JP5961110B2 - 低分子サポート多能性細胞成育およびその方法 - Google Patents

低分子サポート多能性細胞成育およびその方法 Download PDF

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Description

関連出願
この出願は米国特許法に基づき２００９年４月２７日に出願した米国仮出願番号６１／１７２，９９８の優先権の利益を請求する。その全体の開示は本明細書中に参考として援用する。
本発明は低分子神経伝達物質(small molecule neurotransmitters)を少なくとも一部含む多能性幹細胞培地(pluripotent stem cell media)に関する。本発明は、特に、本質的には血清とフィーダを含まない定義された(defined)多能性幹細胞培地であって、少なくともノルエピネフリン、アセチルコリン、およびドーパミンの１つを含み、多分化能ヒト幹細胞の懸濁細胞凝集培養(suspension cell aggregate culture)をサポートする培地に関する。
発明の背景
多分化能ベース細胞補充療法の最終的な用途は、大量培養を可能にする方法と規制ガイドラインに対応する分化条件の発達を必要とするだろう。
アメリカ合衆国では、食品医薬品局（ＦＤＡ）はレビューワーのためのガイダンス案の形でガイダンスを発行した：ヒト体細胞治療治験新医薬品承認申請（ＩＮＤｓ）の化学、製造、およびコントロール（ＣＭＣ）レビューワーのための指示およびテンプレート；２１ＣＦＲ§１２７０および§１２７１の規定。ヨーロッパでは、細胞治療生産物のための要件が人間の胚幹（ｈＥＳ）細胞に適切な、いくつかの指示とガイドラインに概説されている。指示２００４／２３／ＥＣ、指示委員会 ２００６／１７／ＥＣおよび２００６／８６／Ｅ、ＥＵ 規定１３９４／２００７、ガイドラインＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／４１０８６９を参照。これらは本明細書に参考として全体を援用する。各国には、人体組織および細胞の寄付、調達、試験、処理、保存、貯蔵および分配を含む品質と安全についての標準規制がある。規制は開発、製造および品質管理、並びに細胞ベースの医薬品の非臨床の、および臨床の開発のためのガイドラインを確立する。C. Unger et al.(2008),Human Molecular Genetics 17(R1):R48-R53を参照されたい。
規制ガイドラインは製造規模生産幹細胞とそれの生産物のために多くのハードルを作る。例えば、未分化状態で生体外に多能性細胞を維持するために、調査研究はまだマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダーやウシ胎仔血清（ＦＢＳ）などの畜産物を使っている。多分化能を維持するための他の細胞培養条件は、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｒ（ＫＳＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの血清代用品を含んでいる。Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅは、より定義されているが、未知化合物や、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ血清の脂質豊富なアルブミン分画（ＡｌｂｕＭＡＸ）などを含む複雑なクルードの混合物を含む。さらに、血清バッチは彼らの活性、したがって、彼らの多分化能の未分化型細胞培養を維持する能力において異なる。したがって、非動物由来の（「異物性なし（xeno-free）」）定義された成分でのウシ血清の置換は、多能性細胞のＧＭＰ生産のために好ましい。
出願人は、以前に、ＩＧＦ１、インシュリン、ＥＲＢＢ２、およびＥＲＢＢ３ 受容体の活性化が、増殖性ｈＥＳ細胞の顕著な特徴であることを決定した。ＩＧＦ１Ｒ／ＩＲ活性化は、血清中のＩＧＦ１または、例えばさまざまな生育条件における血清代用品またはＮ２／Ｂ２７細胞培養サプリメント中のマイクログラム／ｍｌ濃度のインスリンの結果と考えることができた。これらの活性は強いＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ信号を提供する、そして、ＬＲ３−ＩＧＦ１、ＩＧＦ１類似物の低い濃度で同等な活性化が実現できた。McLean et al., 2007 Stem Cells 25, 29-38を参照。ＥＲＢＢ２／３のリン酸化はＭＥＦ−ＣＭ中のＥＧＦファミリーメンバー、ヘレグリン／ニューレグリンの活性と一致していた。Wang et al., 2007 Blood 110, 4111-9を参照。アクチビンおよびＦＧＦシグナリングの低分子阻害剤のように、ｈＥＳ細胞のＩＧＦ１ＲおよびＥＲＢＢ２の影響を受けた自己再生の阻害が起こる。Robins and Schulz, 2009, “Novel methods of Stem Cell Culture and Maintenance:Media and extra cellular matrix requirements for large scale ESC growth.”を参照。Emerging Technology Platforms for Stem Cells (eds. U. Lakshmipathy J. D. Chesnut and B. Thyagarajan, pp. 251-247) Hoboken.John Wiley & Sons Inc.;and Vallier et al., 2005 J Cell Sci 118, 4495-509)を参照。この定義された培地は開発されＤＣ−ＨＡＩＦと呼ばれた。これはＤＭＥＭ／Ｆ１２、非必須アミノ酸、微量元素、アスコルビン酸、β−メカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン（任意）からなり、タンパク質はカプリル酸で抽出された脂肪酸のないＢＳＡ、鉄結合性グロブリン、組換え型のヘレグリン−１β（Ｈ）、アクチビンＡ（Ａ）、ＬＲ３−ＩＧＦ１（Ｉ）、およびＦＧＦ２（Ｆ）のみである。ＤＣ−ＨＡＩＦは多分化能ｈＥＳ細胞の長期維持、および単独細胞継代、ACCUTASE（登録商標）を使用したスケーリングされたｈＥＳ細胞のエキスパンションをサポートした。上記のRobins and Schulz (2009) ; 上記のWang et al.,を参照。ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標） ｈＥＳ細胞ＳＦＭという商号でＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のライセンスの下で販売される、ＤＣ−ＨＡＩＦのバッチ試験用の市販の配合物が利用可能である。
まだ、代替および／または追加の、例えば、ｈＥＳ、ｉＰＳ細胞のような、多能性幹細胞における重大な機能を有するシグナリング経路を同定する必要性は残っている。それは治療目的で使用できる。培養組成物は、ＧＭＰ規格に定義されおよび／または製造される。
本発明は少なくともノルエピネフリンとドーパミンを含み、血清を本質的に含まない、多能性細胞成育のための基本栄養塩溶液を含む組成物に関する。
図面の簡単な説明
ｈＥＳ細胞における化合物スクリーニングで同定された神経伝達物質／ホルモン受容体の拮抗体／モジュレータを示す。一次的なライブラリスクリーニングのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色は細胞への影響、無し（＋＋＋集密的に成長）、中程度の効果（＋＋）、または大きな効果（＋）を示す。細胞がまれ（＋／−）、細胞無し（−）も示す。一次的なスクリーニングで同定された受容体アンタゴニストも示されている（左のコラム）。スクリーニングは、１０マイクロＭの化合物を使用して実行された。二次的投与量滴定分析が示される（５０−０．１ マイクロＭのカラム）、およびそれぞれの化合物と動作により標的にされた受容体のクラスを示す。
ｈＥＳ細胞（例えば、ＢＧＯ２ 細胞）の低密度平板培養アッセイ。１００００細胞／ウェルで、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標） ｈＥＳＣ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中、６−ウエルトレイ内で培養され、７日後にアルカリホスファターゼ（ＡＰ＋）染色された。Ｙ（Ｙ２７６３２）、ＡＣｈ（アセチルコリン）、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）、ＮＥ（（−）−ノルエピネフリン）、ＮＥ．Ｂｉｔ（（＋／−）−ノルエピネフリン（＋）−酒石酸水素塩）。化合物は示されるように１０または５０マイクロＭで加えられた。
ｈＥＳ細胞の低密度平板培養アッセイ。（Ａ）２００−１００００細胞／ウエルで、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標） ｈＥＳＣ ＳＦＭ培地中、またはＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標） ｈＥＳＣ ＳＦＭ＋５０マイクロＭ ＮＥもしくは＋５０マイクロＭ−ＡＣｈ中、６−ウエルトレイ内で培養され、８日後にアルカリホスファターゼ（ＡＰ＋）染色された。比較コロニー計数値を示す。ＡＣｈ（アセチルコリン）、ＮＥ（（±）ノルエピネフリン（＋）酒石酸水素塩）。（Ｂ）平板培養から低細胞濃度で導かれて、ＮＥまたはＡＣｈ（５日目の）によってサポートされたｈＥＳ細胞コロニーの未分化型形態。
ＲＴ−ＣＥＳインピーダンスリーダーを使用するＮＥとＡＣｈの滴定。１０００ ｈＥＳ細胞／ウェルで、低分子の示した濃度（マイクロＭ）を含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ内で培養された。そのようなアッセイでは、細胞指標が上昇するタイミングは、低密度で生き残っていて、膨張する細胞の割合に関連する。一般に、ＮＥとＡＣｈの濃度の増加が、細胞指数を速く上昇させる。約１６０時間におけるインピーダンスのスパイクは、人為的事象および誤りである。
低い細胞濃度検定方法における、低分子類化合物の組み合わせの効果。（Ａ）１０００ｈＥＳ細胞／ウエルで、５０マイクロＭ（ＮＥ、ＡＣｈ、アデノシン、ＧＡＢＡ）または１０マイクロＭ（Ｙ２７６３２）の低分子を含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ中で培養された。アッセイは、５日間ＲＴ−ＣＥＳシステムを使用して行われた。トレースの４つのグループが観測された：最も効果的な化合物／組み合わせは、ＮＥ／アデノシンと、ＮＥ／ＡＣｈであった。中間的グループは個別要素としてはＮＥとＡＣｈであり、他のいくつかの組み合わせを含んでいた。低水準グループはアデノシン、ＧＡＢＡ単独と、いくつかの有効でなかった要素／組み合わせであった。（Ｂ）観察された活性の要約。相対格付け（−から＋＋＋）は、低密度の成長におけるサポートの有効性を示し、灰色の欄は相乗作用を示し、黒い欄は拮抗を示す。
ｈＥＳ細胞の低密度生存をサポートする追加の神経伝達物質と関連化合物。１０００ｈＥＳ細胞／ウエルで、ヘレグリン（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）、ＩＧＦ１、およびアクチビン（ＨＩＡ）と示された低分子を含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ中でプレートされた。（Ａ）低密度生存をサポートする追加アデノシンとアドレナリン受容体（Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ）アゴニストの同定。化合物は１０マイクロＭでテストされた。ＤＭＳＯトレースは平均８つのウェルである。（Ｂ）同定された化合物の情報について表にした。（Ｃ）ｈＥＳ細胞の、ドーパミン、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）、およびセロトニンでサポートされた低密度生存。化合物は示した濃度でテストされた。約１６０時間におけるインピーダンスのスパイクは、人為的事象および誤りである。
アクチビンの非存在時の改良された低い細胞濃度生存。１０００ｈＥＳ細胞／ウエルで、示された増殖因子と低分子の組み合わせを含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭで培養された。ヘレグリン（Ｈ）、ＬＲ３−ＩＧＦ１（Ｉ）、アクチビン（Ａ）。
低密度生存／コロニー形成へのアクチビンの効果のコロニー計数法アッセイ（Ａ）１００００ｈＥＳ細胞が示された増殖因子と低分子の示された組み合わせを含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭで培養された。７日後にアルカリホスファターゼ活性染色された。ＡＰ＋コロニーが数えられた。明確に、アクチビンが低密度培養に持っているネガティブ効果が示された。（Ｂ）それぞれの増殖因子背景における、＋ＮＥと＋ＡＣｈ条件の顕微鏡写真。アクチビンがないとき、コロニーは非常に堅固で未分化細胞の原型であった。
増殖因子と神経伝達物質の組み合わせの低密度ＲＴ−ＣＥＳ検定方法１０００ｈＥＳ細胞／ウエルは示された増殖因子と低分子の示した組み合わせを含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭで培養された。ヘレグリン（Ｈ）、ＬＲ３−ＩＧＦ１（Ｉ）、アクチビン（Ａ）。低分子は５０マイクロＭでテストされた。
ｈＥＳ細胞の浮遊培養におけるＮＥとＡＣｈの効果（Ａ）５×１０６のＣｙＴ４９細胞が、ローアタッチメント６ウェルのトレーに、５０マイクロＭで、ヘレグリン、ＬＲ３−ＩＧＦ１、アクチビン、および示した神経伝達物質を含む５ｍｌのＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ内にシードされて、１００ｒｐｍで培養された。未分化型懸濁集団は４日目に画像化された。（Ｂ）それぞれの条件で、シード後２４時間で２つのウェルが収穫され、生存細胞数を測定するために数えられた。（Ｃ）培養が４日目に分割されたときのそれぞれの条件の細胞数。（Ｄ）（Ａ）におけるイメージは、ＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア計測ツールを使用することで集団直径を決定するのに使用された。それぞれの条件からの５０−１００集団からの平均直径と標準偏差が示されている。（Ｅ）１継代細胞計算データ（Ａ）のｐ０細胞からの５×１０６のＣｙＴ４９ ｈＥＳ細胞が同じ条件でシードされた。Ｙ２７６３２を含む条件における集団はより大きく、最も大きい集団のセンターが壊死性になる前に、シード後３日で継代しなければならなかった。逆に、他の条件は継代の前に６日間培養され、より多い細胞数をもたらした。
懸濁ｈＥＳ細胞がＮＥ、ＮＥ／ＡＣｈまたはＮＥ／ＡＣｈで培養され、未分化型のままで残っていた。ＣｙＴ４９細胞はＮＥ、ＮＥ／ＡＣｈまたはＮＥ／ＡＣｈの存在下で懸濁集団として、分化モルホロジーなしで１６継代育てられた。ｐ１０の後に、いくつかの細胞が、接着培養に再プレートされ、ＯＣＴ４とＴｒａ−１−６１について核型分析および免疫けい光染色によって調べられた。すべての培養が未分化型のままで残って、これらの多分化能マーカーが均一に発現した。（ＳＰ）ＳｔｅｍＰｒｏ ＳＦＭ ＨＩＡ、ＮＥ（＋５０マイクロＭにおけるＮＥ）、ＡＣｈ（＋５０マイクロＭにおけるＡＣｈ）、ＮＥ／ＡＣｈ（＋５０マイクロＭにおけるＮＥ／ＡＣｈ）。核型データは右に示されている。ＳＰとＳＰ＋ＮＥ培養は核型的に正常であった。ＡＣｈ含有培養物は異数体であった。
標準密度の短期間インピーダンス検定方法でのｈＥＳ細胞（例えば、ＢＧ０２）をサポートするＮＥと成長因子の組み合わせ（Ａ）１０４ＢＧ０２細胞／ウエルで５０マイクロＭのＮＥと増殖因子の示した組み合わせを含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ含有培地で培養された。ヘレグリン（Ｈ）、ＬＲ３−ＩＧＦ１（Ｉ）、アクチビン（Ａ）、ＦＧＦ２（Ｆ）。低細胞濃度における結果と対照的に、ＮＥはいくつかの条件ではヘレグリンの非存在下で培養のエキスパンションをサポートした。そのような支持性組み合わせはＮＥ／ＡＩＦ、ＮＥ／ＩＦ、ＮＥ／ＩＡ、およびＮＥ／Ｉを含む。（Ｂ）５０〜６０時間（Ａのライン）の平板培養後の細胞指数の傾斜の測定値が示されている。最小量の増殖だけを示している条件（ＮＥ／Ｆ）と比べて、他の条件は細胞指数の有効な増大を示した。これは集団のエキスパンションを示している。
標準の密度でｈＥＳ細胞（例えば、ＢＧ０１細胞）の連続継代をサポートするノルエピネフリンと増殖因子の組み合わせ。連続培養の間のｈＥＳ細胞の相対エキスパンション。５×１０５のｈＥＳ細胞ウエルが、６ウェルトレーの中で５０マイクロＭ ＮＥと示した増殖因子の組み合わせを含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ培地で、それぞれの継代において培養された。ヘレグリン（Ｈ）、ＬＲ３−ＩＧＦ１（Ｉ）、アクチビン（Ａ）、ＦＧＦ２（Ｆ）。エキスパンションをサポートした条件について、それぞれの継代の最後の細胞数がプロットされる。二重破線はそれぞれの継代で培養された細胞数を表す。ＨＡＩＦコントロール培養と比べて、ヘレグリン（ＡＩＦ）の欠如は多継代で成長を減少させた。コロニー増殖は、ウェルの密にパックされた外側のリングで観測されたが、皿全体に観測されたというわけではない。ＩＦだけに露出された培養物は、２継代の後に有効に維持できなかった。この細胞ラインのアクチビン／ノーダルシグナリングの必要が確認された。ＮＥの存在はＡＩＦ条件における増殖へ実質的に肯定的な影響を持ち、ＨＡＩＦ条件に類似する培養増殖と形態も可能にした。ＮＥはアクチビン／ノーダルの要求の代わりをすることができなかった。いくつかの継代にわたってＩＦ／ＮＥ条件では分化したからである。
標準の密度でｈＥＳ細胞の連続継代をサポートするノルエピネフリンと増殖因子の組み合わせ。連続培養の間のｈＥＳ細胞の相対的エキスパンション。５×１０５ｈＥＳ細胞／ウエルで、６ウェルトレー中で、５０マイクロＭのＮＥと示した増殖因子混合物を含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭにおいてそれぞれの継代において培養された。それぞれの継代の最後の細胞数がプロットされた。二重破線はそれぞれの継代でプレートされた細胞数を表す。ヘレグリン（Ｈ）、ＬＲ３−ＩＧＦ１（Ｉ）、アクチビン（Ａ）、ＦＧＦ２（Ｆ）。また継代２では、ＡＩＦ培地がＡＩまたはＡＩ／ＮＥの余分なウェルをセットするために使用された。ＨＡＩＦコントロール培地と比べて、ヘレグリン（ＡＩＦ）の欠如は形態変化をもたらした。細胞は未分化細胞の特性を保有したが、外観では、それらは、より平坦であって、より大きかった。細胞の間には、より大きなギャップがあった。同様の形態はすべてのアクチビン（ヘレグリンの非存在下）含有培地で観測された。ＩＦにおけるコロニーは、非常に堅固でドーム型であり、標準のマウス胚性幹細胞培養物の形態とより類似していた。ＩＦ／ＮＥおよびＩＦ／ＮＥ／ノギン中の培養物は例外的な形態を示し、堅固な上皮性のコロニーを有し明白な未分化を示さなかった。
ＮＥと単純化された増殖因子の組み合わせを含む定義された培地でのｈＥＳ細胞連続継代における多分化能マーカーの発現。説明したように（図１４）、４つの継代で培養された人間の胚性幹細胞は、スライド上で培養され、エキスパンドされ、示したマーカーについて免疫染色された。ＩＦ中、ＩＦ／ＮＥ中（並びにＡＩＦおよびＡＩＦ／ＮＥ、図示せず）でエキスパンドした培養物は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０をはじめとする、多分化能のマーカーの発現の予想されたプロファイルを保有した。
ｈＥＳ細胞および膵性内胚葉への分化の間における、アドレナリン受容体発現のｑＰＣＲ分析。遺伝子名は識別子に使用される（例えば、ＡＤＲＡ１Ａはａｌｐｈａ１Ａ−アドレナリン受容体を示す）。膵臓の分化のためのｈＥＳ細胞試料が、１日ごとの分化について示される：ｄ０、未分化 ｈＥＳ細胞；ｄ２／３ 内胚葉分化；ｄ５／７ 原始腸管；ｄ７／９ 後期前腸；ｄ１１ 膵臓内胚葉。 チャートはｄ０ ｈＥＳ細胞試料の倍率として示されている。このサンプルのためのしきい値交差ポイントは、異なったアドレナリン受容体の間の相対発現水準を示唆するために示される。ＢＧ０１、ＢＧ０２、およびＣｙＴ４９細胞を含むｈＥＳ細胞に関する追加サンプルが示される。ＡＤＲＢ１、ＡＤＲＢ２、ＡＤＲＡ２Ｂ、およびＡＤＲＡ１Ｄは、未分化型ｈＥＳ細胞において最も多いアドレナリン受容体を発現し、最も一貫しているように見えた。ＡＤＲＡ２Ｃは、ｈＥＳ細胞試料中で一貫して発現されるが、低レベルで発現されるのに対し、ＡＤＲＡ１ＡとＡＤＲＡ１Ｂは単に低水準であり、または未分化細胞中で一貫性無く検出されただけである。
アドレナリン受容体の阻害は低密度でｈＥＳ細胞の生存とエキスパンションに影響を与える。２０００ＢＧ０２細胞／ウエルの低密度培養が、ヘレグリン、アクチビン、ＬＲ３−ＩＧＦ１、および５０マイクロＭ ＮＥを含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ内で培養され、７日間インピーダンスリーダー内でモニターされた。それぞれのコントロールの８つのウェルが含まれ、ＤＭＳＯ（ネガティブコントロール）、またはＤＭＳＯ／５０マイクロＭ ＮＥ（ＮＥコントロール）が含まれた。アルファまたはベータアドレナリン受容体の４０個の異なった阻害剤が、低密度でｈＥＳ細胞のＮＥ媒介性生存／エキスパンションへのネガティブ効果をくつがえすことができるかどうか、２回づつテストされた。７つのアドレナリン受容体拮抗薬（Ａｎｔ．）、５つのβ−アドレナリン受容体拮抗薬、および２つのβアドレナリン受容体遮断薬が、ｈＥＳ細胞に影響を与えたと同定された。それぞれの活性物質の名前、活性、知られている選択性、および説明を示す。
低密度でｈＥＳ細胞内で重要な機能を有する追加シグナリング経路にハイライトを当てるために、公知の生理活性を有する化合物の低分子ライブラリが、培養エキスパンションおよび／または、多分化能に否定的な影響を与えるものを同定するためにスクリーニングされた。主要な系路の阻害がそのようなアッセイにおける遅くされた増殖、細胞障害性、アポプトーシスまたは分化をもたらすと予想されるだろう。重要なことには、このスクリーニングは単純に定義された培地を背景として実行され、血清または準分別されたアルブミンなどの未定義の、または、可変な成分によって典型的に導入される非一貫性を抑制した。単純なアルカリ性ホスファターゼ染色アッセイが、ｈＥＳ細胞成育に影響を与えた約５０の化合物を決定するのに使用された。細胞表面神経伝達物質受容体の多数の阻害剤は同定され、これらの受容体について自己再生シグナリングの役割を示唆した。天然由来のリガンドまたは薬品作用関連誘導体を使用して、数種類の低分子神経伝達物質（また、ホルモンまたはモジュレータ(modulator)として機能できる）は、低密度で育てられたｈＥＳ細胞の生存および／または、エキスパンションをサポートすることがわかった。ｈＥＳ細胞の商業的、そして、臨床の用途に関して開発される先進技術にそのような活性は重要である場合がある。これらの例としては、たとえば信頼できる単独細胞クローニング、完全に定義されて、ＧＭＰ対応条件下の新しいｈＥＳ細胞ラインの効率的な導出や、継代時の懸濁培養におけるｈＥＳ細胞の成長や向上した生育性などがあげられる。
定義
特記のない場合、本願発明明細書で使用される用語は、関連技術における当業者によって理解される通常の使用法による。また、以下に提供された用語の定義に加えて、分子生物学の一般的な定義は以下に見られる。Rieger et al., 1991 Glossary of genetics:classical and molecular, 5th Ed., Berlin:Springer-Verlag;Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 補足)。単数形の表記が明細書と特許請求の範囲において使用される場合、それが使用されている文脈に基づいて、１つまたはそれ以上の意味であることが理解されるべきである。したがって、たとえば、「細胞」は少なくとも１つ、２つまたは多数の細胞を意味することができる。
また明細書および特許請求の範囲において、特記の無い限り、成分の量、物質の割合または比率、反応条件および他の数値については、すべての場合に“約”という用語によって修飾されるものとして理解される。反する記述のない限り、明細書および特許請求の範囲において記載される数値パラメータは近似値であり、本発明により得られることが求められるものに応じて変化することができる。少なくとも、特許請求の範囲について均等論の適用を制限するものではなく、それぞれの数値パラメータは少なくとも有効数字として報告されており、通常の丸めの技術によっている。
「約」という本明細書に使用される用語は、“約”が付された数が、示された数字のプラスマイナス１−１０％を含むことを意味する。例えば、約５０のヌクレオチドは、４５−５５のヌクレオチドまたは状況に依存して４９−５１のヌクレオチドを意味できる。本明細書では、「４５−５５」などの数値範囲は、範囲内のそれぞれの整数を呼ぶ。例えば、「４５−５５％」は、割合が４５％、４６％、などと増え、５５％を含むことを意味する。本明細書に記載された範囲内が、たとえば「１．２％から１０．５％」のように小数点を含む場合、その範囲は特定の範囲内で示した中で最も小さい増分のそれぞれの少数値について言及する。例えば、「１．２％から１０．５％」の場合には、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、であることができ、１０．５％を含む。また「１．２０％から１０．５０％」は、１．２０％、１．２１％、１．２２％、１．２３％であることができ、１０．５０％を含む。
また、典型的な製造規模の懸濁培養は細胞濃度を最大にしつつ、細胞生存率を維持するための方法として培地の連続かん流(continuous perfusion)を利用する。このような関係においては、培地交換は接着細胞と懸濁集合体に異なった影響の流体せん断を与える。培地流れが細胞表面を横切って流れるとき、不動化された接着細胞は流体せん断応力を受けることがある。対照的に、懸濁集合体は集合体表面を横切るせん断応力をほとんど受けない。集合体が適用されたせん断力に対応して自由に崩れることができるからである。長期間のせん断応力が接着胚性幹細胞に有害であり、懸濁している集合体の形式が最適な生存および機能のために好しいことが予想される。多能性幹細胞、および／または、多能性幹細胞（pluripotent stem cells）から由来されるマルチポーネント前駆細胞(multipotent progenitor cells)の生産のための効率的な製造プロセスと、せん断速度とせん断応力に関連する上記の観測された機構の必要性に基づく必要性が存在している。本発明は、初めて多能性幹細胞の製造方法、および／または、懸濁液形式、特には細胞集合体懸濁液形における多能性幹細胞から誘導されたマルチポーネント前駆細胞の生産のための製造方法を提供する。
本明細書において使用される時、「単独細胞懸濁液(single cell suspension)」またはその同等な表現は、すべての機械的、生物学的または化学的手段により調製することができる、流体と細胞の混合物、より典型的には流体と互いに分離された複数の細胞の混合物を意味する。本明細書における単独細胞懸濁液は典型的には、生理学的溶液、たとえば基本塩類溶液、塩水、細胞培地、または同様のものなどの中に懸濁された生育可能なｈＥＳ細胞またはｈＥＳ−由来の細胞を含むものをいう。細胞集塊を解離して、第１次組織、培養物中の接着細胞および集合体から、単独細胞懸濁液を形成するためにはいくつかの方法が存在し、例えば、物理的力（細胞スクレーパ、狭口径ピペット、細針吸引、渦離解、および細かいナイロンまたはステンレスメッシュを通した強制濾過などによる摩砕などの機械的な解離）、酵素（トリプシン、コラゲナーゼ、アキュターゼ(Acutase)などによる酵素的な解離）、または両者の併用があげられる。さらに、ｈＥＳ細胞の単独細胞への解離を支持するために役立つ方法および培養培地条件は、エキスパンション、細胞選別、マルチウェルプレート検定のための定義されたシーディングのために有用であり、培養手順とクローンエキスパンジョンの自動化を可能にする。したがって、本発明の１つの実施態様は、長期の維持と未分化の多分化能ｈＥＳ細胞または分化型ｈＥＳ細胞の効率的なエキスパンションをサポートすることができる、単独細胞の安定した酵素学的解離ｈＥＳ細胞またはｈＥＳ−由来細胞培養系を発生させるための方法を提供する。
本明細書において使用される時、「接触」という用語（すなわち、細胞、例えば、分化可能な細胞と化合物との接触）は、化合物と細胞を一緒に生体外（例えば、培養物中で化合物を細胞に追加する）でインキュベートすることを含んでいることを意図する。「接触」という用語は、対象中で自然に起こることがある、成分、化合物、成長因子など（たとえば神経伝達物質、ＥｒｂＢ３リガンド、およびＴＧＦ−βファミリーのメンバー）を含む定義された細胞媒地への細胞のｉｎ ｖｉｖｏ暴露（すなわち、天然の生理学的過程の結果、起こることがある暴露）を含めないことを意図する。神経伝達物質、ＥｒｂＢ３リガンド、およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含む定義された細胞培地と細胞が接触するステップは、上記の成分と細胞が接触し暴露されると理解される。例えば、接着培養、または懸濁培養で細胞をインキュベートすることにより細胞を接触させることができる。細胞を安定させるか、または細胞を分化するために、定義された培地と接触された細胞は、さらに細胞分化環境で処理できることが理解される。
細胞培養の文脈で本明細書に使用される「サポート」または支持は、培地組成物とそれの具体的成分を示し、細胞培養の所望の成長、生育、多分化能および／または、他の特性に十分なものである。したがって、ｈＥＳ細胞の未分化型エキスパンションをサポートする定義された培地は、ｈＥＳ細胞がそこに追加要素も、化合物も、添加物もまたは同様のものもなしで培養されるとき細胞が分化しないで成長するものである。ｈＥＳ細胞のエキスパンションをサポートする化合物または要素は、説明されたメディア条件に加えられるとｈＥＳ細胞が成長できるものである。
本明細書において使用される時、「定義された細胞培養培地」は「定義された培養培地」、および「定義された培地」は、互換性を持って使用され、実質的に同様の特性で忠実に再生できる無機および有機の成分（生物学的および生活性の成分を含む）の特定の比、量または活性で含む水性の組成物について言及する。定義された培地はタンパク質、望ましくは組換蛋白質を含むことができる。ただし、それらが有意のロット間変動またはバッチ間変動なくそれらを調製するか、または精製できることが条件である。動物の血清は、本来定義できず、可変であるので、定義された培地は血清を含まない。しかしながら、個別の高度に精製された血清または他のタンパク質、要素などは、所定量、または質量、モル当量または活性（例えば、測定できる生物活性）に比例して含むことができる。
本明細書において使用される時、「分化」という用語は、それが由来する細胞タイプよりも、より分化された型である細胞タイプの生産について言及する。したがって、用語は部分的にまたは最終的に分化された細胞形を包含する。一般に、ｈＥＳ細胞から得られた分化細胞とは、ｈＥＳ−由来細胞、ｈＥＳ−由来細胞集合体培養物、ｈＥＳ−由来単独細胞懸濁液、またはｈＥＳ−由来細胞接着培養物、および同様のものをいう。
本明細書において使用される時、「実質的に」の用語は、大きい範囲又は程度をいい、たとえば方法において「実質的に同様」の用語が使用される場合には、大きい範囲又は程度において他の方法と類似する方法をいう。本明細書に使用される場合、例えば「実質的に含まない」（たとえば「実質的に汚染物を含まない」、「実質的に血清を含まない」、「インスリンまたはインスリン様増殖因子を実質的に含まない」）、またはそれの同等表現は、溶液、培地、サプリメントおよび賦形剤なとが少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％、血清、汚染物または同等物を含まないことを意味する。１つの実施態様では、血清を含まない、１００％血清を含まない、または実質的に血清を含まない定義された培地が提供される。逆に、組成物、プロセス、方法、溶液、培地、サプリメント、賦形剤、および同様のものが、「実質的に同様である」またはそれと同等の表現が記載された場合には、組成物、プロセス、方法、溶液、培地、サプリメント、賦形剤、および同様のものが、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、本明細書で先に記載された組成物、プロセス、方法、溶液、培地、サプリメント、賦形剤、または先に記載された方法と、また全体として本明細書に組み込まれた方法と類似することをいう。
本発明のある実施態様では、「富化された」という用語は、希望の細胞リネッジ(cell lineage)を約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上で含む細胞培養物をいう。
本明細書において使用される時、化合物の「有効な量」という用語またはそれと同等の表現は、フィーダー細胞がないときまたは血清もしくは血清代替物がないときに、１カ月以上、２カ月以上、３カ月以上、４カ月以上、５カ月以上、および／または６カ月以上分化可能な細胞培地の安定化のような所望の結果に作用するように、定義された培地の成分中に存在する化合物の十分な量をいう。本発明の他の態様では、化合物の「有効な量」という用語またはそれと同等の表現は、フィーダー細胞の非存在下または血清もしくは血清代替物の非存在下において５、１０、１５、２０、２５、３０または４０継代よりも長く、多能性細胞培養の安定化に有効な成分が残存するに十分な化合物の濃度を示すことができる。同様に、この濃度は当業者によって容易に決定される。
本明細書において使用される時、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドの転写および／または細胞の中のポリペプチドの翻訳についていい、分子のレベルは分子を発現する細胞では分子を発現しない細胞よりも測定可能に高くされる。分子の発現を測定する方法は、当業者にとって周知であり、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ウェスタンブロット法、および免疫染色があげられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書において使用される時、細胞、細胞ライン、細胞培養または細胞のポピュレーションについて述べる時、「単離された(isolated)」という用語は、細胞の天然源から実質的に分離され、細胞、細胞ライン、細胞培養、または細胞ポピュレーションが生体外で培養できるようにされることをいう。さらに、「単離」という用語は、二個以上の細胞のグループからの１種以上の細胞の物理的分離についていい、細胞は細胞のモルホロジーおよび／または様々なマーカーの発現に基づいて選択される。
本発明は、以下の本発明の好ましい実施態様の詳細な説明ならびにそこに含まれる実施例を参照することでさらによく理解され得る。しかしながら、本発明にかかる組成物と方法について説明する前に、本発明は特定の核酸、特定のポリペプチド、特定の細胞型、特定の宿主細胞、特定の条件、または特定の方法などに限定されないことが理解されるべきである。当業者には当然、種々の改良と変更が明らかである。
Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed.) 1979 Meth. Enzymol. 68; Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; and Setlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York. Lastly, を参照されたい。
使用される略語と用語体系は、この分野で標準であると考えられて、本明細書に引用されたものなどの専門雑誌で一般的に使用される。本発明は、非常に精製された増殖因子を含む定義された培地組成物（例えば、ＤＣ−ＨＡＩＦ培地）は、分化を起こさずに多分化能性幹細胞のエキスパンションをサポートするのに使用できるという本出願人の先の知見に基づいている。本発明は、生育性、成長、多分化能および自己再生に重要なシグナル伝達経路に影響する低分子有機化合物を含んでいる定義された培地を提供する。ｈＥＳ細胞の生育性、成長または潜在活性を減少させる、薬学的に活性な化合物のライブラリのスクリーニングにより、様々な系路がこの点で重要であるとして同定された。知られている活性に従って、これらの化合物は分類された。同定された系路は、神経伝達物質受容体により大きな割合で仲介されることが同定された。具体的には、化合物の多くが、多分化能性幹細胞の成長にマイナスの影響があると同定され、神経伝達物質受容体の拮抗体であるとされた。
本明細書において使用される時、「神経伝達物質」または「内因性神経伝達物質」の用語は、励起したときにニューロンの軸索の末端から放出され、シナプス間隙を横切って移動し、標的細胞（例えば、シナプス後ニューロン、樹枝状終点）を励起するかまたは抑制する物質をいう。神経伝達物質は、低分子化合物（すなわち、＜＝８００ダルトン）であり、たとえばモノアミンおよびアミノ酸、並びにより大きな分子、たとえばぺプチドを含む。一般的な低分子神経伝達物質としては以下が挙げられる。
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神経伝達物質は典型的に７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体（7-transmembrane G-protein-coupled receptors）である標的細胞上の受容体（すなわち、「神経伝達物質受容体」）に結合する。神経伝達物質受容体の例としては：アドレナリン作動性、ドーパミン作動性、グリシン作動性、グルタミン作動性、ＧＡＢＡ作動性、ヒスタミン作動性、コリン作動性、およびセロトニン作動性神経伝達物質受容体があげられる。ある神経伝達物質はシナプスから離れて拡散し、「神経調節(neuromodulation)」として知られているプロセスで複数のニューロンに影響を与え、または他の細胞または受容体に「ホルモン」としての行動する。
大量の薬学的に活性な薬物は、低分子神経伝達物質受容体リガンドであり、たとえばアゴニスト、拮抗体、モジュレータ等である。
本明細書において使用される時、「リガンド」は受容体などの生物学的分子に結合する化学的を示す。本明細書において使用される時、「アゴニスト」は細胞の受容体に結合して、細胞による反応の引き金となるリガンドを示し、「拮抗体」は、受容体に結合し、アゴニストの結合をプロックすることにより細胞の反応を抑制するリガンドをいう。
多分化能性幹細胞の成長、特に低細胞濃度においてポジティブな効果を持っている化合物を同定するために、低分子薬剤化合物ライブラリのサブセットが、定義された培地ＤＣ−ＨＡＩＦ内で低細胞濃度でｈＥＳの成長をサポートする能力を持っている化合物についてスクリーニングされた。神経伝達物質拮抗物質がネガティブにｈＥＳ細胞成育に影響を与える場合、同じ受容体のアゴニストまたは内因性リガンドがポジティブにｈＥＳ細胞に影響を与えることができると推論された。以下の実施例２と３に記載されるように、低細胞濃度でｈＥＳ細胞成育をサポートしたさまざまな物質が同定された。特異的に、神経伝達物質ノルエピネフリン、アセチルコリン、ドーパミン、セロトニン、およびアデノシンは、定義された培地に加えられると、多分化能性幹細胞の低密度生存とエキスパンションをサポートする候補として同定された。
したがって、本発明は基本栄養塩溶液、増殖因子、並びにノルエピネフリン、アセチルコリン、ドーパミン、セロトニン、およびアデノシンから選択された１種以上の神経伝達物質を含む、定義された培地を提供する。また本発明は、神経伝達物質誘導体、変異体、代謝物、構造類似体、塩、および同様のものを含む、天然由来または人工の低分子の神経伝達物質受容体のアゴニスト、拮抗体、リガンド、およびモジュレータを含む定義された培地を提供する。本発明の１つの態様では、媒質はＤＣ−ＨＡＩＦであり、神経伝達物質はノルエピネフリンである。他の実施態様では、培地は２以上の神経伝達物質の組み合わせを含んでいる。例えば、一定の条件の下で、ノルエピネフリンとアセチルコリンの組み合わせはｈＥＳ細胞成育を刺激するために相乗効果的に行動するのがわかった。
本発明のある実施態様では、ノルエピネフリンと簡易型の増殖因子成分を有する定義された培地組成物を提供する。驚くべきことに、より高い（標準の）細胞濃度と比べて、ｈＥＳ細胞が低細胞濃度で培養されたときには、異なった増殖因子をノルエピネフリンおよび／または、他の小さい有機化合物に取り替えることができる。具体的には、標準細胞濃度では必要であることがわかっていたアクチビンは、低細胞濃度においては必ずしも必要ではなく、より高い細胞濃度でノルエピネフリンに置き換えることができた。
本明細書においては「標準細胞濃度」は、培地中で成長可能であって、エキスパンションができるのが典型的に知られている多分化能性幹細胞の濃度領域をいう。たとえば、ｈＥＳ細胞は典型的には、約１×１０５から約５×１０５細胞／ｍｌの濃度で培養され、約２．５×１０６から約５×１０７細胞／ｍｌの濃度になった時に分割されるか、または継代される。対照的に「低細胞濃度」は、標準細胞濃度よりかなり少ない細胞濃度で培養された多分化能性幹細胞をいう。当該技術分野で、ある閾値濃度より下で培養された細胞は、細胞分裂で立ち遅れを経験したり、または継代を乗り切れないことが周知である。１ｍｌあたり約５×１０４細胞／ｍｌまたはそれ以下で培養されたｈＥＳ細胞株は、低細胞濃度のものであると考えられる。
ある実施態様では、多能性細胞は細胞外マトリックス蛋白質（ＥＣＭ）、たとえばＭＡＴＲＩＧＥＬの存在下および／または非存在下において、本明細書に記載された定義された培地で培養される。ＥＣＭの非存在下で培養された多能性細胞は、約０．５〜１０％のヒト血清（ｈＳ）を含んでいるか、または３００Ｋおよび／または１００Ｋカットオフスピンカラム(Microcon，Millipore, Billerica, MA))からのｈＳ濃縮画分を含む。直接ｈＳまたはｈＳ濃縮画分を含む培地でｈＥＳ細胞を直接インキュベートすることによって、ｈＥＳ細胞集合体懸濁液を製造できる。ｈＳまたはｈＳ濃縮画分と培地容器を約３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、または２４時間、３７℃でインキュベートした後に、ｈＥＳ細胞集合体懸濁液を製造できる。ｈＳまたはｈＳ濃縮画分含有培地におけるｈＥＳ細胞のための培養効率は、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５に記載されている、ＤＣ−ＨＡＩＦで培養されたｈＥＳ細胞、またはＥＣＭとしてＭＡＴＲＩＧＥＬを使用してＤＣ−ＨＡＩＦ培地で培養されたｈＥＳ細胞、または他の類似する培地で培養されたｈＥＳ細胞において観察されたものと匹敵していた。実質的に血清を含まない定義された培地でｈＥＳ細胞を培養することが、２００９年４月２３日に出願された、米国出願番号２００９／０１０４６９６の、ヒト血清を含むフィーダーを含まない多能性幹細胞培地組成物と方法(METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER PLURIPOTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HUMAN SERUM)に記載され、これは本明細書の一部として組み込まれる。
異なる実施態様では、単層(monolayer)または集合体懸濁液の多能性細胞は実質的に血清を含まない培地で、外因的に付加された繊維芽細胞生長因子（ＦＧＦ）の非存在下で培養された。これはトムソンらの米国特許番号７，００５，２５２の、血清を含まない培地であるが、ＦＧＦをはじめとする外因的に付加された増殖因子を含む培地でｈＥＳ細胞を培養することを必要とする発明と区別される。
本明細書において使用される時、「分化可能な細胞」という用語は、少なくとも部分的に成熟した細胞に分化できる細胞または細胞集合、たとえば他の細胞との融合のような、少なくとも部分的に成熟した細胞へ分化できる細胞の分化に参加できるものを記載するために使用される。本明細書において使用される時、「少なくとも部分的に成熟している細胞(partially mature cells)」は、「前駆細胞(progenitor cells)」、「前駆体細胞(precusor cells)」、「マルチポーネント細胞(multipotent cells)」、「未熟細胞(immature cells)」、および最終分化(terminally differentiated)細胞を含む。少なくとも部分的に熟している細胞は、例えば、最終的な内はい葉細胞、ＰＤＸｌ陰性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸｌ陽性プレ膵性内はい葉細胞を含むＰＤＸｌ陽性膵性内はい葉細胞、ＰＤＸｌ陽性膵性内胚葉端細胞、またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１コ−ポジティブまたはＰＤＸ１／ＰＴＦ１Ａ コ−ポジティブ膵性内はい葉細胞、ＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２コ−ポジティブ細胞の陽性のマルチまたはシングル−ホルモン性分泌すい臓細胞を含む。すべてが、同じ臓器または組織からの成熟細胞の、たとえばモルホロジーまたは蛋白質発現などの遺伝表現型の少なくとも１つの特徴を示すが、さらに他の少なくとも１つの細胞タイプに分化できる。
さらに、胚様体（ＥＢｓ）を形成する他の方法を説明する。本明細書において使用される時、「胚様体(embryoid bodies)」、「集合体(aggregate bodies)」との用語またはそれと同等の表現は、ＥＳ細胞が単層培地中で過成長した時、または未定義の培地内の懸濁培養で維持されるか、または多発性胚葉組織に向けた非由来性のプロトコールを介して分化された時に現れる分化したおよび未分化の細胞の細胞集合体をいう。すなわち、ＥＢｓは、本明細書に記載されるような、多分化能性幹細胞の単独細胞懸濁液から形成されない。また、ＥＢｓはｈＥＳ−由来のマルチポーネント細胞の接着培養から形成されない。これらの特徴のみによっても、胚様体と本発明は明確に区別される。
胚様体は典型的にはモルホロジー的な評価基準により識別可能な、数個の胚葉である異なる細胞タイプの混合物である。ＥＳ細胞の培養で胚様体を形成した時に関する決定は、当技術分野の当業者によって例えば、モルホロジーの目視検査により、ルーチン的に行われる。培養条件に依存して、約２０以上の細胞の浮いた塊はＥＢｓであると考えられている。たとえばＳｃｈｍｉｔｔら、（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５，７２８−７４０；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら（１９８５）Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．８７、２７−４５を参照。また、用語は胚性生殖腺領域から抽出された初期の細胞である、始原生殖細胞から得られたものと等価の構造をも意味する。例えば、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，１３７２６を参照。また当技術分野で時々ＥＧ細胞または胚芽細胞と呼ばれる始原生殖細胞は、適切な因子群で処理されると、胚様体を誘導することができる多分化能胚性幹細胞を形成できる。例えば、米国特許番号５，６７０，３７２、および上記のＳｈａｍｂｌｏｔｔらを参照。
ＥＢｓを作るための様々な方法が存在している、例えば（２００８）ネイチャープロトコル３（５）：４６８−７７６に記載されたスピン胚様体(spin embryoid bodies)、上記のＢａｕｗｅｎｓ他（２００８）に記載されているような、マイクロパターンド細胞外マトリックスアイランド上にプレーティングされた単独細胞懸濁液からＥＢｓが形成される。しかしながら、これらの方法はｈＥＳ細胞およびｈＥＳによって由来された細胞の大規模な生産（製造）には、費用的に採算が合わず、それほど効率的でない。スケールアップ生産が実際に始まるまでに、あまりに多くの工程を必要とするからである。たとえば、Ｂａｕｗｅｎｓ他の方法では、細胞が懸濁培養を始めるために選択される前に、最初に低減した増殖因子ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）にｈＥＳ細胞をシードしなければならない。この方法の時間と費用は、カスタム設計されたマイクロ−パターンド組織培養プレートが必要であるので、厄介である。さらに、Ｎｇらの方法は、ｈＥＳ細胞とｈＥＳ−由来の細胞の大規模な製造には、より均一なＥＢを作成するために遠心分離機の使用が必要であり、費用効率的でない。最後に、これらのすべての方法論では、本発明のようには、細胞集合体は多分化能性幹細胞の単独細胞懸濁液から作られない。
胚様体は、３つの胚葉からの多数の細胞タイプで作られた細胞集合体であり、典型的には未分化型胚性幹細胞の集合体を非有向性分化シグナル(non-directed differentiation signals)、たとえば２０％のウシ胎仔血清などに暴露することによって作成される細胞集合体である。これは本発明で記載される細胞集合体とは異なる。この非有向性方法論の結果は、生体外で通常の胚成長をまねることを意図する細胞タイプの混合物である。このアプローチは基礎研究レベルで胚成長を調べることの役に立つが、それは細胞収率、集団のアイデンティティ、集団の純粋さ、バッチの一貫性、安全性、細胞機能、および商品原価が主要な関心であるところのすべての大規模な細胞治療製造プロセスには適用できない。そのうえ、胚様体から所定の細胞タイプを精製するのに使われた任意の富化作用戦略にかかわらず、分化プロトコールは単独細胞タイプの大集団を発生させる直接的なアプローチを提供しない。それに続いて、汚染物集団がいつも支配的であり、特定集団を精製するどんな試みも妨げるだろう。
多能性細胞の集合体を作成して、分化することへのすべての先行研究は、それらの方法論において以下のコンポーネンツの一個以上を有する：１）ヒト胚性幹細胞ではなくマウスの使用；２）通常の細胞接着過程ではなく、細胞を集合させるために遠心沈殿に依存する強制集合プロトコール；３）静的条件における、細胞塊の集合；４）非単独細胞解離または表面の細胞をこすり落とすことによる集合体の形成；および５）すべての胚様体と胚葉の細胞タイプの形成をもたらす、１５−２０％の胎児ウシ血清を使用する細胞集合体の非直接分化。我々の知識によれば、胚様体を分化するのに１５−２０％のＦＣＳを利用しない唯一の研究は、細胞集合体が強制的な集合で形成されて、次に集合体がすぐに、中胚葉に適切な培地を使用して分化されるプロトコールについて説明する（Ｎｇら、Ｂｌｏｏｄ．２００５ １０６（５）：１６０１）。しかしながら、この仕事では、１０−１２日間静的に集合された後、研究者が非集合の接着培養に胚様体を移しているので、本発明とは無関係である。
対照的に、本発明は１）ヒト胚性幹細胞を単独細胞に分離し、集合直径および細胞生存のコントロールを改良するために最適化されたせん断速度で回転培養(rotational culture)することによる集合体の形成、２）次に直接、最終的な内胚葉へＥＳ細胞集合体を分化させ、前腸内胚葉に分化させ、プレ膵性前腸内胚葉へ分化させ、次いで膵性内胚葉および最終的に膵臓内分泌細胞へ分化させるとの、単独細胞集合体形成のためのアプローチを提供する。この分化プロトコールは高能率と最小量の汚染物集団で、最終的な内胚葉および膵性リネッジ集団を発生させる。そのうえ、他のすべての公開された研究と対照的に、胚性幹細胞集合と分化へのこのアプローチは胚様体を作成しない。
１つの特定の実施態様では、未分化の細胞および分化可能な細胞は本発明の細胞培地を使用して、懸濁培養中でエキスパンドする。別の特定の実施態様では、分化可能な細胞が懸濁液内に保持されエキスパンドされる。すなわち、それらは、未分化型のままで残っているか、またはさらに分化するのが阻まれる。当該技術分野において、細胞増殖に関連して「エキスパンド(expand)」、「エキスパンドされた」、「エキスパンジョン」の用語が使用される時、細胞増殖および細胞数の増加、好ましくは生菌細胞数の増加をいう。具体的な実施態様では、細胞は、培養懸濁液中で、約１日、すなわち約２４時間以上の間培養することによって、エキスパンドする。より具体的な実施態様では、細胞は懸濁培養中で少なくとも１、２、３、４、５、６、７日間、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間培養することによりエキスパンドする。
本発明は、それらのソースまたはそれらの可塑性(plasticity)にかかわらず、分化可能な細胞に有用な組成物と方法を企図する。本明細書においては、当該技術分野においてそうであるように、細胞の「可塑性」は概略的な意味で使用される。すなわち、細胞の可塑性は、胚、胎児または成長した有機体からの組織または臓器で見い出される特定の細胞タイプに分化する細胞の能力について言及する。細胞が「より可塑性」であればあるほど、細胞が分化できるかもしれない組織はより多くなる。
いくつかの実施態様では、「多能性細胞」は、内胚葉リネッジ（endoderm-lineage）、または、特に膵性内胚葉タイプ細胞（pancreatic endoderm type cells）への分化の出発物質として使用される。本明細書において使用される時、「多分化能」、「多能性」、「多能性細胞」、および同等の表現は、細胞培養において増殖および自己再生の両方ができ、例えば多分化能胚性幹細胞は３つの胚性細胞リネッジのそれぞれをもたらすことができるように、マルチポーネント特性を示すものを含むさまざまな細胞集団に分化するものをいう。しかしながら、多能性細胞は胎座の羊膜や、絨毛膜や、他の成分などの胚体外の組織をもたらすことができない。また生体全体の生体を製造できないだろう。すなわち、多能性細胞は「分化全能性（totipotent）」ではない。単独細胞の子孫から３種のすべての胚性胚葉の誘導体を形成して安定した発生能を示す証拠を提供し、注射の後に奇形腫を免疫抑制マウスに発生させることによって、多分化能を示すことができる。多分化能の他の表示は、多能性細胞および、特徴的形態で発現することが知られている遺伝子の発現を含む。当業者に知られている任意の方法を使用して、本発明の多能性細胞を誘導することができる。
本明細書に使用される「分化全能性」は、すべてのタイプの細胞、すなわち胚外組織（例えば、胎座）および生体（例えば、マウスまたは人間）の全体をもたらすように成長する細胞の能力をいう。
「自己再生」は、分割して親幹細胞と同じ特性を有するより多くの幹細胞を形成し、その結果、幹細胞の集団が無期限に補給されるのを許容する幹細胞の能力をいう。
ある実施態様では、出発物質として使用される多能性細胞は、ｈＥＳ細胞、ｈＥＧ細胞、ｉＰＳ細胞、単為発生細胞（parthenogenic cell）、および同様のものをはじめとする幹細胞を含んでいる。本明細書において使用される時、「胚性」はただ一つの接合体から、発育済み配偶子細胞以外の多分化能または全能細胞を含まない多細胞性構造までのさまざまな生体の発育時期の範囲を示す。配偶子融合により誘導された胚種に加えて、「胚性」という用語は体細胞核移植により誘導された胚種についてもいう。別の実施態様では、多能性細胞は胚種から誘導されないかまたはただちには誘導されない。たとえば非多能性細胞、たとえばマルチポーネント細胞または最終分化細胞から「退行分化」または「再プログラム化」として知られているプロセスでｉＰＳ細胞を得る。本明細書において使用される時、「退行分化(dedifferentiation)」または「再プログラム化」は、分化細胞がそれほど専門化していない先駆、前駆細胞、または幹細胞状態に戻るプロセスをいう。
本明細書において使用される時、「マルチポーネント特性（multipotency）」、「マルチポーネント細胞（multipotent cell）」またはそれと同等の表現は、他の特定の細胞タイプの限定された数をもたらすことができる細胞タイプをいう。すなわち、マルチポーネント細胞は１種以上の胚性細胞の運命にゆだねられ、多能性細胞と対照的に、３つの胚性細胞リネッジのそれぞれ、および胚体外の細胞をもたらすことができない。多分化能体細胞は、多能性細胞に対してさらに分化されるが、最終までには分化されない。したがって、多能性細胞（pluripotent cell）には、マルチポーネント細胞より高い潜在能がある。体細胞のプログラムを変えることができるか、またはｉＰＳ細胞を発生させるのに使用できる潜在能決定要因としては、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、ＦｏｘＤ３、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｒｅｘ１、ＺＮＦ２０６、Ｓｏｘ１５、Ｍｙｂ１２、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、ＤＰＰＡ２、ＥＳＧ１、Ｏｔｘ２またはそれらの組み合わせなどの要素を含むが、これらに限定されない。
本発明の１つの態様は、適切な条件の下で培養される時に、選択的に、およびいくつかの態様では可逆的に選択的に異なったセルリネッジを発現できる、多分化能または前駆細胞の集団を含んでいる。本明細書において使用される時、「集団」という用語は同じ識別特性を有する１つ以上の細胞の細胞培養株を示す。「細胞リネッジ」という用語は、細胞タイプの発達のステージのすべてについて言い、最も早い前駆細胞から完全に成熟した細胞（すなわち、特殊化した細胞）までをいう。「前駆細胞（precursor cell）」または「先祖細胞（progenitor cell）」は、より成熟した細胞に分化できる細胞分化経路における任意の細胞であることができる。そういうものとして、前駆細胞は多能性細胞であることができ、またはそれは部分的に分化したマルチポーネント細胞、または可逆的に分化した細胞であることができる。「先駆細胞集団（precursor cell population）」という用語は、より成熟した、または分化した細胞タイプに生育できる細胞群をいう。先駆細胞集団は多分化能である細胞、制限された幹細胞リネッジである細胞（すなわち、すべての外胚葉性リネッジよりも少なく生育できる細胞、またはたとえば神経細胞リネッジにのみ生育できる細胞）、可逆的な制限された幹細胞リネッジである細胞を含むことができる。したがって、「先祖細胞」または「前駆細胞」は、「多能性細胞」または「マルチポーネント細胞」であることができる。
本明細書において使用される時、「発育する（develop）」、「分化する」、「成熟する」、または「多能性細胞から生産される」、「多能性細胞から誘導される」、「多能性細胞から分化される」、および同等な表現は、分化された、またはより特殊化した細胞タイプの生産をいい、たとえば生体外の、または、生体内の多能性細胞からの生産をいい、例えば、膵性ホルモンの生産方法のタイトルの国際出願PCT/US2007/015536に記載される、生体内の、移植されたＰＤＸ１膵性内はい葉細胞からの成熟した内分泌細胞の生産をいう。この文献は参考として援用される。すべてが、特殊化を経て少なくとも２つの別々の細胞リネッジに分化する可能性を持つステージから、結局最後まで分化する、細胞の発達に関する。本願の目的のために、そのような用語を互換性を持って使用できる。本発明はそのような分化が可逆的であり、多分化能または少なくとも２つ以上の細胞リネッジに分化する能力が選択的に獲得されることを許容する培養条件を企図する。
また、本発明は動物の中の任意のソースからの分化可能な細胞を企図する。ただし、細胞が本明細書に定義されるように分化可能であることが条件である。例えば、分化可能な細胞は胚種、その内部の任意の始原生殖層、胎盤または絨毛膜組織、または成人幹細胞などのより成熟している組織、たとえば、それらに限定されるものではないが、脂肪、骨髄、神経組織、乳房組織、肝臓組織、膵臓、上皮、呼吸器、生殖腺および筋肉組織から収穫することができる。具体的実施態様では、分化可能な細胞は胚幹細胞である。他の具体的実施態様では、分化可能な細胞は成人幹細胞である。さらに、他の具体的実施態様では、幹細胞は胎盤の、または絨毛膜から誘導された幹細胞である。
本発明は、もちろん分化可能な細胞を発生させることができるすべての動物からの分化可能な細胞も使用することを企図する。分化可能な細胞が得られる動物は、脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物、非哺乳動物、人間、または非人間であることができる。動物ソースの例としては、霊長動物、齧歯動物、犬科、ネコ科、ウマ科、うし科、およびブタ科の動物を含むが、これらに限定されない。
ある実施態様では多能性幹細胞が利用される場合、多能性細胞は正常核型を持っている。調べられた分裂中期の多能性細胞培養物の５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が正常核型を有する。
本発明の組成物と方法は基本栄養塩溶液を含む。本明細書において使用される時、基本栄養塩溶液とは、通常の細胞代謝のために本質的なある種のバルクな無機イオン類と水を細胞に提供する塩の混合物であり、細胞内と細胞外の浸透バランスを維持して、エネルギー源として炭水化物を提供して、生理的ｐＨ範囲内の中に媒体を維持するための緩衝化システムを提供する塩の水性溶液をいう。基本栄養塩溶液の例としては、ダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地(Minimal Essential Medium)(MEM)、基本イーグル培地(Basal Medium Eagle)(BME)、ＲＰＭｌ１６４０、ハムズ(Ham's)Ｆ−１０(Ham's F-10)、ハムズＦ−１２(Ham's F-12)、アルファ−最小必須培地(α-Minimal Essential Medium)(αMEM)、グラスゴー最小必須培地(Glasgow's Minimal Essential Medium)(G-MEM)、およびイスコブの改良ダルベッコ培地(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、または多分化能細胞に使用される汎用培地、たとえばＸ−ＶＩＶＯ（Ｌｏｎｚａ）造血基本培地およびそれらの混合物があげられるが、これらに限定されるものではない。１つの具体的な実施例では、基本栄養塩溶液はＤＭＥＭとハムズＦ１２の約５０：５０混合物である。
本明細書に記載される基本栄養塩溶液は、多能性細胞の成育と生存を維持するのに使われるが、本発明の他の実施態様においては、多分化能または多能性細胞の分化を維持するために、代替の幹細胞培養液も実質的に同様に作用し、たとえばＫＳＲ(Invitrogen)、無異物性のＫＳＲ(xeno-free KSR)(Invitrogen)、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標） ｈＥＳＣ ＳＦＭ（Invitrogen)、ｍＴｅＳＲ（登録商標）ｌ(StemCell Technologies)、ＨＥＳ ｃｅｌｌＧＲＯ（ミリポア）、ＤＭＥＭ、およびＸ Ｖｉｖｏ(Lonza)ベース培地などがあげられるが、これらに制限されるものではない。
組成物がさらに微量元素を含むことが企図される。商業的に微量元素を購入でき、例えば、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈから購入できる。微量元素の非限定的な例としては、アルミニウム、塩素、硫酸、鉄、カドミウム、コバルト、クロム、ゲルマニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、ホスフェートおよびマグネシウムがあげられるが、これらに制限されるものではない。微量元素を含む化合物の具体的な例としては、ＡｌＣｌ３、ＡｇＮＯ３、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、ＣｄＣｌ２、ＣｄＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＣｒＣｌ３、Ｃｒ２（ＳＯ４）３、ＣｕＳＯ４、クエン酸第二鉄、ＧｅＯ２、ＫＩ、ＫＢｒ、ＬＩ、モリブデン酸、ＭｎＳＯ４、ＭｎＣｌ２、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３、ＮａＶＯ３、ＮＨ４ＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮｉＳＯ４、ＲｂＣｌ、セレニウム、Ｎａ２ＳｅＯ３、Ｈ２ＳｅＯ３、亜セレン酸塩−２Ｎａ、セレノメチオノン、ＳｎＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＺｒＯＣｌ２、それらの混合物、およびそれの塩があげられるが、これらに制限されるものではない。セレニウム、亜セレン酸塩またはセレノメチオノンが存在している場合には、約０．００２〜約０．０２ｍｇ／Ｌの濃度で存在する。また、さらに、ヒドロキシルアパタイトも存在することができる。
定義された培地にアミノ酸類を加えることができると企図される。そのようなアミノ酸類の非限定的な例としては、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン／グルタマックス、Ｌ−塩酸アルギニン、Ｌ−アスパラギン−Ｈ２Ｏ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン ヒドロクロライド Ｈ２Ｏ、Ｌ−シスチン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−塩酸リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩二水和物、およびＬ−バリンがあげられる。ある実施態様では、アミノ酸は、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−バリン、およびそれらの混合物質である。
また、定義された培地はアスコルビン酸を含むことができると企図される。望ましくは、アスコルビン酸は約１ｍｇ／Ｌから約１０００ｍｇ／Ｌ、または２ｍｇ／Ｌから約５００ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌから約１００ｍｇ／Ｌ、または約１０ｍｇ／Ｌから約１００ｍｇ／Ｌ、または約５０ｍｇ／Ｌの初期濃度において存在している。さらに、本発明の組成物と方法は他の成分を含むことができ、たとえば血清アルブミン、鉄結合性グロブリン、Ｌ−グルタミン、リピド、抗生物質、βメルカプトエタノール、ビタミン、ミネラル、ＡＴＰ、および類似物が存在することができる。存在することができるビタミン類の例としてはビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｅ、トコトリエノール、Ｋ１およびＫ２を含むが、これらに限定されない。当業者はミネラル、ビタミン、ＡＴＰ、リピド、必須脂肪酸などの、特定の培養における使用のための最適濃度を決定できる。例えば、サプリメントの濃度は約０．００１マイクロＭから約１ｍＭまたはそれ以上であることができる。サプリメントが提供されることができる濃度の具体的な例は、約０．００５マイクロＭ、０．０１マイクロＭ、０．０５マイクロＭ、０．１マイクロＭ、０．５マイクロＭ、１．０マイクロＭ、２．０マイクロＭ、２．５マイクロＭ、３．０マイクロＭ、４．０マイクロＭ、５．０マイクロＭ、１０マイクロＭ、２０マイクロＭ、１００マイクロＭなどがあげられるが、これらに限定されない。１つの具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はビタミンＢ６とグルタミンを含む。別の具体的な的実施態様では、本発明の組成物と方法はビタミンＣと鉄分サプリメントを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、ビタミンＫ１とビタミンＡを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、ビタミンＤ３とＡＴＰを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はビタミンＢ１２および鉄結合性グロブリンを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はトコトリエノールとβメルカプトエタノールを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はグルタミンとＡＴＰを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はオメガ３−脂肪酸とグルタミンを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はオメガ６−脂肪酸とビタミンＢ１を含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法は、α−リノレン酸、およびＢ２を含む。
本発明の組成物は本質的には血清を含まない。「本質的に」の用語が、組成物、配合物、方法、および同様のものに使用される時、量および品質が基本的にまたは事実上、呼ばれるものであることをいう。ただし少量の不純物および／または重要でない変更は許容される。一般に、本質的にとは、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％をいう。「事実上血清を含まない」とは、本発明の溶液における、血清の非存在、または基本的にまたは事実上存在していないことを示す。血清は、本発明の組成物と方法における必須成分ではない。したがって、すべての組成物における血清の存在は単に不純物とされ、たとえば細胞初代培養からの残留結成であるか、または出発物質からのものである。例えば、事実上血清を含まない培地または環境は、５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％未満の血清を含むことができ、媒体または環境の改良された生物活性維持能力が依然として観測される。本発明の具体的な実施態様では、事実上血清を含まない組成物は、血清または血清代替物を含んでいないか、または定義された培地に加えられる血清または血清代替物の成分の単離からの血清または血清代替物の痕跡量を含むだけである。
本明細書において使用される時、「機能的な断片(functional fragment)」は、完全な長さのポリペプチドと同様の生理的または細胞の効果を生む完全な長さのポリペプチドの断片またはスプライス変異体をいう。機能的な断片の生物学的な効果は、同様の生理的または細胞の効果が見られる限り、完全な長さのポリペプチドと同じ範囲または強度である必要はない。例えば、ＥｒｂＢ２の機能的な断片、ＨＲＧ−Ｐは検出可能にＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼを刺激できる。本明細書において使用される時、「変異体(variant)」という用語はキメラまたは融合ポリペプチド、同族体、類似物、オーソログ(orthologs)、およびパラログ(paralogs)を含む。たとえばさらに、参照される蛋白質またはポリペプチドの変異体は、アミノ酸配列が参照される蛋白質またはポリペプチドと少なくとも約８０％同じであるタンパク質またはポリペプチドである。具体的な実施態様では、変異体は比較蛋白質またはポリペプチドと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同じである。
本明細書において、たとえば天然の神経伝達物質受容体または人工の神経伝達物質受容体のリガンドのような低分子化合物に関連して使用される時、「類縁体(analog)」という用語は構造的なおよび／または、機能的な類似性を共有する化合物について言う。類縁体は、構造的な類似性を有する「構造類縁体(structural analogs)」と、類似する薬理特性を示す化学的に異なった化合物である「機能的類縁体(functional analogs)」を含む。
本明細書において配列アラインメントに関連して用語「対応する」が使用される時には、参照される蛋白質またはポリペプチド内の記載された位置を意味することを意図している。たとえば野生型ヒトまたはマウスのニューレグリン−１と、変成された蛋白質またはポリペプチドにおける参照される蛋白質またはポリペプチドにおける位置をいう。したがって、対象のタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列が、参照される蛋白質またはポリペプチド配列のアミノ酸配列と並べられた時、参照される蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸配列のある記載された位置に対応する配列は、参照される配列の位置と並ぶ配列であり、参照配列と正確な数字の同じ位置にある必要があるわけではない。以下で配列間で対応するアミノ酸を決定するための配列を整列する方法を説明する。
たとえばＴＧＦ−βである参照されるアミノ酸配列コードとたとえば少なくとも約９５％「同じ」アミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照されるＴＧＦ−β、または上記の低分子神経伝達物質、たとえばノルエピレナミン、ドーパミン、またはアセチルコリンをコード化する参照アミノ酸配列の１００アミノ酸あたり最大およそ５つの変成を含むことができるのを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同じであることを意味することが理解される。言い換えれば、参照アミノ酸配列と約９５％同じアミノ酸配列を持っているペプチドを得るためには、参照配列のアミノ酸残基の約５％までを削除するか、または他のアミノ酸で置換でき、または参照配列に、総アミノ酸類の約５％までのアミノ酸を挿入できる。参照配列のこれらの修飾は参照アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端位置において、またはそれらの端末の位置の間のどこでも起こることができ、参照配列のアミノ酸の間に個別に存在するか、または参照配列中に１種以上の隣接するグループとして存在することができる。
本明細書において使用される時、「同一性(identity)」の用語は、参照されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比べた、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、配列は最も高い順番の一致が得られるように並べられる。「同一性」自体は、当該技術分野で認識された意味を持ち、公知の技術により計算できる。（参照：例えば、コンピュータによる分子生物学(Computational Molecular Biology)、Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York(1988);Biocomputing:インフォーマティクスおよびゲノムプロジェクト(Informatics And Genome Projects)，Ｓmith,D.W.,ed.,Academic Press,New York(1993)；配列データのコンピュータ分析 パート Ｉ(Computer Analysis of Sequence Data,Part I),Griffin,A.M.,and Griffin,H.G,eds.,Humana Press,New Jersey(1994);von Heinje,G,分子生物学における配列分析(Sequence Analysis In Molecular Biology),Academic Press(1987)；および 配列分析プライマー（Sequence Analysis Primer)，Ｇｒｉbskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York(1991)）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の同一性を測定するいくつかの方法が存在しているが、「同一性」という用語は当業者には公知である(Carillo,H.&Lipton,D.,Siam J Applied Math 48:1073(1988))。２つの配列の間の同一性または類似性を決定するのに一般的に使われる方法は、これに限定されるものではないが、大規模コンピュータのガイド(Guide to Huge Computers)，Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego(1994)and Carillo,H.& Lipton,D.,Siam J Applied Math 48:1073(1988)に開示されている。コンピュータプログラムは同一性と類似性について計算する方法とアルゴリズムを含むことができる。２つの配列の間の同一性と類似性を決定するコンピュータプログラム方法の例は、これに限定されるものではないが、GCG program package (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(i):387 (1984)), BLASTP, ExPASy, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)) およびFASTDBがあげられる。同一性および類似性を決定する方法の例は、Michaels, G. and Garian, R., Current Protocols in Protein Science, Vol 1, John Wiley & Sons, Inc. (2000)に述べられており、これは本出願で参照される。本発明のひとつの実施態様では、２またはそれ以上のポリペプチドの間の同一性を決定するために使用されるアルゴリズムはＢＬＡＳＴＰである。
本発明の別の実施態様では、二つ以上のポリペプチドの間の同一性を決定するために使用されるアルゴリズムは、ＦＡＳＴＤＢである。これはＢｒｕｔｌａｇらのアルゴリズムによる(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))。これは参照され、本明細書に組み込まれる。ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントでは、対照とされる配列はアミノ配列である。得られる配列アラインメントの同一性はパーセントで示される。同一性のパーセントを計算するためにアミノ酸配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントに使用されるパラメータ類は、これらに限定されないが、以下の通りである。マトリックス＝ＰＡＭ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ＝１、ジョイニングペナルティ＝２０、ランダマイゼイショングループ長さ＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ ０．０５、ウインドーサイズ＝５００、または対象とされるアミノ配列の長さの、どちらか短い方。
対象の配列がＮ末端またはＣ終点の付加または染色体欠失のために対象とされる配列よりも短いかまたは長い場合、内部の付加または染色体欠失のためであるかに関わらず、手作業で矯正をすることができる。なぜなら、パーセントの同一性について計算するとき、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象の配列のＮ末端とＣ末端のトランケーションまたは付加を計算しないからである。対象とされている配列に関し、５’または３’末端においてトランケーションされている配列について、同一性のパーセントは、マッチング／アラインしていない対象配列に対する、Ｎ−末端およびＣ末端である対象配列の塩基の数について計算することによって、対象配列の全塩基のパーセントとして修正される。ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果が、マッチング／アラインメントを決定する。アラインメントの割合は、具体的なパラメータ類を使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムで計算された同一性パーセントから引き算され、最終パーセント同一性スコアが得られる。アラインメントがどのようにお互いに「対応するか」を決定する目的に、同一性パーセントと同様に、この修正されたスコアを使用できる。手動で同一性パーセントスコアを調整する目的のために、参照または対象の配列のＮまたはＣ末端を超えて伸びる質問（対象）の配列の残基を考慮することができる。すなわち、比較配列のＮまたはＣ末端にマッチ／アラインされていない残基は、手動でパーセント同一性スコアまたはアラインメントナンバリングを調整するときに計算できる。
例えば、９０アミノ酸残基被検配列は、パーセントの同一性を決定するために１００残基参照配列と並べられる。染色体欠失は対象の配列のＮ末端で起こる。したがって、ＦＡＳＴＤＢ配列はＮ末端で最初の１０残基のマッチ／アラインメントを示さない。１０の不対残基が配列の１０％を示す時（ＮとＣ末端における残基数が被検配列における残基の総数と合っていない時）、ＦＡＳＴＤＢプログラムで計算されたパーセント同一性スコアから１０％が引かれる。残っている９０の残基が完全に合わせられているなら、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例では、９０残基の対象配列は１００の対象配列と比較される。このとき、染色体欠失は、対象の配列のＮまたはＣ末端には残基が全くない、対象とマッチしないかまたはアラインされていない内部欠損である。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算されたパーセントの同一性は、手動で修正されない。
また、本発明はキメラまたは融合ポリペプチド(chimeric or fusion polypeptides)を提供する。本明細書において使用される時、「キメラポリペプチド」または「融合ポリペプチド」は、少なくとも第二の異なったポリペプチドに有効にリンクされた参照ポリペプチドのメンバーの一部を含む。第二のポリペプチドは、実質的に参照ポリペプチドと同じでないポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有し、該ポリペプチドは同じかまたは異なった有機体から誘導される。融合ポリペプチドに関して、「有効にリンクする」という用語は、参照ポリペプチドと第二のポリペプチドがお互いに融合し、両方の配列が使用される配列に生ずる期待される機能を実現させるようにされることを意図する。参照ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に第二のポリペプチドを融合できる。例えば、ある実施態様では、融合ポリペプチドは、ＩＧＦ−１配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ−ＩＧＦ−１融合ポリペプチドである。そのような融合ポリペプチドは組換ポリペプチドの精製を容易にすることができる。別の実施態様では、融合ポリペプチドはＮ末端におけるヘテロロガスシグナル配列を含むことができる。ある宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）の中では、ポリペプチドの発現および／または分泌はヘテロロガスシグナル配列の使用で増加できる。
断片および融合ポリペプチドに加えて、本発明は天然存在ポリペプチドの同族体と類似物を含んでいる。「同族体」は本明細書において類似又は同一のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を持つ２つの核酸またはポリペプチドと定義される。同族体は、以下に定義されるような、対立遺伝子多型、オーソログ、パラログ、アゴニスト、および拮抗体を含んでいる。「同族体」という用語はさらに遺伝コードの縮退のため参照ヌクレオチド配列と異なっていて、その結果参照ヌクレオチド配列によってコード化されたものと同じポリペプチドをコード化する核酸分子を包含する。本明細書において使用される時、「天然存在」は天然に発生する核酸またはアミノ酸配列を示す
ポリペプチドのアゴニストは実質的にポリペプチドの生物活動と同じ、またはサブセットを保持できる。ポリペプチドの拮抗物質はポリペプチドから天然に発生する活性の一以上を禁止できる。
本発明の組成物および方法においては、分化可能な細胞の中のＥｒｂＢ２チロシンキナーゼ活性を刺激する手段を含む。本発明の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、少なくとも１つのＥｒｂＢ３リガンドの存在を含む。典型的には、ＥｒｂＢ３リガンドは、ＥｒｂＢ３受容体と結合して、ＥｒｂＢ２受容体と二量化する。ＥｒｂＢ２受容体は、次いで分化可能な細胞の中で細胞内のチロシンキナーゼ活性に応答性となる。
本明細書において使用される時、「ＥｒｂＢ３リガンド」はＥｒｂＢ３に結合するリガンドであって、ついでＥｒｂＢ２と二量化し、その結果、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体受容体のＥｒｂＢ２部分のチロシンキナーゼ活性を活性化するものをいう。ＥｒｂＢ３リガンドの非限定的な例としてはニューレグリン−１；ヘレグリン−Ｐ（ＨＲＧ−Ｐ）、ヘレグリン−ａ（ＨＲＧ−ａ）、ニュー分化因子(Neu Differentiation Factor:NDF)、アセチルコリン受容体由来作用（ＡＲＩＡ）、膠細胞増殖因子２（ＧＧＦ２）、および知覚性および運動性ニューロン−由来要素(Sensory And Motor Neuron-Derived Factor:SMDF)を含むニューレグリン−１のスプライス変異体とアイソフォーム；ニューレグリン−２；ＮＲＧ２−βを含むがこれに限定されないニューレグリン−２のスプライス変異体(splice variants)とアイソフォーム；エピレグリン；ビレグリン(Biregulin)があげられる。
１つの実施態様では、ＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼ活性を刺激する手段は、ニューレグリン−１、ヘレグリン−Ｐ（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ−Ｐ：ＨＲＧ−Ｐ）、ヘレグリン−ａ（ＨＲＧ−ａ）、ニュー分化因子（ＮＤＦ）、アセチルコリンの受容体由来活性体（ＡＲＩＡ）、膠細胞増殖因子２（ＧＧＦ２）、運動ニューロン由来要素(motor-neuron derived factor:SMDF)、ニューレグリン−２、ニューレグリン−２ｐ（ＮＲＧ２−Ｐ）、エピレグリン(Epiregulin)、ビレグリン、およびそれらの変異体、機能的な断片からなる群から選択された少なくとも１つのＥｒｂＢ３リガンドを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、たとえば二個以上ＥｒｂＢ３リガンドを使用することであるがこれらに限定されない、ＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼ活性を刺激する１より多い手段を含む。
さらなる具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法は、ＥｒｂＢ３リガンドは、ＨＲＧ−Ｐ、またはそれらの変異体、機能的な断片である。１つの実施態様では、培地添加タンパク質、ポリペプチド、それらの変異体または由来体の機能的な断片は、培養される細胞種と同じである。例えば、マウス胚性幹細胞が培養されている場合、培養における添加物としてハツカネズミ(mus musculs) ＨＲＧ−Ｐ配列と同じアミノ酸配列を有するＨＲＧ−Ｐを使用でき、「同じ種」であると考えられる。他の実施態様では、生物学的添加物から誘導された種は、培養される細胞と異なっていると考えられる。例えば、マウス胚性幹細胞が培養されている場合、ヒトＨＲＧ−Ｐ配列と同じアミノ酸配列を有するＨＲＧ−Ｐを使用でき、「異なる種」または「ゼノグラフィック(xenographic)」であると考えられる。
本発明の１つの実施態様では、本発明の組成物と方法は外因のインスリンとインスリン代用物を含まない。「外因のインスリンまたはインスリン代用物」を含まないという句は、インスリンまたはインスリン代用物を故意に本発明の組成物または方法に追加されないということを示すのに本明細書に使用される。本発明のある実施態様では、本発明の方法と組成物は、したがって、故意に供給されるインスリンまたはインスリン代用物を含まない。しかしながら、本発明の組成物または方法が必ずしも内因性インスリンを含むことができないというわけではない。本明細書において使用される時、「内因性インスリン」は、本発明の方法により培養された時に、培養細胞が自らの作用としてインスリンを製造できることを示す。細胞初代培養からの不純物、または出発物質からの残留不純物を示すものとして内因性インスリンが使用されることもある。具体的例では、本発明の組成物および方法は、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１マイクロｇ／ｍｌ以下のインスリンを含んでいる。
本明細書において使用される時、「インスリン」という用語は、正常な生理学的濃度でインスリン受容体と結合し、インスリン受容体を通してシグナルを引き起こすことができる、タンパク質、変異体またはその断片を示す。「インスリン」という用語は、すべての自然なヒトインスリン、他の哺乳動物インスリン、これらの配列の同族体やまたは変異体のポリペプチド配列を有するタンパク質を包含する。さらに、用語インスリンはインスリン受容体と結合し、インスリン受容体を通してシグナルを引き起こすことができる、ポリペプチド断片を包含する。「インスリン代用物」という用語はインスリンとして実質的に同様の結果を与えるためにインスリンに代わって使用されるすべての亜鉛含有化合物をも包含する。インスリン代用物の例としては、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛、および硫酸亜鉛を含むが、これらに限定されない。
はっきり言えば、インスリン様増殖因子は、本発明で企図されるインスリン代用物でなく、またインスリンの同族体でもない。従って、別の具体的実施態様では、本発明の組成物および方法は少なくとも１つのインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、変異体またはそれの機能的な断片の使用を含む。別の実施態様では、本発明の組成物および方法はすべての外因のインスリン様増殖因子（ＩＧＦｓ）も含まない。具体的実施態様では、本発明の組成物および方法は２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｎｇ／ｍｌ以下のＩＧＦ−１を含んでいる。
本明細書において使用される時、「ＩＧＦ−１Ｒのアクチベータ」という用語は調整された細胞増殖、分化、およびアポプトーシスにおいて極めて重要な役割を果たす有糸分裂促進因子をいう。ＩＧＦ−１Ｒのアクチベータの効果は、他の受容体を通して媒介されることもできるが、ＩＧＦ−１Ｒを通して通常媒介される。また、ＩＧＦ−１Ｒは腫瘍ウイルス蛋白質と癌遺伝子産物によって引き起こされた細胞形質転換を含み、相互作用は特異的結合蛋白質（ＩＧＦＢＰｓ）のグループによって規制される。さらに、ＩＧＦＢＰプロテアーゼの大きいグループはＩＧＦＢＰｓを加水分解し、ＩＧＦｓ結合を解離し、ＩＧＦ−１Ｒと相互作用する能力を再開する。本発明の目的のために、リガンド、受容体、結合蛋白質、およびプロテアーゼはすべてＩＧＦ−１Ｒのアクチベータであると考えられている。ある実施態様では、ＩＧＦ−１Ｒのアクチベータは、ＩＧＦ−１、またはＩＧＦ−２である。更なる実施態様では、ＩＧＦ−１ＲのアクチベータはＩＧＦ−１類似物である。ＩＧＦ−１類似物の非限定的な例は、ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌ，Ｄｅｓ（ｌ−３）ＩＧＦ−１，［Ａｒｇ３］ＩＧＦ−ｌ，［Ａｌａ３１］ＩＦＧ−１，Ｄｅｓ（２，３）［Ａｌａ３１］ＩＧＦ−１，［ＬｅＵ２４］ＩＧＦ−ｌ，Ｄｅｓ（２，３）［Ｌｅｕ２４］ＩＧＦ−ｌ，［Ｌｅｕ６０］ＩＧＦ−ｌ，［Ａｌａ３１］［Ｌｅｕ６０］ＩＧＦ−ｌ，［Ｌｅｕ２４］［Ａｌａ３１］ＩＧＦ−ｌ，およびそれらの組み合わせである。更なる実施態様では、ＩＦＧ−１類似物はＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌである。ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌはヒトインスリン増殖因子−１の組換え型の類似物である。ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌは、約１ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約５ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約５０ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約１００ｎｇ／ｍｌから約３００ｎｇ／ｍｌまたは約１００ｎｇ／ｍｌである。
ある実施態様では、本発明の組成物および方法は、形質転換増殖因子ベータ（transforming growth factor beta:ＴＧＦ−β）、またはＴＧＦ−βファミリー、変異体またはそれの機能的な断片を含む。本明細書において使用される時、「ＴＧＦ−βファミリーのメンバー」という用語または増殖因子に関連して使用される同様の語は、ＴＧＦ−βファミリーに関連する当業者に使用される一般的なもの、またはＴＧＦ−βファミリーのメンバーに知られた相同性により、またはＴＧＦ−βファミリーのメンバーに知られた機能の類似性により特徴付けられる。本発明の具体的な実施対態様では、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーが存在する場合には、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー、変異体またはそれの機能的な断片がＳＭＡＤ２または３を活性化する。ある実施態様では、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、ノーダル（Ｎｏｄａｌ）、アクチビン Ａ、アクチビン Ｂ、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１および骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）から成る群から選ばれる。１つの実施態様では、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーはアクチビン Ａ、アクチビン Ｂ、ノーダル、ＧＤＦ−８、およびＧＤＦである。
ノーダル(Nodal)が存在している場合には、約０．１ｎｇ／ｍｌから約２０００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約１ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約１０ｎｇ／ｍｌから約７５０ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約２５ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌの初期濃度で存在していることが企図される。使用される場合には、アクチビン Ａは約０．０１ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍｌ、または望ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの初期濃度において存在していることが企図される。存在する場合には、ＴＧＦ−βは約０．０１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌの初期濃度において存在していることが企図される。
本発明の追加の実施態様では、本発明の組成物および方法はＦＧＦ受容体のアクチベータを含まない。本明細書において使用される時、「ＦＧＦ受容体のアクチベータ」という用語は、一般に、ＦＧＦ−βファミリーに関連する当業者に使用される一般的なもの、またはＦＧＦ−βファミリーのメンバーに知られた相同性により、またはＦＧＦ−βファミリーのメンバーに知られた機能の類似性により特徴付けられる増殖因子をいう。ある実施態様では、ＦＧＦ受容体のアクチベータはＦＧＦであり、たとえばαＦＧＦおよびＦＧＦ２であるが、これらに限定されない。具体的な実施態様では、組成物および方法には外因のＦＧＦ２を含まない。「外因のＦＧＦ２」を含まないとの用語は、故意に本発明の組成物または方法に線維芽細胞増殖因子２、すなわち塩基性ＦＧＦが追加されないことを示すものとして本明細書に使用される。したがって、本発明のある実施態様では、本発明の方法と組成物は故意に供給されたＦＧＦ２を含まない。しかしながら、本発明の組成物または方法が必ずしも内因性のＦＧＦ２を含むことができないというわけではない。本明細書において使用される時、「内因性のＦＧＦ２」は、本発明の方法により培養された時に、培養細胞それ自身がＦＧＦ２を製造できることを示す。細胞初代培養からの不純物、または出発物質からの残留不純物を示すものとして内因性ＦＧＦ２が使用されることもある。具体例としては、本発明の組成物または方法は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｎｇ／ｍｌ以下のＦＧＦ２を含んでいる。
しかしながら、本発明の組成物および方法は、ＦＧＦポリペプチド、その機能的な断片またはその変異体を包含するＦＧＦ受容体の少なくとも１つのアクチベータを含むことができると企図される。ＦＧＦ２が存在する場合には、約０．１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約０．５ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約１ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約１ｎｇ／ｍｌから約１２ｎｇ／ｍｌ、また最も望ましくは約８ｎｇ／ｍｌの初期濃度において存在することが企図される。別の具体的実施態様では、本発明の組成物および方法は、ＦＧＦ２以外のＦＧＦ受容体の少なくとも１つのアクチベータを含むことができる。例えば、本発明の組成物および方法は、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ−２２、それらの変異体またはそれらの機能的な断片の少なくとも１つを含むことができる。具体的実施態様では、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０とＦＧＦ−２２、それらの変異体またはそれらの機能的な断片の少なくとも２つが存在している。別の実施態様では、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２２、それらの変異体またはそれらの機能的な断片の３つのすべてが存在している。ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２２、それらの変異体またはそれらの機能的な断片のいずれかが存在する場合には、それぞれが約０．１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約０．５ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約１ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約１ｎｇ／ｍｌから約１２ｎｇ／ｍｌ、また最も望ましくは約８ｎｇ／ｍｌの初期濃度において存在することが企図される。
さらなる実施態様では、本発明の組成物および方法は、血清アルブミン（ＳＡ）を含む。具体的実施態様では、ＳＡはウシのＳＡ（ＢＳＡ）または好ましくはヒトのＳＡ（ＨＡＳ）のどちらかである。具体的実施態様では、ＳＡの濃度は容積（ｖ／ｖ）で約０．２％以上であるが、約１０％ｖ／ｖ以下である。さらなる具体的な実施態様では、ＳＡの濃度は、約０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、 ０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．２％、１．４％、１．６％、１．８％、２．０％、２．２％、２．４％、２．６％、２．８％、３．０％、３．２％、３．４％、３．６％、３．８％、４．０％、４．２％、４．４％、４．６％、４．８％、５．０％、５．２％、５．４％、５．６％、５．８％、６．０％、６．２％、６．４％、６．６％、６．８％、７．０％、７．２％、７．４％、７．６％、７．８％、８．０％、８．２％、８．４％、８．６％、８．８％、９．０％、９．２％、９．４％、９．６％ および ９．８％（ｖ／ｖ）よりも高い。
従って本発明の細胞培養環境および方法は接着培養に細胞をプレーティングすることを含む。本明細書において使用される時、「プレートされる」、および「プレーティング」という用語は、細胞が接着培養中で成長することを許容する任意のプロセスをいう。本明細書において使用される時、「接着培養」という用語は、細胞が固体表面で培養される培養システムであって、該固体表面は不溶性基体でコーティングされ、ついで以下に例示されるような基体の他の表面被覆でコーティングされるか、または細胞が増殖するか安定することを許容する任意の他の化学物質または生物物質などでコーティングされるものをいう。細胞はしっかりと固体表面、または基体に接着することができるし、またそうでないこともできる。接着培養のための基体は、ポリオルニチン(polyornithine)、ラミニン、ポリリシン、精製コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、テネイシン、ビトロネクチン、エンタクチン、ヘパリン硫酸塩プロテオグリカン、多糖分解酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、およびポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）の一つ又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。さらに、接着培養のための基体はフィーダー層または多分化能ヒト細胞または細胞培養物を含むマトリックスを含むことができる。本明細書において使用される時、「細胞外マトリックス」という用語は、上で説明した固体基体（ただしこれらに限定されない）を包含し、並びにフィーダー層または多分化能ヒト細胞または細胞培養物を含むマトリックスを包含する。１つの実施態様では、細胞はＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングされたプレート上にプレーティングされる。別の実施態様では、細胞はフィブロネクチンコーティングされたプレート上にプレーティングされる。ある実施態様では、細胞がフィブロネクチン上にプレーティングされる場合、プレートは１０マイクロｇ／ｍｌのヒト血漿フィブロネクチン（インビトロゲン、＃３３０１６−０１５）のコーティングで調製され、組織グレード水で希釈され、室温で２〜３時間保持される。別の実施態様では、細胞がプラスチック上にプレーティングされるのを許容するため、２４時間までの間、血清を媒体中に置くことができる。細胞の接着を促進するために血清を使用する場合には、次に、培地が移されて、事実上血清を含まない組成物をプレーティングされた細胞に加える。
本発明の組成物および方法は、分化可能な細胞が本質的にはフィーダー細胞またはフィーダー層を含まない条件下で培養されることを企図する。本明細書において使用される時、「フィーダー細胞(feeder cell)」は生体外で成長する細胞である。すなわち、標的細胞と共同培養される。存在する場合には、フィーダー細胞は標的細胞の本質的な細胞密度の要求を満たし、標的細胞についての基体または細胞−細胞相互作用を提供し、細胞培地をコンディショニングし、および／または分化の段階で標的細胞を安定化させる。本明細書において使用される時、「フィーダー細胞」という用語と「フィーダ細胞層」とは互換性を持って使用できる。本明細書において使用される時、「フィーダー細胞を本質的に含まない」との用語は、フィーダー細胞を含まないか、または「デ ミニマス(de minimus)」の数のフィーダー細胞を含む組織培養条件を示す。「デ ミニマス」の用語は、分化された細胞がフィーダー細胞上で培養されていた先の培養条件から現在の培養条件へ持ち越された、フィーダー細胞の数を意味する。上記の方法の１つの実施態様では、分化の現状における標的細胞を安定させるフィーダー細胞から、コンディショニングされた培地を得る。別の実施態様では、定義された培地はコンディショニングされていない培地であり、これはフィーダー細胞から得られない培地である。
本明細書において使用される時、細胞または細胞培養物の細胞の分化状態に関連して使用される時に「安定」という用語は、細胞が複数の代にわたり培地中で増殖を続け、好ましくは無期限に培地中で増殖を続け、全部ではなくてもほとんどの培地中の細胞が同じ分化状態にあることを意味する。さらに安定した細胞が分裂するとき、分裂は同じ細胞タイプの細胞または同じ分化状態の細胞を通常もたらす。一般に、安定した細胞または細胞集団は、培養条件が変更されない場合には、さらなる分化又は再分化せず、細胞は継代され続け、過成長しない。１つの実施態様では、安定している細胞は、無期限に、または少なくとも２代以上にわたり、安定状態で増殖ができる。より具体的な実施態様では、細胞は３代以上、４代以上、５代以上、６代以上、７代以上、８代以上、９代以上、１０代以上、１５代以上、２０代以上、２５代以上、３０代以上にわたり、細胞は安定している。１つの実施態様では、細胞は約１カ月以上、２カ月以上、３カ月以上、４カ月以上、５カ月以上、６カ月以上、７カ月以上、８カ月以上、９カ月以上、１０カ月、または１１カ月の連続した継代において安定である。別の実施態様では、約１年間以上の連続した継代において、細胞は安定している。１つの実施態様では、それらが分化されるのが望ましくなるまで、幹細胞は多分化能状態で定義された培地において通常の継代で維持される。本明細書において使用される時、「増殖」という用語は細胞培養における細胞の数の増大について言う。
ある実施態様では、本発明の組成物と方法はＢＭＰシグナリングのイナクチベータを含む。本明細書において使用される時、「ＢＭＰシグナリングのイナクチベータ」とは、１種以上のＢＭＰタンパク質の活性、またはそれらの上流または下流シグナルコンポーネンツのいずれかを、可能なシグナリング経路のいずれかを介して拮抗する薬剤をいう。ＢＭＰシグナリングのイナクチベートに使用される１つまたは複数の化合物は、当技術分野で知られているもの、または今後発見される任意の化合物であることができる。ＢＭＰシグナリングのイナクチベータの非限定的な例としては、ドミナント−陰性 トランケイティド (dominant-negative, truncated)ＢＭＰ受容体、可溶性のＢＭＰ受容体、ＢＭＰ受容体−Ｆｃキメラ、ノギン(noggin)、ホリスタチン(follistatin)、神経由来因子(chordin)、グレムリン(gremlin)、セルベラス／ＤＡＮファミリー蛋白質(cerberus/DAN family proteins)、ベントロピン（ventropin)、高ドーズアクチビン（high dose activin)、およびアムニオンレス（amnionless)があげられる。
ある実施態様では、本発明の組成物と方法は少なくとも１つのホルモン、シトキン、アディポカイン、成長ホルモン、それらの変異体またはそれらの機能的な断片を含むことができる。ある実施態様では、定義された培地に存在している成長ホルモンは、定義された培地で培養される分化可能な細胞と同じ種のものであると想定される。したがって、例えば、人間細胞が培養されているなら、成長ホルモンは人成長ホルモンである。また、培養細胞と異なった種から来ている成長ホルモンの使用も企図される。望ましくは、ホルモン、シトキン、アディポカイン、および／または成長ホルモンは、約０．００１ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約０．００１ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍｌ、または、より望ましくは約０．０１ｎｇ／ｍｌから約１５０ｎｇ／ｍｌの初期濃度で存在する。
本発明の組成物と方法に含むことができるシトキンとアディポカインの例としては、シトキン類の４αヘリックスバンドルファミリー、シトキン類のインターロイキン−１（ＩＬ−Ｉ）ファミリー、シトキン類のＩＬ−１７ファミリー、およびシトキン類のケモカインファミリーを含むが、これらに限定されない。もちろん、本発明はシトキン類のこれらのファミリーのそれぞれのメンバーとサブクラスを企図し、たとえば、ＣＣケモカイン類、ＣＸＣケモカイン類、Ｃケモカイン類およびＣＸ３Ｃケモカイン類、インターフェロン類、インターロイキン類、リンホトキシン類、ｃ‐ｋｉｔリガンド、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(Granulocyte/Macrophage-Colony Stimulating Factor:GM-CSF)、単球−マクロファージコロニー刺激因子(monocyte-macrophage colony-stimulating factor；M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、レプチン、アディポネクチン、レジスチン、プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１（ＰＡＩ−１）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）、白血病阻止因子、ビスファチン、レチノール結合蛋白４（ＲＢＰ４）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、スロンボポエチン（ＴＨＰＯ）があげられるが、これらに限定されるものではない。もちろん、当業者は本発明が上に記載された要素の変異体または機能的な断片を企図していることを理解するだろう。
本発明は分化可能な細胞を培養する方法に関し、この方法は、細胞培養表面に分化可能な細胞をプレーティングすることを含み、基本栄養塩溶液を細胞に提供して、細胞にＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼ活性を刺激する手段を提供することを含む。
１つの実施態様では、血清または血清代替物の非存在下、およびフィーダー細胞層の非存在下で、少なくとも１つの本発明の組成物と分化可能な細胞が接触し、細胞が少なくとも１カ月、未分化状態で維持されるようにされる。多分化能は表面マーカ−、転写性マーカー、核型、３つの胚葉層の細胞に分化する能力に関する細胞のキャラクタリゼーションを介して決定できる。当業者にとって、これらのキャラクタリゼーションは周知である。
「懸濁」との用語が細胞培養の文脈で使用される場合、当技術分野で用いられる意味で使用される。すなわち、細胞培養懸濁液は、細胞または細胞集合体が表面に接着しない細胞培養環境である。当業者は懸濁培養技術に詳しく、たとえば、これらに限定されるものではないが、フローフード類(flow hoods)、インキュベータ、および／または、細胞を一定の動きに維持するために使用される装置、例えば、撹拌機プラットホーム、シェーカーなどを必要に応じて備えることができる。本明細書において使用される時、細胞が動いている場合、またはそれらの間の環境が細胞に対して動いている場合には、細胞には「動き」がある。細胞が「動き」の状態に維持されると、１つの実施態様では、動きは細胞をせん断力に暴露することを避けるか、または防ぐように設計されている「優しい動き」または「優しい撹はん」となるだろう。
細胞集合体を作るさまざまな方法が当該技術分野において公知であり、例えば「ハンギングドロップ(hanging drop)」法が知られ、この方法では組織培養液の逆さの滴の中で細胞が滴の底部に沈み、集まり、実験フラスコ中で細胞懸濁液を震動させる。これらのテクニックの種々の変法も使用できる。例えば、N.E.Timminsら，(2004)Angiogenesis 7,97-103;W.Daiら，(1996)Biotechnology and Bioengineering 50,349-356;R.A.Fotyら，（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２，１６１１−１６２０；Ｇ．Ｆｏｒｇａｃｓら，(2001)J.Biophys.74,2227-2234(1998)；K.S.Fumkawaら,Cell Transplantation 10,441-445；Ｒ．Ｇｌｉｃｋｌｉｓら，（２００４)Biotechnology and Bioengineering 86,672-680;Carpenedoら，(2007)Stem Cells 25,2224-2234；およびT.Korffら，(2001)FASEB J.15,447-457を参照。これらの全体は本明細書に参照され組み込まれる。より最近では、細胞集合体はマイクロパターン化されたコロニーを懸濁液内にこすり落とし、マイクロタイタープレートのコロニーを遠心分離で取り出し懸濁液にするか、またはピペットを使用してパターンドマイクロウェルで成長されたコロニーを取り出し懸濁させる(Ungrin他、(2008)PLoS ONE 3(2)、1-12;Bauwens他、(2008)、Stem Cells Published online June 26,2008)。本明細書に記載された細胞集合体を製造するのにそのような方法を使用できるが、本明細書に製造された細胞集合体は、同期した有向分化（synchronous directed-differentiation)のために上記のｄ’Ａｍｏｕｒ他２００６に記載されているようにして、最適化される。これらの他の方法と異なって、本明細書に記載された懸濁液中における細胞集合体を製造するための方法は大規模製造に影響を受けやすい。
一般に、本発明の細胞培地組成は、少なくとも１日に１度リフレッシュされるが、よりしばしばまたは、より少なく懸濁培養物の具体的必要性と事情によって媒体を変えることができる。生体外で、細胞は、通常バッチ・モードにより培養液で育てられて、様々な培地条件に暴露される。本明細書に記載されたように、細胞は接着培養として、または懸濁中における細胞集合体として皿培地中に存在して、取り囲む培地に接触し；および定期的に廃棄物培地が取り替えられる。一般に、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、または２４時間毎、またはそれの任意の時間で培養液をリフレッシュできる。追加例では、１．１日、１．２日、１．３日、１．４日、１．５日、１．６日、１．７日、１．８日、１．９日または２日またはそれ以上ごとに、またはそれらの間の任意の期間で培地はリフレッシュされることができるが、これらに限定されるものではない。
しかし、本発明の別の実施態様では、増殖因子および頻繁に取り替えられなければならない他の薬剤の分解を防止するために環流方法(perfusion method)が採用され、または一定期間の間に培地からの廃棄物を減耗する手段として環流方法が採用された。例えば、米国特許第５，３２０，９６３号は、懸濁細胞の潅流培養のためのバイオリアクタについて説明する。米国特許第５，６０５，８２２号は、環流による培養でのＨＳＣ細胞の成長のために、増殖因子を提供するのにストロマ細胞を使うバイオリアクタシステムについて説明する。米国特許第５，６４６，０４３号は、ＨＳＣ細胞の成長のための培地組成物を含む連続した周期的環流でのＨＳＣ細胞の成長について説明する。米国特許第５，１５５，０３５号は、流体培地回転による細胞の懸濁培養のためのバイオリアクタについて説明する。これらは参照され本明細書にそれらの全体が取り入れられる。
一般に、本発明の培地組成物中で懸濁培養される細胞は、ほぼ毎週、「スプリット(split)」または「継代(passage)」されるが、細胞は具体的な必要性および懸濁培養の環境に応じて、より頻繁にまたはより少ない頻度で継代されることができる。例えば、細胞は１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日間、またはそれらの間の任意のタイムフレームで継代されることができる。本明細書において使用される時、それが細胞培養の文脈で使用される場合、「スプリット」または「継代」という用語は、当該技術分野における使用されている意味で使用される。すなわち、細胞培養スプリットまたは継代は、前の培養からの細胞の収集と、新しい細胞培養容器への、より少ない数の収集された（収穫された）細胞の移転である。一般に、継代細胞は、健康な細胞培養環境で成長し続けることができる。当業者は細胞培養継代のプロセスおよび方法になじみ深く、これは必ずではないがそれらの成長エキスパンションの間に一緒に集合している細胞を分けるために使用できる酵素的または非酵素的方法の使用を含む。
ある場合に、ある程度の細胞死が、継代直後の（懸濁または接着培養の）細胞で起こることがある。１つの実施態様では、分化可能な細胞は、２４時間以上細胞媒体のリフレッシュを遅らせることによって継代から「回復できる」。その後、より頻繁に細胞媒体を変えることができる。別の実施態様では、細胞培地は、さらに細胞死の防止剤を含むことができる。例えば最近Ｗａｎｔａｎａｂｅ他は、解離の後にヒト胚性幹細胞を保護するためにＲｈｏ−関連キナーゼ阻害薬(Rho-associated kinase inhibitor)、Ｙ２７６３２の使用を開示する。Wantanabe,K.,ら，Nat.Biotechnol,25(6):681-686(2007)を参照されたい。これは参照され、本明細書に援用される。追加の実施態様では、細胞培地は、継代直後の細胞死を防ぐか、または減衰させるようにカスパーゼ阻害剤、増殖因子または他の栄養素を含むことができる。使用できる物の具体的例としては、ＨＡ１０７７、ジヒドロクロライド(Dihydrochloride)、ヒドロキシファスジル(Hydroxyfasudil)、Ｒｈｏ キナーゼ 阻害剤、Ｒｈｏ−キナーゼ 阻害剤 ＩＩ、Ｒｈｏ キナーゼ 阻害剤 ＩＩＩ、キナーゼ 阻害剤 ＩＶ、およびＹ２７６３２があげられるが、これらに限定されるわけではない。なお、上記の物質はすべて商業的に利用可能である。さらに別の実施態様では、細胞継代直後またはその間の細胞死を防ぐかまたは減衰させるために使用される物質または要素は、細胞が継代のプロセスから回復した後に、細胞培地から取り除くことができる。追加の実施態様では、未分化型胚性幹細胞は、標準のベース培地中で有効に集合することができ、解離と集合の間、生育性を維持するためにＹ２７６３２または他の関与を必要としない。
また、追加の実施態様では、本発明の組成物および方法は界面活性化合物の存在または使用を含むことができる。１つの特定の実施例では、本発明の組成物と方法は懸濁培養において少なくとも１つの表面活性剤を含む。界面活性化合物は、当技術分野で周知であり、一般的には両親媒性である。具体的実施態様では、本発明はアニオン系、カチオン性、ノニオン性または双性である少なくとも１つの表面活性剤の使用を含む。本発明の組成物および方法に使用される表面活性剤の濃度の決定は、ルーチン的な検査と最適化の問題である。たとえばオーエン他は、ヒーラ細胞とヒト羊膜細胞の細胞培養法における界面活性化合物の使用を報告する。Ｏｗｅｎら，J.Cell.Sc,32:363-376(1978)を参照。これは参照して本明細書に組み込まれる。使用できる界面活性化合物の例としては、これらに限定されるわけではないが、以下の物質があげられる；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、アンモニウムラウリル硫酸、および他のアルキル硫酸塩；ナトリウムラウレススルフェート（ＳＬＥＳ）、アルキルベンゼンスルホン酸エステル、石鹸、または脂肪酸塩、セチルトリメチルアンモニウム臭素（ＣＴＡＢ）（ヘキサデシルトリメチル臭化アンモニウム）、および他のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシル化獣脂アミン（ＰＯＥＡ）、ベンズアルコニウム塩化物（ＢＡＣ）、ベンズエトニウム塩化物（ＢＺＴ）、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミン酸化物、コカミドプロピルベタイン、ヤシアンフォグリシナート、アルキルポリ（エチレンオキシド）、ポリエチレンオキシドとポリプロピレン・オキシドコポリマー、たとえばプルロニック(Pluronic)Ｆ６８、アルキルポリグリコシド、たとえば、オクチルグルコシド、デシルマルトシド、脂肪アルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、コカミド ＭＥＡ、コカミドＤＥＡおよびコカミドＴＥＡ、および／または、ポリオキシエチレン−ソルビタン モノラウレート（トゥイーン）があげられるが、これらに制限されるものではない。
本明細書に記載された実施態様は、低せん断環境を維持することにより、システムの細胞濃度を維持して、流体せん断応力を最小にし、ｈＥＳ細胞を増殖させ、および／または分化させる大規模製造のための方法を提供する。特に、本発明は６０ｍｍの皿、６ウェルのプレート、回転するボトル、バイオリアクタ（例えば、スピナーフラスコ）、容器、およびクローズドループシステムなどで細胞懸濁液を培養することによる、真核細胞製造スケールアップシステムにおける低せん断環境を維持するための方法を提供する。あるいはまた、細胞を培養する連続かん流システムは、細胞の懸濁、酸化、および新鮮な栄養物の提供のため、すなわち成長および／または分化のために、バイオリアクタまたは容器内における撹拌または動きを必要とする。細胞懸濁液を得るために、バイオリアクタ容器は典型的にはせん断応力の可能なソースである１種以上の可動な機械的撹はん装置を使用する。
分化可能な細胞は、酵素学的または非酵素学的方法を使用して、または、本発明の定義された培地との接触の前および接触の後の手動の解離方法により、継代することができる。当技術分野において手動の継代技術についてはよく説明されており、たとえばＳｃｈｕｌｚら，２００４ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２２（７）：１２１８−３８に記載されている。機械的な継代は追加の物質を含まないが、多能性細胞またはそれらの誘導体を大規模で生産するためには効率的でない。たとえばバイオリアクターまたは大きなフラスコ中での、たとえばＧＭＰ−コラゲナーゼのような酵素の使用が企図される。酵素的な解離方法の非限定的な例としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）などのプロテーアーゼの使用を含む。１つの実施態様では、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）は接触された細胞の継代に使用される。酵素的継代方法が使用されるとき、得られた培養物は、シングレット(singlet)、ダブレット(doublet)、トリプレット(triplet)および細胞のクランプ(clumps)を含むことができ、これらは使用された酵素の種類に応じてサイズが異なる。非酵素学的解離方法の非限定的な例は細胞分散バッファ(cell dispersal buffer)である。存在する場合には、細胞外マトリックスの選択により継代方法の選択は影響を及ぼされるが、当業者によって容易に決定されることができる。
本発明の方法で使用される離解溶液(disaggregation solution)は、大規模な急性毒性を細胞に引き起こさずに、単独細胞に細胞をばらばらにするか、または離解することができる離解溶液であることができる。離解溶液の例は、トリプシン、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ、またはＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）（ＥＤＴＡ）とトリプシンを含むが、これらに限定されない。本発明の方法は、少なくともいくつかの単独細胞が離解され再培養できることを条件として、集密層または懸濁液中のあらゆる細胞が単独細胞に離解されることを必要とするわけではない。
培養の始め、または継代の後に、どんな密度でも分化可能な細胞をシードでき、培養チャンバーにひとつの細胞でもよい。さまざまな要素によって、シードされる細胞の細胞濃度を調整できる。たとえば接着培養、懸濁培養の使用、使用される培養細胞培養液の具体的処方、生育条件、および培養される細胞の企図された使用を含む。細胞培養密度の例としては以下があげられる；０．０１×１０５細胞／ｍｌ，０．０５×１０５細胞／ｍｌ，０．１×１０５細胞／ｍｌ，０．５×１０５細胞／ｍｌ，１．０×１０５細胞／ｍｌ，１．２×１０５細胞／ｍｌ，１．４×１０５細胞／ｍｌ，１．６×１０５細胞／ｍｌ，１．８×１０５細胞／ｍｌ，２．０×１０５細胞／ｍｌ，３．０×１０５細胞／ｍｌ，４．０×１０５細胞／ｍｌ，５．０×１０５細胞／ｍｌ，６．０×１０５細胞／ｍｌ，７．０×１０５細胞／ｍｌ，８．０×１０５細胞／ｍｌ，９．０×１０５細胞／ｍｌ，または１０．０×１０５細胞／ｍｌ、またはそれ以上、たとえば５×１０７細胞／ｍｌまでが、良好な細胞の生存を示して培養される。これらの値の間の任意の値も採用できる。
上記に加えて、本明細書に使用される時には、「細胞濃度操作」という用語、「操作された細胞濃度」またはそれの等価な表現は、製造プロセスまたはシステムでの細胞密度が操作され、増殖性または分化性のｈＥＳ細胞培養物を生産することをいう。そのような細胞濃度は、システムに供給されるビタミン、ミネラル、アミノ酸、代謝物などの栄養物、または酸素分圧などの環境条件が、細胞生育力を維持するために十分である下でのものをいう。あるいはまた、そのような細胞濃度は、細胞生育力を維持できるような速度でシステムから廃棄物を取り除くことができる下でのものをいう。当業者は容易にそのような細胞濃度を決定できる。
維持できる作動細胞濃度は、少なくとも約０．５×１０６細胞／ｍｌからである。典型的なスケールアップシステム作動式細胞濃度は、約０．５×１０６細胞／ｍｌから約２５×１０６細胞／ｍｌの間である。例示的な濃度は、約２．５×１０６細胞／ｍｌ、２２×１０６細胞／ｍｌから、最大５×１０７細胞／ｍｌの間である。本発明の方法では、細胞生存率は少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、および約１００％までである。他のスケールアップシステム作動細胞濃度と許容細胞生存率レベルは、当業者によって認められ、当業者にとって周知のテクニックにより決定できる。例えば、バッチ、フェドバッチ(fed-batch)および連続供給される構成では、約０．５×１０６細胞／ｍｌから１５×１０６細胞／ｍｌの間の細胞濃度であってもよい。
ACEA Biosciences,Inc.(www.aceabio.com)からのＲＴ−ＣＥＳ（登録商標）法を使用することで、細胞増殖と生育性を測定することができる、インピーダンスのリアルタイム測定値を提供する９６ウェルの培養装置でｈＥＳＣｓを育てることができた。そのようなアプローチは分化可能な細胞における微妙であるか即座の効果のラベルを使用しない識別と定量化を可能にするだろう。また、増殖、アポプトーシスおよびモルホロジー変化のリアルタイム測定も可能にするだろう。
さらに、冷凍、冷所保存、および解凍プロセスは、ＧＭＰ規格により最適に行われる。冷凍保存法および従来のゆっくりとした冷却／急速な暖めの両方が、多能性細胞、少なくともｈＥＳ細胞の冷所保存に使われた。Hunt C.J., et al., Methods Mol.Biol.(2007)368:261-270。Richards et al.(2004)他は、冷凍防止剤中の主な蛋白源として、胎児ウシ血清ではなくヒト血清アルブミンを使用し、閉鎖密閉ストロー内に冷所保存することを含む、ｈＥＳ細胞のための異物の無い凍結保存実験計画について説明した。Richards M., et al., Stem Cells (2004) 22:779−789を参照。Fujioka et al.(2004)は、ストローの代わりに、冷凍管を使用した冷所保存方法により、霊長類胚性幹細胞を低温保存した。猿胚性幹細胞についての生存率は６．５％、人間の胚性幹細胞についての生存率は１２．２％であった。Fujioka T., et al., Int.J.Dev.Biol.(2004)48:1149−1154を参照。従って、本発明の１つの実施態様は、多能性細胞の適切な冷凍、および冷所保存または冷所貯蔵に関する。
マルチポーネント細胞または分化細胞の生産のモニター
多能性細胞のマルチポーネント細胞、さらなるマルチポーネント細胞または分化細胞への進行は、ある種の遺伝子マーカーの発現を測定し、定量化することによってモニターすることができる。たとえば、ＴＧＦ−βシグナル伝達物質のような外因性の要因の添加の前後の異なる時間ポイントで特定の遺伝子マーカーの存在または非存在を検出することができる。あるいはまた、ある種のマーカーの発現は、細胞培養または細胞集団の細胞内のマーカーの存在量を測定することによって、決定できる。例えば、あるプロセスで、多分化能細胞に対するマーカーの発現、およびマルチポーネント細胞または分化細胞に対するマーカーの顕著な発現の不足が決定される。
最終的な内胚葉リネッジのタイプの、より低い分化細胞タイプの生産をモニターすることに関する説明として、マーカー発現を測定するのに、プロット移動法や免疫細胞学的方法（ＩＣＣ）または免疫組織学的方法（ＩＨＣ）のような、定性的または準定量的技術が使用できる。あるいはまた、Ｑ−ＰＣＲなどのテクニックの使用で正確にマーカー発現を定量化することができる。さらに、あるポリペプチド濃度では、膵性の小島ホルモン発現細胞のマーカーの多くが分泌蛋白質である。細胞外マーカーの内容の測定のために、ＥＬＩＳＡなどのテクニックを利用できる。
本明細書に記載された多能性細胞の発現の進行（例えば上掲のＤ’Ａｍｏｕｒ他２００６で記載されているような、ステージまたは工程１−５の結果として生産された細胞）は、発生経路に沿ってそれぞれの多分化能由来細胞タイプに対するマーカーの発現を決定することによってモニターできる。例えば、いくつかのプロセスでは、多分化能由来の細胞タイプの識別とキャラクタリゼーションは、ある種のマーカーの発現または異なる発現水準、および１以上のマーカーのパターンにより行われる。すなわち、存在または非存在、発現の高低、１種以上のマーカーが、細胞タイプを代表して、同定する。また、ある種のマーカーは一過性発現を持つことができる。それによりマーカーは、１つの発展段階の間非常に発現され、別の発展段階では不十分に発現される。ある特定のマーカーの発現は、標準化されたかまたは正常にされた制御マーカーと比べて、細胞培養または細胞集団中の、細胞内のマーカーの存在量を測定することによって、決定できる。そのようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的であるか、または定量的であることができる。マーカー遺伝子によって生産されるマーカーの発現を定量化する１つの方法が定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）の使用である。Ｑ−ＰＣＲを実行する方法は当技術分野で周知である。
さらに、他の実施態様では、Ｑ−ＰＣＲは正確に細胞タイプをキャラクタリゼーションし、同定し、対象細胞タイプ中のそのようなマーカーの量と相対的比率の両方を決定するために、免疫組織化学的方法またはフローサイトメトリー法とともに使用される。１つの実施態様では、Ｑ−ＰＣＲは細胞の混合種個体群を含む細胞培養物における、ＲＮＡ発現のレベルを定量化できる。しかしながら、対象のマーカーまたはタンパク質が同じ細胞中で共に発現されるか否かどうかは、Ｑ−ＰＣＲは、提供できないし、定量化することができない。別の実施態様では、細胞タイプをキャラクタリゼーションし、同定するために、流動細胞計測法方法とともにＱ−ＰＣＲが使用される。したがって、本明細書に記載した方法の組み合わせを使用して、内胚葉リネッジタイプ細胞を含む様々な細胞タイプの完全なキャラクタリゼーションと同定を実行して、示すことができる。
それでも、また、当技術分野で知られている他の方法もマーカー遺伝子発現を定量化するために使用できる。例えば、対象となるマーカー遺伝子生成物に対して特異的な抗体を使用することによって、マーカー遺伝子産物の発現を検出できる（例えば、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー分析、および同様のもの）。あるプロセスでは、多分化能誘導細胞のマーカー遺伝子特性の発現、および多分化能誘導細胞のマーカー遺伝子の欠如を検出できる。多分化能由来細胞タイプのキャラクタリゼーションおよび同定のための更なる方法は、上で示した関連出願に記載されている。本明細書に、関連出願の全体を参考として援用する。増幅分析における使用に適した増幅プローブ／プライマーの組み合わせは以下を含む：インシュリン（ＩＮＳ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿０００２０７）：プライマーＡＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；
ＣＡＧＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣＣＡＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；Ｎｋｘ６．１（ＮＭ＿００６１６８）：
プライマーＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＣＣＴＣＡＴＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；
ＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；Ｐｄｘ１（ＮＭ＿０００２０９）：
プライマーＡＡＧＴＣＴＡＣＣＡＡＡＧＣＴＣＡＣＧＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；
ＧＴＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；Ｎｇｎ３（ＮＭ＿０２０９９９）：
プライマーＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＴＣＴＴＴＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；
ＧＧＴＴＧＡＧＧＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；
ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）（ＮＭ＿０２１７８４）：
プライマーＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；
ＴＣＡＴＧＴＴＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＧＡＧＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）；
グルカゴン（ＧＣＧ）（ＮＭ＿００２０５４）：
プライマーＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：[[１６]]１１）；
ＴＧＡＴＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＧＴＧＴＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）；
ＨＮＦ６（ＮＭ＿０３０７１２）：
プライマーＣＧＣＴＣＣＧＣＴＴＡＧＣＡＧＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）；
ＧＴＧＴＴＧＣＣＴＣＴＡＴＣＣＴＴＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）；
ＨＮＦ４アルファ（ＮＭ＿０００４５７）：
プライマーＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＴＣＣＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；
ＧＡＣＣＴＴＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）；
Ｓｏｘ１７（ＮＭ＿０２２４５４）：プライマーＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）；ＨＬｘＢ９（ＮＭ＿００５５１５）：
プライマーＣＡＣＣＧＣＧＧＧＣＡＴＧＡＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）；
ＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＴＴＣＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）；Ｎｋｘ２．２（ＮＭ＿００２５０９）：
プライマーＧＧＣＣＴＴＣＡＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）；
ＧＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＴＣＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）；ＰＴＦ１ａ（ＮＭ＿１７８１６１）：
プライマーＧＡＡＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
ＧＧＣＣＡＴＡＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）；ＳＳＴ（ＮＭ＿００１０４８）：
プライマーＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＡＧＴＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）；
ＴＣＣＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＧＴＴＣＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）；
ＰＡＸ６（ＮＭ＿０００２８０）：
プライマーＣＣＡＧＡＡＡＧＧＡＴＧＣＣＴＣＡＴＡＡＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）；
ＴＣＴＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＡＧＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）；
Ｏｃｔ４プライマー：ＴＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
ＧＣＡＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡＴＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）；
ＭＩＸＬ１プライマーＣＣＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）
ＣＴＣＴＧＡＣＧＣＣＧＡＧＡＣＴＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）；
ＧＡＴＡ４プライマーＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＴＧＣＧＧＡＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）
ＣＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＣＴＣＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）；
ＧＳＣプライマーＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）
ＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）；
ＣＥＲプライマーＡＣＡＧＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）
ＡＣＡＡＣＴＡＣＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）；
ＡＦＰプライマーＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）
ＣＴＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）；
ＳＯＸ１プライマーＡＴＧＣＡＣＣＧＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）
ＣＴＣＡＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧＣＧＡＧＴＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）；
ＺＩＣ１プライマーＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＡＧＧＴＣＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）
ＣＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＣＴＣＧＣＡＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）；
ＮＦＭプライマーＡＴＣＧＡＧＧＡＧＣＧＣＣＡＣＡＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）
ＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＴＧＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）。
ＦＧＦ１７（Ｈｓ００１８２５９９＿ｍ１）、ＶＷＦ（Ｈｓ００１６９７９５＿ｍ１）、ＣＭＫＯＲ１（Ｈｓ００６０４５６７＿ｍ１）、ＣＲＩＰ１（Ｈｓ００８３２８１６＿ｇ１）、ＦＯＸＱ１（Ｈｓ００５３６４２５＿ｓ１）、ＣＡＬＣＲ（Ｈｓ００１５６２２９＿ｍ１）およびＣＨＧＡ（Ｈｓ００１５４４４１＿ｍ１）を含む他のプライマーは、ＡＢＩ Ｔａｑｍａｎから利用可能である。
多分化能懸濁集合培養を使うスクリーニング法
いくつかの実施態様では、スクリーニング法は、多能性、マルチポーネント細胞および／または分化細胞を含むある細胞集団を得るのに使われる。ついで候補分化因子(candidate differentiation factor)を細胞集団に提供する。候補分化因子を提供する前またはほとんど同時である最初の時間ポイントでは、マーカーの発現が決定される。あるいはまた、候補分化因子を提供した後に、マーカーの発現を決定できる。最初の時間ポイントに引き続く、候補分化因子を細胞集団に提供する工程に引き続く第２の時間ポイントで、同じマーカーの発現が再び決定される。候補分化因子が膵性前駆細胞の分化を促進できるかどうかが、第２の時間ポイントでのマーカーの発現を最初の時間ポイントでのマーカーの発現と比較することによって、決定される。最初の時間ポイントでのマーカーの発現と比べて、第２の時間ポイントでのマーカーの発現が増加するか、または減少しているなら、候補分化因子は膵性先祖細胞の分化を促進できる。
本明細書に記載されたスクリーニング法の実施態様では、細胞集団は接触または別の方法で候補（テスト）分化因子が提供される。候補分化因子は上記の細胞のどれかの分化を促進する可能性を持つことができるどんな分子も含むことができる。別の実施態様では、候補分化因子は細胞分化を促進することが知られていない分子を含む。好適な実施例では、候補分化因子は人間の膵性先祖細胞の分化を促進することが知られていない分子を含む。
本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、候補分化因子は低分子を含む。「低分子」の用語は、当該技術分野において使用されている低分子量有機化合物の意味で使用され、ポリマーではないものとして定義される。低分子は天然に存在するもの（内因性神経伝達物質など）、または当技術分野で知られていた合成有機化学方法で調製されたものであることができる。ある実施態様では、低分子は約８００ダルトン以下の分子質量を有する分子である。
本明細書に記載された他の実施態様では、候補分化因子は大きな分子、例えばポリペプチドを含む。ポリペプチドは、任意のポリペプチドであることができ、たとえば、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞外マトリックス蛋白質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、インターロイキンまたは成長因子であることができるが、これらに限定されるものではない。好ましいポリペプチドは成長因子を含んでいる。
本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、候補分化因子は以下から成る群から選択された１種以上の成長因子を含む：アンフィレグリン、Ｂリンパ球刺激物質、ＩＬ−１６、チモポエチン(Thymopoietin)、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ−２、プレＢ細胞集落増強因子、内皮分化関連因子１（ＥＤＦ１）、内皮単核細胞活性化ポリペプチドＩＩ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ナチュラルキラー細胞増強因子（ＮＫＥＦＡ）、骨形成蛋白質２、骨形成蛋白質８（骨形成性タンパク質２）、骨形成タンパク質６、骨形成タンパク質７、結合組織生長因子（ＣＴＧＦ）、ＣＧＩ−１４９タンパク質（神経内分泌分化因子）、サイトカイン Ａ３（マクロファージ炎症蛋白１−α）、膠芽腫（Ｇｌｉａｂｌａｓｔｏｍａ）細胞の分化関連タンパク質（ＧＢＤＲ１）、肝細胞癌（Ｈｅｐａｔｏｍａ）由来の成長因子、肝細胞癌 Ｕ−２５先駆体、導管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、導管内皮成長因子 Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、Ｔ細胞特異性ＲＡＮＴＥＳ先駆体、胸腺樹状細胞−誘導因子１、トランスフェリン(Transferrin)、インターロイキン−１（ＩＬ１）、インターロイキン−２（ＩＬ２）、インターロイキン−３（ＩＬ３）、インターロイキン−４（ＩＬ４）、インターロイキン−５（ＩＬ５）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキン−７（ＩＬ７）、インターロイキン−８（ＩＬ８）、インターロイキン−９（ＩＬ９）、インターロイキン−１０（ＩＬ１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ１３）、顆粒白血球(Granulocyte)−コロニー形成活性化因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒白血球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリトロポエチン(Erythropoietin)；スロンボポエチン、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、表皮(Epidermal)成長因子（ＥＧＦ）、脳−誘導神経栄養因子、白血病抑制因子、甲状腺ホルモン、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ａＦＧＦ ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７／ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血小板−誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来成長因子−ＢＢ、ベータ神経成長因子、アクチビンＡ、形質転換成長因子β１（ＴＧＦβ１）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死要素−α、腫瘍壊死要素−β、バースト促進活性（ＢＰＡ）、赤血球促進活性（ＥＰＡ）、ＰＧＥ２、インシュリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ ＩＩ、ニューロトロフィン成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン４／５、線毛(Ciliary)神経栄養因子、グリア−誘導ネキシン、デキサメサゾン(Dexamethasone)、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸(Retinoic acid)、ブチル化ヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アンホテリシン(Amphotericin) Ｂ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールリン酸、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チアゾリジンジオン類、ＴＷＳ１１９、オキシトシン、ヴァソプレッシン、メラニン細胞刺激ホルモン、コルチコトロピン(corticortropin)；脂肪刺激ホルモン、甲状せん刺激ホルモン、成長ホルモン、乳腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、濾胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ゴナドトロピン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン抑制因子、生長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、甲状せん刺激ホルモン放出因子、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド１、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、モチリン、血管作動性小腸ペプチド、サブスタンスＰ、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシン、神経ペプチドチロシン、インシュリン、グルカゴン、胎盤ラクトゲン、弛緩ホルモン、アンジオテンシンＩＩ、カルシトリオール（ｃａｌｃｔｒｉｏｌ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド、およびメラトニン、サイロキシン、トリヨードチロニン、カルシトニン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン、エピネフリン、ノルエピネフリン、アンドロステン(androstiene)、カルシトリオール、コラーゲン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アンホテリシン Ｂ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールリン酸、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、トリアゾリジンジオン類、およびＴＷＳ１１９。
本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、１以上の濃度で候補分化因子を細胞集団に提供する。いくつかの実施態様では、候補分化因子を細胞集団に提供し、細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの実施態様では、細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの範囲である。細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌから約１００マイクロｇ／ｍｌの範囲である。さらに、他の実施態様では、細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌから約１０マイクロｇ／ｍｌの範囲である。好適な実施例では、細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌから約１０００マイクロｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの実施態様では、本明細書に記載されたスクリーニング法の工程は、最初の時間ポイントと２回目の時間ポイントで少なくとも１つのマーカーの発現を決定することを含む。これらの実施態様のいくつかでは、第１の時間ポイントは、候補分化因子を細胞集団に提供する前かまたはほとんど同時であることができる。あるいはまた、いくつかの実施態様では、第１の時間ポイントは候補分化因子を細胞集団に提供した後である。いくつかの実施態様では、複数のマーカーの発現は第１の時間ポイントで決定する。
前述の方法は、生存率を上げ、分化状態を安定させ、成長を増加させ、ｈＥＳ細胞の多分化能を維持する低分子および他の化合物のためのスクリーニングに等しく適切である。当業者は本明細書に記載された技術をそのようなスクリーニング法に適合することができるであろう。
第１の時間ポイントで少なくとも１つのマーカーの発現を決定することに加えて、本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、第１の時間ポイントの後であり、候補分化因子を細胞集団に提供した後である第２の時間ポイントにおいて少なくとも１つのマーカーの発現を決定することを企図する。そのような実施態様では、同じマーカーの発現を１番目と２番目の時間ポイントの両方で決定する。いくつかの実施態様では、複数のマーカーの発現は１番目と２番目の時間ポイントの両方で決定する。そのような実施態様では、同じ複数のマーカーの発現は１番目と２番目の時間ポイントの両方で決定する。いくつかの実施態様では、マーカー発現は複数の時間ポイントで決定され、それらはそれぞれ第１の時間ポイントの後であり、それらのそれぞれは候補分化因子を細胞集団に提供した後である。ある実施態様では、マーカー発現はＱ−ＰＣＲで決定する。他の実施態様では、マーカー発現は免疫細胞学的方法で決定する。
本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、候補分化因子を細胞集団に提供してから、第２の時間ポイントでマーカー発現を決定するまでに十分な時間を取ることができる。候補分化因子を細胞集団に提供してから、第２の時間ポイントでマーカー発現を決定するまでに十分な時間は、約１時間から最大約１０日間であることができる。いくつかの実施態様では、少なくとも１つのマーカーの発現は、候補分化因子を細胞集団に提供した後の複数の時間で決定される。いくつかの実施態様では、十分な時間は少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間から数日から数週間である。
本明細書に記載された方法のいくつかの実施態様では、第１の時間ポイントでのマーカーの発現と比べて、第２の時間ポイントでのマーカーの発現が増減したかどうかさらに決定される。少なくとも１つのマーカーの発現の増大または減少は、候補分化因子が内分泌性前駆細胞の分化を促進できることを示す。同様に、複数のマーカーの発現が決定されるなら、第１の時間ポイントでの複数のマーカーの発現と比べて、第２の時間ポイントでの複数のマーカーの発現が増減したかどうかがさらに決定される。マーカー発現の増大または減少は、第１と第２の時間ポイントでの細胞集団における、マーカーの量、レベルまたは活性を測定するか、または他の方法で評価することによって決定できる。そのような決定は、他のマーカーとの相対値、例えば、ハウスキーピング遺伝子表現に対して、または絶対値であることができる。ある実施態様では、マーカー発現が第２の時間ポイントで第１の時間ポイントと比べて増加する場合には、増加量は少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍または少なくとも約１００倍以上である。いくつかの実施態様では、増加額は２倍より少ない。マーカー発現が第２の時間ポイントで第１の時間ポイントと比べて減少する場合には、減少の量は少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍または少なくとも約１００倍以上である。いくつかの実施態様では、減少の量は２倍より少ない。
本出願を通じて、種々の文献が参照されている。これらの刊行物の開示内容は、本発明の技術分野における技術水準をより完全に記載するために、その全体が本願に参考として援用される。
実施例
以下の実施例で使われた単純で定義された培地は、ＤＣ−ＨＡＩＦと呼ばれ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、非必須アミノ酸、微量元素、アスコルビン酸、β−メカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン（任意）、カプリル酸抽出された脂肪酸非含有のＢＳＡ、鉄結合性グロブリン、組換え型のヘレグリン−１β（Ｈ）、アクチビンＡ（Ａ）、ＬＲ３−ＩＧＦ１（Ｉ）、およびＦＧＦ２（Ｆ）のタンパク質から本質的になる。ＤＣ−ＨＡＩＦは多分化能ｈＥＳ細胞の長期維持をサポートし、またＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を使用した単独細胞継代およびｈＥＳ細胞のスケールドエキスパンション（scaled expansion）をサポートした。上掲のRobins, A. & Schulz, T. 2009を参照。ＤＣ−ＨＡＩＦのバッチテストされた市販製剤は、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標） ｈＥＳＣ ＳＦＭという商号でＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから利用可能である。
これらの背景研究の間中、ＦＧＦ２が定義された培地の必要な成分でなないことが明確になった。高濃度のときにさえ、ＦＧＦ受容体の貧しいかまたは中程度のリン酸化だけが成長因子刺激の後に観測された。増殖、突発性分化または多分化能の維持について測定可能な影響を培養物に与えることなく、ＦＧＦ２を定義された培地から省略できた。上掲のRobins, A. & Schulz, T. 2009を参照。したがって、以下の研究では、テキストおよび図の凡例に示すように、加えられたＦＧＦ２なしで行われた。さらに、いくつかの検定方法は、成長因子の組み合わせを変えることを要求したので、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標） ｈＥＳＣ ＳＦＭの成長因子を含まないバッチがLife Technologiesに特注され、購入され、そのような適応性を提供した。
ｈＥＳ細胞培養で重要な機能を有する追加シグナリング経路にハイライトを当てるために、公知の生理活性を有する低分子化合物のライブラリから本質的に成るＬＯＰＡＣライブラリが、低密度ｈＥＳ細胞培養をスクリーニングするのに使われた。目的は、培養エキスパンションおよび／または、多分化能に否定的な影響を与えた低分子を同定することであった。主要な系路の阻害が、遅くされた増殖、細胞障害性、アポプトーシスまたは分化をもたらすと予想されるだろう。重要なことには、これらの一次的および二次的スクリーニングは、本明細書に記載された単純定義された培地を背景として実行され、血清またはセミ分画されたアルブミンなどの未定義の成分によって典型的に導入される変異性を減少させた。活性を決定するために、アルカリホスファターゼ染色検定が行われ、約５０の低分子化合物がｈＥＳ細胞成育と生存を含むｈＥＳ細胞へのそれらの影響に関していくらかの測定できる活性を示した。これらの化合物の、細胞表面神経伝達物質受容体の多数の阻害剤が同定され、これらの受容体の自己再生におけるシグナリングの役割を少なくとも示唆している。天然由来のリガンドまたは薬品作用関連誘導体を使用して、数種類の低分子神経伝達物質（これらは副腎皮質ホルモンとしても機能する）が同定され、低密度でｈＥＳ細胞成育のサポートおよび／または、エキスパンションと生存を示した。ｈＥＳ細胞の商業的および臨床用途に関する発展する先進技術に、そのような活性は重要である場合がある。たとえば信頼できる単独細胞クローニング、完全に定義された新規なｈＥＳ細胞ラインの効率的な導出、ＧＭＰ対応条件、懸濁液中におけるｈＥＳ細胞の成長や継代の向上した生存などである。
また、上記が本発明の例示の実施態様に関連し、本発明の範囲から逸脱せずに多数の変更を行うことができることが理解されるべきである。本発明は以下の実施例によってさらに説明される。実施例はいかなる方法でも本発明の範囲を制限することは意図されない。一方、手段は多くの他の実施態様、変更および等価手段を有し、本明細書に記載する説明を読んだ後に、本発明の精神および特許請求の範囲の記載から離れることなく明確に理解されるべきである。
実施例１：
多能性幹細胞における重要な経路の同定
定義されたメディアＤＣ−ＨＡＩＦ（ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標） ｈＥＳＣ ＳＦＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）での生育の間、この定義された培地中のｈＥＳ細胞の培養とＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）による単一細胞継代が小規模培養形式における確固とした平板培養を可能にすることが示された。９６−および３８４ウェルのプレートにこのアプローチを適用して、定量的で統計的に有意に細胞を数え、データは、ＥＲＢＢ２シグナリングの阻害剤であるＡＧ８２５の自己再生への効果を確認した。
１ウエルあたりおよそ３×１０４のｈＥＳ細胞がＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標） ｈＥＳＣ ＳＦＭのマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）上で、９６ウェルのプレートで約２４時間培養された。次に培地を変えた。新しい培地は、ＬＯＰＡＣ１２８０ライブラリ（表１の部分的なリスト）からの化合物の１０マイクロＭを含んでいて、培地はさらに４８時間培養された。培養物はついで固定され、未分化型ｈＥＳ細胞のマーカーである内因性のアルカリホスファターゼ活性のために染色された。このアッセイの形式は影響を受けたウエル（非集密的成長）と、影響を受けないウェル（集密的成長（confluent growth））の明らかな区別を示した。
よく特徴付けられた薬理活性を有する小有機分子のライブラリであるＬＯＰＡＣ１２８０のコレクション（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃ＬＯ１２８０）は、９６ウェルプレート（合計１６プレート）で上記のアルカリ性ホスファターゼ検出分析を使用することでスクリーニングされた。それぞれの９６ウェルのアッセイは８０個の化合物（１ウェルあたり１個の化合物）と１６ウエルのＤＭＳＯキャリアネガティブコントロールで実行された。約５０個以上の化合物が一次的なスクリーニングでｈＥＳ細胞成育とエキスパンションに影響を与えるとして同定された。それらはついで二次スクリーニングにより３８分子の群（表１）にされ、通常の知られている細胞傷害性分子類は除かれた（例えば、５アザシチジン）。これらの分子類によって影響を与えられそうな系路（したがってｈＥＳ細胞において重要な系路）はＮＦκＢ、ｅＮＯＳ、ＲＡＲ（ａ）、カルシウムチャネル、タヒキニンシグナリング、グアニリルシクラーゼ、ＳｒｃおよびＪａｋ２によるシグナリングを含む。
二次スクリーニングは同じアッセイを使用することで実行されたが、１０マイクロＭではなく、０．１−５０マイクロＭの化合物の希釈列が使用された。それぞれの化合物の最小有効濃度を示す（表１）。興味深いことに、３８の候補化合物のうち１１（２８％）は既知の、神経伝達物質受容体のアゴニスト、拮抗体、モジュレータまたはリガンドであった（表１、図１）。ｈＥＳ細胞自己再生でのＧＡＢＡシグナリングの役割は以前に（Ludwig et al., 2006）強調されていたが、他の定義されたメディア条件の下では調べられていない。未分化型多分化能性幹細胞での他の神経伝達物質のための潜在的役割は特徴付けられていない。
Figure 0005961110
Figure 0005961110
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実施例２：
定義された培地の低細胞濃度における多能性細胞自己再生をサポートする低分子
神経伝達物質受容体を通して作動するのが知られている１１の候補化合物の一次的なＬＯＰＡＣスクリーニングでは、６つは拮抗体（アデノシン、ドーパミン、コリン作動性、ＮＭＤＡ、セロトニン、およびヒスタミン受容体）と１つの受容体モジュレータ（コリン作動性（ニコチン様の）の受容体）である（図１）。これらの受容体のブロッキングが増殖を禁止するか、またはアポプトーシスを引き起こすように見えたので、ｈＥＳ細胞の成育と生存に、受容体シグナルは重要であるかもしれない。したがって、リガンド駆動の受容体刺激がｈＥＳ細胞での自己再生または他の望ましい活性に作用できるということになる。現在のｈＥＳ細胞培養における主要な制限は低密度での細胞培養のが不能であることである。ｈＥＳ細胞の単独細胞クローニングのいくつかの報告にもかかわらず、完全に定義された培地における、個々のｈＥＳ細胞の低密度培養とクローニングのための信頼できる条件は開発されていない。Amit et al., 2000 Dev Biol 227, 271-278; Pyle et al., 2006 Nat Biotechnol 24, 344-50; and Watanabe et al., 2007 Nat Biotechnol 25, 681-6を参照。そのような活性を顕在化させる低分子は、高密度、大規模なｈＥＳ細胞の懸濁培養において、より高い培養／生存、集合または抗アポトーシス活性をサポートし、実質的な改善を提供すると予測されるだろう。上記で特定された受容体に対応する神経伝達物質リガンド、並びに他のさまざまな神経伝達物質リガンドは、ｈＥＳ細胞が低密度で培養された時に、細胞生存と増殖のサポートについてテストされた。
コロニー形成アッセイ
約１０４ｈＥＳ細胞／ウエルでＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標） ｈＥＳＣ ＳＦＭ中、６ウェルのトレー中で、異なった化合物の存在下において約７日間培養された。培養物はついで固定され、アルカリホスファターゼ活性染色され、そして、コロニーが数えられた（図２）。５０未満のコロニーがＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ単独で、定義された培地で７日後に観測され、ｈＥＳ細胞がＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭの臨界密度閾値以下で生存および／または、有効に増殖しなかったことを示した。
前の実験は、最小で約１０５の細胞が６ウェルのトレーの中のエキスパンションと連続継代に必要であることを示した。ＲＯＣＫ阻害剤のＹ２７６３２が、ＭＥＦの低密度で育てられたｈＥＳ細胞成長が報告されていた(Watanabe et al., 上掲)のでコントロールとして含まれていたが、定義された培地におけるコロニー生存／エキスパンションをサポートしなかった（０コロニー）。また、神経伝達物質ヒスタミン、ニコチン、およびＮＭＤＡも向上したコロニー形成をサポートしなかった。しかしながら、アデノシン、アセチルコリン（ＡＣｈ）、およびノルエピネフリン（（−）−ノルエピネフリン、または（±）ノルエピネフリン（＋）酒石酸水素塩）のすべては、 向上したコロニー形成をサポートした（図２）。すべての３つの分子類が結合し、細胞表面受容体を活性化して、ｈＥＳ細胞で自己再生または反アポプトーシス信号に重要な、新たに認識されるシグナリング経路を示唆した。（±）ノルエピネフリン（＋）−酒石酸水素塩は、特記の無い限り、ノルエピネフリン（ＮＥ）にかかわるすべての以下の実験に使用された。
同様のコロニー計数法実験が、さまざまな細胞濃度（図３）を使用することで行われた。ＮＥまたはＡＣｈの存在下において４回以上において、ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ媒体単独と比べて多くのコロニーが検出され、それぞれ最低で１ウエル当たり１０００細胞と５００細胞であった。コロニー形成の頻度は異なる始めの密度と比較的一致しており、培養された細胞の２．５−３．５％のオーダーであった。より高い細胞濃度では、細胞移動は最初の約２４時間の培養でミクロコロニーの形成につながる。上掲のRobins and Schulz 2009を参照されたい。これらの低密度検定方法でのコロニー形成の一貫した速度は、移動と菌株群形成よりむしろ単独細胞から多くのコロニーを得ることができたと示唆した。低細胞濃度で誘導されたコロニーのイメージは、緊密な、典型的なｈＥＳ細胞形態を示した（図３）。しかしながら、コロニーの低い頻度は、よりゆるい、細胞のより星状のアレンジメントを示し、部分的な分化またはコロニー内のより不良な細胞−細胞接触を示した。
リアルタイムの細胞指数モニタリング
より詳細に個々の神経伝達物質の潜在能力を調べて、相乗作用が異なった要素の間に存在しているかどうかを評価するために、低密度検定方法がリアルタイムのインピーダンスリーダーを使用することで実行された。ＡＣＥＡバイオサイエンスＲＴ−ＣＥＳシステムは、細胞指数(cell index)の尺度に翻訳される電気インピーダンスの変化をモニターするために組み込まれたマイクロセンサを含む９６−ウエルトレイを使用する。細胞培養中のどんな明白な変調も検出でき、たとえば細胞増殖、移動、細胞拡散、アポプトーシス、分化、および同様のものが検出できるがこれらには限定されない。前の実験は、ｈＥＳ細胞がＲＴ−ＣＥＳトレー中において、有効に接着しエクスパンドすることを示し、進行性の増加する細胞指数が未分化細胞（Ｑ−ＰＣＲで確認される）の増殖を意味した。未分化型培養がいったんコンフリューエントになると、細胞指数は高いままであるが、毎日の給餌の間に上下する（波形：scallop）傾向がある。逆に、分化は典型的にはたとえば細胞指数における山と谷などのような特有のパターンの外観で示される。同様に上皮から間葉への変転（epithelial-to-mesenchymal transition）、平坦化、細胞移動、アポプトーシスまたは同様の分化とまたは成長に関連する変化を暗示する。
有効な神経伝達物質濃度の力価測定
ＲＴ−ＣＥＳシステムは、ＮＥとＡＣｈが有効である濃度領域を調べるのに使用された。人間の胚性幹細胞は低密度、１０００細胞／ウエルで、１０日間、ＲＴ−ＣＥＳトレー中で培養された（図４）。細胞はキャリアコントロール（ＤＭＳＯ）、ＮＥ、またはＡＣｈを含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ中で直接培養された。予想された通り、細胞はＤＭＳＯ単独では生存もしなかったし、有効に増殖もしなかった。細胞指数の上昇は９日後に観測されただけである。１マイクロＭのＮＥは低密度生存／増殖に影響するように見えなかったが、細胞指数の増大は最初の約６．５日間で５、１０、および５０マイクロＭ ＮＥで検出された。７０マイクロＭおよび１００マイクロＭ ＮＥの両方では、細胞指数は次第に速い上昇を示して、それぞれ約９日と１０日の後に明らかにコンフリューエントであった。ＡＣｈの力価測定は類似パターンをもたらした、また、効果を顕在化させた最も低い濃度は５マイクロＭであった。これらのデータはＮＥとＡＣｈの両方のための増加する用量応答を示唆した。これは受容体仲介機構と一致した、ＮＥとＡＣｈの両方が次に５０マイクロＭで使用された。それは、それぞれの神経伝達物質のための中間濃度を表した。
神経伝達物質組み合わせ
低分子神経伝達物質の潜在的追加効果を調べるために、ｈＥＳ細胞は、キャリア対照（ＤＭＳＯ）、またはＮＥ、ＡＣｈ、アデノシン、ＧＡＢＡ、Ｙ２７６３２、またはこれらの要素の２つの組み合わせを含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ中で培養された（図５）。ＤＭＳＯ単独、またはＹ２７６３２の存在下において、細胞は生存も増殖もしなかった。細胞膨張の３つのパターンが検出された。５０マイクロＭ ＮＥ、またはＡＣｈの、ただ一つの要素としての追加が、有効な生存とエキスパンションを可能にし、細胞指標が約３日後にバックグラウンドを超えて上昇した。２番目のグループの中のエキスパンションでは、５０マイクロＭのアデノシンまたはＧＡＢＡを含むものはあまり効果的ではなく、培養の約４．５日後に検出可能であった。最も著しいエキスパンションを示すグループは、３日後に検出可能であり、ＮＥ＋アデノシンおよびＮＥ＋ＡＣｈを含む培養液から成った。これはこれらのホルモン／神経伝達物質の間の相乗作用を示唆する。相乗作用を示唆した他の唯一の組み合わせが、ＧＡＢＡ＋アデノシンであった。これは中程度のグループであった。興味深いことには、Ｙ２７６３２の存在はＮＥ、ＡＣｈ、アデノシンおよびＧＡＢＡの効果を減少させ、明確に、ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ培地と神経伝達物質の中でＲＯＣＫ系路を禁止するという好ましくない効果を示した。これらの要素の間の相互作用に関する要約図は図５に提示される。
実施例３：
多分化能性幹細胞の低密度生存／エキスパンションをサポートするアゴニスト
合計６つの異なったクラスの神経伝達物質受容体がオリジナルのＬＯＰＡＣスクリーニングに含まれたので、次の目的はｈＥＳ細胞の低密度生存そして／または、エキスパンションへの影響の大きさを決定するために、同様のリガンドの広い配列（ａｒｒａｙ）を調べることであった。８８の神経伝達物質アゴニストのサブライブラリをＬＯＰＡＣコレクションから作成した。これはアデノシン、アドレナリン性、ベンゾジアゼピン系、大麻類のアゴニストおよびコリン作動性レセプタを表す。人間の胚性幹細胞は１０００細胞／ウエルで直接、ＤＭＳＯまたは個々のアゴニスト（１０マイクロＭ）を含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ中に入れられ、ＲＴ−ＣＥＳシステムで約９日間培養された。アデノシンとアドレナリン受容体（図６Ｂ）のアゴニストである、（±）ノルエピネフリン（＋）酒石酸水素塩（図６Ａ）の効果をまねた追加アゴニストが同定された。ドーパミン、セロトニン、およびホモバニリン酸（ＨＶＡ）、カテコールアミン代謝物を含む、いくつかの追加神経伝達物質が低密度インピーダンスアッセイでテストされた。ＤＭＳＯコントロール（図６Ｃ）と比べて、これらの化合物は上昇した生存／増殖を示した。これらの研究は、さまざまな神経伝達物質受容体またはシグナリング経路が低密度培養およびエキスパンションをサポートできて、それぞれの系路が多発性リガンドまたはアゴニストを活性化することができそうだと確認した。重要なことには、神経伝達物質系路のすべてがｈＥＳ細胞成育と多分化能にかかわるわけではない。これは、ＮＭＤＡ、ヒスタミン、およびＧＡＢＡによって示された確固とした活性の不足、およびアゴニストサブライブラリの１０マイクロＭの濃度でテストされたのときに有効でなかった８３個の化合物によって証明される。
実施例４：
低密度多分化能幹細胞培地の定義された培地における、神経伝達物質と増殖因子の組み合わせの効果
上記の研究は、同定された神経伝達物質によって提供されたシグナリングは潜在的にＤＣ−ＨＡＩＦまたはＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭに含まれた成長因子蛋白質を補足するかまたは置き換え、したがって、安価な低分子を高価な組換体蛋白質の代わりに用いることによってそのような培地をより費用対効果に優れるようにすることができると示唆した。定義された培地の費用の約半分は特に、アクチビンのためである。それは、製造するのが、難しく、ＣＨＯ細胞を使用して製造されている。しかし、少なくとも低密度のＲＴ−ＣＥＳ検定方法は、神経伝達物質の候補がＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭに提供された増殖因子の完全な代理をすることができそうにないことを示した。しかしながら、通常の（高い）細胞濃度では、これらの低分子は潜在的適合性代用物である。
したがって、追加検定方法が、ヘレグリン（Ｈ）、ＬＲ３−ＩＧＦ１（Ｉ）およびアクチビン（Ａ）の簡易型の組み合わせについて、神経伝達物質のあるものとないものについて効果を調べるために実行された（図７）。ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭとＨＡＩ（ヘレグリン、アクチビン、およびＬＲ３−ＩＧＦ１）だけを含むウェルでは、細胞は、予想されるように約９日目までバックグラウンドを超えて検出されなかった。しかしながら、ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ ＨＩ（ヘレグリンおよびＬＲ３−ＩＧＦ１）は予想外にはるかに確固とした生存／エキスパンションをサポートし、成長は約５．５日目に最初に検出された。おそらく、望ましくないＢＭＰ誘導の分化シグナルと競争することによってｈＥＳ細胞培養で突発性分化を抑圧するように見えたこと、およびアクチビン受容体の阻害が増加する分化を引き起こしたため、アクチビンは元々ＤＣ−ＨＡＩＦ媒体に含まれていた。アクチビンの役割は以前に低細胞濃度でテストされていなかったが、これらおよび次の実験は、培養においてこれらの条件での細胞の生存および／またはエキスパンションにおける主要な負の役割を担うことを示した。ＮＥ、ＡＣｈまたはＮＥ／ＡＣｈの添加は、ＨＡＩ（ヘレグリン、アクチビン、およびＩＦＧ１）またはＨＩ（ヘレグリンとＩＧＦ１）バックグラウンドにおいて、改善された生存／エキスパンションを実質的にサポートした。興味深いことには、ＮＥとＡＣｈの間の相乗作用はＨＡＩのバックグラウンドにおいて観測されたが（以前に観測されたように）、アクチビンが省略されたとき、それは明白でなかった。したがって、最大生存／エキスパンションはＮＥを有するＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ ＨＩ（ヘレグリンとＩＧＦ１）で観測された。ＡＣｈの添加はさらなる改善を提供しなかった。
コロニー計数アッセイ
異なるアプローチを使用することでこれらの観察が適正であることを示すために、低密度コロニー計数法アッセイが実行された（図８）。約１０４ｈＥＳ細胞はＨＡＩ（ヘレグリン、アクチビン、およびＩＦＧ１）またはＨＩ（ヘレグリンとＩＧＦ１）を含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭと、それ単独または神経伝達候補物質との組み合わせ、および前の実験からの（ＮＥ、ＮＥ／セロトニン、ＮＥ／ＡＣｈ、ＡＣｈ、またはＡＣｈ／セロトニン）の組み合わせを、６ウェルのトレーの中で培養した。ＡＰ＋コロニーの計数は、低細胞濃度におけるコロニー形成のときのアクチビンの負の影響を明確に確認し、ＨＩ内で神経伝達物質コントロールの無い場合に、＞２００コロニーであった（図８Ａ）。これらのコロニーは、小さく、大規模に増殖していなかったが、ネガティブコントロールと比べて、明確に存在していた。任意の神経伝達物質リガンドの付加はコロニー形成における顕著な改善を引き起こし、これはＲＴ−ＣＥＳ検定方法と一致した。またＮＥを有するＨＩ条件はテストされた他の要素の添加で改良されなかった。染色されたコロニーのイメージは、アクチビンの存在下で、生き残っているコロニーが主として不均等であり、分散細胞が小さなコロニーコアの周囲に観察され、一般にはより多くの星状の形態(stellate morphology)を示した（図８Ｂ）。これらの特徴は、低い細胞濃度のアクチビンが培養物の部分的な分化、または細胞の遊走の増加を引き起こし、コンパクトなコロニーが形成されないことを示唆する。これらまたは他の効果は細胞生存に非常に影響を与えそうである。逆に、アクチビンの非存在と神経伝達物質の存在下では、タイトでコンパクトなコロニーが典型的に形成された。これは安定してエキスパンドできる未分化型ｈＥＳ細胞の典型である。
同様の実験が、神経伝達物質によって提供されたシグナリングが、ＩＧＦ１またはヘレグリンの代理をすることができるかどうか決定するために行われた。低密度平板培養検定方法は、ＲＴ−ＣＥＳリーダーで、アクチビン（Ａ）、ヘレグリン（Ｈ）、ＬＲ３−ＩＧＦ１（Ｉ）、および神経伝達物質候補の異なった組み合わせを有するＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭを使用して実行された（図９）。前の検定方法と一致して、インピーダンスの上昇はアクチビンの非存在、神経伝達物質ＮＥ、ＮＥ／ＡＣｈ、ＮＥ／アデノシン、ＮＥ／ドーパミン、ＮＥ／セロトニンおよびＡＣｈ／セロトニンが存在する時に非常に早く検出された。ＡＣｈ／ドーパミンの組み合わせまたは、ＡＣｈ／ＨＶＡの組み合わせは、ｈＥＳ細胞の実質的な生存／エキスパンションを促進するように見えなかった。ヘレグリンだけを含有する培地は、低い細胞濃度生存をサポートしなかったが、上記の神経伝達物質の添加は顕著な改善を引き起こした。しかしながら、ヘレグリン（ＩＧＦ単独）がないとき、培養は神経伝達物質の存在または非存在のどちらでもエキスパンドしなかった。したがって、アクチビンとＩＧＦ１が、これらの短時間分析において不必要であるように見える一方、神経伝達物質によって提供された活性は、低細胞濃度でヘレグリンシグナリングの代理をするように見えなかった。
実施例５：
神経伝達物質は多能性細胞の浮遊培養を向上する
低細胞濃度で生存または自己再生をサポートする低分子リガンドが、他の培養形式においても有益な効果を持っていると予想できた。出願人は、以前に、細胞の連続的増殖と培養の効果的なエキスパンションを可能にするｈＥＳ細胞の浮遊培養システムを開発した。人間の胚性幹細胞（少なくともＢＧ０２とＣｙＴ４９細胞）は、分化なしで１０以上の継代で懸濁で維持された。テクニックの基礎は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）、ＴｒｙｐＬＥまたは細胞散布バッファなどの高い生育性を保持する試薬で培養物を分離して単独細胞にすることであり、次に、回転培養で定義された培地において、細胞の規定された濃度で集合体にした。これらの方法は、２００８年１１月４日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８２３５６の幹細胞集合体懸濁液組成物、その分化方法、および２００７年２月２３日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５の分化細胞の培養方法および培養物に詳細に記載される。これらは本明細書に参考として全体を援用する。ｈＥＳ細胞の自己凝集は、加えられた細胞外マトリックス（ＥＣＭ）またはＥＣＭのようなタンパク質の非存在下に起こり、Ｅ−カドヘリンのホモタイプ相互作用によって一部駆動されると推定される。３−４日間のエキスパンドで形成される集団は、回転培養によって発生したせん断力によって互いに離れて保たれる。細胞は、定義された培地によって提供される自己再生シグナリングにより分化が妨げられて、それらの多分化能特性、生体外と奇形腫におけるマーカー発現、正常核型、および分化能を保持する。それぞれの継代で培養のエキスパンションを最大にするために、最小量の実行可能なサイズの均一の集団の最多数を発生させるのは、望ましい。
人間の胚性幹細胞はローアタッチメント６ウェルのトレー中に１０６細胞／ｍｌで、ヘレグリン（Ｈ）、ＩＧＦ１（Ｉ）、およびアクチビン（Ａ）を含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭの５ｍｌ中、１００ｒｐｍで培養され、懸濁液中で凝集された。実験変数はＹ２７６３２、ＮＥ、ＡＣｈまたはＮＥ／ＡＣｈの添加を含んでいた（図１０Ａ）。首尾よく集合体であり、コピーされたウエルの全ての条件で、短期的な細胞生存を決定するために、２４時間後に収穫され、分離され、数えられた。ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ単独では、約５０％の細胞だけが最初の２４時間生き残ったが、他のすべての処理は約４ｘ１０６細胞を示した（図１０Ｂ）。ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ中の高細胞密度での細胞生存へのＹ２７６３２のポジテイブな効果は、接着培養における前の観察と一致していて、ＮＥ、ＡＣｈおよびＮＥ／ＡＣｈの類似の効果とマッチしていた。すべての条件で４日間の回転培養により拡張され、低分子を有する処理で顕在化する細胞数の増大は、細胞計数によって確認された（図１０Ｃ）。さらに、４日目における集団の直径の測定は培養の期間での観察を確認した（図１０Ｄ）。ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ単独では、凝集体サイズは非常に可変であったが、Ｙ２７６３２の添加は細胞の向上した集合を引き起こし、より少ない数の、より大きい集団が見いだされた。対照的に、ＮＥ、ＡＣｈまたはＮＥ／ＡＣｈの添加は、Ｙ２７６３２で形成されたものよりより小さい集団を可能にし、ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ単独のものより一貫して均一サイズのものであった。これらのデータは、神経伝達物質がｈＥＳ細胞の（通常）の、より高い密度浮遊培養のためにいくつかの利点を提供することを示した。第一に、それらは集合段階の間、Ｙ２７６３２で観察されたものと等しいかまたは優れた細胞生存を促進した。第二に、それらはより小さくて一貫して均一なサイズの集合体の形成を促進し、潜在的に凝集体サイズとスプリットの間の時間の長さのより優れた制御を提供し、その結果、それぞれの継代で可能なエキスパンションを最大にする。
染色体安定性
これらの可能性を調べるために、これらの培養物はｐ１に連続的に継代された（図１０Ｅ）。Ｙ２７６３２によって処理された集団がより大きいサイズのものであったので、それらは、３日後に継代を必要として、その期間におよそ１．２×１０７の細胞しか発生させなかった。対照的に、ＮＥ、ＡＣｈまたはＮＥ／ＡＣｈ含有培養液が、６日間培養されて、１ウエルあたり２×１０７の細胞を発生させた。ＮＥ、ＡＣｈまたはＮＥ／ＡＣｈを含む浮遊培養液が、１２の連続継代のために保持され、平行してＨＡＩＦコントロール培養が行われ、すべての条件が、未分化型形態を維持した。懸濁集団は、１０継代の後に単独細胞に分離され、分析のために接着培養で再培養された。Ｏｃｔ４およびＴｒａ−１−６０（図１１）、および他の多分化能マーカーの発現は一様に維持され、培養が未分化であったのを示した。再培養物も、それらの核型を決定するためにＧ−結合された。ＨＡＩＦコントロールとＨＡＩＦ／ＮＥ培養物の両方が、正倍数体または正常であったが、ＡＣｈ含有培養物は異数体または異常性であり、第５染色体の三染色体性と他の変調を示した。この実験は、ＮＥの存在下においてｈＥＳ細胞の長期培養の間ゲノム安定性を維持できて、成長利点を有する異数性細胞の亜細胞が、発生されなかったか、または富化されなかったことを示唆した。しかしながら、このデータが、ＡＣｈがゲノム一体性に影響することを示唆するので、ｈＥＳ細胞の低密度の生存／成長をサポートするすべての要素が、より高い密度での細胞生育条件で有用性を有するわけではないことは明確である。
実施例６：
ノルエピネフリンの存在下において標準の密度での多能性細胞のエキスパンションをサポートする増殖因子の組み合わせ
ノルエピネフリンは細胞が低密度で育てられたとき、ヘレグリンシグナリングの代理をすることができるように見えなかった。これはこれらの要素が異なったシグナリング経路に影響を与えることができることを示唆している。しかしながら、細胞−細胞接触とシグナリングの関係は、標準の播種密度において全く異なっている。そこでは細胞がマイグレートし、最初の２４時間の培養でミクロコロニーを形成する。上掲のRobins and Schulz, 2009を参照。したがって、ｈＥＳ細胞をサポートするのに必要な増殖因子の実質的な相違を、低密度および高密度で観測できる。したがって、インピーダンスリーダーを使用して、ｈＥＳ細胞の標準の密度における短期的成長検定が行われた。約１０４ｈＥＳ細胞／ウエルが、５０マイクロＭの、ＮＥ、ヘレグリン（Ｈ）、ＬＲ３−ＩＧＦ１（Ｉ）、アクチビン（Ａ）、またはＦＧＦ２（Ｆ）の異なった組み合わせを含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭで培養され、３．５日間にわたりモニターした。低細胞濃度における結果と対照的に、ＮＥはある程度の高い密度条件でヘレグリンが存在しない時、培養のエキスパンションをサポートするかもしれない（図１２Ａ）。サポートできる組み合わせはＮＥ／ＡＩＦ、ＮＥ／ＩＦ、ＮＥ／ＩＡおよびＮＥ／Ｉを含む。ログ相成長の間の細胞指数の傾斜の測定結果が示される（図１２Ｂ）。これらのデータは、ＮＥが存在する時、組換え型の増殖因子の簡単な組み合わせで、未分化型ｈＥＳ細胞をエキスパンドすることが可能であることを示す。そのような簡単な培地は実質的な利益を持つことができ、特に治療応用のための大規模製造の間のｈＥＳ細胞の商品原価と関連する。
実施例７：
ノルエピネフリンの存在下における多能性細胞の連続継代のための成長因子への要求
ＮＥと増殖因子の簡単な組み合わせ候補を含むメディア中のｈＥＳ細胞の連続継代の効果は、少なくともＢＧ０１（図１３）とＢＧ０２（図１４）細胞についてテストされた。試験条件は１０ｎｇ／ｍｌのヘレグリン（Ｈ）、２００ｎｇ／ｍｌのＬＲ３−ＩＧＦ１（Ｉ）、１０ｎｇ／ｍｌのアクチビン（Ａ）、および８ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｆ）を含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ中で維持された細胞と比較された。ヘレグリン（すなわち、ＡＩＦ）の非存在下において、ある種のｈＥＳ細胞培養は有効に維持できなかった。たとえば培養物は、密にパックされた領域があるが、一般に不十分な増殖であった。たとえば増殖はウェルの外側の縁で密であるが、増殖は通常であった。アクチビンが省略された培地（ＩＦ）も、不十分に増殖して、４番目の継代で失われた。しかし、ＮＥが含まれていたとき、ヘレグリン（ＡＩＦ ＮＥ）の非存在下において、有効なｈＥＳ細胞増殖とウェル全体のｈＥＳ細胞コロニー増殖さえ観測された。それでも、ＮＥは標準細胞ではアクチビンの要件のための代理をするように見えない。ＩＦ ＮＥ培地がいくつかの継代にわたって分化されるからである。ＨＡＩＦ、ＡＩＦ、およびＡＩＦ ＮＥ条件は少なくとも５継代にわたり維持された。ＡＩＦ ＮＥはＡＩＦだけより好ましかった。なぜなら後者は、不均等な成長を示し続けたからである。
また、ある種のｈＥＳ細胞もヘレグリン（ＡＩＦ）の非存在に対して形態的応答を示した。細胞がより平坦になり、より広がり、コロニーがタイトな上皮性のパッキングを示さない。同様の形態はすべての（ヘレグリンがない）アクチビン含有細胞培養液で観測された。これらの細胞培養は、別の方法で未分化型特性を表示し続けて、明白に分化しているように見えなかった。ヘレグリンとアクチビンの両方（ＩＦ）が存在しないとき、コロニーは、非常に緊密にパックされてドーム型になり、典型的なマウスＥＳ細胞培養の形態と、より類似していた。ＩＦ／ＮＥおよびＩＦ／ＮＥ／ノギンの培地は例外的なＥＳ形態を示し、緊密な上皮性のコロニーを示し、明白な分化は示さなかった。したがって、複数の条件が多数の継代にわたってｈＥＳ細胞の連続性エキスパンションをサポートするかもしれないが、ＩＦ ＮＥおよびＩＦ ＮＥ ノギンの組み合わせのみが予想された上皮性の特性の維持を促進した。これらの連続的に継代されたｈＥＳ細胞における多分化能の維持は、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０およびＳｏｘ２の免疫蛍光によって示された（図１５）。これらの実験は、増殖因子の簡易型の組み合わせが、特にはノルエピネフリン（ＮＥ）が培養液に含まれているとき、多能性細胞および連続的増殖をサポートすることを示し、確認した。
実施例８：
多能性細胞におけるアドレナリン受容体の発現と機能
多分化能幹細胞増殖におけるそれらの潜在的役割を調べるために、アドレナリン受容体の発現がＱ−ＰＣＲを使用して調べられた。そして、アドレナリン受容体機能の阻害剤が細胞成育への効果についてテストされた。いくつかのアドレナリン受容体の一定の比較的高い発現はＡＤＲＢ１、ＡＤＲＢ２、ＡＤＲＡ２ＢおよびＡＤＲＡ１Ｄを含むｈＥＳ細胞ラインで検出された（図１６）。ＡＤＲＡ２Ｃは、ｈＥＳ細胞試料で一貫して発現されるが、低レベルでは、ＡＤＲＡ１ＡとＡＤＲＡ１Ｂは低水準にあったか、または未分化細胞中で非一貫的に検出されただけである。５０マイクロＭ ＮＥの存在下において、アドレナリン受容体の４０個の異なった阻害剤がｈＥＳ細胞膨張への効果について低細胞濃度でテストされた。未処置のＨＡＩＦ＋ＮＥコントロール、７つのα−アドレナリン作動性受容体拮抗体、５つのβ−アドレナリン受容体拮抗体、および２つのβ−アドレナリン受容体遮断薬の比較により、低細胞濃度でｈＥＳ細胞生存および／または、エキスパンションに影響を与えかどうかが同定された（図１７）。これらの研究は、ｈＥＳ細胞が、さまざまなαおよびβアドレナリン受容体の両方を発現し、受容体機能を禁止して、ｈＥＳ細胞のエキスパンションに影響を与える。その両方がｈＥＳ細胞におけるＮＥシグナリングの重要さを確認する。
本明細書に記載された、方法、組成物、および装置は、好適な実施例を表わすものであり、例示に過ぎず、本発明の範囲を制限することを意図しない。例えば、あるｈＥＳ細胞ラインが使われた；しかしながら、本発明は任意の多分化能幹細胞ラインの使用を意図し、たとえば人間のｉＰＳ細胞ラインと他の言及されなかったｈＥＳおよびｉＰＳ細胞ライン、たとえば以下の表２と３に示されるもの、国立衛生研究所の幹細胞レジストリからのhttp://stemcells.nih.gov/research/registrのワールドワイドウェブに適合しているもの、マサチューセッツ医学大学、ウスター（マサチューセッツ）、米国に位置する、ヒト胚性幹細胞レジストリおよび国際幹細胞レジストリに示されるものを含む。
細胞ラインが利用可能となり、登録が得られると、定期的にこれらのデータベースはアップデートされる。それの細胞ラインのいくつかは、ＮＳＣＢ幹細胞レジストリで利用可能ではない。
それにも関わらず、本発明の出願日現在、少なくとも以下のｈＥＳ細胞ラインは商業的に利用可能である。
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本明細書に記載された培地組成物は、ｉＰＳ細胞ラインなどの他の多能性細胞ラインと共に使うことができる。例えば、少なくともｉＰＳ（Foreskin）、およびｉＰＳ（ＩＭＲ９０）のクローン、ｉＰＳ−ＤＦ１９−９のクローン、これはベクターフリーｉＰＳ細胞ラインである、も使用できる。ｉＰＳ細胞の研究と応用のための京都大学センター（ＣｉＲＡ；山中伸弥）およびウィスコンシン大学（ジェームズ・トムソン）からの細胞ラインも使用できる。それの或るものはＷｉＣｅＩｌから利用可能である。
そこでの変化および他の用途は当業者によって考えられるであろうが、それらは本発明の精神の範囲内に包含され、請求の範囲によって定義される。本明細書中で開示された発明に対する種々の置換および変更が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく行われうることは、当業者に容易に理解されるであろう。
以下の特許請求の範囲および本出願の開示において使用される、「本質的に成る」との用語は、引き続くリストに記載される任意の要素を含むことを意味し、列記された要素について記載された活性や作用を妨害しないかまたはそれらに貢献する他の要素を含むことができる。すなわち「本質的に成る」との用語は、列記された要素は必要であるかまたは義務的であるが、他の要素は任意であり、それらが記載された要素の活性または機能に影響するかどうかによって、存在できないかまたは存在できる。

Claims (19)

  1. ａ）定義された細胞培地、
    ｂ） 神経伝達物質受容体のアゴニスト、リガンド、およびモジュレータから成る群から選択された化合物であって、該神経伝達物質受容体は、アドレナリン作動性、ドーパミン作動性、またはアドレナリン作動性およびドーパミン作動性受容体である化合物、および
    ｃ） 人間の多分化能性幹細胞を含む組成物。
  2. 該化合物は神経伝達物質受容体のアゴニストである、請求項１記載の組成物。
  3. 該神経伝達物質受容体が、ノルエピネフリン、ドーパミン、それらの構造類似体、誘導体、および生理的に許容できる塩から成る群から選択される、請求項２記載の組成物。
  4. 該神経伝達物質受容体が、ノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、および生理的に許容できる塩である、請求項３記載の組成物。
  5. 少なくとも１つの増殖因子を含む、請求項１記載の組成物。
  6. 該少なくとも１つの増殖因子が以下から成る群から選択される、請求項５記載の組成物：
    ＥｒｂＢ３リガンドまたはそれらの機能的な断片；ＴＧＦ−βファミリーメンバーまたはそれらの機能的な断片；インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）のアクチベータまたはそれらの機能的な断片；および繊維芽細胞生長因子（ＦＧＦ）受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片。
  7. 該組成物が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項６記載の組成物。
  8. 該ＥｒｂＢ３リガンドは、ニューレグリン−１、ヘレグリン−Ｐ（ＨＲＧ−Ｐ）、ヘレグリン−ａ（ＨＲＧ−ａ）、Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、アセチルコリン受容体誘導活性剤（ＡＲＩＡ）、膠細胞成長因子２（ＧＧＦ２）、感覚および運動神経由来の因子（ＳＭＤＦ）、ニューレグリン−２；エピレグリン、ビレグリン、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項６記載の組成物。
  9. 該ＴＧＦ−βファミリーメンバーが、ノーダル、アクチビン Ａ、アクチビン Ｂ、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１、および骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）から成る群から選ばれる、請求項６記載の組成物。
  10. 該ＩＧＦ−１ＲのアクチベータがＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ｌｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項６記載の組成物。
  11. 該ＦＧＦ受容体のアクチベータが、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２２、およびそれらの機能的な断片から選択される、請求項６記載の組成物。
  12. 該培地が外因のＦＧＦ受容体のアクチベータ、外因のＴＧＦ−βファミリーメンバー、外因のＥｒｂＢ３リガンド、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項１記載の組成物。
  13. 単独細胞集合体の懸濁液として、多分化能性幹細胞が培養される、請求項１記載の組成物。
  14. 該組成物が、正倍数体状態で該多能性幹細胞のエキスパンションをサポートする、請求項１記載の組成物
  15. 前記の少なくとも１つの増殖因子が、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）のアクチベータまたはそれらの機能的な断片；繊維芽細胞生長因子（ＦＧＦ）受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片；および任意のＥｒｂＢ３リガンドまたはそれらの機能的な断片の組み合わせから成る、請求項６記載の組成物。
  16. 該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩を含む、請求項１記載の組成物。
  17. ノギンをさらに含む、請求項１６記載の組成物。
  18. 人間の多分化能性幹細胞をエキスパンドさせるための方法であって、
    ａ）定義された細胞培地、および
    ｂ） 神経伝達物質受容体のアゴニスト、リガンド、およびモジュレータから成る群から選択された化合物であって、該神経伝達物質受容体は、アドレナリン作動性、ドーパミン作動性、またはアドレナリン作動性およびドーパミン作動性受容体である化合物を含む組成物中で、人間の多分化能性幹細胞をインキュベートすることを含む方法。
  19. ５００から１０，０００セル／ウエルの濃度で人間の多分化能性幹細胞がインキュベートされる、請求項１８記載の方法。
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