JP5771833B2

JP5771833B2 - 核酸、核酸によりコードされるタンパク質、核酸が導入された組換え生物、及び組換え生物により作られるタンパク質

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Publication number: JP5771833B2
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Inventors: 天福趙; 玉軍王; 雅雄中垣
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Filing date: 2010-09-10
Publication date: 2015-09-02
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Description

本発明は、核酸、核酸によりコードされるタンパク質、核酸が導入された組換え生物、及び組換え生物により作られるタンパク質に関する。

クモの糸は、強度と弾性の組み合わせにより優れた強靭性を有する天然の高性能ポリマーとして知られている。クモには最大７つの特化した腺が存在し、これらは性質の異なる多種類のクモ糸を産生するが、中でも、大瓶状腺により産生される牽引糸は、最も強靭なクモ糸として、医療、航空、衣料等の様々な産業分野における新素材の開発において注目されている。

牽引糸を構成する主要タンパク質として、大瓶状腺スピドロイン（ＭａｊｏｒＡｍｐｕｌｌａｔｅＳｐｉｄｒｏｉｎ：ＭａＳｐ）と称されるタンパク質が知られており、これまでに、クロゴケグモ（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓｈｅｓｐｅｒｕｓ）、ハイイロゴケグモ（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ）、北米ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）等、種々のクモのＭａＳｐタンパク質をコードする遺伝子配列が明らかにされている（非特許文献１、２等）。

ＮａｄｉａＡ．Ａｙｏｕｂｅｔａｌ．，ＢｌｕｅｐｒｉｎｔｆｏｒａＨｉｇｈ−ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌ：Ｆｕｌｌ−ＬｅｎｇｔｈＳｐｉｄｅｒＤｒａｇｌｉｎｅＳｉｌｋＧｅｎｅｓ，２００７，Ｉｓｓｕｅ６，ｅ５１４ＷｉｌｌｉａｍＡ．ＧａｉｎｅｓＩＶｅｔａｌ．，ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＭｕｌｔｉｐｌｅＳｐｉｄｒｏｉｎ１ＧｅｎｅｓＥｎｃｏｄｉｎｇＭａｊｏｒＡｍｐｕｌｌａｔｅＳｉｌｋＰｒｏｔｅｉｎｓｉｎＮｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ，ＩｎｓｅｃｔＭｏｌＢｉｏｌ，２００８，１７（５），４６５−４７４

しかし、各産業分野において、優れた物性を有する天然繊維に対する需要は高まる一方であり、更なる新素材の開発が期待されている。

そこで本発明は、天然繊維において、優れた物性を有する新素材を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、オオジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｐｉｌｌｉｐｅｓ）の牽引糸を構成するＭａＳｐタンパク質をコードする遺伝子が、従来知られているＭａＳｐ遺伝子とは異なる独特の構造を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの核酸に関する。
（ａ）配列番号１又は１９の塩基配列を有する核酸
（ｂ）配列番号２又は２０のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｃ）上記（ａ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸
（ｄ）上記（ａ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸

また、本発明は、以下の（ｅ）〜（ｈ）のいずれかの核酸を含み、配列番号１の塩基配列を有する核酸と７０％以上、好ましくは８０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸に関する。
（ｅ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列を有する核酸
（ｆ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｇ）上記（ｅ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有する核酸
（ｈ）上記（ｅ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸

また、本発明は、以下の（ｉ）〜（ｌ）のいずれかの核酸を含み、配列番号１９の塩基配列を有する核酸と７０％以上、好ましくは８０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸に関する。
（ｉ）配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５の塩基配列を有する核酸
（ｊ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｋ）上記（ｉ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有する核酸
（ｌ）上記（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸

また、本発明は、上記核酸によりコードされるタンパク質に関する。

上記本発明に係る特定の核酸によれば、従来のＭａＳｐタンパク質とは異なる優れた物性を有するＭａＳｐタンパク質（牽引糸タンパク質）がコードされ、天然繊維における新素材を提供することが可能となる。特に、本発明の核酸によりコードされる牽引糸タンパク質（本発明に係るタンパク質）は、従来のものよりも優れた弾性（又は弾力性、伸縮性、伸度、柔軟性）を有し、医療用品、衣料品等をはじめ、様々な産業分野において、弾性が必要とされる用途に好適に用いられる。

さらに、本発明は、上記核酸が導入された組換え生物、及びその組換え生物により作られるタンパク質に関する。本発明の組換え生物によれば、上記核酸によりコードされる物性の優れた牽引糸タンパク質の大量生産が可能となる。上記組換え生物により作られるタンパク質は、物性の優れた牽引糸タンパク質を含むことにより、様々な産業分野で好適に用いられる。

特に、本発明は、上記核酸が導入された組換えカイコ、及びその組換えカイコにより作られる絹糸に関する。本発明の組換えカイコによれば、上記核酸によりコードされる物性の優れた牽引糸タンパク質を含む絹糸の大量生産が可能となる。上記組換えカイコにより作られる絹糸は、物性の優れた牽引糸タンパク質を含むことにより、従来の絹糸よりも優れた物性、特に、優れた弾性を有するものとなる。

また、本発明は、以下の（ｍ）又は（ｎ）のアミノ酸配列を有する、牽引糸タンパク質に関する。
（ｍ）配列番号２又は２０のアミノ酸配列
（ｎ）上記（ｍ）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列

また、本発明は、以下の（ｏ）又は（ｐ）のアミノ酸配列を有する、牽引糸タンパク質に関する。
（ｏ）以下の（ｏ−１）又は（ｏ−２）のアミノ酸配列を有し、配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｏ−１）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８のアミノ酸配列
（ｏ−２）上記（ｏ−１）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｐ）以下の（ｐ−１）又は（ｐ−２）のアミノ酸配列を有し、配列番号２０のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｐ−１）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６のアミノ酸配列
（ｐ−２）上記（ｐ−１）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列

さらに、本発明は、以下の一般式（１）で表されるアミノ酸配列、又は上記アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。
［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−（Ｘ４）ｍ−（Ｘ５）ｍ−（Ｘ６）ｍ−Ｘ７−Ｘ８］ｎ（１）

上記一般式（１）中、ｍはそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、ｎは１〜１０の整数を示し、Ｘ１は配列番号３７〜４５のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ２は配列番号４６〜５２のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ３は配列番号５３〜５９のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ４は配列番号４９のアミノ酸配列を示し、Ｘ５は配列番号６０又は６１のアミノ酸配列を示し、Ｘ６は配列番号６２〜６４のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ７は配列番号６５〜７０のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ８は配列番号７１〜８１のいずれかのアミノ酸配列を示す。

上記本発明に係るタンパク質は、その独特の構造により、従来の牽引糸タンパク質よりも優れた物性を有するため、様々な産業分野において好適に用いられる。

本発明の核酸によれば、優れた物性を有するタンパク質が提供される。また、本発明の組換え生物によれば、優れた物性を有するタンパク質が大量生産できる。特に、本発明の組換えカイコによれば、優れた物性を有する絹糸が大量生産できる。本発明により提供される牽引糸タンパク質又は絹糸は、特に、優れた弾性を有するものとなる。このように、本発明によれば、天然繊維において、弾性等の物性に優れた新素材を提供することが可能となる。

ＮＰ−牽引糸タンパク質ＡのｃＤＮＡ配列を示す図である。ＮＰ−牽引糸タンパク質Ａのアミノ酸配列を示す図である。ノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真図である。ＮＰ−牽引糸タンパク質ＢのｃＤＮＡ配列を示す図である。ＮＰ−牽引糸タンパク質Ｂのアミノ酸配列を示す図である。

以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの核酸に関する。
（ａ）配列番号１又は１９の塩基配列を有する核酸
（ｂ）配列番号２又は２０のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｃ）上記（ａ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸
（ｄ）上記（ａ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸

まず、本発明は、配列番号１又は１９の塩基配列を有する核酸（ａ）に関する。配列番号１又は１９の塩基配列は、いずれも、ジョロウグモ属オオジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｐｉｌｉｐｅｓ）の牽引糸を構成するタンパク質の主要成分である大瓶状腺スピドロイン（ＭａｊｏｒＡｍｐｕｌｌａｔｅＳｐｉｄｒｏｉｎ：ＭａＳｐ）と称されるタンパク質（ポリペプチド）をコードする遺伝子である。本明細書では、配列番号１の塩基配列を有する核酸によりコードされるタンパク質を、「Ｎｐ−牽引糸タンパク質Ａ」と称し、配列番号１９の塩基配列を有する核酸によりコードされるタンパク質を、「Ｎｐ−牽引糸タンパク質Ｂ」と称する。これらの核酸（ａ）は、オオジョロウグモから取得したものであることを要さず、配列番号１又は１９の塩基配列を有するものであれば、人工合成やゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから取得したものでもよく、これらをＰＣＲで増幅したものや制限酵素で切り出したものであってもよい。

本発明の核酸は、配列番号２又は２０のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸（ｂ）であってもよい。配列番号２又は２０のアミノ酸配列は、いずれも、オオジョロウグモのＭａＳｐタンパク質が有するアミノ酸配列である。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列は、上記Ｎｐ−牽引糸タンパク質Ａが有するアミノ酸配列であり、配列番号２０のアミノ酸配列は、上記Ｎｐ−牽引糸タンパク質Ｂが有するアミノ酸配列である。

また、本発明の核酸は、牽引糸タンパク質（ＭａＳｐ）をコードするものであれば、配列番号１又は１９の塩基配列を有する核酸と９０％以上の配列同一性を有する核酸（ｃ）であってもよい。上記配列同一性は９０％以上であればよいが、９３％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることが更に好ましい。

さらに、本発明の核酸は、牽引糸タンパク質をコードするものであれば、配列番号１又は１９の塩基配列を有する核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（ｄ）であってもよい。本明細書において、核酸の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。また、「ハイブリダイズ」とは、上記相補鎖間で起こる相補的結合、又は一本鎖核酸分子間の塩基対相互作用の形成を意味する。

本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔ_ｍ）より約５℃低く選択される。Ｔ_ｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓＩｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＡｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＷｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓＰａｒｔＩ、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｐｒｏｂｅａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）に見出される。

代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０ＭＮａ^＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ^＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。

また、本発明の核酸は、以下の（ｅ）〜（ｈ）のいずれかの核酸を含み、牽引糸タンパク質をコードするものであれば、配列番号１の塩基配列を有する核酸と７０％以上の配列同一性を有する核酸であってもよい。上記配列同一性は７０％以上であればよいが、７５％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、８５％以上であることが更に好ましく、８８％以上であることが特に好ましい。
（ｅ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列を有する核酸
（ｆ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｇ）上記（ｅ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有する核酸
（ｈ）上記（ｅ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸

上記配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列は、配列番号１の塩基配列のうち、本発明の優れた物性を有する牽引糸タンパク質をコードする上で重要な特徴を有する配列である。このような特徴的配列を有する核酸を含むことによって、配列番号１の塩基配列を有する核酸と７０％以上の配列同一性しか有しない核酸であっても、配列番号１の塩基配列を有する核酸と同様に、本発明の優れた物性を有する牽引糸タンパク質をコードすることが可能となる。

配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８のアミノ酸配列を有するタンパク質は、それぞれ、上記配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列によりコードされるタンパク質である。

上記核酸（ｇ）において、核酸（ｅ）との配列同一性は９０％以上であればよいが、９３％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることが更に好ましい。

また、本発明の核酸は、以下の（ｉ）〜（ｌ）のいずれかの核酸を含み、牽引糸タンパク質をコードするものであれば、配列番号１９の塩基配列を有する核酸と７０％以上の配列同一性を有する核酸であってもよい。上記配列同一性は７０％以上であればよいが、７５％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、８５％以上であることが更に好ましく、８８％以上であることが特に好ましい。
（ｉ）配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５の塩基配列を有する核酸
（ｊ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｋ）上記（ｉ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有する核酸
（ｌ）上記（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸

上記配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５の塩基配列は、配列番号１９の塩基配列のうち、本発明の優れた物性を有する牽引糸タンパク質をコードする上で重要な特徴を有する配列である。このような特徴的配列を有する核酸を含むことによって、配列番号１９の塩基配列を有する核酸と７０％以上の配列同一性しか有しない核酸であっても、配列番号１９の塩基配列を有する核酸と同様に、本発明の優れた物性を有する牽引糸タンパク質をコードすることが可能となる。

配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６のアミノ酸配列を有するタンパク質は、それぞれ、上記配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５の塩基配列によりコードされるタンパク質である。

上記核酸（ｋ）において、核酸（ｉ）との配列同一性は９０％以上であればよいが、９３％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることが更に好ましい。

また、本発明は、上記本発明の核酸が導入された組換え生物及びその組換え生物により作られるタンパク質に関する。特に、本発明は、上記本発明の核酸が導入された組換えカイコ及びその組換えカイコにより作られる絹糸に関する。

本明細書において、「組換え生物」とは、遺伝子組換えにより外来遺伝子が染色体に導入され、形質転換された生物を示す。形質転換される対象となる被組換え生物としては、特に制限はなく、昆虫、動物、植物、微生物等を用いることができるが、昆虫を用いることが好ましい。好適な昆虫としては、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（てんさん）（Ａｎｔｈｅｒａｅａｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（さくさん）（Ａｎｔｈｅｒａｅａｐｅｒｎｙｉ）等が挙げられる。なかでも、カイコガ科に属するカイコ、クワコ等が好適に用いられ、特に、カイコを用いることが好ましい。

本明細書において、「カイコ」とは、カイコガ属カイコ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）をいう。カイコは、実験用の品種であっても、実用商品化された実用品種であってもよい。また、「組換えカイコ」とは、遺伝子組換えにより外来遺伝子がカイコ染色体に導入され、形質転換されたカイコを示す。遺伝子組み換えは、例えば、トランスポゾンを用いる方法により行うが、外来遺伝子をカイコに導入できる方法であれば制限はなく、エレクトロポレーション等の他の方法によって遺伝子組み換えを行ってもよい。

本明細書において、「絹糸」とは、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）により吐糸される繊維であり、繭を構成し、フィブロインタンパク質を主成分とするものである。フィブロインタンパク質は、大小２つのサブユニット（Ｈ鎖及びＬ鎖）からなる。

本明細書において、「オオジョロウグモ」とは、ジョロウグモ属オオジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｐｉｌｉｐｅｓ）をいい、オオジョロウグモの産地は特に限定されない。

上記アミノ酸配列（ｎ）において、上記（ｍ）のアミノ酸配列との配列同一性は９０％以上であればよいが、９３％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることが更に好ましい。

また、本発明は、以下の（ｏ）又は（ｐ）のアミノ酸配列を有する、牽引糸タンパク質に関する。
（ｏ）以下の（ｏ−１）又は（ｏ−２）のアミノ酸配列を有し、配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｏ−１）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８のアミノ酸配列
（ｏ−２）上記（ｏ−１）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｐ）以下の（ｐ−１）又は（ｐ−２）のアミノ酸配列を有し、配列番号２０のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｐ−１）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６のアミノ酸配列
（ｐ−２）上記（ｐ−１）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列

上記アミノ酸配列（ｏ）において、配列番号２のアミノ酸配列との配列同一性は７０％以上であればよいが、７５％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、８５％以上であることが更に好ましく、８８％以上であることが特に好ましい。

同様に上記アミノ酸配列（ｐ）において、配列番号２０のアミノ酸配列との配列同一性は７０％以上であればよいが、７５％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、８５％以上であることが更に好ましく、８８％以上であることが特に好ましい。

また、上記アミノ酸配列（ｏ−２）において、上記（ｏ−１）のアミノ酸配列との配列同一性は９０％以上であればよいが、９３％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることが更に好ましい。

同様に、上記アミノ酸配列（ｐ−２）において、上記（ｐ−１）のアミノ酸配列との配列同一性は９０％以上であればよいが、９３％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることが更に好ましい。

さらに、本発明は、以下の一般式（１）で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。
［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−（Ｘ４）ｍ−（Ｘ５）ｍ−（Ｘ６）ｍ−Ｘ７−Ｘ８］ｎ（１）

上記一般式（１）で表されるアミノ酸配列は、［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−（Ｘ４）ｍ−（Ｘ５）ｍ−（Ｘ６）ｍ−Ｘ７−Ｘ８］で表される繰り返し単位をｎ個有する。繰り返し単位の数（ｎ）は特に制限されないが、１〜１０であることが好ましく、２〜９であることがより好ましく、３〜８であることが更に好ましく、特にｎ＝８であることが好ましい。

式（１）中、ｍはそれぞれ独立に０又は１の整数を示す。すなわち、繰り返し単位ごとに、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６で表されるアミノ酸配列を有する場合と、有しない場合とがある。

式（１）中、Ｘ１は配列番号３７〜４５のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ２は配列番号４６〜５２のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ３は配列番号５３〜５９のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ４は配列番号４９のアミノ酸配列を示し、Ｘ５は配列番号６０又は６１のアミノ酸配列を示し、Ｘ６は配列番号６２〜６４のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ７は配列番号６５〜７０のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ８は配列番号７１〜８１のいずれかのアミノ酸配列を示す。

また、本発明に係るタンパク質は、上記一般式（１）で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。上記配列同一性は、９０％以上であればよいが、９３％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることが更に好ましい。

図１は、オオジョロウグモのＭａＳｐタンパク質の１種であるＮＰ−牽引糸タンパク質ＡのｃＤＮＡ配列を示す図である。図１に示す遺伝子配列は、配列番号１の塩基配列と同じである。

図２は、図１に示す遺伝子配列（配列番号１の塩基配列）を有する核酸によりコードされるＮＰ−牽引糸タンパク質Ａのアミノ酸配列を示す図である。図２に示すアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列と同じである。

また、図４は、オオジョロウグモのＭａＳｐタンパク質のほかの１種であるＮＰ−牽引糸タンパク質ＢのｃＤＮＡ配列を示す図である。図４に示す遺伝子配列は、配列番号１９の塩基配列と同じである。

図５は、図４に示す遺伝子配列（配列番号１９の塩基配列）を有する核酸によりコードされるＮＰ−牽引糸タンパク質Ｂのアミノ酸配列を示す図である。図５に示すアミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸配列と同じである。

図２又は図５に示すように、配列番号１又は１９の塩基配列を有する核酸によりコードされる牽引糸タンパク質は、下記一般式（２）によって表されるアミノ酸配列からなる。
［（α）（Ｖ）（β）］ｑ（２）

上記一般式（２）で表されるアミノ酸配列は、［（α）（Ｖ）（β）］で表される繰り返し単位をｑ個有する。繰り返し単位の数（ｑ）は特に制限されず、１〜１００であればよいが、１〜１０であることが好ましく、２〜９であることがより好ましく、３〜８であることが更に好ましく、特にｑ＝８であることが好ましい。

上記式（２）において、（α）は、２〜４個のＧＧＸを連続的に有するグリシンリッチな配列からなり、非結晶性α−ヘリックス構造を形成する無定型領域を示す。（Ｖ）は、ＧＸ含有率の高い準結晶領域を示し、（β）は、アラニン又はトレオニンを豊富に含み、βプリーツシートを形成する結晶領域を示す。

上記（α）及び（Ｖ）に含まれるＸは、グルタミン、アラニン、セリン、ロイシン、プロリン、チロシン等である場合が多いが、これらに限定されず、ほかのアミノ酸であってもよい。また、Ｘは同一のアミノ酸である必要はない。

以下、図２又は図５に示す牽引糸タンパク質が有する独特な分子構造と、それによって得られる牽引糸タンパク質の物性について説明する。

まず、図２又は図５に示す牽引糸タンパク質の（α）領域（非結晶性無定型領域）においては、４個のＧＧＸが連続して配列している。このような配列により、牽引糸はα−ヘリックス構造を形成する。α−ヘリックス構造は、通常、繊維中で曲がった状態で存在するが、引っ張られることによって繊維軸に沿って直鎖状構造に変わる。このように、外部からの応力に対してα−ヘリックス構造が大幅に伸展することにより、繊維に弾性が付与される。一方、従来公知のクモ牽引糸タンパク質（ＭａＳｐ）には、４個のＧＧＸが連続して配列する構造は見られない（非特許文献１、２等参照）。以上のことから、（α）領域において４個のＧＧＸが連続して配列する独自構造を形成することによって、本発明によって得られる牽引糸タンパク質は、弾性（又は弾力性、伸縮性、伸度、柔軟性）が優れたものになると考えられる。

なお、ＧＧＸ繰り返しモチーフが糸に弾性を付与することは、以下の文献にも記載されている。
・ＣｈｅｒｙｌＹ．Ｈａｙａｓｈｉｅｔａｌ．，ＥｖｉｄｅｎｃｅｆｒｏｍＦｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍＳｉｌｋｃＤＮＡｆｏｒｔｈｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢａｓｉｓｏｆＥｌａｓｔｉｃｉｔｙａｎｄＭｏｄｕｌａｒＮａｔｕｒｅｏｆＳｐｉｄｅｒＳｉｌｋｓ，１９９８，ｐ．７７９
・ＴｈｏｍａｓＳｃｈｅｉｂｅｌ，Ｓｐｉｄｅｒｓｉｌｋｓ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｓｐｉｎｎｉｎｇ，ａｎｄｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ，２００４，ｐ．２

また、図２又は図５に示す牽引糸タンパク質の（Ｖ）領域（準結晶領域）には、親水性アミノ酸が豊富に含まれている。表１に示すように、図２又は図５に示す牽引糸タンパク質は、従来公知の北米ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）や日本産ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖａｔａ）と比べて親水性アミノ酸を多く含む。これにより、本発明によって得られる牽引糸タンパク質は、吸湿性が高いものになると考えられる。また、牽引糸タンパク質の結晶化度が低いことも、吸湿性を増加させる要因になっていると考えられる。

さらに、図２又は図５に示す牽引糸タンパク質の（β）領域（結晶領域）には、ポリアラニンの合間に、トレオニン、アスパラギンなどの極性アミノ酸が含まれている。本発明によって得られる牽引糸タンパク質は、このように極性アミノ酸が豊富なポリアラニン（Ｐｏｌｙ（Ａ））モチーフを有することによって、優れた強靭性を有するものになると考えられる。

なお、極性アミノ酸が豊富なポリアラニン（Ｐｏｌｙ（Ａ））モチーフが糸に強靭性を付与することは、以下の文献にも記載されている。
・ＧｌａｒｅｈＡｓｋａｒｉｅｈｅｔａｌ．，Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｓｐｉｄｅｒｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎｓｉｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｂｙａｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｌａｙ，２０１０，ｖｏｌ．４６５，ｐ．１
・Ｊ．Ｍ．ＧＯＳＬＩＮＥ，ｅｔａｌ．，ＴＨＥＭＥＣＨＡＮＩＣＡＬＤＥＳＩＧＮＯＦＳＰＩＤＥＲＳＩＬＫＳ：ＦＲＯＭＦＩＢＲＯＩＮＳＥＱＵＥＮＣＥＴＯＭＥＣＨＡＮＩＣＡＬＦＵＮＣＴＩＯＮ，１９９９，ｐ．３２９９

また、表１に示すように、図２又は図５に示す牽引糸タンパク質は、従来公知の北米ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）や日本産ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖａｔａ）に対して、約２倍の極性アミノ酸を含む。このように分子内に大量に存在する極性アミノ酸残基は、外部からの応力に対して、分子を応力の方向に沿って規則的に配列し、分子間の作用力を大きくすることによって、牽引糸を優れた強度を有するものとする。特に、分子間の水素結合が、糸繊維の強度増加に役立っていると考えられる。

表１に、オオジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｐｉｌｉｐｅｓ）、北米ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）、日本産ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖａｔａ）のＭａＳｐタンパク質における極性アミノ酸及び親水性アミノ酸の含有率（％）を示す。なお、極性アミノ酸の含有率は、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）及びＹ（Ｔｙｒ）の含有率を示し、親水性アミノ酸の含有率は、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｓ（Ｓｅｒ）及びＴ（Ｔｈｒ）の含有率を示す。

以下、実施例を挙げて本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

供試動物としては、７月に採集したオオジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｐｉｌｉｐｅｓ）の雌成虫を用いた。

（ＲＮＡ抽出）
ＴｏｔａｌＲＮＡは、オオジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｐｉｌｉｐｅｓ）の大瓶状腺から準備した。生理食塩水（ＮａＣｌ０．７５％）中でクモの大瓶状腺を解剖し、１ｍｌのＴＲＩＺＯＬを添加し、よく砕いた。懸濁液は２００μｌのクロロホルムで分離し除去した。水層を別のチューブに移し、同量のイソプロパノールを加えＲＮＡを沈殿させた。沈殿物を７５％エタノールでリンスし、−８０℃で保存した。その後、７５００ｒｐｍ、４℃にて５分間遠心分離し、８分間真空乾燥したのち、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅｗａｔｅｒに溶解した。５５℃で１０分間ＲＮＡを溶解した後、サンプルとして使用した。サンプルをアガロース電気泳動することにより、ＲＮＡが抽出できたことを確認した。

（ｃＤＮＡライブラリーの構築）
Ｇ−キャッピング法による大瓶状腺のｃＤＮＡライブラリーの合成と構築は、タカラバイオ株式会社に委託した。ライブラリーベクター（ｐＤＮＲ−ＬＩＢ）は約５０μｌのＴＥに溶解した。

（クローニングとシークエンス）
高い確率で形質転換を行うため、エレクトロポレーション法を用いた。ＤＮＡ溶液としては、準備されたｃＤＮＡライブラリー溶液を用い、コンピテントセルとしては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製「ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ^ＴＭＤＨ１２Ｓ^ＴＭＣｅｌｌｓ」（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８３１２−０１７）を用い、キュベットとしては０．１ｃｍサイズのものを用いた。

まず、キュベットを予め氷上で冷やしておき、コンピテントセル（＞１０^１０ｃｆｕ／μｇ）５０μｌを氷上で融かした後、１μｌのｃＤＮＡライブラリー溶液をチューブに添加した。この混合液をキュベットの底に一様になるように移した。エレクロポレーションの条件は、電圧２．５ｋＶ、パルスコントローラー（Ｒ_２−７）２００Ω、キャパシタンス２５μＦとした。パルスを一回かけ、可能な限り素早く１ｍｌのＳＯＣ培地（２％Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％Ｂａｃｔｏｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，１０ｍＭＮａＣｌ，２．５ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＭｇＣｌ_２，１０ｍＭＭｇＳ０_４，２０ｍＭグルコース）をキュベット内に加え、溶液を懸濁した。懸濁液を培養チューブに移し１時間から１時間半培養後、抗生物質（アンピシリン）、ＩＰＴＧ及びＸ−Ｇａｌを含むＬＢプレート（１％Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％Ｂａｃｔｏｙｅａｓｔｅｘｔｒａｘｔ，０．５％ＮａＣｌ）にまいた。プレートにできた白色コロニーをＬＢ（＋アンピシリン）培地に植菌させ、５８８個の組換えプラスミドをランダムに選択し、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ^ＴＭＫｉｔ（アマシャム社製）を用いて精製した。

（シークエンスと配列の比較解析）
インサートの配列は、「ＡＢＩＰｒｉｓｍｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｚｅｒ３１００」（ライフテクノロジーズジャパン（株）製）とＴ７ｐｒｉｍｅｒを使用しシークエンスした。ＤＮＡとアミノ酸配列のコンピューター分析は、「Ｇｅｎｅｔｙｘｐａｃｋａｇｅ」（（株）ゼネティック製）と「Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ４．１４」（Ｄｅｍｏｖｅｒｓｉｏｎ）（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ社製）を用いて行った。配列の比較はタンパク質のデータベースに対してＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ；／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）のＳＩＢＢＬＡＳＴＮｅｔｗｏｒｋＳｅｒｖｉｃｅにより相同性分析を行った。

（糸腺特異的発現を証明する実験）
ＭａＳｐ（ｍａｊｏｒａｍｐｕｌｌａｔｅｓｐｉｄｒｏｉｎ）は名前の通り、大瓶状腺で発現するとされている。本発明の遺伝子が大瓶状腺で働いていることを証明するため、ｃＤＮＡ配列の３’末端（アミノ酸配列のＣ末端）配列を用いてプローブを作成し、クモの四種類糸腺（鞭状腺、管状腺、大瓶状腺、小瓶状腺）から抽出したＲＮＡとノーザンハイブリダイゼーション実験を行った。図３は、ノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。図３のレーン１〜４には、順に、鞭状腺、管状腺、大瓶状腺、小瓶状腺から抽出したＲＮＡを流した。この結果より、本発明の遺伝子（核酸）は、オオジョロウグモの大瓶状腺で特異的に発現していることが分かった。また、転写物質の分子量は約３〜４ｋｂであると推測される。

（牽引糸の物性評価）
オオジョロウグモの牽引糸と、従来公知のクモの牽引糸の物性を比較するため、それぞれの伸度（弾性率）を測定した。伸度の測定は、測定前日から、２０℃、ＲＨ６５％で２４時間放置し、吸湿量をバランス状態にした２０ｍｍの各牽引糸をサンプルとして、２０℃、ＲＨ６５％で引張り速度２０ｍｍ／ｍｉｎの条件のもと、引張試験機「ＴｅｎｓｉｌｏｎＵＴＭ−ＩＩＩ−１００」（ＴｏｙｏＢａｌｄｗｉｎ社製）を用いた伸度試験により行った。従来公知のクモとしては、日本産ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖａｔａ）及びナガコガネグモ（Ａｒｇｉｏｐｅｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ）を用いた。結果を表２に示す。

表２に示されるように、オオジョロウグモの牽引糸は、従来公知のクモの牽引糸と比べて、優れた弾性を有することが明らかとなった。すなわち、本発明の核酸が、優れた弾性を有する牽引糸タンパク質をコードするものであることが示された。

本発明により提供される牽引糸タンパク質は、弾性等の物性に優れる天然繊維であるため、医療、航空、衣料等の様々な産業分野における新素材として、好適に用いられる。

Claims

以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの核酸。
（ａ）配列番号１又は１９の塩基配列を有する核酸
（ｂ）配列番号２又は２０のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｃ）前記（ａ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸
（ｄ）前記（ａ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸
以下の（ｅ）〜（ｈ）のいずれかの核酸を含み、配列番号１の塩基配列を有する核酸と９０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸。
（ｅ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７の塩基配列を有する核酸
（ｆ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｇ）前記（ｅ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有する核酸
（ｈ）前記（ｅ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
配列番号１の塩基配列を有する核酸と９５％以上の配列同一性を有する、請求項２に記載の核酸。
以下の（ｉ）〜（ｌ）のいずれかの核酸を含み、配列番号１９の塩基配列を有する核酸と９０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸。
（ｉ）配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５の塩基配列を有する核酸
（ｊ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｋ）前記（ｉ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有する核酸
（ｌ）前記（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
配列番号１９の塩基配列を有する核酸と９５％以上の配列同一性を有する、請求項４に記載の核酸。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸によりコードされるタンパク質。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸が導入された非ヒト組換え生物。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸が導入された組換えカイコ。
請求項７に記載の非ヒト組換え生物により作られるタンパク質。
請求項８に記載の組換えカイコにより作られる絹糸。
以下の（ｍ）又は（ｎ）のアミノ酸配列を有する、牽引糸タンパク質。
（ｍ）配列番号２又は２０のアミノ酸配列
（ｎ）前記（ｍ）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
以下の（ｏ）又は（ｐ）のアミノ酸配列を有する、牽引糸タンパク質。
（ｏ）以下の（ｏ−１）又は（ｏ−２）のアミノ酸配列を有し、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｏ−１）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８のアミノ酸配列
（ｏ−２）前記（ｏ−１）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｐ）以下の（ｐ−１）又は（ｐ−２）のアミノ酸配列を有し、配列番号２０のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｐ−１）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６のアミノ酸配列
（ｐ−２）前記（ｐ−１）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
前記（ｏ）のアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有し、前記（ｐ）のアミノ酸配列が、配列番号２０のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有する、請求項１２に記載の牽引糸タンパク質。
以下の一般式（１）で表されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する牽引糸タンパク質。
［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−（Ｘ４）ｍ−（Ｘ５）ｍ−（Ｘ６）ｍ−Ｘ７−Ｘ８］ｎ（１）
（式中、ｍはそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、ｎは１〜１０の整数を示し、Ｘ１は配列番号３７〜４５のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ２は配列番号４６〜５２のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ３は配列番号５３〜５９のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ４は配列番号４９のアミノ酸配列を示し、Ｘ５は配列番号６０又は６１のアミノ酸配列を示し、Ｘ６は配列番号６２〜６４のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ７は配列番号６５〜７０のいずれかのアミノ酸配列を示し、Ｘ８は配列番号７１〜８１のいずれかのアミノ酸配列を示す。）