレネルレンズのパターンを与え、その際に、複数の異なるフレネルレンズが波面変調素子の複数の異なる小区域に与えられるステップと、（ｂ）励起光をサンプル内の参照物体に照射するステップと、（ｃ）フレネルレンズのパターンが波面変調素子に与えられている状態で参照物体によって放射される光を集めるステップと、（ｄ）変調されて集められた光のビームの断面が個々のビームレットを含んでおり、フレネルレンズのパターンが与えられる状態で波面変調素子で集められた光のビームを変調するステップと、（ｅ）集められて変調された光を画像化するステップと、（ｆ）画像化された光の参照物体の画像のパターンの位置の特徴を参照物体の画像の理想パターンの位置の特徴と比較するステップと、（ｇ）比較に基づいて、２つのパターン間の差異を減らすことになる位相値のプロファイルを決定するステップと、を含む。

１つまたは複数の実施形態の詳細を添付図面および以下の説明に記載する。他の特徴は、説明および図面から、また特許請求の範囲から明らかになるであろう。

適応光学系がシステム及び／又はサンプル収差の補正に使用されるポイントスキャン顕微鏡検査法に使用することのできる顕微鏡システムの概略ブロック図である。

適応光学系がシステム及び／又はサンプル収差の補正に使用されるポイントスキャン顕微鏡検査法に使用することのできる顕微鏡システムの概略ブロック図である。

図３ａは、対物レンズに当たって収差なしで回折限界焦点に収束されている平面波光ビームの概略図である。

図３ｂは、波の経路に沿った不均質性によって収差を受けているときの、対物レンズに当たって非回折限界焦点に収束されている平面波光ビームの概略図である。

図３ｃは、波の経路に沿った不均質性によって収差を受けているときの、対物レンズに当たって回折限界焦点に収束されている複数のビームレットから構成される歪み波光ビームの概略図であり、受ける収差はビームレットが対物レンズの後瞳に入る角度および相対位相によって補償される。

ビームの経路に沿った不均質性によって収差を受けているときの、サンプル内の対物レンズに当たって非回折限界焦点に収束されている平面波励起光ビームと、物体の放射光から作られるサンプル内の物体の対応する画像との概略図である。

対物レンズに当たってサンプル内の焦点に回折されている図４Ａの励起光ビームのビームレットと、物体の放射光から作られる物体の対応する画像との概略図である。 対物レンズに当たってサンプル内の焦点に回折されている図４Ａの励起光ビームのビームレットと、物体の放射光から作られる物体の対応する画像との概略図である。 対物レンズに当たってサンプル内の焦点に回折されている図４Ａの励起光ビームのビームレットと、物体の放射光から作られる物体の対応する画像との概略図である。

ビームレットの経路に沿った不均質性によって収差を受けているときの、対物レンズに当たって回折限界焦点に収束されている複数のビームレットから構成される歪み波光励起ビームの概略図であり、受ける収差はビームレットが対物レンズの後瞳に入る角度によって補償される。

光ビームの参照ビームレットとともに示す、図４Ｅの励起光ビームのそれぞれのビームレットの概略図であり、それぞれのビームレットと参照ビームレットはいずれも対物レンズに当たってサンプル内の焦点に回折されており、それぞれのビームレットと参照ビームレットの間の複数の異なる相対位相が示され、放射光の信号は相対位相の関数としてサンプルから放射される。 光ビームの参照ビームレットとともに示す、図４Ｅの励起光ビームのそれぞれのビームレットの概略図であり、それぞれのビームレットと参照ビームレットはいずれも対物レンズに当たってサンプル内の焦点に回折されており、それぞれのビームレットと参照ビームレットの間の複数の異なる相対位相が示され、放射光の信号は相対位相の関数としてサンプルから放射される。

対物レンズに当たる複数のビームレットから構成される歪み波光励起ビームの概略図であり、個々のビームレットはサンプル内の回折限界焦点に同相で収束されるように対物レンズの後瞳に当たるビームレットにおける相対位相および角度が制御される。

図５ａは対物レンズの後瞳をセグメント化するために使用される３つの独立したマスクの概略図である。

図５ｂは対物レンズの後瞳をセグメント化するために使用される９つの独立したマスクの概略図である。

図５ｃは対物レンズの後瞳で９つのセグメントを作るために重複する６つのマスクの概略図である。

図５ｄは対物レンズの後瞳に１８のセグメントを作るために互いに重複するように複数の位置に配置される９つのマスクの概略図である。

サンプルを通る光に収差を誘導するサンプルの概略図である。

適応光学系技術を用いて収差を補正する広視野顕微鏡検査システムの概略図である。

適応光学系技術を用いて収差を補正する広視野顕微鏡検査システムの概略図である。

波面変調素子に適用されるフレネル・ゾーン・プレート・パターンの概略図である。

図９Ａのフレネル・ゾーン・プレート・パターンを有する物体の画像化によって形成される物体の画像の概略図である。

波面変調素子に適用されるフレネル・ゾーン・プレート・パターンの配列の概略図である。

図９Ｃのフレネル・ゾーン・プレート・パターンの配列を有する物体の画像化によって形成される物体の画像の配列の概略図である。

サンプルの画像を形成するプロセスのフローチャートである。

サンプルの画像を形成するプロセスのフローチャートである。

図１は、適応光学系がシステム及び／又はサンプル収差の補正に使用されるサンプルのポイントスキャン顕微鏡検査法に使用されうる顕微鏡検査システム１００の概略ブロック図である。ポイントスキャン顕微鏡検査法では、回折限界点に光が収束され、該点に由来する信号光は非結像検出器（例えば、光電子増倍管）に入る。物体の画像は、サンプルの焦点の全域を走査し、焦点の複数の異なる位置から得られた信号光から画像をコンピュータで構成することによって形成される。システムは励起光源１０２を含む。ある実施形態では、光源１０２は、近赤外線励起光ビームを発生する１フェムト秒パルスのチタン：サファイアレーザー（例えば、モデルＣｈａｍｅｌｅｏｎ Ｕｌｔｒａ ＩＩ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｉｎｃ．製）を含むことができる。励起光ビームは、１対のガルバノメータ１０４ａ、１０４ｂから反射されて、励起光ビームとサンプル１０６における励起ビームの焦点との２次元（２Ｄ）ラスター走査（ｘ方向およびｙ方向の）を提供する。一実施形態では、ガルバノメータは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製の３ｍｍビームアパーチャガルバノメータ、モデル番号６２１５Ｈを含むことができる。ガルバノメータ１０４ａ、１０４ｂは、２つの特注の３０ｍｍ焦点距離のテレセントリックｆ−θレンズ１０８ａ、１０８ｂによって光学的に互いに共役関係にある。第３のレンズ１１０と特注の１５０ｍｍ焦点距離のテレセントリックｆ−θレンズ１１２は、波面変調素子（「ＷＭＥ」）１１４に対してガルバノメータ１０４ｂが共役となるように機能し、さらにＷＭＥの寸法によく合うように励起ビームを拡大する。

一実施形態では、ＷＭＥ１１４は、液晶相のみの空間光変調器（例えば、１９２０×１０８０ピクセル、ＰＬＵＴＯ−ＮＩＲ空間光変調器、Ｈｏｌｏｅｙｅ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ ＡＧ製）を含むことができる。他の実施形態では、ＷＭＥ１１４は、可変鏡（例えば、Ｍｉｒａｏ ５２−ｅ、Ｉｍａｇｉｎｅ Ｅｙｅｓ，Ｉｎｃ製）またはマイクロミラーのアレイ（例えば、Ｂｏｓｔｏｎ Ｍｉｃｒｍａｃｈｉｎｅｓ製、Ｋｉｌｏ−ＤＭ）を含むことができる。ＷＭＥ１１４は、システムまたはサンプルで誘発される収差の特殊ＡＯ補正を行うようにプログラムされることができる。ＷＭＥとして反射型液晶相のみの空間光変調器（ＳＬＭ）を使用することの利点は、ピクセル数が高い（例えば、１９２０×１０８０ピクセル）ために、これは各々が滑らかに変化する線形位相ランプを有する多くの小区域に容易に分割されうるうえに、小区域が全く独立していることもあり、可変鏡の場合のように機械的に結合されないことである。ＷＭＥ１１４に対するガルバノメータ１０４ａおよび１０４ｂの共役によって、ＷＭＥ１１４の各小区域における励起ビームの強度がビーム走査中も確実に一定に保たれる。

ＷＭＥ１１４自体は、励起ビームをサンプル１０６内の焦点１２０に収束させる顕微鏡対物レンズ１１８に対して１対のレンズ１１６ａ、１１６ｂによって共役の関係にある。一実施形態では、対物レンズ１１８は、１６ｍｍ径の後瞳を有する２０×ＮＡ １．０水浸対物レンズ（例えば、モデルＷ Ｐｌａｎ−ＡＰＯＣＨＲＯＭＡＴ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．製）とすることができる。別の実施形態では、対物レンズ１１８は、２０ｍｍ径の後瞳を有する１６×ＮＡ ０．８水浸対物レンズ（例えば、モデルＬＷＤ １６×Ｗ、Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐ．製）とすることができる。

対物レンズ１１８に対するＷＭＥ１１４の共役関係によって、ＷＭＥ１１４で適用される補正位相パターンは、励起ビームの走査中およびサンプル１０６内の焦点１２０の走査中に、後瞳孔を横切って振動しないことが保障される。レンズ１１６ａ、１１６ｂ間の中間像面にある視野絞り１２２は、望ましくない比較的高い回折次数からの光と、ＷＭＥの前面からの鏡面反射（ＷＭＥがＳＬＭなどの反射素子を含むとき）と、サンプル１０６に入らないように意図された角度でのＷＭＥ１１４の小区域から反射される光とを阻止するように機能する。

ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）対物レンズの場合（デザインＮＡ １．０）、ＷＭＥ１１４における６．０ｍｍの１／ｅ^２ビーム半径と、後瞳半径ａに正規化された開口率σ／ａ＝０．７５に対する対物レンズ１１８の後瞳とが採用されうる。ニコン（Ｎｉｋｏｎ）対物レンズ（デザインＮＡ ０．８）の場合、正規化された開口率σ／ａ＝１．２に対して、１／ｅ^２ビーム半径σはＷＭＥ１１４において６．０ｍｍであってもよく、１／ｅ^２ビーム半径は対物レンズ１１８の後瞳において１２．０ｍｍであってもよい。これらの開口率によって、位相補正は励起ビームのほとんどに適用されるようになり、かつ励起ビームエネルギーのほとんどは対物レンズ１１８に入るようになる。ツァイス対物レンズの比較的低い開口率によって、対物レンズは深部の生体内撮像により適したものとなるが、ニコンの場合の比較的高い開口数では分解能を最大にするために対物レンズＮＡがより有効に利用される。ツァイス対物レンズの場合、適応光学系補正に使用されるＷＭＥ領域は長方形であるが、ニコン対物レンズの場合、ＷＭＥ領域は正方形である。

対物レンズの真上の２色性ロング・パス・ビームスプリッタ１２４は、励起ビーム光をサンプル１０６に伝達することができ、サンプル１０６から放射される放射光の蛍光信号を反射することができる。反射された放射光は、この後、検出器１２６で検出されうる。検出器１２６は、１つまたは複数の光電子増倍管チューブ（例えば、モデルＨ７４２２−４０、Ｈａｍａｍａｔｓｕ製）でありうる。対物レンズ１１８は、ｚ軸ステージ１２８によってサンプル１０６に当たる励起ビームの軸方向に移動されることができる。システム１００は、１つまたは複数のプロセッサ及び／又はコンピュータデバイス１５０を含んでいてもよく、これらはシステムの他の素子を制御し、及び／又はシステムから得られる情報を処理するように動作してもよい。例えば、プロセッサ及び／又はコンピュータデバイス１５０は、ＷＭＥ１１４の光学特性を制御するために、ミラー及びレンズを含むシステム内の光学素子の位置及び／又は角度を制御するために光源１０２の出力および周波数を制御するように動作することができる。また、プロセッサ及び／又はコンピュータデバイス１５０は、検出器１２６によって検出される光に関する情報を処理するように動作することができる。例えば、プロセッサ及び／又はコンピュータデバイス１５０も、検出された光に基づいてサンプル１０６の画像を作成してもよく、例えば、システムがポイントスキャン顕微鏡検査法に使用されるとき、プロセッサ及び／又はコンピュータデバイス１５０は、焦点１２０がサンプル１０６内の複数の異なる位置にあるときに放射光の量および質に関する情報に基づいてサンプル１０６の画像を作成してもよい。

図２は、図１に示すシステム１００のさらなる詳細を示す顕微鏡システム１００の概略ブロック図である。システムの一部のさらなる詳細は、１）サンプルにおいて所望のレーザー強度を設定し、２）レーザー強度を安定化し、ｃ）ビームがサンプル１０６の走査に使用されていないときに、あるいは走査中のｘガルバノメータ１０４ａのフライバック中に励起ビームを削除するために、アナログ・フィードバック・ループで、ビームピックオフ２０４（例えば、モデル７９４０ビームピックオフ、Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ製）、光検出器２０６（例えば、モデルＰＤＡ１００Ａ光検出器、ＴｈｏｒＬａｂｓ製）、及び比例−積分−微分コントローラ（図示せず、例えば、ＳＩＭ９６０コントローラ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）と結合されうる電気光学変調器（「ＥＯＭ」）２０２（例えば、モデル３５０−８０ＬＡ ＥＯＭ、Ｃｏｎｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．製）を含む。励起ビームの出力が確実に制御されうる（例えば、励起ビームのフルパワーの０．０１％〜１００％）ダイナミックレンジをさらに拡大するために、一連の中性密度フィルターを有するフィルターホイール２０８（例えば、Ｌａｍｂｄａ １０−Ｂフィルターホイール、Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）が使用されることができる。ＥＯＭ ２０２から顕微鏡対物レンズ１１８までの長い経路にわたる励起ビームの発散を最小にするために、Ａ２×ビーム拡大器２１０（例えば、モデルＢＥ０２Ｍ−Ｂ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ Ｉｎｃ．製）が使用されることができる。逆に、高速移動ステージ２１４（例えば、モデルＭ−６６３、Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ，ＧｍｂＨ製）に取り付けられた２ｘビームレジューサ２１２（例えば、モデルＢＥ０２Ｍ−Ｂ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ Ｉｎｃ．製）が、必要に応じてＷＭＥ１１４の小区分にビームを集中するために、励起ビームの経路に往復的に送り込まれることができる。同じ対の高速移動ステージに取り付けられた１対のミラー２１６は、ＷＭＥ１１４に対して二次元でビームの位置を合わせることができる。ビームレジューサ２１２とレーザー位置決めミラー２１６の動作を以下でさらに詳しく説明する。

顕微鏡対物レンズは、軸方向の２Ｄおよび３Ｄ画像化のための高速単一軸圧電屈曲ステージ２１８（例えば、モデルＰ−７３３．ＺＣＬステージ、Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ，ＧｍｂＨ製）に取り付けられうる。検出経路に沿って、蛍光は、まずレンズ２２０（例えば、ＬＡ１００２−Ａレンズ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ製）によってコリメートされ、カスタム２色性ビームスプリッタ２２２（例えば、Ｑ５６０ＤＣＸＲビームスプリッタ、Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．製）によって赤色および緑色成分に分けられ、２つの新たなレンズ２２４、２２６（例えば、モデルＬＡ１００２−Ａレンズ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ製）によって再収束され、この後、２つのＰＭＴ ２２６、２２８で検出されうる。緑色の蛍光が１対のフィルター２３０（例えば、ガラスフィルター：モデルＣＧ−ＢＧ−３９−１．００−２、ＣＶＩ製、および帯域通過フィルター：モデルＦＦ０１−５１０／８４、Ｓｅｍｒｏｃｋ製）によって第１のＰＭＴ ２２６で選択され、赤色の蛍光が別のフィルター対２３２（例えば、帯域通過フィルター：モデルＦＦ０１−６１７／７３、Ｓｅｍｒｏｃｋ製、および帯域通過フィルター：モデルＦＦ０１−６３０／６９、Ｓｅｍｒｏｃｋ製）によって第２のＰＭＴ ２２８で選択されうる。低ノイズ電流増幅器（例えば、モデルＤＬＰＣＡ−２００増幅器、ＦＥＭＴＯ Ｍｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ，ＧｍｂＨ製）が２つのＰＭＴ２２６、２２８で測定される信号を昇圧するために使用されることができ、高速リセット・カスタム・アナログ積分器が各ピクセルの時間的経過にともなって得られる増幅された電流スパイクを加算して、赤色および緑色の画像を形成するためのディジタル化される２つの最終信号を生み出すために使用されることができる。

図１および図２のシステム１００は、例えば、厚い組織における２光子蛍光顕微鏡検査法に使用されてもよく、その場合、励起光のビームはサンプル１０６内の焦点に強く収束され、焦点がサンプル１０６を通じて走査される間に放射光が焦点１２０から検出される。２光子顕微鏡検査法では、画像品質に影響を与える収差のみが焦点１２０の強収束を劣化させるので、この収差のみが収束された励起光によって受ける収差である。焦点１２０の空間強度プロファイルは電磁理論から計算されてもよく、かつその理想的な回折限界からのずれは収差モードの無限級数の形で数学的に記述されてもよいが、ここでは、本発明者らはその代わりに収差補正のために直感的な適応光学系アルゴリズムにつながる焦点形成の簡単な物理的モデルに従う。

このモデルでは、顕微鏡対物レンズ１１８の後瞳に入るすべての光線が曲げられて共通位相を有して共有点で交わるときに、回折限界焦点１２０が生じるものと考えられ−すなわち、焦点は最大の建設的干渉点である。このような状態は図３ａに示されており、ここでは、平面波３０２として顕微鏡対物レンズ３０４に当たるビームは顕微鏡対物レンズ３０４によって点３０６に収束され、ビームのビームレット３０８、３１０、３１２の各例は同じ焦点３０６に収束される。しかしながら、図３ｂに示すように、対物レンズ３０４と公称焦点３０６の間の経路に沿った予期せぬ屈折率の不均質性によってビームレット３０８、３１０、３１２が偏向される可能性があるので、これらのビームレットはすべてが焦点で交わるわけでなくかつ／またはビームレット３０８、３１０、３１２の相対位相をシフトさせる可能性があり、したがって個々のビームレットは焦点において他のビームレットとさほど建設的に干渉しない。

図３ｃに示すように、顕微鏡対物レンズの後瞳に光学的に共役な波面変調素子１１４などの能動光学素子を使用すると、このようなビームレットは個々に焦点３０６に戻されることができ、ビームレットの相対位相はすべてのサンプルによって誘導された収差を効果的に無効にするように再び最適化され、したがって、回折限界焦点３０６が得られうる。このような能動光学素子が収差を補正するために使用されるとき、顕微鏡対物レンズの後瞳に当たるビームは平面波でなく、ビームレットは対物レンズ３０４およびサンプルを通り、非常に低い空間的広がりを有する焦点において同相で強く収束されるように、むしろ、後瞳に垂直な角度で、互いに相対位相を有して、後瞳の位置で後瞳に当たるビームレット３１６、３１８、３２０を含む歪み波３１４である。当然ながら、ビームレットの無限連続体を個々に取り扱うことは可能でないが、能動素子１１４を各小区域が独立した調整可能な平面的な位相パターンを有するＮ個の小区域に分割し、それによって傾斜角と相対位相オフセットを個々に制御可能なＮ個のビームレットに後瞳を分けることは可能である。後瞳全体に必要な補正位相パターンの複雑さが増すと、正確な近似を実現するためにより多くの小区域Ｎが必要である。しかしながら、収差が多種多様である場合に、回折限界性能を取り戻すためにはＮ＜１００であれば通常は十分である。

ＷＭＥ１１４の個々の小区域によって変調されるビームレットを共通焦点１２０にまとめるために、まず、対物レンズ１１８の後瞳が十分に照射される状態でサンプル１０６の参照画像が取得されることができる。例えば、図４Ａに示すように、収差のある励起光のビームを用いて画像が作成されることができる。例えば、サンプル１０６内の蛍光ビーズは、参照画像を作成するために使用されることができる。適応光学系補正に選定される横方向画像平面は、蛍光参照ビーズなどのサンプル１０６内の関心対象の特徴の画像の三次元スタックを取得し、ユーザーが定義する関心対象の領域にわたって積分されたような信号が最大となる平面を選択することによって選択されることができる。おそらくは、この平面は最初の理想的な焦点に最も近く、したがって、回折限界性能を取り戻すために最小の補正で済むことになる。

参照画像が取得された後、二進位相パターンがＷＭＥ１１４のＮ個の小区域の１つを除くすべてに加えられることができる−これはＮ個の小区域の１つを除くすべてに関連するビームレットを中間画像平面における視野絞り１２２によって回折させ阻止させて、これらのビームレットを効果的に「オフ」にする（つまり、これらの小区域に当たる光は対物レンズ１１８に達しない）パターンである。ビームレットは、ビームレットに関連するＷＭＥ１１４の小区域に０およびπの位相シフトの交互の列からなる位相格子を適用することによって「オフ」にされることができる。この位相格子は、これらの小区域によって変調されるビームレットの光のほとんどを、中間画像平面で視野絞り１２２の中で回折させ、光が遮断される。

この後、サンプルの画像（例えば、サンプル内の蛍光ビーズの画像）が、唯一の残る「オン」ビームレットを用いて取得されることができる。ビームレットを理想的な焦点から偏向させる唯一の残る「オン」ビームレットの経路に沿った不均一性は、参照画像に対するこの画像内のシフトとして明らかになる。例えば、図４Ｂに示すように、図４Ｂに示すビームレットのみから励起光によって作り出されるサンプル内の蛍光ビーズの画像が、図４Ａに示すように、収差のある励起光のすべてのビームレットから作り出される画像（点線参照）から上および左に変位される。例えば、図４Ｃに示すように、図４Ｃに示すビームレットのみから励起光によって作り出されるサンプル内の蛍光ビーズの画像が、図４Ａに示すように、収差のある励起光のすべてのビームレットから作り出される画像（点線参照）の中心にある。例えば、図４Ｄに示すように、図４Ｄに示すビームレットのみからの励起光によって作り出されるサンプル内の蛍光ビーズの画像が、図４Ａに示すように、収差のある励起光のすべてのビームレットから作り出される画像（点線参照）から上および右に変位される。

簡単な単独の物体の場合、唯一のビームレットからの励起光によって作り出される画像のシフトは画像内の物体における重心のシフトから決定されることができるが、多くの複雑なサンプルの場合、画像相関がシフトを決定するために用いられることができる。さらに複雑なサンプルでは、サンプル内の複数の特徴の画像相関は、種々の瞳のセグメントが作動させられるときに画像シフトを測定するために用いられることができる。例えば、サンプルにおける複数の蛍光ビーズなどの特徴の画像は、ビームレットを共通焦点に導くために比較されて用いられることができる。また、画像相関は、任意の蛍光パターンを有する複雑な生物組織内での適応光学系技術の適用を可能にする。

ビーム偏向測定に画像相関を使用する１つの利点は、ユーザーによって選択された相関領域全体にわたる平均収差を測定することであり、したがって、その領域全体にわたって有効な適応光学系補正を提供することである。対応する欠点は、測定された収差が大量の生物組織に関する光学特性の平均値を表すので、これはローカル的屈折率プロファイルが測定平均値と異なる特殊な小区域での最適補正よりも低くなる可能性があるということである。このような領域では、ローカル画像相関またはローカル的特徴の重心推定のいずれかを用いたさらにローカル的な測定が要求されるかもしれない。この後、比較的大きい視野画像は、各々が固有の補正波面で作り出される比較的小さいサブ画像からまとめられることができる。

いずれにしても、収差のない方向からの個々のビームレットの傾斜角のシフトが検知された時点で、ビームレットの所望の方向からのビームレットの偏向角度が計算されてもよく、大きさが等しい対頂角がＷＭＥ１１４の対応する小区域に適切な位相ランプを適用することによってビームレットに与えられてもよい。

このプロセスは、この後、すべてのＮ個のビームレットが図４Ｅに示すように共通焦点で交わるまで、ＷＭＥ１１４の他のＮ−１個の小区域、および他のＮ−１個の対応するビームレットに対して繰り返されることができる。Ｎ個の小区域に関する傾斜角測定の場合、同時に「オン」であるのは１つの小区域のみであるという事実を補償するために、出力が最初に少なくともＮ倍に増加されることができる。ＷＭＥ１１４全体のガウス強度変動に起因して、画像変位を正確に測定すべく、ただしサンプル１０６で過度な光退色を生じない程度に、十分な信号を得るために必要に応じて各小区域でさらなる出力調整が自動的に行われることができる。

つぎに、ビームレットの位相を補正するために、参照ビームレットが他のＮ−１個のビームレットの１つとともに「オン」にされることができる。この後、図４Ｆに示すように、焦点における信号が最大になるまで第２のビームレットに与えられる複数の異なる位相を有する一連の画像が取得されることができる。この後、このプロセスは、同じ参照ビームレットを用いて、さらには、残るＮ−２個のビームレットの各々を用いて、図４Ｇに示すように繰り返されることができる。この後、適応光学系アルゴリズムが終了し、Ｎが十分に大きければ、励起光ビームのビームレットは共通焦点においてすべて交わるとともに、回折限界焦点が実現されるように焦点において互いに同相である。異なる個々のビームレットの相対位相を補正するとき、励起光の特定ビームレット出力は十分な信号を実現するが、光退色を回避するために、必要に応じて調整されることができる。光退色をさらに最小にするために、４〜７個の画像のみが各小区域に対して０と２πの間の等間隔位相オフセットで取得されてもよい。この後、これらの画像の各々からの焦点における信号を、関数Ｓ＝｜１＋αｅｘｐ（ｉ（φ−φ_０））｜^４にフィットさせることによって、最大建設的干渉に対する正確な位相オフセットφ_０が決定されてもよく、ここで、Ｓは現在の小区域からの電場と参照小区域またはすべての他の小区域のいずれかからの電場との干渉から生じる２つの光子信号を表す。

別の実施形態では、個々のビームレットの位相を補正するために、個々のビームレットを共通焦点において一緒に交わらせるためにＷＭＥ１１４によって適用されるビーム偏向角に関する情報が、対物レンズの後瞳全体の位相勾配測定値のアレイを規定するために使用されることができる。これらの位相勾配測定値から、焦点１２０において個々のビームレットが建設的に干渉するために必要な後瞳における個々のビームレットの相対位相は、非特許文献１に記載されて本明細書で参照によって援用されるように、波面全体の位相の既知の空間的連続性に基づく反復アルゴリズムによって決定されうる。

「オン」の小区域では、ＷＭＥがＳＬＭなどの反射素子を含むとき、制御不可能であるＷＭＥの前面から鏡面的に反射されるほんの僅かな光からＷＭＥ１１４内で変調される光の大部分を分離するために、緩やかでグローバルな位相ランプを適用することができる。適応光学系補正の後、ＷＭＥ１１４の各小区域に固有の別のローカル位相ランプが、サンプル１０６において回折限界焦点１２０を作り出すために必要な個々のビームレットの傾斜角および位相に必要な補正をもたらすためにグローバルな位相ランプに重畳されうる。一実施形態では、ＷＭＥの個々の画素は、２５６の異なるグレースケール値の１つでプログラムされることができる。ＷＭＥを制御するために使用される８ビット・グレースケール・レベルとピクセルによって変調されたビームレットにもたらされた実際の位相シフトとの関係は、メーカーの推奨値に従って較正によって決定される。

適合光学系プロセスの傾斜角と位相測定値部分の両方に対して、すべての小区域が「オフ」の背景画像が出力レベルが変更されるときには必ず取得されてもよく、背景画像は測定値の精度を保証するために同じ出力レベルで取得されたすべての後続画像から差し引かれてもよい。

単一の「オン」小区域は、対物レンズ１１８の全ＮＡの〜

の空間広がりを有するビームレットにおけるサンプル１０６に対して、励起ビームで得られる出力のせいぜい１／Ｎを供給するので、適応光学系プロセスアプローチは広ダイナミックレンジの出力で動作すべきである。このため、著しく低減された強度Ｉの大きい焦点が得られ、２光子励起の場合、信号は｜Ｉ｜^２に比例するのでピーク信号Ｓにさらに大幅な低減が生じる。改善対策は、励起光の単一ビームレットが採用されるときにレーザー出力およびピクセル積分時間を増加することと、２×ビームレジューサ２１２および１対のビーム・ステアリング・ミラー２１６を用いて「オン」小区域に励起光を集中することを含むことができる。

それにもかかわらず、励起ビームで得られる出力の大きさはやはりビーム偏向測定値の数、従って提供されうる補正の複雑さに実際の制限を課し、後瞳がＮ個の非重複小区域に分割されるとき一度にオンになるのはその１つのみである（以後、「独立マスクアプローチ」と称する）。比較的高いＮをもたらす代替的な方策（以後、「重複マスクアプローチ」と称する）は、一連の重複マスクにおける小区域の隣接するグループをオンにすることを含み、各マスクはＷＭＥ１１４の任意の単一の小区域に対応する後瞳領域よりも大きい後瞳領域のほんの一部である１／Ｍに対応し、それによって著しく強力な焦点を作り出す。ビーム偏向および位相オフセットは、前述のように各マスクに対して測定され、各小区域が固有の１組のマスクによってサンプリングされ、各小区域において固有の補正位相が得られるまで種々のマスクが適用される。

図５ａ、５ｂ、５ｃ、及び５ｄは、適応光学系補正に対する独立、重複、および段階的重複マスクアプローチの例を提供する。対物レンズ１１８の後瞳は図において大きい方形で表され、網掛けされた長方形はビーム偏向測定中に特定点においてオンにされる瞳のほんの一部を表す。図５ａ及び５ｂに示す独立マスクアプローチでは、対物レンズ１１８の後瞳は非重複領域にセグメント化される。各領域、すなわち「マスク」は、ビーム偏向測定中に個々に「オン」にされる。マスクされた各小区域における補正波面は、すべての他の区域における平面から独立した平面によって推定される。図５ａは独立したマスクアプローチを示し、ここでは、各々が全瞳領域の１／３に対応するＷＭＥ１１４に対する３つの非重複マスクがビーム偏向を独立に測定し、３つの瞳小区域の各々における収差を補正する。図５ｂは独立マスクアプローチを示し、ここでは、各々が瞳領域の１／９に対応するＷＭＥ１１４に対する９つの非重複マスクがビーム偏向を独立に測定し、９つの瞳小区域の各々における収差を補正する。

図５ｃに示す重複マスクアプローチでは、ビーム偏向測定中に個々に「オン」となるマスクは他のマスクと重複する。その結果、最終補正波面における平面小区域の全数は、マスク領域に対する瞳領域の比よりも大きい。しかしながら、これらの小区域における位相の最終値は、マスクの重複によって互いに完全に独立でないかもしれない。他方、所与のマスク領域の場合、あるいは同じことであるが、所与のレーザー出力の場合、重複マスクには、さらに多くの小区域を使用することができ、それゆえ、優れた補正が得られる場合が多い。従って、図５ｃは重複マスクアプローチを示し、ここでは、各々が瞳領域の１／３をカバーするＷＭＥ１１４に対する６つの重複マスクによって９つの異なる瞳小区域の各々に対する固有の波面推定値が得られる。

最後に、図５ｄに示す段階的な重複マスクアプローチでは、マスクは同じ寸法を有するが、マスクの寸法よりも小さい距離で隣接するマスクから離される。例えば、図５ｄに記載するパターンは、３×３および２×１の段階的な重複マスクで示され、ここで、「３×３」は各マスクの寸法（後瞳に亘るための３つの水平マスク×３つの垂直マスク）を示し、「２×１」は段階的パターン（各マスクの幅を横断するための２ステップと高さをカバーするための１ステップ）を示す。このアプローチは、位相勾配データの高密度アレイを一定間隔で測定できるので、位相復元に特によく適している。それゆえ、段階的重複アプローチでは、収差のある波面は、小区域そのものよりも小さい一連の離散ステップで小区域を移動し、各ステップでビーム偏向、したがって位相勾配を測定することによって、単一の「オン」小区域のサイズよりも小さいスケールで測定されることができる。図５ｄは段階的重複マスクアプローチを示し、ここでは、瞳領域の１／９をカバーするＷＭＥ１１４のマスクは、マスクの幅の半分に等しい水平ステップと、マスクの高さに等しい垂直ステップとで移動される。ビーム偏向は、マスクの各位置で測定される。それゆえ、図５ｄは、瞳領域の１／９に対応するマスクが１８の異なる瞳小区域の各々に固有の波面推定をもたらすように、３×３および２×１の段階的重複マスクとして示される。位相復元は、段階的重複マスクの各位置における最適な位相オフセットを決定するために使用されてもよく、各測定点を中心とする領域において収差がある波面に最適な平面を決定するために勾配データと結合されてもよい。

重複および段階的重複マスクアプローチは、例えば、後瞳のＮ＝８１小区域が後瞳の領域の１／９に対応するマスクを用いて規定されるように、さらに拡張されることができる。当然ながら、所与の数Ｎの小区域の場合、独立したマスクアプローチは、小区域間の結合が残留する重複および段階的重複マスクアプローチよりも優れている。しかしながら、所与のマスク領域の場合、あるいは同じことであるが、所与のレーザー出力の場合、重複または段階的重複マスクには、さらに多くの小区域を使用することができ、それゆえ、優れた補正が得られる場合が多い。

サンプル１０６の焦点１２０における励起ビーム光の収差の低減と、サンプルから得られる結果として生じる画像の改善とは、通常ＷＭＥ１１４の小区域数Ｎの関数として単調増加し、Ｎは対物レンズ１１８の後瞳の個々のセグメントに対応するが、Ｎのある値において分解能と信号強度の改善は限界に達する。良好な結果を実現するために必要な小区域の数Ｎは、調査中のサンプルと、最適化されているパラメータと、所望の最適化度との詳細に依存する。当然ながら、対物レンズ１１８の後瞳の個々のセグメントに対応するＷＭＥ１１４の小区域の密度は、ＷＭＥ全体で均一である必要はない。むしろ、収差がある波面の初期の低分解能マップは低い値のＮを用いて作成されてもよく、この後、微細構造を示唆する領域が高密度の小区域を用いてサンプリングされてもよい。

顕微鏡システム１００の性能に影響を与える収差は、サンプル１６０自体からと同様に、光源１０２と焦点１２０との間の光路に沿ってどこからでも由来することができる。それゆえ、これらの本質的な顕微鏡収差は、後続の実験における全測定収差のサンプルによって誘導された成分を導出しうるように特徴づけられることができる。例えば、画像は蛍光ビーズ参照物体について取得されてもよく、また画像はＷＭＥ１１４の平坦性の乏しさに大きく起因する可能性のある著しい非点収差およびコマ収差を示してもよい。しかしながら、Ｎ＝３６の独立した小区域を有する本明細書に記載する適応光学系補正と直接位相測定を適用した後、横（Ｘ−Ｙ平面）方向および軸（Ｘ−Ｚ、Ｙ−Ｚ、長軸Ｚ、および短軸−Ｚ平面）方向の両方のビーズ画像の半値全幅（ＦＷＨＭ）はそれらの回折限界値に近づきうる。

適応光学系プロセスが終了し、回折限界焦点１２０を実現するために対物レンズ１１８の後瞳における適切な角度と位相とを有する個々のビームレットを生じるＷＭＥ小区域に適用される位相が決定された後、ＷＭＥ１１４の位相パターンは、最終補正波面、モジュロ２πを表す。この波面をより直感的な形で表示するために、測定中に使用されるグローバルな位相ランプが差し引かれ、位相は、縁をカウントし位相が小区域境界を越えて連続するものと仮定することによって明らかにされる。最後に、サンプルのみによる収差を決定するために、システム収差に起因する明らかにされた波面の一部が差し引かれる。

前述のように、適応光学系は、ポイントスキャン顕微鏡検査法に使用されることに加えて、広視野顕微鏡検査法によって得られる画像の品質を向上させるためにも使用されることができる。広視野顕微鏡検査法では、サンプルの大きい区域が均一に照射され、関心区域全体が画像検出器（例えば、ＣＣＤカメラ）に同時に記録される。多くのポイントスキャン法の場合、収差の主要な影響は励起光にあり、回折限界焦点が形成されることを阻止する。前述のように、収差の主要な影響は、さらに、放射経路にあり、サンプル内の各点から放射される信号が画像検出器の回折限界点に再収束されことを阻止する。ポイントスキャン顕微鏡検査法は散乱生物組織に好ましく、広視野走査顕微鏡検査法は透明な生物サンプルに、より一般的に適用されるが、サンプルによって誘発される収差はいずれにしてもよく見られる。

例えば、図６に示すように、放射光の球面波面はサンプル６０４において点６０２から放射されることができる。波面はサンプル６０４における屈折率の不均質性によって歪められうる（すなわち、収差を生じる）。この後、収差を生じた波面を顕微鏡対物レンズ６０６によって収束させると、結果的に平面波ではなく、収差を生じた波面６０８を生じる。

ポイントスキャン顕微鏡検査法と違って、従来の広視野顕微鏡検査法はオプティカルセクショニング能力を欠いている。それゆえ、これは、通常、単一の培養細胞および極薄組織切片に使用され、この場合、収差は典型的に問題ではない。しかしながら、選択的平面照明顕微鏡検査法（「ＳＰＩＭ」）および構造化照明顕微鏡検査法（「ＳＩＭ」）などの軸方向切断能力を有する広視野法の最近の開発によって、厚いサンプルへの適用が現在では可能であり、したがって、放射光の収差の補正が現実味を帯びている。

図７は、適応光学系技術を用いて収差を補正する広視野顕微鏡システム７００の概略図である。放射光はシステム７００の焦点面７０４から放射され、この場合、焦点面はサンプル７０２内にある。対物レンズ７０６は、サンプル７０２を通過することによって収差を受ける可能性のある放射光の焦点を合わせ、１対の望遠レンズ７０８ａ、７０８ｂは収束された光を視野絞り７１０に通して放射光ビームのウエストを拡大または縮小するために使用されることができる。波面変調素子７１２によって、この後、放射光を検出器７１４に通す前に、収差がある波面に適応光学系技術が適用される。ＷＭＥ７１２によって、ポイントスキャン顕微鏡検査法に関して前述した同様の適応光学系瞳セグメンテーション技術を適用してもよく、波面の複数の異なる部分で形成された画像を回折限界の完全な広視野波面を復元するために使用できるように、焦点面７０４からの放射光ビームのビームレットの角度に個々のシフトを適用してもよい。

図８は、適応光学系技術を用いて収差を補正し、システム７００のさらなる詳細を示す広視野顕微鏡システム８００の概略図である。励起光源８０２は、移動ステージ８０８に取り付けられた対物レンズ８０６を通ってビームスプリッタ８０４からサンプル８１０に反射される励起光を提供する。放射光は、対物レンズ８０６の焦点面でサンプル８１０から放射され、対物レンズ８０６によって放射光ビームに収束され、望遠レンズシステム８１４ａ、８１４ｂに向かってミラー８１２から反射される。望遠レンズ８１４ａ、８１４ｂは、放射光ビームを視野絞り８１６に通す。前述したポイントスキャン顕微鏡検査法で使用される適応光学系と同様に、波面変調素子８１８は、放射光ビームの個々のビームレットを修正するための波面センサーおよび位相制御デバイスの両方としての機能を果たす。ＷＭＥ８１８によって変調される放射光は、放射光を画像化する検出器８２０（例えば、ＣＣＤ検出器）に向けられる。

図９Ａに示すような一実施形態では、単一のフレネル・レンズ・パターンがＷＭＥ８１８に適用されることができる。フレネル・レンズ・パターンは、この後、図９Ｂに示すように、サンプル８１０の単一画像を形成するために放射ビームを検出器８２０に収束させる。この後、図９Ｃに示すように、フレネルレンズのアレイがＷＭＥ８１８の複数の異なる小区域に適用されて、放射光波面を、複数の異なる、個々に制御可能なビームレットにセグメント化し、図９Ｄに示すように、検出器８２０の画像平面でサンプルの画像のアレイを作り出すことができる。完全な平面波放射波面の場合、画像のアレイは、完全な格子に位置することになる。しかしながら、その理想的な格子位置からの個々の画像のずれは、個々の画像を作成するために使用される波面の部分の傾斜（及び、波面のその部分に対応するビームレットの角度）を測定するために使用されることができる。それゆえ、その理想的な格子位置からの個々の画像のずれの測定は、対物レンズ８０６の後瞳全体の波面傾斜測定値のアレイを決定するために使用されてもよく、それから所望の補正波面が復元されてもよい。この補正をＷＭＥ８１８に適用し、これに図９Ａに示す単一のフレネル・レンズ・パターンを重ね合わせ、これを使用して画像全体を検出器に収束させると、サンプル８１０の回折限界画像が検出器８２０で復元される。

２光子蛍光顕微鏡検査法と同様に、サンプル８１０が視野位置に依存する収差を示さない場合、結果として得られる適応光学系補正は視野のいたるところで回折限界分解能を復元することが可能である。収差が視野に依存する場合、視野全体に対して平均化された補正が得られ、これは信号および分解能をさらに改善することが可能である。さらに、複数の異なる部分的視野内の蛍光の特徴を用いた画像シフトを解析することによって、視野に依存する収差が測定されてもよく、適切な収差パターンを各部分的視野に順次適用することによって回折限界画像が復元されてもよい。

図１０は、サンプルの画像を形成するプロセス１０００のフローチャートである。プロセス１０００では、励起光ビームがサンプル内の焦点に収束される（１００２）。そして、ビームの断面は個々のビームレットを含む。焦点が、サンプル内の複数の異なる位置で走査される（１００４）。個々のビームレットの角度は、焦点が複数の異なる位置にあるとき個々に制御される（１００６）。個々のビームレットの角度を個々に制御するステップは、個々のビームレットに対応する個々の小区域を含む波面変調素子で励起ビームを変調するステップ（１００６ａ）を含んでいてもよく、個々の小区域内で対応する個々のビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために対応するビームレットに小区域によって与えられる位相値のプロファイルを制御するステップ（１００６ｂ）を含んでいてもよい。

位相値のプロファイルは、個々のビームレットを物体に照射することによって形成される物体の位置画像のシフトを観察することによって決定されることができる。例えば、サンプル内の参照物体には、励起ビームの複数の異なるビームレットが照射されてもよく、その場合、複数の異なるビームレットは、波面変調素子の種々の対応する小区域によって変調される。参照物体からの放射光は、参照物体に複数の異なるビームレットが照射されるときに検出されてもよく、サンプル内の参照物体の位置は参照物体に複数の異なるビームレットが照射されるときに検出される放射光に基づいて決定されてもよい。決定された位置に基づいて、ビームレットが位相に空間的勾配を含むときに位置が実質的に互いに等しくなるように、対応するビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために、小区域の対応するビームレットに各小区域によって与えられる位相値のビームレット−角度−補正プロファイルについての決定がなされることができる。

個々のビームレットの相対位相は、焦点が複数の異なる位置にあるときに個々に制御される（１００８）。例えば、焦点におけるビームレット間に建設的干渉をもたらすことになる波面変調素子におけるビームレット間の相対位相は、位相値のビームレット−角度―補正プロファイルに基づいて決定されることができる。焦点から放射される放射光は、焦点が複数の異なる位置にあるときに検出される（１０１０）。焦点の複数の異なる位置から検出された放射光に基づいてサンプルの画像が作成される（１０１２）。

図１１は、サンプルの画像を形成するプロセス１１００のフローチャートである。プロセス１１００では、サンプルに励起光が照射され（１１０２）、サンプルによって放射される光は対物レンズで集められる（１１０４）。集められた光のビームは波面変調素子によって変調され、この場合、変調された光のビームの断面は個々のビームレットを含む（１１０６）。個々のビームレットが変調される角度は、波面変調素子の異なる個々の小区域によって個々に制御される（１１０８）。個々のビームレットの角度を個々に制御するステップは、個々のビームレットに対応する波面変調素子の個々の小区域内で、個々の対応するビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために、小区域によって対応するビームレットに与えられる位相値のプロファイルを制御する（１１０８ｂ）ステップを含むことができる。波面変調素子によって変調される光は画像化される（１１１０）。

ビームレットが個々の小区域によって変調される位相値のプロファイルは、波面変調素子にフレネルレンズのパターンを与えることによって決定されてもよく、その場合、複数の異なるフレネルレンズは波面変調素子の複数の異なる小区域に与えられる。サンプル内の参照物体には励起光が照射されてもよく、参照物体によって放射される光は、フレネルレンズのパターンが波面変調素子に与えられる間に集められてもよい。集められた光のビームはフレネルレンズのパターンが与えられる間に波面変調素子で変調されてもよく、この場合、変調され集められた光のビームの断面は個々のビームレットを含む。集められて変調された光は画像化されてもよく、画像化された光における参照物体の画像パターンの位置特徴は参照物体の画像の理想パターンの位置特徴と比較されてもよい。比較に基づいて、２つのパターンの差を減らすことになる位相値のプロファイルが決定されることができる。

本明細書に記載する様々な技術の実施形態は、ディジタル電子回路、またはコンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、あるいはこれらの組合せで実施されることができる。実施形態は、コンピュータプログラム製品、すなわち、情報担体において、例えば、機械で読取可能な記憶デバイスにおいて、または伝播信号において、データ処理装置、例えば、プログラマブルプロセッサ、コンピュータ、または複数のコンピュータによって実行するために、あるいはこれらの動作を制御するために、明白に具体化されるコンピュータプログラムとして実施されてもよい。前述したコンピュータプログラムなどのコンピュータプログラムは、コンパイラ型言語、インタープリタ型言語を含む任意の形のプログラミング言語で書かれることができ、スタンドアロンプログラムとして、あるいはモジュール、コンポーネント、サブルーチン、またはコンピュータ環境での使用に適した他のユニットとしてなど、任意の形で展開されることもできる。コンピュータプログラムは、１つのサイトまたは複数サイトに分散された、１台のコンピュータあるいは複数台のコンピュータで、通信ネットワークによって相互接続されて、実行されるように展開されうる。

方法のステップは、入力データで動作し出力を発生することによって機能を実施するためにコンピュータプログラムを実行する１つまたは複数のプログラマブルプロセッサによって実施されてもよい。さらに、方法のステップは、特殊目的論理回路、例えば、ＦＰＧＡ（フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ）またはＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）によって実施されてもよく、また、装置はこれらとして実現されてもよい。

コンピュータプログラムの実行に適したプロセッサは、例として、汎用および専用の両マイクロプロセッサと、あらゆる種類のディジタルコンピュータのいずれか１つまたは複数のプロセッサとを含む。一般に、プロセッサは、リード・オンリー・メモリまたはランダム・アクセス・メモリまたは両方から命令およびデータを受け取る。コンピュータの要素は、命令を実行する少なくとも１つのプロセッサと、命令およびデータを記憶する１つまたは複数のメモリデバイスを含んでいてもよい。また、一般に、コンピュータは、データを記憶する１つまたは複数の大容量記憶装置、例えば、磁気ディスク、光磁気ディスク、または光ディスクを含んでいてもよく、あるいはこれらからデータを受け取り、またはこれらにデータを転送し、またはこれらの両方を行うように動作可能に結合されてもよい。コンピュータプログラム命令およびデータを具体化するのに適した情報担体は、例として、半導体メモリデバイス、例えば、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、およびフラッシュ・メモリ・デバイス；磁気ディスク、例えば、内蔵ハードディスクまたはリムーバブルディスク；光磁気ディスク；およびＣＤ−ＲＯＭおよびＤＶＤ−ＲＯＭディスクなど、あらゆる形態の不揮発性メモリを含む。プロセッサおよびメモリは、専用論理回路によって補完されてもよく、専用論理回路に組み込まれてもよい。

ユーザーとの対話を行うために、実施形態は、表示装置、例えば、ユーザーに対して情報を表示するブラウン管（ＣＲＴ）または液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）モニタと、キーボードおよびポインティングデバイス、例えば、ユーザーがコンピュータに入力を提供することができるマウスまたはトラックボールを有するコンピュータで実施されてもよい。ユーザーとの対話を行うために他の種類のデバイスも使用されることができる。例えば、ユーザーに提供されるフィードバックは、任意の形態の感覚フィードバック、例えば、視覚フィードバック、聴覚フィードバック、または触覚フィードバックであってもよく、ユーザーからの入力は音響、音声、触覚入力などのいかなる形態で受け取られてもよい。

前述の実施形態の特定の特徴は本明細書で説明した通りであるが、ここで多くの修正形態、代替形態、変更形態、および等価物が当業者に想起されるであろう。そこで、添付の特許請求の範囲は実施形態の真の趣旨に含まれるすべての修正形態および変更形態を網羅するものであることを理解されたい。

Claims (26)

1. サンプルの画像を形成する方法であって、
   前記サンプル内の焦点に、ビームの断面が個々のビームレットを含む、光源からの励起光ビームを収束させるステップと、
   前記サンプル内の複数の異なる位置で前記焦点を走査するステップと、
   前記焦点が前記複数の異なる位置にあるときに前記個々のビームレットの角度を独立に制御して、前記焦点における前記励起光の収差を低減させるステップであって、前記個々のビームレットの角度を独立に制御するステップは、
   他のビームレットがオフの間に個々のビームレットをオンにし、前記サンプルを画像化して前記ビームレットに対する角度を決定するステップと、
   前記個々のビームレットに対応する個々の小区域を含む波面変調素子で前記励起ビームを変調するステップと、
   個々の小区域内で、前記対応する個々のビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために前記対応するビームレットに前記小区域によって与えられる位相値のプロファイルを制御するステップと、を含むステップと、
   前記焦点が前記複数の異なる位置にあるときに、前記焦点において前記個々のビームレットが互いに建設的に干渉するように、前記個々のビームレットの相対位相を独立に制御するステップと、
   前記焦点が前記複数の異なる位置にあるときに前記焦点から放射された放射光を検出するステップと、
   前記焦点の複数の異なる位置から前記検出された放射光に基づいて前記サンプルの画像を作成するステップと、
   を備える、方法。
2. 前記複数の異なる位置は前記サンプルの平面内にある、請求項１に記載の方法。
3. 前記平面は前記サンプル内の前記励起ビームの軸に非垂直である、請求項２に記載の方法。
4. 前記励起光は第１の波長を有し、前記放射光は前記第１の波長よりも小さい第２の波長を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記波面変調素子は空間光変調器を含み、前記空間光変調器の活性層から反射される光にグローバルな位相ランプを適用して、前記空間光変調器の前面から反射される光と前記活性層から反射される光との間に非ゼロ角度を誘導するステップをさらに備える、請求項１に記載の方法。
6. 前記位相値のプロファイルを決定するステップをさらに備え、前記決定するステップは、
   複数の異なる個々のビームレットが、前記波面変調素子の種々の対応する小区域によって変調され、前記サンプル内の参照物体に、前記励起ビームの複数の異なる個々のビームレットを照射するステップと、
   前記参照物体に前記複数の異なる個々のビームレットが照射されるとき前記参照物体から放射光を検出するステップと、
   前記参照物体に前記複数の異なる個々のビームレットが照射されるときに検出された前記放射光に基づいて前記サンプル内の前記参照物体の位置を決定するステップと、
   前記決定された位置に基づいて、前記対応するビームレットの位相に空間的勾配を誘導するための前記小区域の対応するビームレットに各小区域によって与えられる位相値のビームレット−角度−補正プロファイルを決定し、前記ビームレットが前記位相に前記空間的勾配を含むときに前記位置が互いに実質的に等しくなるようにするステップと、
   を含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記参照物体は蛍光ビーズである、請求項６に記載の方法。
8. 前記位相値のプロファイルを決定するステップは、
   前記位相値のビームレット−角度−補正プロファイルに基づいて、前記焦点におけるビームレット間に建設的干渉をもたらすことになる前記波面変調素子における前記ビームレット間の相対位相を決定するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記位相値のプロファイルを決定するステップをさらに備え、前記決定するステップは、
   前記波面変調素子の参照小区域によって変調される参照ビームレットを前記サンプル内の参照物体に照射するステップと、
   他の複数のビームレットが前記参照物体を照射していないときに、前記波面変調素子の異なる個々の小区域によって変調される複数の異なるビームレットを前記参照物体に連続的に照射できるようにするステップと、
   各ビームレットに対して、前記焦点における前記ビームレットと、参照ビームレットとの間に建設的干渉をもたらすことになる前記ビームレットと前記参照ビームレットの間の相対位相を誘導するために、前記ビームレットの対応する小区域によって前記ビームレットに与えられる位相値のプロファイルを決定するステップと、
   を含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記位相値のプロファイルを決定するステップをさらに備え、前記決定するステップは、
    複数のビームレットの中の、前記波面変調素子の小区域に対応する各ビームレットに対して、
    前記サンプル内の参照物体に前記ビームレットを照射し、前記複数のビームレットの他のビームレットで前記参照物体を照射しないステップと、
    前記参照物体に前記ビームレットが照射されるときで前記参照物体が前記複数のビームレットの前記他のビームレットで照射されないとき、前記サンプル内の前記参照物体から放射光を検出するステップと、
    前記検出された放射光に基づいて前記サンプル内の前記参照物体の位置を決定するステップと、
    前記決定された位置に基づいて、前記対応するビームレットの位相に空間的勾配を誘導するための前記小区域の対応するビームレットに各小区域によって与えられる位相値のビームレット−角度−補正プロファイルを決定し、前記ビームレットが前記位相で前記空間的勾配を含むとき、前記ビームレットは該ビームレットが前記位相で前記空間的勾配を含まないときに形成される焦点よりも小さいサイズを有するサンプル内の焦点で交わるようにするステップと、
    を含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記位相値のプロファイルを決定するステップは、
    前記位相値のビームレット−角度−補正プロファイルに基づいて、前記焦点における前記ビームレット間に建設的干渉をもたらすことになる前記波面変調素子でのビームレット間の相対位相を決定するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 励起光を放射するように構成された光源と、
    サンプル内の焦点にその断面が個々のビームレットを含む励起光ビームを収束させるように構成された収束素子と、
    前記サンプル内の複数の異なる位置で前記焦点を走査するように構成された走査素子と、
    前記励起光を変調し、前記個々のビームレットの角度および相対位相を独立に制御して、前記焦点が複数の異なる位置にあるときに前記焦点における前記励起光の収差を低減させるように構成された波面変調素子であって、前記角度の制御は他のビームレットがオフの間に個々のビームレットをオンにして前記サンプルを画像化して前記ビームレットに対する角度を決定することを含んでおり、前記個々のビームレットの相対位相を制御して前記焦点において前記個々のビームレットが互いに建設的に干渉するように構成されており、前記波面変調素子は、前記個々のビームレットに対応する前記波面変調素子の個々の小区域内で、前記個々の対応するビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために前記対応するビームレットに前記小区域によって与えられる位相値のプロファイルを制御することによって、前記個々のビームレットの角度を制御するように構成されている、波面変調素子と、
    前記焦点が複数の異なる位置にあるときに前記焦点から放射された放射光を検出するように構成された検出器と、
    前記焦点の複数の異なる位置からの前記検出された放射光に基づいて前記サンプルの画像を作成するように構成されたプロセッサと、
    を備える、顕微鏡システム。
13. 前記複数の異なる位置は前記サンプルの平面内にある、請求項１２に記載の顕微鏡システム。
14. 前記平面は前記サンプル内の前記励起ビームの軸に非垂直である、請求項１２に記載の顕微鏡システム。
15. 前記励起光は第１の波長を有し、前記放射光は前記第１の波長よりも小さい第２の波長を有する、請求項１２に記載の顕微鏡システム。
16. 前記波面変調素子は空間光変調器を含み、前記空間光変調器の前面から反射された光と活性層から反射された光との間に非ゼロ角度を誘導するために、前記空間光変調器の前記活性層から反射された光にグローバルな位相ランプを適用するように構成された、請求項１２に記載の顕微鏡システム。
17. 前記波面変調素子は前記サンプルに達しない方向に個々のビームレットの方向を変調して前記サンプル内の参照物体に前記励起ビームの残りの異なる個々のビームレットが照射されうるように、さらに構成され、前記複数の異なるビームレットが前記波面変調素子の種々の対応する小区域によって変調され、さらに、前記参照物体に前記複数の異なる残りのビームレットが照射されるときに前記サンプル内の前記参照物体からの放射光が検出されうるようになっており、前記顕微鏡システムは、
    前記参照物体が前記サンプルに到達しない前記個々のビームレットによって照射されないときで、前記参照物体に前記複数の異なる残りのビームレットが照射されるときに検出された前記放射光に基づいて前記サンプル内の参照物体の位置を決定するステップと、
    前記決定された位置に基づいて、前記位置が実質的に互いに等しくなるように、前記対応するビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために前記小区域の対応するビームレットに各小区域によって与えられる位相値のビームレット−角度−補正プロファイルを決定するステップと、
    によって、前記位相値のプロファイルを決定するように構成された１つまたは複数のプロセッサをさらに備える、請求項１２に記載の顕微鏡システム。
18. 前記波面変調素子と前記サンプルの間の前記励起ビームの経路に沿って位置し、前記サンプルに達しない方向に変調される励起光のビームレットを阻止するように構成される視野絞りをさらに備える、請求項１７に記載の顕微鏡システム。
19. 前記位相値のプロファイルを決定するステップは、前記位相値のビームレット−角度−補正プロファイルに基づいて、前記焦点におけるビームレット間に建設的干渉をもたらすことになる前記波面変調素子におけるビームレット間の相対位相を決定するステップをさらに含む、請求項１７に記載の顕微鏡システム。
20. 前記波面変調素子は前記サンプルに達しない方向に個々のビームレットの方向を変調して前記サンプル内の参照物体に前記励起ビームの残りの異なる個々のビームレットが照射されるように、さらに構成され、前記複数の異なるビームレットが前記波面変調素子の種々の対応する小区域によって変調され、さらに、前記参照物体に複数の異なるビームレットが照射されるときに前記サンプル内の前記参照物体からの放射光が検出されるように、前記顕微鏡システムは、
    各々の異なる個々のビームレットに対して、前記個々のビームレットと前記参照ビームレットの間の焦点に建設的干渉をもたらすことになる前記ビームレットと前記参照ビームレットの間に相対位相を誘導するために、前記ビームレットの対応する小区域によって前記ビームレットに与えられる位相値のプロファイルを決定するステップによって、
    前記位相値のプロファイルを決定するように構成された１つまたは複数のプロセッサをさらに備える、請求項１７に記載の顕微鏡システム。
21. サンプルの画像を形成する方法であって、
    サンプルに励起光を照射するステップと、
    前記サンプルによって放射される光を対物レンズの焦点面で集めるステップと、
    この集められた光を検出器上で画像化するステップと、
    波面変調素子によって前記集められた光のビームを変調するステップであって、その変調された光のビームの断面が個々のビームレットを含んでおり、各ビームレットは前記焦点面から前記波面変調素子までの経路により定まる量だけ収差を受けている、ステップと、
    前記個々のビームレットが前記波面変調素子の異なる個々の小区域によって反射される角度を独立に制御するステップであって、あるビームレットが反射される角度は、前記焦点面におけるそのビームレットの収差を補償して、前記集められた光のビームは前記検出器上に平面波として画像化されるように制御され、前記個々のビームレットの角度を独立に制御するステップは、
    他のビームレットがオフになっている間に個々のビームレットをオンにし、前記サンプルを画像化して前記ビームレットに対する角度を決定するステップと、
    前記個々のビームレットに対応する前記波面変調素子の個々の小区域内で、
    前記個々の対応するビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために、前記対応するビームレットに前記小区域によって与えられる位相値のプロファイルを制御するステップを含む、ステップと、
    前記波面変調素子によって変調される前記光を画像化するステップと、
    を備える、方法。
22. 前記波面変調素子は、空間光変調器を含み、前記空間光変調器の活性層から反射される光にグローバルな位相ランプを適用して、前記空間光変調器の前面から反射される光と前記活性層から反射される光との間に非ゼロ角度を誘導するためのステップをさらに備える、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ビームレットが前記個々の小区域によって変調される位相値のプロファイルを決定するステップをさらに備え、前記決定するステップは、
    フレネルレンズのパターンを前記波面変調素子に与え、その際に複数の異なるフレネルレンズが前記波面変調素子の複数の異なる小区域に与えられるステップと、
    前記サンプル内の参照物体に励起光を照射するステップと、
    前記フレネルレンズのパターンが前記波面変調素子に与えられている状態で前記参照物体によって放射される光を集めるステップと、
    変調され集められた光のビームの断面が個々のビームレットを含んでおり、前記フレネルレンズのパターンが与えられている状態で前記波面変調素子で前記集められた光のビームを変調するステップと、
    前記集められ変調された光を画像化するステップと、
    前記画像化された光で前記参照物体の画像パターンの位置の特徴を前記参照物体の画像の理想パターンの位置の特徴と比較するステップと、
    前記比較に基づいて、前記２つのパターンの間の差異を減らすことになる位相値のプロファイルを決定するステップと、
    を含む、請求項２１に記載の方法。
24. サンプルを照射するように構成された励起光の光源と、
    光を画像化するように構成された検出器と、
    集光光学系の焦点面における前記サンプルによって放射される光を集めるように、且つ、前記検出器上に集められた光を画像化するように構成された前記集光光学系と、
    前記集められた光のビームを変調するように構成された波面変調素子であって、反射光のビームの断面が個々のビームレットを含み、各ビームレットは前記焦点面から前記波面変調素子までの経路により定まる量だけ収差を受けており、前記波面変調素子は、個々のビームレットが前記波面変調素子の異なる個々の小区域から反射される角度を独立に制御するように構成されており、あるビームレットが反射される角度は、そのビームレットの収差を補償して、前記集められた光のビームは前記検出器上に平面波として画像化されるように制御される波面変調素子とを備え、前記個々のビームレットの角度を前記波面変調素子による独立の制御は、
    他のビームレットがオフになっている間に個々のビームレットをオンにし、前記サンプルを画像化して前記ビームレットに対する角度を決定するステップと、
    前記個々のビームレットに対応する前記波面変調素子の個々の小区域内で、前記個々の対応するビームレットの位相に空間的勾配を誘導するために、前記対応するビームレットに前記小区域によって与えられる位相値のプロファイルを制御するステップと、
    を含む、顕微鏡システム。
25. 前記波面変調素子は空間光変調器を含み、前記空間光変調器の前面から反射された光と活性層から反射された光との間に非ゼロ角度を誘導するために、前記空間光変調器の活性層から反射された光にグローバルな位相ランプを適用するように構成される、請求項２４に記載の顕微鏡システム。
26. 前記小区域によって与えられる位相値のプロファイルを決定するように構成された１つまたは複数のプロセッサをさらに備えており、前記決定するステップは、
    フレネルレンズのパターンを前記波面変調素子に与え、その際に複数の異なるフレネルレンズが前記波面変調素子の複数の異なる小区域に与えられるステップと、
    前記サンプル内の参照物体に励起光を照射するステップと、
    フレネルレンズの前記パターンが前記波面変調素子に与えられている状態で前記参照物体によって放射される光を集めるステップと、
    変調され集められた光のビームの断面が個々のビームレットを含んでおり、フレネルレンズの前記パターンが与えられている状態で前記波面変調素子で前記集められた光のビームを変調するステップと、
    前記集められ変調された光を画像化するステップと、
    前記画像化された光で前記参照物体の画像のパターンの位置の特徴を前記参照物体の画像の理想パターンの位置の特徴と比較するステップと、
    前記比較に基づいて、前記２つのパターンの間の差異を減らすことになる位相値のプロファイルを決定するステップと、
    を含む、請求項２４に記載の顕微鏡システム。

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