JP5771962B2

JP5771962B2 - マイクロ流路チップ及びその製造方法

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Description

本発明はマイクロ流路チップに関し、特に、細胞培養用のマイクロ流路チップに関する。

半導体製造技術を流路形成に応用したμ−ＴＡＳ（Micro Total Analysis System)やLab-on-a-chip、ＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical Systems）と呼ばれるマイクロ流路チップが研究され、実用化されている。これらのマイクロ流路チップは、数ｃｍ角の大きさのチップの内部にマイクロ流路と呼ばれるマイクロメートルオーダーの幅の流路を有し、マイクロ流路が合流したり、分岐したりする構造を有する。

マイクロ流路チップは、マイクロ流路に微量の溶液を流して、溶液の反応や分離、分析を行うシステムであるが、生命科学分野への応用が進められ、特に細胞の分離や分析への応用例が報告されるようになってきた。さらに、実験スペースの省スペース化の観点から、細胞培養にマイクロ流路チップを用いる方法も報告されている。

例えば、特許文献１には、酸素透過性材料からなり、内部に細胞が固着され且つ培養液が灌流される培養液用流路構造を有する少なくとも２つの細胞培養チャンバーが積層された細胞装置において、各細胞培養チャンバー間の少なくとも１カ所に、気体用流路構造を設けたマイクロ流路チップを用いた細胞培養装置が記載されている。

特開２００４−１４７５５５号公報

細胞を培養する場合、一般に、細胞へのコンタミネーションの有無や、細胞の増殖状況を確認するために、定期的な細胞の観察が必要となる。しかし、特許文献１の細胞培養装置では、少なくとも２つの細胞培養チャンバーが積層された構造を有するため、位相差顕微鏡等の光学顕微鏡を用いた細胞の観察ができない。また、培養された細胞は、継代したり、分析したりするために、細胞培養装置から回収する必要があるが、特許文献１の細胞培養装置は、細胞の培養について記載されているものの、細胞を回収する方法については開示していない。

本発明は上述の問題点を解決するもので、培養液と雰囲気ガスとにおいて、酸素及び二酸化炭素のガス交換が可能であり、且つ、光学顕微鏡を用いた細胞観察及び培養細胞の回収が可能なマイクロ流路チップを提供することを目的とする。

本発明の一実施形態によると、第１開口部、第２開口部、培養部、前記第１開口部と前記培養部とを接続する第１流路、及び前記第２開口部と前記培養部とを接続する第２流路を有する基材と、前記培養部の一部に配置された開口を酸素透過膜によって塞がれた窓部と、を有し、前記酸素透過膜は光透過性を有し、前記培養部の下部に位置する前記基材の一部は透明な材料で形成され、前記酸素透過膜は、膜厚が０．２ｍｍ以下のポリジメチルシロキサンで形成され、前記第１開口部は、前記培養部に細胞及び培養液を導入して、前記細胞を前記培養部で培養するための開口部であり、前記第２開口部は、前記培養部に導入した前記培養液を排出するための開口部であり、前記酸素透過膜の少なくとも一部を破ることによって前記窓部から前記培養部で培養された細胞を回収可能であることを特徴とするマイクロ流路チップが提供される。

本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップは、培養された細胞は、窓部から回収することができる。培養時には窓部は酸素透過膜により塞がれているため、外部の異物が窓部から培養部へ混入するのを防止することができ、且つ、酸素透過膜を介した外部と培養部との酸素及び二酸化炭素のガス交換を行うことができる。また、酸素透過膜の少なくとも一部を破ることによって、培養部で培養された細胞を窓部から回収することが可能となる。本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップは、酸素透過膜が光透過性を有し、且つ、培養部の下部に位置する基材の少なくとも一部が透明な材料で形成されるため、光学顕微鏡による細胞が観察可能である。細胞培養期間において、随時、細胞の状態を観察することができる。本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップは、酸素透過膜をポリジメチルシロキサンで形成することで、酸素透過膜を介した外部と培養部との酸素及び二酸化炭素のガス交換を良好に行うことができる。本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップは、ポリジメチルシロキサンで形成された酸素透過膜の膜厚が０．２ｍｍ以下であることにより、酸素透過膜を介した外部と培養部との酸素及び二酸化炭素のガス交換を良好に行うことができる。また、培養した細胞を窓部から回収するときに、酸素透過膜を容易に破ることができる。本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップは、細胞及び培養液を導入して、培養部で細胞を培養することができる。本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップは、培養部に過剰な培養液が導入されても、第２開口部から排出することができる。これにより、第１開口部から培養液を常時供給することも可能となる。

前記マイクロ流路チップにおいて、前記第１流路の断面積は前記細胞よりも大きく、前記第２流路の断面積は前記細胞よりも小さくてもよい。

本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップは、第１流路の断面積は細胞よりも大きく、第２流路の断面積は細胞よりも小さく形成されているため、培養部に導入された細胞は、第２流路に流出することなく、培養部に留めることができる。

前記マイクロ流路チップにおいて、前記培養部の底部に、前記細胞が１つ収容される大きさの凹部を有してもよい。

本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップは、培養部の底部に、前記細胞が１つ収容される大きさの凹部を有することで、培養部内での細胞の配置を制御することができる。

前記マイクロ流路チップにおいて、複数の前記第２流路を有し、前記複数の第２流路の断面積の合計が前記第１流路の断面積以上であってもよい。

本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップは複数の第２流路を有し、複数の第２流路の断面積の合計が第１流路の断面積以上とすることで、細胞を培養部に導入するときや、培養液を培養部に供給するときに、第１流路と第２流路とにかかる圧力差をなくすようにすることができ、細胞に対するストレスを低減することが出来る。

前記マイクロ流路チップにおいて、前記細胞よりも小さな間隔で配置された複数の柱状体を前記培養部に有してもよい。

本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップは、細胞よりも小さな間隔で配置された複数の柱状体を細胞培養部に有することで、培養部に導入された細胞は第２流路に流出することなく、培養部に留めることができる。

前記マイクロ流路チップにおいて、前記細胞よりも大きな間隔で配置された複数の柱状体を前記第１流路に有してもよい。

本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップは、細胞よりも大きな間隔で配置された複数の柱状体を第１流路に有することで、培養部に細胞を導入するときや、培養液を供給するときに、異物が培養部に混入するのを防ぐことができる。

また、本発明の一実施形態によると、第１基材に培養部、第１流路、及び第２流路を形成し、第２基材に複数の開口を形成することで、前記培養部に細胞及び培養液を導入する第１開口部、前記培養部に導入した前記培養液を排出する第２開口部、および窓部を形成し、ポリジメチルシロキサンの膜を介して前記第１基材と前記第２基材とを接合して、前記窓部を前記ポリジメチルシロキサンの膜で塞ぎ、前記第１開口部及び第２開口部に位置する前記ポリジメチルシロキサンの膜を除去し、前記ポリジメチルシロキサンの膜は光透過性を有し、前記培養部の下部に位置する前記第１基材の一部は透明であり、前記ポリジメチルシロキサンの膜は、膜厚が０．２ｍｍ以下であることを特徴とするマイクロ流路チップの製造方法が提供される。

本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップの製造方法は、培養部と流路を形成した第１基材と、開口部と窓部を形成した第２基材と、をポリジメチルシロキサンの膜を介して貼り合わせることができる。また、開口部に位置するポリジメチルシロキサンの膜は、容易に除去することができる。また、培養時には窓部は酸素透過膜であるポリジメチルシロキサンの膜により覆って塞がれるため、外部の異物が窓部から培養部へ混入するのを防止することができ、且つ、酸素透過膜を介した外部と培養部との酸素及び二酸化炭素のガス交換を行うこと可能なマイクロ流路チップを製造することができる。また、本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップの製造方法は、ポリジメチルシロキサンの膜が光透過性を有し、且つ、培養部の下部に位置する第１基材の少なくとも一部が透明であるため、光学顕微鏡による細胞が観察可能なマイクロ流路チップを製造することができる。細胞培養期間において、随時、細胞の状態を観察することができる。本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップの製造方法は、ポリジメチルシロキサンの膜を介した外部と培養部との酸素及び二酸化炭素のガス交換を良好に行うことが可能なマイクロ流路チップを製造することができる。本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップの製造方法は、ポリジメチルシロキサンの膜の膜厚が０．２ｍｍ以下であることにより、ポリジメチルシロキサンの膜を介した外部と培養部との酸素及び二酸化炭素のガス交換を良好に行うことが可能なマイクロ流路チップを製造することができる。また、培養した細胞を窓部から回収するときに、ポリジメチルシロキサンの膜を容易に破ることが可能なマイクロ流路チップを製造することができる。本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップの製造方法は、細胞及び培養液を導入して、培養部で細胞を培養することが可能なマイクロ流路チップを製造することができる。本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップの製造方法は、培養部に過剰な培養液が導入されても、第２開口部から排出することが可能なマイクロ流路チップを製造することができる。これにより、第１開口部から培養液を常時供給することも可能となる。

前記マイクロ流路チップの製造方法において、前記第１基材は、第３基材と第４基材とを接合することにより形成されており、前記第３基材にガラス基板を用い、前記第４基材にシリコン基板を用いてもよい。

本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップの製造方法は、培養部の上下に配置する第２基材と第３基材にガラス基板を用い、光透過性を有するポリジメチルシロキサンの膜が窓部を覆って塞ぐため、光学顕微鏡による細胞が観察可能なマイクロ流路チップを製造することができる。

前記マイクロ流路チップの製造方法において、前記第２基材と前記第４基材の表面をＯ_２プラズマ照射または真空紫外線照射により処理し、前記第２基材と前記第４基材との間に前記ポリジメチルシロキサンの膜を挟んで圧着することにより貼り付けてもよい。

本発明の一実施形態に係るマイクロ流路チップの製造方法は、第２基材と第４基材の表面をＯ_２プラズマ照射または真空紫外線照射により処理し、第２基材と第４基材との間にポリジメチルシロキサンの膜を挟んで圧着することにより貼り付けることで、第３基材及び第４基材と、第２基材との接合を簡便に行うことができる。また、細胞毒性のある接着剤を用いることなく、第３基材及び第４基材と、第２基材とを接合することができる。

前記何れか一に記載のマイクロ流路チップを用い、前記第１開口部から細胞及び培養液を前記培養部に導入し、前記第２開口部から培養液を排出し、前記培養部で細胞を培養することを含む細胞培養方法が提供される。

本発明の一実施形態に係る細胞培養方法は、上述の何れかのマイクロ流路チップを用い、第１開口部から細胞及び培養液を培養部に導入し、第２開口部から培養液を排出し、培養部で細胞を培養することができる。

前記細胞培養方法において、前記酸素透過膜の少なくとも一部を破ることによって前記窓部から前記培養部で培養された細胞を回収してもよい。

本発明の一実施形態に係る細胞培養方法は、酸素透過膜の少なくとも一部を破ることによって窓部から培養部で培養された細胞を簡便に回収することができる。

本発明によると、培養液と雰囲気ガスとにおいて、酸素及び二酸化炭素のガス交換が可能であり、且つ、光学顕微鏡を用いた細胞観察及び培養細胞の回収が可能なマイクロ流路チップが提供される。

一実施形態に係る本発明のマイクロ流路チップ１００を説明する図である。（ａ）はマイクロ流路チップ１００の上面図であり、（ｂ）は（ａ）のＡＡ’におけるマイクロ流路チップ１００の断面図であり、（ｃ）はマイクロ流路チップ１００の変形例であるマイクロ流路チップ１５０の（ａ）のＡＡ’における断面図である。一実施形態に係る本発明のマイクロ流路チップ１００の他の変形例を説明する図である。（ａ）はマイクロ流路チップ１００’の上面図であり、（ｂ）は（ａ）のＡＡ’におけるマイクロ流路チップ１００’の断面図であり、（ｃ）はマイクロ流路チップ１００’の変形例であるマイクロ流路チップ１５０’の（ａ）のＡＡ’における断面図である。一実施形態に係る本発明のマイクロ流路チップ１００の培養部２１と、培養部２１に接続する第１流路３１及び第２流路３３の一部とを拡大した図である。一実施形態に係る本発明のマイクロ流路チップ２００を説明する図である。（ａ）はマイクロ流路チップ２００の培養部２２１と、培養部２２１に接続する第１流路３１及び第２流路２３３の一部とを拡大した上面図であり、（ｂ）は（ａ）のＡＡ’におけるマイクロ流路チップ２００の当該部分の断面図である。一実施形態に係る本発明のマイクロ流路チップ３００を説明する図である。（ａ）はマイクロ流路チップ３００の培養部３２１と、培養部３２１に接続する第１流路３１及び第２流路３３の一部とを拡大した上面図であり、（ｂ）は（ａ）のＡＡ’におけるマイクロ流路チップ３００の当該部分の断面図である。一実施形態に係る本発明のマイクロ流路チップ４００の培養部４２１と、培養部４２１に接続する第１流路３１の一部及び複数の第２流路４３３とを拡大した上面図である。一実施形態に係る本発明のマイクロ流路チップ５００を説明する図である。（ａ）はマイクロ流路チップ５００の第１流路５３１の一部を拡大した上面図であり、（ｂ）は（ａ）のＡＡ’におけるマイクロ流路チップ５００の当該部分の断面図である。一実施形態に係る本発明のマイクロ流路チップ１００の製造過程を説明する模式図である。一実施形態に係る本発明のマイクロ流路チップ１００’の製造過程を説明する模式図である。一実施形態に係る本発明のマイクロ流路チップ１００の製造過程を説明する模式図である。

以下、図面を参照して本発明に係るマイクロ流路チップ及びその製造方法について説明する。但し、本発明のマイクロ流路チップは多くの異なる態様で実施することが可能であり、以下に示す実施の形態及び実施例の記載内容に限定して解釈されるものではない。なお、本実施の形態及び実施例で参照する図面において、同一部分又は同様な機能を有する部分には同一の符号を付し、その繰り返しの説明は省略する。

（実施形態１）
図１Ａを参照して、本発明の実施形態１に係るマイクロ流路チップ１００を説明する。図１Ａ（ａ）はマイクロ流路チップ１００の上面図であり、図１Ａ（ｂ）は図１Ａ（ａ）のＡＡ’におけるマイクロ流路チップ１００の断面図である。また、図１Ａ（ｃ）はマイクロ流路チップ１００の変形例であるマイクロ流路チップ１５０の図１Ａ（ａ）のＡＡ’における断面図である。マイクロ流路チップ１００は、第１開口部１１と、第２開口部１３と、培養部２１と、第１開口部１１とを接続する第１流路３１と、第２開口部１３と培養部２１とを接続する第２流路３３と、を有する。

マイクロ流路チップ１００は、例えば、第１基材１に第２基材３、酸素透過膜５、第３基材７を順次積層して形成することができる。培養部２１は平坦でもよく、また、図１Ａ（ｂ）に示したように、培養部２１の底部に凹部（窪部）２３を形成しても良い。第２基材３は培養部２１、第１流路３１及び第２流路３３を形成する。第３基材７は、第１開口部１１、第２開口部１３、培養部２１の上部に配置された窓部４１を形成する。第１開口部１１、第２開口部１３の両方又はいずれか一方が第１基材１側に存在していてもよい。また、酸素透過膜５は培養部２１と窓部４１との間に介在し、培養部２１の一部に配置された開口を覆って塞ぐ、培養部２１と外部との隔壁である。本実施形態においては、培養部２１と窓部４１の形状と大きさを同じにしているが、培養部２１と窓部４１の形状を異なる形状としてもよく、窓部４１の開口領域の大きさを培養部２１より小さくしても良い。また、本実施形態においては、第１流路３１と第２流路３３が形成される第１基材１の上部表面の高さを等しくしているが、第２流路３３の断面積が第１流路３１の断面積よりも小さくなるように、例えば、第１流路３１が形成される第１基材１の部分に凹部を形成することにより、第１流路３１の高さを第２流路３３より高くするようにしてもよい。逆に、第２流路３３を形成する第１基材１の上部に第２流路３３の底部を第２基材３で形成することにより、第２流路３３の高さを第１流路３１より低くするようにしてもよい。

また、マイクロ流路チップ１００は、図１Ａ（ｃ）に示す変形例であるマイクロ流路チップ１５０の構成にすることもできる。マイクロ流路チップ１５０は、第１基材１に第２基材３、第３基材７、酸素透過膜５を順次積層して形成した構造である。つまり、マイクロ流路チップ１５０は、窓部４１の上部に酸素透過膜５を配置することで、酸素透過膜５を培養部２１と外部との隔壁として機能させる。

マイクロ流路チップ１００に用いる第１基材１は、透明な材料で形成することが好ましい。第１基材１を不透明な材料により形成する場合でも、培養部２１の下部に位置する部分は、少なくとも透明な材料で形成する。また、酸素透過膜５は、光透過性を有する材料で形成することが好ましい。マイクロ流路チップ１００は、このように構成することにより、光学顕微鏡による細胞が観察可能である。細胞培養においては、細胞培養期間において、随時、細胞の状態を観察することが要求され、このような観察には、培養容器の上方から光を照射し、培養容器の下方にレンズを配置した倒立型の位相差顕微鏡を用いるのが一般的である。したがって、マイクロ流路チップ１００は、第１基材１に透明な材料を用いることで、細胞観察を可能にする。

本実施形態に係る第１基材１に用いる透明な材料としてはガラスが好ましく、位相差顕微鏡を用いた細胞観察に好適である。第１基材１にガラスを用いた場合は、第２基材３には、シリコンを好適に用いることができる。また、第３基材７にはガラスを用いるとよい。このような材料を用いることで、後述するように、ＭＥＭＳの製造法を用いてマイクロ流路チップ１００を製造することができる。

酸素透過膜５に用いる光透過性を有する材料としてはポリジメチルシロキサン（polydimethylsiloxane：ＰＤＭＳ）が好ましい。ＰＤＭＳは酸素透過性に優れた材料であり、酸素透過膜５にＰＤＭＳを用いることで、酸素透過膜５を介した外部と培養部２１との酸素及び二酸化炭素のガス交換を良好に行うことができる。また、本実施形態に係る酸素透過膜５は、膜厚を０．２ｍｍ以下とすることが好ましい。ＰＤＭＳで形成された酸素透過膜５の膜厚が０．２ｍｍ以下であることにより、酸素透過膜５を介した外部と培養部２１との酸素及び二酸化炭素のガス交換を良好に行うことができ、培養した細胞を窓部４１から回収するときには、酸素透過膜５を容易に破る（破壊する、開口する）ことができるため好適である。

また、図１Ｂに、マイクロ流路チップ１００の他の変形例を示す。図１Ｂ（ａ）はマイクロ流路チップ１００’の上面図であり、図１Ｂ（ｂ）は図１Ｂ（ａ）のＡＡ’におけるマイクロ流路チップ１００’の断面図であり、図１Ｂ（ｃ）はマイクロ流路チップ１００’の変形例であるマイクロ流路チップ１５０’の図１Ｂ（ａ）のＡＡ’における断面図である。

図１Ｂ（ｂ）に示したように、マイクロ流路チップ１００’においては、第１基材１’で培養部２１、第１流路３１及び第２流路３３を形成してもよい。第１基材１’としては、例えば、ガラスやＰＤＭＳを用いることができる。第１基材１’と、第１開口部１１、第２開口部１３および窓部４１を形成した第２基材７とは、ＰＤＭＳで形成された酸素透過膜５を介して接合することができる。

また、図１Ｂ（ｂ）に示したように、マイクロ流路チップ１５０’は、第１基材１’に第２基材７、酸素透過膜５を順次積層して形成することもできる。これらの変形例においては、培養部２１、第１流路３１及び第２流路３３を第１基材１’のみで簡便に形成することができる。後述する実施形態においても、培養部２１、第１流路３１及び第２流路３３を形成した第１基材１’を適用することができる。

（培養方法）
上述のマイクロ流路チップ１００は、細胞培養に好適に用いることができる。図２は、図１に示したマイクロ流路チップ１００の培養部２１と、培養部２１に接続する第１流路３１及び第２流路３３の一部とを拡大した図であり、第１流路３１が形成される第１基材１の部分に凹部を形成することにより、第１流路３１の高さを第２流路３３より高くする構成とした図である。

第１開口部１１から培養液に懸濁した細胞９０を第１開口部１１からマイクロ流路チップ１００に添加すると、第１流路３１を通り、培養部２１に導入される。ここで、第１流路３１の断面積は細胞９０よりも十分に大きくなるように設定されている。培養部２１に過剰量の培養液が供給された場合は、培養液は第２流路３３を通り、第２開口部１３からマイクロ流路チップ１００の外部へ排出される。ここで、第２流路３３の断面積は細胞９０よりも十分に小さくなるように設定されている。このような第１流路３１及び第２流路３３を配置することにより、細胞９０は培養部２１に速やかに導入されて、過剰量の培養液はマイクロ流路チップ１００の外部へ排出され、培養部２１に導入された細胞９０は、第２流路３３に流出することなく培養部２１に留めることができる。また、本実施形態においては、培養部２１は円形であることが好ましい。培養部２１が円形であることにより、過剰な培養液が培養部２１から第２流路３３に排出しやすくすることができる。

培養部２１に細胞９０を導入した後は、第１開口部１１及び第２開口部１３は封止してもよく、灌流装置を第１開口部１１及び第２開口部１３に接続して、培養部２１に培養液を所定流量で供給してもよい。

培養部２１に導入される細胞９０は、浮遊系細胞、接着系細胞の何れも用いることができる。細胞９０が接着系細胞である場合には、細胞９０は培養部２１の底面の凹部２３に接着して成長し、増殖する。また、細胞９０が接着系細胞である場合には、培養部２１で浮遊した状態で成長、増殖する。用いる培養液の組成や血清の濃度、培養温度、雰囲気ガス（二酸化炭素濃度）等の細胞９０の培養条件は、用いる細胞の種類により適宜選択し、公知のものを用いることができる。顕微鏡観察により細胞９０が所望の細胞数に達したことが確認された場合、酸素透過膜５を破ることで窓部４１から培養部２１内の細胞９０を回収することができる。例えば、滅菌したメス等の刃物で酸素透過膜５の少なくとも一部を破ったり、マイクロピペットのチップやシリンジに装着した注射針等を用いて酸素透過膜５の少なくとも一部を突き破ったりして、細胞９０を回収してもよい。

細胞９０が接着系細胞である場合には、マイクロピペットやシリンジ等により吸引することで容易に回収することができる。細胞９０が接着系細胞である場合には、第１開口部１１から培養液やＰＢＳを培養部２１に導入することで、培養部２１の底部に接着（付着）した細胞９０の表面を洗浄し、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むトリプシン溶液を添加することで細胞９０を処理し、第１開口部１１から培養液をさらに供給することで細胞９０を浮遊させることができる。過剰量の培養液やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むトリプシン溶液は、第２開口部１３からマイクロ流路チップ１００の外部へ排出される。また、マイクロピペットで回収する場合には、培養部２１内の細胞９０をピペッティングすることにより細胞９０が浮遊するのを促進することもできる。

本実施形態に係るマイクロ流路チップは、培養部に導入して細胞を培養し、培養された細胞は、窓部から回収することができる。培養時には窓部は酸素透過膜により被覆されているため、外部の異物が窓部から培養部へ混入するのを防止することができ、且つ、酸素透過膜を介した外部と培養部との酸素及び二酸化炭素のガス交換を行うことができる。また、本実施形態に係るマイクロ流路チップは、酸素透過膜が光透過性を有し、且つ、培養部の下部に位置する基材の少なくとも一部が透明な材料で形成されるため、光学顕微鏡による細胞が観察可能である。

（実施形態２）
本実施形態においては、培養部２１に代わり、マイクロピラー２２５が配置された培養部２２１を有するマイクロ流路チップ２００について説明する。図３（ａ）はマイクロ流路チップ２００の培養部２２１と、培養部２２１に接続する第１流路３１及び第２流路２３３の一部とを拡大した上面図であり、図３（ｂ）は図３（ａ）のＡＡ’におけるマイクロ流路チップ２００の当該部分の断面図である。なお、培養部２２１、第２流路２３３及び窓部２４１以外は実施形態１と同様に構成することができる。

マイクロ流路チップ２００は、培養部２２１の底部に結合した柱状体であるマイクロピラー２２５が複数配置され、培養液の送液方向（図３（ａ）のＡからＡ’方向）に直交するように配置された隣接するマイクロピラー２２５は、細胞９０よりも小さな間隔で配置される。このように構成することで、マイクロ流路チップ２００は培養部２２１に導入された細胞が第２流路２３３に流出するのを防止することができる。

本実施形態に係るマイクロピラー２２５は、実施形態１において説明した、第２基材３により形成することができる。マイクロピラー２２５は、図３（ａ）に示したように酸素透過膜５と離間して配置してもよく、酸素透過膜５と接着してもよい。マイクロピラー２２５を酸素透過膜５と離間して配置する場合には、マイクロピラー２２５の上端部と酸素透過膜５との距離が、細胞９０よりも小さな間隔となるように配置する。なお、マイクロ流路チップ２００は、マイクロピラー２２５の上端部と酸素透過膜５との距離を細胞９０よりも小さな間隔となるように配置すれば、実施形態１で説明したマイクロ流路チップ１５０のように、窓部２４１の上部に酸素透過膜５を配置する構成にしてもよい。また、培養部２２１と窓部２４１の形状を異なる形状としてもよく、窓部２４１の開口領域の大きさを培養部２２１より小さくしても良い。

このため、本実施形態においては、第２流路２３３の断面積は細胞９０よりも小さくする必要はなく、したがって、第１流路３１と第２流路２３３の断面積を等しく形成することができる。また、マイクロ流路チップ２００は細胞９０を培養部２２１に導入するときや、培養液を培養部２１に供給するときに、第１流路３１と第２流路２３３とにかかる圧力差をなくすようにすることができ、細胞９０に対するストレスを低減することが出来る。

なお、マイクロ流路チップ２００は、第１流路３１と第２流路２３３の断面積が等しくすることができるため、培養部２２１の形状は図３（ａ）に示したように、角部がカーブした略矩形形状でもよく、円形でもよい。また、第１流路３１と第２流路２３３の断面積が等しいため、第１基材１は凹部のない平板形状でよい。マイクロ流路チップ２００において、その他の構成、細胞９０の培養方法及び回収方法は、実施形態１と同様であるため、説明は省略する。

（実施形態３）
本実施形態においては、培養部２１に代わり、底部に細胞を捕捉するための凹部３２７が配置された培養部３２１を有するマイクロ流路チップ３００について説明する。図４（ａ）はマイクロ流路チップ３００の培養部３２１と、培養部３２１に接続する第１流路３１及び第２流路３３の一部とを拡大した上面図であり、図４（ｂ）は図４（ａ）のＡＡ’におけるマイクロ流路チップ３００の当該部分の断面図である。なお、培養部３２１及び窓部３４１以外は実施形態１と同様に構成することができる。

マイクロ流路チップ３００は、培養部３２１の底部に凹部３２７が複数配置され、第２流路３３の断面積は細胞９０よりも十分に小さくなるように設定されている。このように構成することで、マイクロ流路チップ３００は培養部３２１に導入された細胞９０が第２流路３３に流出するのを防止することができ、培養部３２１内での細胞９０の配置を制御することができる。

本実施形態においては、凹部３２７は第１基材１に形成する。また、第１流路３１と第２流路３３が形成される第１基材１の上部表面の高さは等しくしてもよく、第２流路３３の断面積が第１流路３１の断面積よりも小さくなるように、例えば、第１流路３１が形成される第１基材１の部分に凹部を形成することにより、第１流路３１の高さを第２流路３３より高くするようにしてもよい。逆に、第２流路３３を形成する第１基材１の上部に第２流路３３の底部を第２基材３で形成することにより、第２流路３３の高さを第１流路３１より低くするようにしてもよい。また、培養部３２１の形状は図４（ａ）に示したように、角部がカーブした略矩形形状でもよく、円形でもよい。マイクロ流路チップ３００は、実施形態１で説明したマイクロ流路チップ１５０のように、窓部３４１の上部に酸素透過膜５を配置する構成にしてもよい。また、培養部３２１と窓部３４１の形状を異なる形状としてもよく、窓部３４１の開口領域の大きさを培養部３２１より小さくしても良い。

なお、培養部３２１内での細胞９０の配置を制御するために、凹部３２７以外の培養部３２１の底部に、例えば、シリコーンコーティングを施すことにより撥水処理し、細胞９０が凹部３２７に配置するようにしてもよい。

マイクロ流路チップ３００において、その他の構成、細胞９０の培養方法及び回収方法は、実施形態１と同様であるため、説明は省略する。

（実施形態４）
本実施形態においては、第２流路３３に代わり、培養部４２１と第２開口部１３に接続された複数の第２流路４３３を有するマイクロ流路チップ４００について説明する。図５はマイクロ流路チップ４００の培養部４２１と、培養部４２１に接続する第１流路３１の一部及び複数の第２流路４３３とを拡大した上面図である。なお、培養部４２１、第２流路４３３及び窓部４４１以外は実施形態１と同様に構成することができる。

マイクロ流路チップ４００は、培養部４２１に複数の第２流路４３３が接続され、第２流路４３３の断面積は細胞９０よりも十分に小さくなるように設定されている。このように構成することで、マイクロ流路チップ４００は培養部４２１に導入された細胞９０が第２流路４３３に流出するのを防止することができる。また、マイクロ流路チップ４００は複数の第２流路４３３の断面積の合計が第１流路３１の断面積以上となるように設定されている。このような構成にすることにより、マイクロ流路チップ４００は細胞９０を培養部４２１に導入するときや、培養液を培養部４２１に供給するときに、第１流路３１と第２流路４３３とにかかる圧力差をなくすようにすることができ、細胞９０に対するストレスを低減することが出来る。

本実施形態においては、第１流路３１と第２流路４３３が形成される第１基材１の上部表面の高さは等しくしてもよく、第２流路４３３の断面積が第１流路３１の断面積よりも小さくなるように、例えば、第１流路３１が形成される第１基材１の部分に凹部を形成することにより、第１流路３１の高さを第２流路４３３より高くするようにしてもよい。逆に、第２流路４３３を形成する第１基材１の上部に第２流路４３３の底部を第２基材３で形成することにより、第２流路４３３の高さを第１流路３１より低くするようにしてもよい。また、培養部４２１の形状は図５（ａ）に示したように、円形でもよく、角部がカーブした略矩形形状でもよい。マイクロ流路チップ４００は、実施形態１で説明したマイクロ流路チップ１５０のように、窓部４４１の上部に酸素透過膜５を配置する構成にしてもよい。また、培養部４２１と窓部４４１の形状を異なる形状としてもよく、窓部４４１の開口領域の大きさを培養部４２１より小さくしても良い。

なお、図５においては、培養部４２１に接続した複数の第２流路４３３が１つの流路に合流する形態として示したが、複数の第２流路４３３が第２開口部１３に直接接続する構成であってもよい。マイクロ流路チップ４００において、その他の構成、細胞９０の培養方法及び回収方法は、実施形態１と同様であるため、説明は省略する。

（実施形態５）
本実施形態においては、第１流路３１に代わり、マイクロピラー５３３が配置された第１流路５３１を有するマイクロ流路チップ５００について説明する。図６（ａ）はマイクロ流路チップ５００の第１流路５３１の一部を拡大した上面図であり、図６（ｂ）は図６（ａ）のＡＡ’におけるマイクロ流路チップ５００の当該部分の断面図である。なお、第１流路５３１以外は実施形態１と同様に構成することができる。

マイクロ流路チップ５００は、第１流路５３１の底部に結合した柱状体であるマイクロピラー５３３が複数配置され、培養液の送液方向（図６（ａ）のＡからＡ’方向）に直交するように配置された隣接するマイクロピラー５３３は、細胞９０が通過可能な程度の間隔で配置される。すなわち、隣接するマイクロピラー５３３の間隔は、培養部２１に導入する細胞９０の大きさよりわずかに広い間隔に設定される。このように構成することで、第１開口部１１から添加された細胞９０は第１流路５３１を通過して培養部２１に導入されるが、細胞９０よりも大きな細胞９１や異物９３はマイクロピラー５３３によりトラップされ、培養部２１に導入されるのを防止することができる。

本実施形態に係るマイクロピラー５３３は、実施形態１において説明した、第２基材３により形成することができる。マイクロピラー５３３は、図６（ａ）に示したように酸素透過膜５と離間して配置してもよく、酸素透過膜５と接着してもよい。マイクロピラー５３３を酸素透過膜５と離間して配置する場合には、マイクロピラー５３３の上端部と酸素透過膜５との距離が、細胞９０の大きさよりわずかに広い間隔となるように配置する。

マイクロ流路チップ５００において、その他の構成、細胞９０の培養方法及び回収方法は、実施形態１と同様であるため、説明は省略する。なお、マイクロピラー５３３は実施形態２〜４のマイクロ流路チップにも適用可能である。

（製造方法）
上述した本発明に係るマイクロ流路チップについて、その製造方法を説明する。以下では、実施形態１のマイクロ流路チップ１００を例に説明する。図７Ａ及び図８は、マイクロ流路チップ１００の製造過程を説明する模式図である。

まず、第１基材１（図７Ａ（ａ））に凹部２３を形成する（図７Ａ（ｂ））。第１基材１にガラス基板を用いた場合、凹部２３は、ウェットエッチング、反応性イオンエッチング（Reactive Ion Etching：ＲＩＥ）等のエッチングや、ブラスト、ドリル等の物理的な加工方法を用いることができる。

凹部２３を形成したガラス基板に第２基材３を接合する（図７Ａ（ｃ））。第２基材３にシリコン基板を用いる場合は、ガラス基板とシリコン基板とを陽極接合する。接合したガラス基板の上部表面を、第１流路３１及び第２流路３３を形成するために必要な厚さまで研削、研磨する。次に、シリコン基板に培養部２１、第１流路３１及び第２流路３３を形成する（図７Ａ（ｄ））。シリコン基板の加工には、Deep RIE（ＤＲＩＥ）を好適に用いることができる。また、実施形態２において説明したマイクロピラー２２５や、実施形態５において説明したマイクロピラー５３３も第２基材３を用いて形成することができる。

つづいて、第３基材７にガラス基板を用い（図８（ａ））、ドリル、サンドブラスト、反応性イオンエッチング（Reactive Ion Etching：ＲＩＥ）等により、第３基材７に第１開口部１１、第２開口部１３及び窓部４１を形成する（図８（ｂ））。このように加工した第３基材７の基底面に酸素透過膜５を貼り付ける（図８（ｃ））。

第３基材７酸素透過膜５にＰＤＭＳを用いて貼り付ける場合は、Ｏ_２プラズマ照射や真空紫外線（Vacuum Ultra-Violet：ＶＵＶ）照射によりガラス基板表面を処理して、圧着（８０℃以上、３ｋＮ以上）することにより貼り付ける行うことができる。マイクロ流路チップ１００に用いるＰＤＭＳとしては、例えば、東レダウコーニング株式会社のSYLGARD（登録商標） 184を好適に用いることができる。なお、本発明の実施形態に係るＰＤＭＳはこれに限定されるのもではない。酸素透過膜５にＰＤＭＳを用いる場合、膜厚を０．２ｍｍ以下とすることが好ましい。例えば、窓部４１を２ｍｍ × ２ｍｍとする場合、膜厚を５０μｍとすることができる。

上述のように形成した第１基材１及び第２基材３と、第３基材７及び酸素透過膜５とを貼り合わせる（図８（ｄ））。この貼り合わせ工程は、Ｏ_２プラズマ照射やＶＵＶ照射により第２基材３の表面を処理して貼り付けることができる。

また、酸素透過膜５にＰＤＭＳを用いる場合は、第１基材１及び第２基材３と、第３基材７とを接着する接着剤として利用することも可能である。この場合には、ＰＤＭＳ膜を加熱して、第１基材１及び第２基材３と、第３基材７との間に挟み、圧着させることで第１基材１及び第２基材３と、第３基材７との接合を簡便に行うことができる。第３基材７に第１開口部１１、第２開口部１３及び窓部４１に位置するＰＤＭＳ膜を除去し、マイクロ流路チップ１００を製造する（図８（ｅ））。ＰＤＭＳ膜の除去は、パンチまたはドリルなどの機械加工により行うことができる。細胞毒性のある接着剤を用いることなく、第１基材１及び第２基材３と、第３基材７とを接合することができる。

また、上述の製造方法では、第１基材１と第３基材７にガラス基板を用い、第２基材３にシリコン基板を用いる例を説明したが、本発明に係るマイクロ流路チップはこれらに限定されるものではなく、図７Ｂ（ａ）に示したようにマイクロ流路チップ１００’において、鋳型を用いて培養部２１、第１流路３１及び第２流路３３を形成した第１基材１’を用いることができる。第１基材１’と、図８に示した第１開口部１１、第２開口部１３及び窓部４１を形成した第３基材７（マイクロ流路チップ１００’においては、第２基材）と、をＰＤＭＳ膜で形成された酸素透過膜５で接着して製造することも可能である。

第１基材１’としては、ガラスやＰＤＭＳを用いることができ、鋳型を用いて培養部２１、第１流路３１及び第２流路３３を形成すると、製造工程が簡便となる。また、第３基材７（または第２基材７）と、酸素透過膜５との配置順を逆にすることで、マイクロ流路チップ１５０やマイクロ流路チップ１５０’を製造することもできる。

１：第１基材、３：第２基材、５：酸素透過膜、７：第３基材、１１：第１開口部、１３：第２開口部、２１：培養部、２３：凹部、３１：第１流路、３３：第２流路、４１：窓部、５１：流路、９０：細胞、９１：大きな細胞、９３：異物、１００：マイクロ流路チップ、２００：マイクロ流路チップ、２２１：培養部、２２５：マイクロピラー、２３３：第２流路、３００：マイクロチップ、３２１：培養部、３２７：凹部、４００：マイクロ流路チップ、４３３：第２流路、５００：マイクロ流路チップ、５３１：第１流路、５３３：マイクロピラー

Claims

第１開口部、第２開口部、培養部、前記第１開口部と前記培養部とを接続する第１流路、及び前記第２開口部と前記培養部とを接続する第２流路を有する基材と、
前記培養部の一部に配置された開口を酸素透過膜によって塞がれた窓部と、を有し、
前記酸素透過膜は光透過性を有し、前記培養部の下部に位置する前記基材の一部は透明な材料で形成され、
前記酸素透過膜は、膜厚が０．２ｍｍ以下のポリジメチルシロキサンであり、
前記第１開口部は、前記培養部に細胞及び培養液を導入して、前記細胞を前記培養部で培養するための開口部であり、
前記第２開口部は、前記培養部に導入した前記培養液を排出するための開口部であり、
前記酸素透過膜の少なくとも一部を破ることによって前記窓部から前記培養部で培養された細胞を回収可能であることを特徴とするマイクロ流路チップ。
前記第１流路の断面積は前記細胞よりも大きく、前記第２流路の断面積は前記細胞よりも小さいことを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流路チップ。
前記培養部の底部に、前記細胞が１つ収容される大きさの凹部を有することを特徴とする請求項２に記載のマイクロ流路チップ。
複数の前記第２流路を有し、前記複数の第２流路の断面積の合計が前記第１流路の断面積以上であることを特徴とする請求項３に記載のマイクロ流路チップ。
前記細胞よりも小さな間隔で配置された複数の柱状体を前記培養部に有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流路チップ。
前記細胞よりも大きな間隔で配置された複数の柱状体を前記第１流路に有することを特徴とする請求項１乃至５の何れか一に記載のマイクロ流路チップ。
第１基材に培養部、第１流路、及び第２流路を形成し、
第２基材に複数の開口を形成することで、前記培養部に細胞及び培養液を導入する第１開口部、前記培養部に導入した前記培養液を排出する第２開口部、および窓部を形成し、
ポリジメチルシロキサンの膜を介して前記第１基材と前記第２基材とを接合して、前記窓部を前記ポリジメチルシロキサンの膜で塞ぎ、
前記第１開口部及び第２開口部に位置する前記ポリジメチルシロキサンの膜を除去し、
前記ポリジメチルシロキサンの膜は光透過性を有し、前記培養部の下部に位置する前記第１基材の一部は透明であり、
前記ポリジメチルシロキサンの膜は、膜厚が０．２ｍｍ以下であることを特徴とするマイクロ流路チップの製造方法。
前記第１基材は、第３基材と第４基材とを接合することにより形成されており、前記第３基材にガラス基板を用い、前記第４基材にシリコン基板を用いることを特徴とする請求項７に記載のマイクロ流路チップの製造方法。
前記第２基材と前記第４基材の表面をＯ_２プラズマ照射または真空紫外線照射により処理し、前記第２基材と前記第４基材との間に前記ポリジメチルシロキサンの膜を挟んで圧着することにより貼り付けることを特徴とする請求項８に記載のマイクロ流路チップの製造方法。
請求項１乃至６の何れか一に記載のマイクロ流路チップを用い、
前記第１開口部から細胞及び培養液を前記培養部に導入し、前記第２開口部から培養液を排出し、
前記培養部で細胞を培養することを含む細胞培養方法。
前記酸素透過膜の少なくとも一部を破ることによって前記窓部から前記培養部で培養された細胞を回収することを含む請求項１０に記載の細胞培養方法。