JP5975886B2 - Ｆｃ融合タンパク質を含む、免疫応答を増強するための方法および組成物 - Google Patents

Description

本発明は、一般に免疫応答を調節することに関し、より具体的には、Fc融合タンパク質を用いて、個体における細胞性免疫応答を増強することに関する。

患者を治療するための癌ワクチンの良好な活用は、定義が難しいままであり、がん細胞によって発現される抗原に対する細胞性および他の免疫応答を刺激する組成物および方法の有効性を改善することについて、現在もなお、満たされていない要求が存在する。

本発明は、これらの及び他の関連する要求を満たすことを課題とする。

本発明は、個体において細胞の増殖を抑制する組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法によって標的にされる細胞は、抗原、抗原のミモトープ、またはCXCR4 ケモカインレセプターを発現する。

一実施形態において、前記方法は、個体に、免疫グロブリン(Ig)Fcおよび前記細胞によって発現される抗原または前記抗原のミモトープをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与することを含む。別の実施形態において、前記方法は、個体に、免疫グロブリンFcおよび前記細胞によって発現されるCXCR4 ケモカインレセプターのアンタゴニスト・ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与することを含む。様々な実施形態において、本発明はがん細胞（腫瘍細胞であってもよいが、必ずしもそれに限定されない）の増殖を抑制する。

IgFcをコードするポリヌクレオチドは、一実施形態において、組換え腫瘍退縮性ワクシニアウイルスである。

前記ポリヌクレオチドによってコードされた融合タンパク質は、ヒトIgG1 FcもしくはヒトIgG3 Fcを含んでもよく、さらに、Ｔヘルパー・エピトープを含んでもよい。本発明は、また、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び／又は前記コード化タンパク質を含む組成物を提供する。前記タンパク質は、免疫グロブリンFcおよび抗原または当該抗原のペプチド模倣物(peptide mimic)、または、免疫グロブリンFcおよびがん細胞によって発現されるレセプターのアンタゴニスト・ペプチドを含む。

図１は、担がんマウスにおける47-LDA-もしくは47-LDA-Fcγ2a-パルス樹状細胞(DCs)および養子細胞移入(ACT)を用いたワクチン接種の概要を描写する図である。 Aは、47-LDA-もしくは47-LDA-Fcγ2a-パルス樹状細胞を用いたワクチン接種を示す。A/Jマウス(n＝5)は、IL-15およびIL-21ベクターの存在下、47-LDA-もしくは47-LDA-Fcγ2a-パルス樹状細胞を用いて2週間間隔で免疫化された。三度目の免疫化の三週間後、CD8⁺脾細胞を、ネガティブ・セレクションによって取得し、NXS2-担持マウス(NXS2-bearing mice)にACTのために使用した。 Bは、ACTおよびDCワクチンによる原発腫瘍増殖の抑制を示す。A/Jマウスは、2×10⁶のNXS2細胞でチャレンジ(曝露)された。15日後（ACTおよびDCワクチン接種の1日前）に、5 Gy TBIもしくは9 Gy TBIプラスBM移入(10⁷細胞)によって、リンパ球減少症が、担がんマウスに誘発された。16日目に、抗原経験CD8⁺細胞(2×10⁷)の養子移入とともに、DCワクチンが投与された。腫瘍の増殖は、週に一度から三度、マイクロキャリパー(microcaliper)を用いて、皮下腫瘍を測定し、腫瘍体積を決定する(幅×長さ×幅／2＝mm³)ことによってモニターされた。 Cは、ACTおよびDCワクチンによる転移性疾患の抑制を示す。NXS2-担持マウスは、腫瘍切除時に、骨髄非破壊的な若しくは骨髄破壊的なTBIを受けた。1日後、前記マウスは、免疫化マウスからのCD8⁺Ｔ細胞(2×10⁷)のACT、あるいは未処置マウスからの非分離脾細胞のACTを、DCワクチンとともに受けた。生存時間は、マウスが広範な腫瘍増殖あるいは転移の発生のために犠牲になった時点と定義された。 図２は、47-LDA-Fcγ2a 融合タンパク質および樹状細胞との相互作用の特性評価を示す。 Aは、ビオチン化14G2a mAb及びストレプトアビジン-HRPを用いた47-LDA-Fcγ2a 融合タンパク質と47-LDA ポリペプチドのウエスタンブロット法を示す。 Bは、未熟CD11c⁺DCsへの47-LDA-Fcγ2a 融合タンパク質及び47-LDA ポリペプチドの結合を示す。骨髄(BM)由来DCsは、ビオチン化47-LDA-Fcγ2a 融合タンパク質もしくは47-LDA ポリペプチド、続くストレプトアビジン-PEとの併用で、FITC-結合CD11c-特異的mAbを用いて染色され、フローサイトメトリーで分析された。抗CD86-PE mAbで染色されたDCsは、特異性コントロールとして使用された。CD11c-陽性DCs上の47-LDA-Fcγ2a、47-LDAおよびCD86分子のパーセント及び平均蛍光強度(MFI)が求められた。矢印は、ヒストグラムにおいて、細胞の起源を示す。データは、三回行ったうちの一つの代表的な実験のものである。 Cは、LPS刺激後の、47-LDA-Fcγ2a⁺、47-LDA⁺、CD86⁺ DCsおよびそれらのネガティブ対応物によるIL-12p70の細胞内発現を示す。未熟DCsは、ビオチン化47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質、47-LDAポリペプチドまたはCD86-特異的mAb、それに続くストレプトアビジン-PEで染色された。ポジティブ及びネガティブな集団は、BD FACSAria(登録商標)フローサイトメーターで分別され、1μm/mlのLPSとともに一晩インキュベートされ、IL-12p35サブユニットに特異的なラット 抗マウス IL-12p70 mAb、続いて、ヤギ抗ラット二次抗体を用いた細胞内染色によってIL-12p70発現が分析された。バックグラウンド染色(MFI＜2.6)は、アイソタイプ・コントロールAbを用いて評価された。全てのフローサイトメトリー評価は、FACScanもしくはFACSCaliburフローサイトメーターで行われた。前方および側方散乱パラメーターでゲーティング(gating)後、少なくとも10,000のゲート事象(gated events)がルーチン的に獲得され、CellQuestソフトウェアを用いて解析された。データは、三回行ったうちの一つの代表的な実験のものである。 図３は、LPS刺激後の、47-LDA⁺および47-LDA-Fcγ2a⁺DCsにおけるCCL22の発現差異および、47-LDA-および47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンによるCD4⁺脾細胞におけるINF-γおよびTNF-αの誘発を示す。未熟DCsは、ビオチン化47-LDAポリペプチドあるいは47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質、続いてストレプトアビジン-PEで染色された。47-LDA⁺(A)および47-LDA-Fcγ2a⁺(B)-DCsは、BD FACSAria(登録商標)フローサイトメーターで分別され、1μg/mlのLPSとともに、24時間インキュベートされ、ラット抗マウスCCL22mAb、続いてヤギ抗ラット二次抗体を用いた細胞内染色によってCCL22発現が分析された。CCL22発現が陽性の細胞のMFIおよびパーセントを示す。ライトグレーのエリアは、アイソタイプ・コントロールAbを使用して評価されたバックグラウンド染色を表示する。データは、三回行ったうちの一つの代表的な実験のものである。 Cは、47-LDA-DCおよび 47-LDA-Fcγ2a-DCワクチン(それぞれ、黒色およびハッチングの棒グラフ)で免疫化されたマウスの脾細胞におけるINF-γおよびTNF-αの発現を示す。A/Jマウス(n＝5)は、IL-15およびIL-21ベクターの存在下でLPS-誘発成熟された後、47-LDAポリペプチドもしくは47-LDA-Fcγ2a 融合タンパク質で被覆されたDCsで三回免疫化された。LPS処理DCで免疫化されたマウスから単離された細胞は、コントロールとしての役割を果たした(白い棒グラフ)。最後の免疫化から三週間後、CD4⁺脾細胞中のIFN-γおよびTNF-αの発現は、47-LDAミモトープを発現しているDCsで一晩刺激した後、細胞内染色によって解析された。 Dは、NXS2神経芽細胞腫-特異的CTL応答を示す。47-LDA-DC(●)および47-LDA-Fcγ2a-DC(■)ワクチンで免疫化されたマウス由来のCD8⁺脾細胞は、ネガティブ・セレクションによって得られた。細胞は、47-LDA発現DCs(黒色の記号)もしくは、偽プラスミド(sham plasmid)-トランスフェクトDCs(白い記号)とともに、物質と方法の項に記載されているように、20:1の比率で培養された。NXS2細胞に対するCTL活性は、標準⁵¹Cr-リリース・アッセイで解析された。全ての測定は、三つのサンプルで行われ、SDは10％未満であった。結果は、4つの独立した実験の平均値±SDで表される。 図４は、47-LDA-DCおよび47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンで免疫化されたマウスにおける調節性Ｔ細胞(Treg cell)の誘発および機能の分析を示す。47-LDA-DCs(A)もしくは47-LDA-Fcγ2a-DCs(C)での最後の免疫化から三週間後、腋窩リンパ節が取り除かれ、抗-CD4-PE、抗-CD25-FITCおよび抗-FoxP3-AlexaFluor 647 mAbs、またはその関連するアイソタイプ・コントロールを用いた染色によって、Treg細胞発現が分析された。ヒストグラムは、ゲート集団(CD4⁺CD25⁺細胞)におけるFoxP3発現を示す。エフェクターＴ細胞(Teff cell)増殖に対するTreg細胞の効果を解析するために、47-LDA-DC(B)もしくは47-LDA-Fcγ2a-DC(D)ワクチンで免疫化されたマウス由来のCD8⁺細胞は、CFSEを負荷され、Treg細胞の存在下もしくは不存在化で(比1:1)、72時間、47-LDA-を発現している同系のDCsとともに培養された(比20:1)。細胞は、PE-結合-抗-CD8 mAbsで染色され、フローサイトメトリーで解析された。1ラウンドを超える細胞分裂を経験した細胞のパーセンテージが示される。データは、三回行ったうちの一つの代表的な実験のものである。 図５は、47-LDA-および47-LDA-Fcγ2a-DCワクチン並びにACTによる、NXS2原発性および転移性の腫瘍増殖の抑制を示す。 上部のパネルは、ACT並びに47-LDA-DCワクチン(A)および47-LDA-Fcγ2a-DC ワクチン(B)による、原発腫瘍増殖に対する保護作用を示す。A/Jマウス(n＝8〜10)は、2×10⁶のNXS2細胞を皮下注射され、15日後に、47-LDA-もしくは47-LDA-Fcγ2a-ワクチン化同系マウスから単離されたCD8⁺に富んだ脾細胞の静脈内養子移入で治療された。担がんマウスのリンパ球減少症は、材料および方法の項に記載されているように、CD8⁺Ｔ細胞移入の一日前に、TBI(5Gy;●)もしくは(9Gy;■)に加えてBM(10⁷細胞)の移植によって、誘発された。マウスは、IL-15およびIL-21 ベクターの存在下、DCワクチンを用いて二週間間隔で免疫化された。5Gy(○)もしくは9Gy(□)で照射され、加えてBM移植されたNXS2担がんマウスは、コントロールとしての役割を果たした。 下部のパネルは、養子性移入CD8⁺脾細胞および47-LDA-DC(C)および47-LDA-Fcγ2a-DC(D)ワクチンによる転移性疾患の制御を示す。播種性疾患の免疫療法のために、骨髄非破壊的な(5Gy;●)もしくは、骨髄破壊的な(9Gy;■)TBIを腫瘍切除時に受けたNXS2-担持A/Jマウスは、47-LDA-もしくは47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンとともに、免疫化されたマウス由来のCD8⁺脾細胞(2×10⁷細胞)のACTを受けた。5Gy(○)もしくは9Gy(□)で照射され、加えてBM移植されたNXS2-チャレンジマウスは、コントロールとしての役割を果たした。 Eは、NXS2-チャレンジマウスであって、DCワクチンとともに、未処置のA/Jマウス由来のACTを受けたマウスを示す。マウスは、IL-15およびIL-21ベクターの存在下、DCワクチンを用いて二週間間隔で免疫化された。コントロールマウスは、TBIおよびBM移植有り(○)または無し(□)で、原発腫瘍を切除された。生存時間は、マウスが広範な腫瘍増殖のために犠牲になった時点と定義された。カプラン・マイヤー 生存プロットが作成され、有意性が、ログランク・マンテル-コックス(Mantel-Cox)法を使用して判定された。 図６は、ACTおよびDCワクチン接種後の、担がんマウスおよび腫瘍の無いマウスにおける細胞応答の分析を示す。上部のパネルは、NXS2-担持(担がん)マウスの脾細胞における増殖応答(A)およびCTL活性(B)の欠如を示す。A．未処置脾細胞のACTおよび47-LDAポリペプチド-DCワクチン後、進行性に増大する腫瘍が発生したマウスから単離された脾細胞は、CFSEを負荷され、47-LDA-発現同系DCsとともに(比率 20:1)72時間培養された。細胞は、PE-結合 抗-CD4あるいは抗-CD8 mAbsで染色され、フローサイトメトリーで分析された。細胞分裂を１ラウンドより多く経験した細胞のパーセンテージを示す。データは、四回行ったうちの一つの代表的な実験のものである。 B．担がんマウス由来の刺激されたCD8⁺脾細胞又はコントロールCD8⁺脾細胞の、NXS2細胞に対するCTL活性が、標準⁵¹Cr-リリース・アッセイにおいて分析された。全ての測定は、三つのサンプルで行われ、結果は、三つの独立した実験の平均値±SDで表される。下部パネルは、未処置マウス由来のACTおよび47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンを受けた後の、腫瘍の無いマウスにおける、増殖応答(C)およびNXS2に対するCTL活性(D)の分析を示す。実験は、上部のパネルで記載した通り実施された。 図７は、rOVV-EGFPあるいはrOVV-47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質を用いた治療的な腫瘍ウイルス療法(腫瘍溶解性ウイルス療法)を基礎とする癌ワクチンを説明する。Aは、rOVV-47-LDA-Fcγ2aベクターによる腫瘍増殖の抑制を示す。A/Jマウス(n＝10)は、2×10⁶ NXS2細胞を皮下注射され、15日後、10⁸PFUのrOVV-47-LDA-Fcγ2a(▲)またはrOVV-EGFP(■)ベクターの静脈内注射で治療された。PBSで治療された担がんマウスは、コントロールとされた(○)。生存時間は、マウスが広範な腫瘍増殖のために犠牲になった時点と定義された。カプラン・マイヤー生存プロットが作成され、有意性が、ログランクMantel-Cox法を使用して判定された。Bは、腫瘍特異的な免疫記憶が、マウスを、NX2の再チャレンジ(再負荷：re-challenge)から保護したことを示す。rOVV-47-LDA-Fcγ2a(▲)またはrOVV-EGFP(■)ベクターで治療後の腫瘍の無いマウスは、NX2細胞で再チャレンジされた。NXS2腫瘍でチャレンジされた未治療マウスは、コントロールとして使用された(○)。動物は、腫瘍が触知可能になるまで毎日検査され、その後、一週間に一度から三度、皮下腫瘍を測定することによって腫瘍増殖がモニターされた。 図８は、本発明が、臨床的に意義のあるマウスモデルにおいて、FADUおよび4T1腫瘍の増殖を抑制するのに効果的であることを示すデータのグラフ表示である。図８にまとめられたデータを得るために、マウスは、FADUまたは4T1腫瘍細胞を皮下に(s.c.)移植された。CTCE-9908-Fc融合タンパク質(200マイクログラム/マウス)(トランスフェクト細胞の上清からプロテインGカラムで精製された)が、静脈内注射で毎日投与された。腫瘍の増殖は、週に一度から三度、マイクロキャリパーを用いて、皮下腫瘍を測定し、腫瘍体積(幅×長さ×幅／2＝mm³)を決定することによってモニターされた。 図９は、CXCR4-A-Fc融合タンパク質の特性評価と、そのCXCR4との相互作用を示す。 Aは、非還元条件(NRC)および還元条件(RC)下でウイルス感染細胞の上清から単離されたCXCR4-A-Fcのウエスタンブロットを示す。 Bは、CTCE-9908ペプチドによるSUPT-1細胞上のCXCR4に結合するCXCR4-A-Fcの阻害を示す。細胞は、ビオチン化CXCR4-A-Fc(300μg/ml)とインキュベートされ、ストレプトアビジン-PEとの結合を分析された。阻害試験のため、細胞は、融合タンパク質を用いた染色前に、CTCE-9908(100μg/ml)ペプチドでインキュベートされた。バックグラウンドの染色は、アイソタイプ・コントロールを使用して評価された。 Cは、融合タンパク質による遊走の抑制を示す。4T1細胞(5×10⁴)は、培地単独あるいはCXCR4-A-FcもしくはCTCE-9908ペプチド(100μ/ml)を含む培地において、8μmのトランスウェル・システム(transwell system)の上部チャンバーに蒔かれた。下部チャンバーは、SDF-1(1,000ng/ml)を含有する培地1mlで満たされた。トランスウェル・メンブランを通した10時間の遊走後、遊走を数量化するために、細胞は、固定され、染色され、6つの視角で数えられた。結果は、顕微鏡視野における遊走した細胞の数の平均±SDである。コントロール培養における遊走細胞の数は、実験値から差し引かれた。データは、三回の実験の代表的なものである。 Dは、CXCR4-A-FCによるSDF-1-誘導カルシウム動員の抑制を示す。細胞(1×10⁶)は、37℃の暗所で45分間、10μMのIndo-1AMを負荷された。3〜5分間の基底蛍光の測定後、CTCE-9908もしくは CXCR4-A-Fc(300μg/ml)が、Indo-1-負荷細胞に添加され、続いてSDF-1(50ng/ml)が添加された。蛍光の変化が、時間の関数として記録され、490nmの発光蛍光に対する410nmの発光蛍光(indo-1に結合されたカルシウム)の比を測定することによって決定された。410と490nmの発光、及び410：490比は、SDF-1および阻害剤の投与前と後の時間(0〜5分)にかけて集められた。データは、二回の実験の代表的なものである。***，P＜0.0001。 図１０は、単独でまたは組み合わせで投与されたOVV-CXCR4-A-FcまたはASA404による、4T1原発性および転移性の腫瘍増殖の抑制を示す。 A．BALB/c(n＝8〜12)は、7×10⁴の4T1細胞を、胸部の乳腺脂肪体中に接種された。100〜150mm³の腫瘍体積(V)を有する4T1-担持マウスは、OVV-EGFPまたはOVV-CXCR4A-Fc(10⁸PFU)またはASA404の最大耐用量(20mg/kg)を静脈内注射された。 B．単独でまたは組み合わせで投与されたOVV-CXCR4-A-FcまたはASA404による4T1原発性および転移性の腫瘍増殖の抑制。カプラン・マイヤー生存プロットが用意され、生存期間中央値が、マウスの腫瘍-チャレンジ群について決定された。生存アクロス群(survival across groups)における統計的有意差は、ログランクMantel-Cox法を用いて評価された。 C．転移性疾患の治療のために、4T1-担持マウスは、腫瘍ウイルス療法(V＝〜200mm³)を単独であるいはASA404との組み合わせで受け、腫瘍は8日後に切除された。コントロールのマウスは、治療なしで原発腫瘍を切除された。生存時間は、広範な腫瘍量のため、マウスが安楽死させられた時点として定義された。 D．腫瘍微小環境中のMDSCs(Gr1⁺,CD11b⁺,Ly6G⁺)のパーセンテージは、単個細胞浮遊液の免疫蛍光染色による処理の4日後に、フローサイトメトリーによって決定された。 E．腫瘍から調製された細胞可溶化物におけるSDF-1のレベルは、ELISAアッセイによって決定された(*，P＜0.05；***，P<0.0001)。データは、三つの独立した実験の算術的な平均±SDとして表される。

本発明は、抗体のFc領域と、i)抗原に存在するエピトープを模倣するミモトープ；あるいはii)がん細胞上に発現するレセプターのペプチド・アンタゴニスト、を含有する融合タンパク質が、前記抗原を発現する細胞に対する免疫応答を増強するため、および、前記ペプチド・アンタゴニストが結合するレセプターを通じたシグナル伝達を阻害するために使用できるという我々の発見を利用する。本発明は、そのような融合タンパク質を含有する組成物、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する組成物、および、疾患の予防及び／又は治療のためにそのような組成物を使用する方法を包含する。前記方法は、本発明の組成物を個体に投与し、前記抗原を発現する細胞または前記ペプチド・アンタゴニストが結合するレセプターを発現する細胞の増殖を抑制することを含む。

本明細書中で使用される「ミモトープ」は、エピトープの構造を模倣するペプチド配列を意味する。ミモトープに対して生じた免疫応答は、それが模倣するエピトープに向けられ、それゆえ前記エピトープを含む抗原をも認識するであろう。ある実施形態では、ミモトープ自体が抗原として機能することができると見なされる。

我々は、活性化Fc融合タンパク質と、ミモトープもしくはがん細胞上に発現されるレセプターのペプチド・アンタゴニストのいずれかを含む融合タンパク質を含有する治療ワクチンが、抗腫瘍応答(一部は、抗原特異的Ｔ細胞の刺激によって特徴づけられる)を生成することを実証する。

本発明のある証明において、我々は、活性化Fc融合タンパク質と関連して発現されたGD2ガングリオシドのCD166交差反応性ミモトープ(明細書中で「47-LDA」と称する)を用いた治療ワクチンが、担がん同系マウスにおいて腫瘍特異的Ｔ細胞を産生したことを示す。前記ミモトープは、樹状細胞(DCs)上の活性化Fcγレセプターに抗原性カセットを送達するために、普遍的なＴヘルパー・エピトープおよびマウスのIgG2a Fcフラグメントと協同して融合タンパク質として発現された(47-LDA-Fcγ2a)。

47-LDAミモトープの配列は、GPGPGEDPSHSLGLDAALFMである(配列番号１)。普遍的な(universal)Ｔヘルパー・エピトープと47-LDAミモトープを含む代表的なアミノ酸配列は、配列番号２として提示され、以下の通りである。
KCKRQCGPGPGAKFVAAWTLKAAAGPGPGCKRKIHIGPGQAFYTGPGPGEDPSHSLGLDAALFM
配列番号２の1〜6位アミノ酸は、スペーサーを構成する。7〜11および25〜29位のアミノ酸は、リンカーを構成する。どのＴヘルパー・エピトープも本発明との関連で使用できると考えられるが、好適なＴヘルパー・エピトープの非限定的な実施形態は、非天然panDRエピトープ(PADRE)[AKFVAAWTLKAAA：配列番号３]およびHIVgp120糖タンパク質のV3ループ[CKRKIHIGPGQAFYT：配列番号４]と称される普遍的なThペプチドを含む。これらの代表的なＴヘルパー・エピトープのそれぞれは、配列番号Xにも示される。

我々は、また、47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質を用いた担がんマウスの免疫化が、47-LDAポリペプチド-樹状細胞(DC)ワクチンよりも高いレベルの抗腫瘍性免疫応答と保護を誘導したことを示した。治療的47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンの抗腫瘍有効性は、47-LDA-Fcγ2a 融合タンパク質を発現している組換え腫瘍退縮性ワクシニアウイルス(rOVV)を使用するウイルス療法関連癌ワクチンによって達成される有効性に匹敵した。後者の治療は、しかしながら、全身照射(TBI)または養子細胞移入(ACT)を要求せず、確立された耐性の状況において抗腫瘍性免疫応答の誘発をもたらした。

本発明の別の実施形態において、我々は、CXCR4ケモカインレセプター・アンタゴニストである抗がん剤(CTCE-9908)を採用する。CXCR4のこのペプチド・アンタゴニストは、アミノ酸配列：KGVSLSYR-K-RYSLSVGK(配列番号５)を含む。したがって、一実施形態において、CXCR4のペプチド・アンタゴニストは、配列 KGVSLSYR(配列番号６)を含む。

CTCE-9908は、転移細胞による器官組織の浸潤に重要な意味をもつ、CXCR4レセプターとCXCL12の相互作用をブロックし、それにより、腫瘍転移を減じる。CXCR4レセプターは多くの腫瘍細胞タイプで発現される。CTCE-9908ペプチドは、カナダ、バンクーバーのChemokine Therapeutics社によって開発され、後期のがん患者における臨床治験のフェースI/IIにおいて使用されてきた。本発明の方法を行うことによって、我々は、Fcフラグメントが生来持っているジスルフィド結合を利用し、CTCE-9908ペプチドの二量体構造を保存する。我々は、DNAベクターにおいて、活性化マウスおよびヒトのFcγフラグメント(それぞれ、IgG2aおよびIgG1)と関連してCTCE-9908ペプチドを発現させ、CTCE-融合タンパク質のマウスバージョンを用いて、マウスの同系(T41乳がん)および異種移植(FADUヒト頭頸部がん)モデルにおいてその構築物(construct)の抗腫瘍有効性を実証する。我々は、これが、抗体依存性細胞傷害(ADCC)殺腫瘍メカニズムを動員することによって、ペプチドの治療有効性を増強すると信じる。したがって、本発明は、抗原に対する免疫応答を増強するための様々な組成物および方法を提供し、この際、前記抗原が、免疫グロブリン(Ig)のFc領域(活性化Fcγレセプターと優先的に結合する)とのコンビネーションで融合構築物として提示される。したがって、一実施形態において、本発明は、融合構築物を含む組成物を提供し、ここで、前記融合構築物は、マウスIgG2aもしくはヒトIgG1のFc領域、またはそのようなFc領域のフラグメントを含む。様々な実施形態において、前記Fc領域は、IgA、IgGあるいはIgE抗体に由来するFc領域またはそのフラグメントである(他の抗体タイプ由来のFc領域、または合成/人工Fc領域も使用できるが)。前記Fc領域は、ヒト等の哺乳類によって産生されたFc領域と同一のアミノ酸配列を含んでもよく、あるいはそれからなってもよい。様々な実施形態において、前記Fc領域は、マウス及び／又はヒトによって産生されるFc領域との80％〜100%の間(この間の全ての整数を含む)のアミノ酸配列類似性を有してもよい。前記Fc領域は、無傷のFc領域(全Fc領域を意味する)であってもよく、当該Fc領域のフラグメントであってもよい。前記Fc領域のフラグメントは、好ましくは、Fcγレセプターに特異的に結合するアミノ酸配列を含む。当業者は、抗体の「Fc領域」が、抗体のクラスに応じて２ないし３の定常ドメイン(CD)を与える２つの重鎖を含む抗体の「Fragment, crystallizable」領域を意味することを認識するであろう。マウスおよびヒトの免疫グロブリンのFc領域のアミノ酸配列と同様、Fc領域をコードするヌクレオチド配列は、当該分野において周知である。一実施形態において、本発明において前記Ig領域として使用するための、好適なヒトIgガンマ-1C領域（Homo sapiens)は、以下の配列を有する；
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK（配列番号７）

別の実施形態において、好適なヒトIgガンマ-3鎖C領域は、以下の配列を有する。ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRVEL KTPLGDTTHT CPRCPEPKSC DTPPPCPRCP EPKSCDTPPP CPRCPEPKSC DTPPPCPRCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE ALHNRFTQKS LSLSPGK（配列番号８）

個体の抗体アイソタイプは、Fcγレセプター(マウスのIgG2aおよびIgG2bアイソタイプまたはヒトIgG1およびIgG3アイソタイプへのより高い親和性を有する活性化Fcγレセプターを含む)への異なる親和性を有するため、提示された抗原複合体による活性化-対-抑制型レセプター結合の比率の違いから、免疫応答を誘導するためのDCsの能力が予測できる可能性が有る。この経路を利用することは、抗体治療あるいは癌ワクチンによる獲得免疫と免疫記憶の補充を可能にする可能性が有る。

一実施形態では、融合タンパク質のFc部分は抗体重鎖(複数であってもよい)のみを含む。

当業者は、マウス動物モデルを使用した本発明の実演では、前記融合タンパク質のFc部が好ましくはIgG2aもしくはIgG2b FcマウスIg部であるが、人間における疾患の治療及び／又は予防には、前記Fc部は、好ましくはIgG1もしくはIgG3 Fc部であることを認識するであろう。

ある実施形態において、本明細書中で提供される融合タンパク質のFc部は、抗原認識部を含まない(すなわち、融合タンパク質の抗体部が、抗体可変領域を含まない)。このように融合タンパク質は、抗原結合部を含む抗体と異なり、架橋ないしは別の方法で連結されたミモトープ、抗原、あるいはペプチド・レセプターリガンドを含んでいてもよい。

Fc-融合タンパク質をコードするDNA構築物は、当業者によく知られている従来技術のいずれかを使用して作ることができる。例えば、Fc-融合をコードする構築物は、市販の試薬を使用して作ることができる。例えば、INVIVOGEN社は、免疫グロブリン(Ig)のFc領域に所定のタンパク質をコードする配列を融合することによって、Fc-融合タンパク質の作成を促進するために開発されたプラスミドのpFUSE-Fcファミリーを提供する。この構築物において、Fc領域は、IgG重鎖のCH2およびCH3ドメインおよびヒンジ領域を含む。ヒンジは、Fc-融合タンパク質の２つの部分の間の可動性スペーサーとして働き、融合タンパク質の各部分が独立して機能することを可能にする。一般に、Fcγレセプターを活性化するいずれのFc領域(したがって、そのようなFc領域をコードするいずれのポリヌクレオチド)も、本発明を実行するために使用できる。

融合タンパク質をコードするDNA構築物は、単離及び／又は精製のための、あるいは治療目的のための融合タンパク質を産生するために、好適なタンパク質発現システムを使用して発現させられることができる。様々なタグまたは他の部分(moieties)は、融合タンパク質が容易に精製できるように(例えば、様々なアフィニティークロマトグラフィー法を使用して)、融合タンパク質に付加されてもよい。

治療目的のために、融合タンパク質を含む、及び／又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬品等の組成物を製造できる。治療目的で使用するための組成物は、Fc-融合タンパク質及び／又はそれらをコードするポリヌクレオチドと、任意の好適な製薬的に許容されるキャリア、賦形剤及び／又は安定剤と混合することによって調製されてもよい。前記薬剤と混合するのに好適な組成のいくつかの例は、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2005) 21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins」に記載されている。前記組成物はさらに、任意の好適なアジュバントを含んでもよい。

本発明の方法で使用される治療薬がポリヌクレオチドの場合、それはネイキッド・ポリヌクレオチド(naked polynucleotide)として、送達試薬との組み合わせで、あるいは前記ポリヌクレオチド剤を含む及び／又は発現する組換プラスミドもしくはウイルスベクターとして、個体に投与されることができる。投与に好適な送達試薬は、Mirus Transit TKOの親油性試薬であるリポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、または、ポリカチオン(例えば、ポリリシン)、またはリポソームを含む。一実施形態において、Fc-Ag/アンタゴニスト融合は、組換え腫瘍退縮性 組換えワクシニアウイルス (rOVV)によってコードされている。この関連で、腫瘍退縮ウイルスは、選択的にがん細胞内で増殖し、がん細胞を破壊する。作用のこの一次メカニズムは、細胞溶解部位におけるウイルスによる免疫原性/治療的タンパク質の発現を含む二次メカニズムによって補完される。腫瘍退縮ウイルスの活性を評価するための臨床治験の大多数は、局所性(例えば、腫瘍内)あるいは領域性(例えば、腔内もしくは動脈内)のルートを使用したが、浸潤性および転移性のがんの効果的な治療は、好ましくはウイルスの全身投与を使用して実行されると考えられる(例えば、Hu,J.C.,et al.Clin Cancer Res 2006.12:6737-6747参照)。

ポックスウイルスは、細胞外のエンベロープ・ワクシニアウイルスが、いくつかのホスト補体制御タンパク質および、補体による中和に対してそれを耐性にするわずかな露出ウイルスタンパク質を含むホスト細胞由来のエンベロープにそれ自身を包むため、血液を通じて全身性に移動する能力によって特徴づけられる。改変された腫瘍退縮性ワクシニアウイルス(OVV)は、前臨床モデルおよび初期の臨床治験においてがんの治療において有望な結果を実証し(Kirn, D. H. and Thorne, S. H., Nat Rev Cancer 2009. 9: 64-71, Mastrangelo, M. J., et al. Cancer Gene Ther 1999. 6: 409-422; Park, B. H., et al. Lancet Oncol 2008. 9: 533-542; Thorne, S. H., et al. Curr Gene Ther 2005. 5: 429-443; Zeh, H. J. and Bartlett, D. L., Cancer Gene Ther 2002. 9: 1001-1012; Zhu, J., et al. Blood 2007. 109: 619-625)、及び全身性のウイルス伝播が、広範な転移を有する患者において実証された(Park, B. H., et al. Lancet Oncol 2008. 9: 533-542, 47-49; Mastrangelo, M. J., et al J Clin Invest 2000. 105: 1031-1034; Mastrangelo, M. J., et al. Adv Exp Med Biol 2000. 465: 391-400; DiPaola, R. S., et al. J Transl Med 2006. 4: 1)。しかしながら、たいていの患者は効果的に治療されず、したがって、ヒトにおけるOVVの有効性は本発明によって提供される組成物および方法との組み合わせから恩恵を受けるはずである。

一実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、Fc-Ag/アンタゴニスト融合タンパク質を発現するポリヌクレオチドを含む抗原提示細胞(樹状細胞等)の投与によって、個体に投与される。「Fc-Ag/アンタゴニスト」は、前記Fc領域が、抗原、そのミモトープ、またはがん細胞特異的ペプチドレセプターアンタゴニストのいずれかとともに、キメラタンパク質内、またはそのようなキメラタンパク質(複数であってもよい)をコードするヌクレオチド配列内に存在することを意味する。一実施形態において、前記Fc-Ag/アンタゴニストは、抗原特異的Ｔ細胞の誘発のために抗原提示細胞上の活性化Fcγレセプターに抗原性カセットを送達するために、普遍的なＴヘルパー・エピトープおよびFcフラグメントと協同した融合タンパク質として発現されることができる。

別の実施形態において、本発明は、前記個体に、Fc-Ag 融合タンパク質-樹状細胞によって増殖された(expanded)Ｔ細胞を養子導入することを含む、抗原への免疫応答を増強するための方法を提供する。一実施形態において、養子導入Ｔ細胞は、CD8⁺Ｔ細胞である。「CD8⁺」Ｔ細胞は、CD8(表面抗原分類8：cluster of differentiation 8)を発現するＴ細胞を意味する。CD8は、Ｔ細胞レセプター(TCR)のためのコレセプター(co-receptor)として機能する、特徴がはっきりした膜貫通糖タンパク質である。CD8は、ヒトにおいて、抗原提示細胞の表面上のクラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC-I)タンパク質に結合する。一実施形態において、本発明は、ワクチン-誘導CD8⁺Ｔ細胞およびFc-Ag融合タンパク質-発現樹状細胞の単離集団を、担がんホストへ養子移入し、生体内で前記養子移入Ｔ細胞の増殖および腫瘍増殖の抑制を促進することを提供し、また、前記Fc-Ag融合をコードするポリヌクレオチドを提供する。

一実施形態において、本発明は、本発明のFc-Ag融合物内の抗原である(あるいはそれを模倣した)抗原に対する増強されたＴ細胞応答を誘発する。増強されたＴ細胞応答には、前記抗原を有する細胞に対する細胞傷害活性を示すＴ細胞、前記抗原への抗原-リコール応答及び／又は増強された栄養を示すＴ細胞の増加、前記抗原に特異的なエフェクターＴ細胞の量及び／又は活性の増加、または細胞性免疫応答の前述のタイプの組み合わせが含まれ得るが、必ずしもこれらに限定されない。本発明の方法によって誘発されたＴ細胞応答は、液性及び／又は自然免疫応答における有益な変更を伴い得る。一実施形態において、増強された免疫応答は、個体における前記抗原を発現する腫瘍細胞の増殖の抑制によって、及び／又は個体の生存時間の延長によって証明されることができる。

ペプチド(ミモトープ)によって模倣されることができるエピトープ(複数であっても良い)を含む抗原はいずれも、本発明での使用に好適であると考えられる。前記抗原は、MHCクラスI分子と協同した抗原提示細胞による提示に好適なエピトープを含むことが好ましい。したがって、前記抗原は、それが融合タンパク質中に存在する場合、タンパク質またはペプチドであってもよく、またはそれらを含んでもよい。前記抗原は、組換え抗原であってもよく、それは化学的に合成されてもよく、それは細胞培養液から単離されてもよく、または、それは個体から得られた生物サンプルから単離されてもよい。前記抗原は、感染性の生物における細胞上に存在してもよく、または前記抗原は病気のまたは感染した細胞、組織もしくは器官によって発現されてもよい。

一実施形態では、前記抗原は腫瘍抗原である。腫瘍抗原は、市販されている抗原であってもよく、あるいは組換え法による等従来技術によって、あるいは本発明の組成物および方法において使用するための新規な抗原を同定するために腫瘍細胞可溶化物の調製によって、得ることができる。

様々な実施形態において、がん細胞抗原は、がん細胞によって発現されてもよく、その具体例には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、腹膜偽粘液腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、内皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、頭頸部癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、胸腺腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および重鎖病。

一実施形態において、前記抗原は、GD2ガングリオシドのCD166交差反応性ミモトープである。別の実施形態では、前記抗原はCTCE-9908である。

前記抗原は、感染病原体もしくは感染性生物によって発現される抗原であってもよく、その非限定的な例には、ウイルス、バクテリア、真菌、原生動物、または他の寄生虫もしくはその他の感染病原体が含まれる。

当業者は、前記抗原の分子構造、治療する個体の大きさや年齢、疾患を有する疑いのある、または有すると診断された個体の疾患の種類と段階のようなファクターを考慮して、本発明の方法を実施するための投与計画をどのように策定すればよいか認識するであろう。本発明は、予防的もしくは治療的な増強された免疫応答を誘発するために使用されてもよい。前記組成物が投与される個体は、治療を必要としている個体であってもよく、及び／又は、前記抗原の発現と関連する疾病もしくは他の障害を有すると診断された、有することが疑われる、あるいは発病するリスクのある個体であってもよい。

本発明の組成物中に含まれる、及び／又は本発明の方法において使用される、Fc-Ag/アンタゴニスト融合タンパク質の量、あるいはFc-Ag/アンタゴニストタンパク質をコードする発現ベクターの量、あるいは、Fc-Ag/アンタゴニスト融合タンパク質あるいはFc-Ag/アンタゴニスト融合物をコードする発現ベクターもしくは他の発現カセットを含む抗原提示細胞等の細胞の量は、当業者によって決定されることができ、本開示の利益を供与する。したがって、一実施形態では、本発明の組成物の有効量が投与される。有効量は、前記抗原を発現する個体中の細胞の増殖を抑制する組成物の量であってもよく、あるいは、個体の生存時間を延ばす量、もしくは個体において抗原の発現に付随する疾患症状を軽減する量であってもよい。

本発明の方法は、前記抗原と関連する疾患もしくは障害の治療を目的とする従来の療法とともに行われてもよい。例えば、前記方法が個体において腫瘍抗原に対する免疫応答を増強するために使用される場合、治療様式には、本発明の方法の前に、同時に、もしくは後に行われることができる化学療法、外科的処置および放射線療法が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書中で提示された実施例によって証明されるように、担がんマウスにおけるTreg細胞と相互作用する癌ワクチンの能力を制限する手段を開発するために、我々はまず、DCsに提示される47-LDAペプチド模倣物による機能的な腫瘍特異的細胞応答の発生を、普遍的Thエピトープと協同する線状ポリペプチドとして、あるいは、マウスIgG2a Fcフラグメントを有する融合タンパク質として比較した。我々は、47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質-DCワクチンが、腫瘍特異的CD8⁺Ｔ細胞を増大しただけでなく、骨髄破壊的TBIおよびBM移植を受けた担がんマウスへの未処置脾細胞のACT後の一次免疫応答も誘発したことを示した。47-LDA-Fcγ2aワクチン-誘発CD8⁺Ｔ細胞は、原発腫瘍の増殖を抑制し、および、担がんマウスを微小残存病変の発達から保護した。他方、47-LDAポリペプチド-DCワクチンによって誘発された保護は、腫瘍増殖の遅延をもたらし、骨髄破壊的な状況でのACT後のみ有意であった。これらの研究の結果は、FcγRsが担がんマウスにおける治療的なワクチン接種の間、Ｔ細胞性免疫応答を調節することができるという所見と一致する。

47-LDA⁺DCsによって産生されるものと比較してより高レベルの腫瘍特異的免疫応答を誘発する47-LDA-Fcγ2a⁺DCsの増加した能力に関与するメカニズムは、依然として不明である。IL-12を発現する抗原提示細胞が、Treg細胞応答よりむしろタイプ1を刺激する能力を増強したので、LPS-誘発成熟後の47-LDA-Fcγ2a⁺DC集団内のIL-12発現細胞の増加した数(47-LDA⁺対応物と比べて)が、この効果に寄与した可能性がある。この観察は、さらに、47-LDA-Fcγ2a⁺DCsにおけるCCL22ケモカインの発現の減少、および、47-LDA-DCワクチンを受けた動物と比較して47-LDA-Fcγ2a⁺DC-免疫化マウス中のTreg細胞のより少ない比率によって裏付けられる。我々の結果は、炎症性の環境の特徴が、TeffとTreg細胞活性化の間のバランスに影響を与えることができる(成熟DCsにこれらのＴ細胞タイプのそれぞれと相互作用する安定な傾向を採用することを指示することによって)という以前の発見と一致する。しかしながら、癌ワクチンのデザインにおいてDC機能の変化が示唆されてきたが、腫瘍関連抗原のミモトープを用いた治療的ワクチン接種の間、腫瘍増殖と関連する免疫抑制を妨げるDC応答の調整が、広範に評価されてこなかったということは注目に値する。したがって、これらの所見は、がんの免疫療法のためのペプチド・ミモトープの新しい適用に脚光を当てる。

活性化および抑制型低親和性FcγRsがエフェクター免疫応答の調節に重要な意味を持つことは十分に確立されている。獲得免疫の誘発におけるそれらの役割は、免疫複合体の形でDCsに抗原を投与する間、活性化/抑制型レセプターの機能における変化が、生体内でのDCsの賦活化に影響を与えることができ、且つ、抗腫瘍性Ｔ細胞応答を増強することができることを示した。この概念は、抑制型FcγRIIbレセプターの選択的遮断が、ヒトDC成熟および抗体被覆腫瘍細胞に対する免疫を可能にし、およびFcγRIIb-欠損マウス由来のDCsが、抗原特異的Ｔ細胞を刺激する能力の増加の主要因となりうる共刺激分子のより高い発現を示すという観察によって裏付けられる。しかしながら、巨大なタンパク質キャリアの使用は、ワクチン有効性及び／又は実用的な実行可能性を危険にさらし得る、抗原結合の再現性の観点において困難をもたらす。それゆえ、抗原性のおよびヘルパーエピトープ、並びに、活性化FcγRsへの増強された結合親和性を有するIgG抗体のFc部を包含する合成構築物は、製造および特性評価に関して免疫複合体を超える明白な利点を提供するはずである。これはまた、担がんマウスにおいて、DCsに、特異的CD8⁺CTL応答を効率的に刺激し、拡大する権限を与える47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質の能力が、腫瘍免疫療法の有効性の改善をもたらす可能性があることも示唆する。

DCワクチンあるいは手術後の抗腫瘍性免疫応答の研究は、Treg細胞が、免疫原性が不十分な腫瘍を有するホストにおけるＴ細胞記憶の発展への基本的な障害であることを示した。手術は現在のところ固形腫瘍の主要な治療法であるが、メモリーＴ細胞応答が、手術後の腫瘍の再発および転移の耐久性ある予防のために必要かもしれない。がんを有するたいていの患者で見られるように、我々の研究結果は、手術あるいはDCワクチン単独が、免疫原性の低い腫瘍関連抗原に対する保護を誘発しないことを示した。しかしながら、我々のモデルでは、手術と、リンパ球の枯渇(lymphodepletion)、ACTおよびDCワクチン接種の併用が、長続きする腫瘍保護の発展を可能にする。我々は、腫瘍それ自体が抗原のソースとして働いた可能性を除外できないが、おそらくTregsの不存在下で手術後免疫の誘発の間に多数の腫瘍抗原に対するＴ細胞応答を刺激しても、47-LDAミモトープDCワクチン接種の不存在化で生成した抗腫瘍性免疫は、担がんマウスの生存期間を延ばしただけである。対照的に、骨髄破壊された(myeloablated)担がんホストにおける活性化FcγRsを標的とする47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質を用いた能動免疫は、原発腫瘍の有意な抑制および自然転移性疾患の発症からの保護をもたらした。

生体外で生成したDCsの使用が、腫瘍誘発性のDC機能障害を回避する唯一の機会を提供し、DC特性の正確な操作を可能にするが、患者細胞の生体外操作のための特殊化した細胞培養施設の必要性は、担がんホストの身体内の内在性DCをターゲットにする能力がある無細胞ワクチンを開発する試みを促した。腫瘍抗原あるいはそれらのミモトープを選択的にDCsに送達するために改変されたそのようなワクチンは、なんら生体外処理なしで、インビボのDC極性化を誘発する戦略と併用されることができる。DCsによる分泌および交差提示のために腫瘍病巣に直接導入遺伝子を送達する(データは示さない)、rOVV-47-LDA-Fcγ2aベクターを用いたウイルス療法アプローチを使用する我々の研究結果は、保護的なTeffの誘発、および、外因性サイトカイン療法、ACT、TBIもしくは生体外操作の不存在化におけるメモリーＴ細胞の誘発を実証した。TeffsとTregsの間、およびウイルス療法により誘発された抗腫瘍性免疫応答の有効性と長寿命の間のバランスによる腫瘍微小環境内に、ウイルス性に送達された47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質の交差提示の効果をより明確にするために、更なる研究が必要とされる。この関連で、エビデンスのいくつかの系統は、VVがTLR2/MyD88-依存的経路を通じて自然免疫応答を誘発し、炎症性サイトカインの産生をもたらし、そしてTLR-非依存的経路が、インビトロおよびインビボでINF-βの賦活化を導くことを示す。自然免疫のTLRsの持続的な刺激が、インビボで確立されたTreg-媒介耐性を破壊するのに要求され、そしてVVがTLRシグナルを提供できるため、ワクチン媒体としてのVVのこの独特な効能は、宿主防御の賦活化を導くことができ、腫瘍チャレンジからマウスを保護することができる。このように、CD4⁺CD25⁺Tregsの存在下でのウイルスベースのワクチンによるCD8⁺Ｔ細胞耐性の破壊の可能性は、rOVV発現47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質あるいは他の腫瘍関連の抗原が、インビボでCD4⁺CD25⁺Ｔ細胞性CD8耐性を克服するDCワクチンの魅力的な代替案を証明するかもしれないことを示唆する。要約すると、この研究は、免疫エフェクター細胞を活性化するために、および抗炎症性のTreg細胞を誘引する能力を制限するために、DCsによる腫瘍/自己-抗原の取込みおよびプロセシングを探索する重要性を強調する。我々の知見は、免疫細胞の炎症性vs制御性タイプの選択的賦活化を目的とするがん免疫療法の新しいパラダイムに光を当てる。

以下の実施例は、本発明を具体的に説明することを意図し、限定を意図しない。

本実施例は、本明細書で提示されるデータを得るために使用された材料および方法の説明を提供する。

動物および株化細胞
６〜８週齢のメスのA/Jマウスを、Jackson Laboratory(メイン州、バーハーバー)から入手した。実験手順は、ロズウェル・パークがん協会の施設内実験動物委員会によって承認されたプロトコルに従って行われた。マウスのNXS2神経芽細胞腫株化細胞(カリフォルニア州、ラ・ホーヤ、スクリプス研究所のDr.R.A.Reisfeldによって提供された)は、GD2-ネガティブC1300マウスの神経芽細胞腫(A/Jバックグラウンド)とGD2-ポジティブマウスの後根神経節腫細胞とのハイブリッドである。前記ハイブリッド株化細胞は、そのH-2K^k-ポジティブ/H-2K^bネガティブ表現型によってA/Jマウスと同系のMHCクラスIであることが示された(Lode, H. N., R. Xiang, T. Dreier, N. M. Varki, S. D. Gillies, and R. A. Reisfeld. 1998. Natural killer cell-mediated eradication of neuroblastoma metastases to bone marrow by targeted interleukin-2 therapy. Blood 91: 1706-1715.)。GD2-特異的mAbを分泌する14G2aハイブリドーマ株化細胞(Mujoo, K., T. J. Kipps, H. M. Yang, D. A. Cheresh, U. Wargalla, D. J. Sander, and R. A. Reisfeld. 1989. Functional properties and effect on growth suppression of human neuroblastoma tumors by isotype switch variants of monoclonal antiganglioside GD2 antibody 14.18. Cancer Res 49: 2857-2861)は、Dr.R.A.Reisfeld(スクリプス研究所)によって提供された。

47-LDA-Fcγ2a 融合タンパク質の産生
組織プラスミノーゲン活性化因子分泌性の(tPA)シグナル配列を有する47-LDA発現ベクターの作成 ２つの普遍的なThペプチドPADRE[AKFVAAWTLKAAA：配列番号３](Alexander, J., M. F. del Guercio, A. Maewal, L. Qiao, J. Fikes, R. W. Chesnut, J. Paulson, D. R. Bundle, S. DeFrees, and A. Sette. 2000. Linear PADRE T helper epitope and carbohydrate B cell epitope conjugates induce specific high titer IgG antibody responses. J Immunol 164: 1625-1633)、および、HIV gp120 糖タンパク質のV3ループ[CKRKIHIGPGQAFYT：配列番号４](Ahluwalia, A., K. Gokulan, I. Nath, and D. N. Rao. 1997. Modification of delivery system enhances MHC nonrestricted immunogenicity of V3 loop region of HIV-1 gp120. Microbiol Immunol 41: 779-784)が、47-LDA模倣ペプチドとともに他で報告されている(Bolesta, E., A. Kowalczyk, A. Wierzbicki, P. Rotkiewicz, B. Bambach, C. Y. Tsao, I. Horwacik, A. Kolinski, H. Rokita, M. Brecher, X. Wang, S. Ferrone, and D. Kozbor. 2005. DNA vaccine expressing the mimotope of GD2 ganglioside induces protective GD2 cross-reactive antibody responses. Cancer Res 65: 3410-3418.)。マウスの47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質は、EcoRIおよびBglII制限酵素切断部位を使用して、pFUSE-mIgG2Aa-Fc1ベクター(カリフォルニア州、サンディエゴ、InvivoGen社)のhEF1-HTLVプロモーターとマウスIgG2aFc領域の間に、47-LDAポリペプチドコード配列を挿入することによって作成された。293Ｔ細胞の安定な形質移入は、47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質コンストラクト、またはリポフェクタミン試薬を使用する偽のベクター(カリフォルニア州、カールズバッド、Invitrogen社)を用いて行われ、続いてゼオシン(zeocin)含有培地で選択を行った。47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質は、トランスフェクト細胞の培養上清から、プロテインGカラム(ニュージャージー州、ピスカタウェイ、GE Healthcare, Bio-Sciences社)で精製された。融合タンパク質は、製造者のプロトコルに従い、SDS-15%PAGEと14G2a mAbを用いた免疫ブロット法によって、続いてECL＋ウエスタンブロット検出システム(Amersham Pharmacia Biotech社)によって分析された。

免疫化
DCsは、前述の通り、BM前駆物質からインビトロで産生した(Brinker, K. G., H. Garner, and J. R. Wright. 2003. Surfactant protein A modulates the differentiation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 284: L232-241)。簡単に説明すると、BM細胞は、６〜８週齢のメスのA/Jマウス(n＝5)の脛骨および大腿骨から収集し、その後、10ng/mlのGM-CSFを追加した完全培地中で37℃で６日間培養した。前記培地は２〜３日ごとに補充された。７日目に、ほとんどの非付着性細胞は、DC形態を獲得し、フローサイトメトリー分析によって特定されるように、CD11cが高く、CD80、CD86、CD40およびMHCクラスIIが低かった。DCsは５時間、10μ/mlの47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質または47-LDAポリペプチド(マサチューセッツ州、ガードナー、New England Peptide社)でパルスされ、成熟を誘発するために１時間、LPS(1.0μg/ml)とともにインキュベートされ、洗浄され、マウスに静脈内注射(2×10⁶)された(図１Ａ)。20μgのDNAプラスミド-コード化IL-15およびIL-21サイトカインは、ワクチン接種時および５日後に、それぞれ筋肉内注射された。

フローサイトメトリー
未熟DCsは、ビオチン標識47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質または47-LDAポリペプチドとともに、続いてストレプトアビジン-結合PEとともにインキュベートされた。いくつかの実験で、DCsは以下のmAbsを用いて染色された：抗-CD11c-FITC、抗-CD80-PE、抗-CD86-PE、抗-CD40-PEまたは抗-MHCクラスII-PE(カリフォルニア州、サンノゼ、BD Bioscience社)。脾細胞は、抗-CD4-PE、抗-CD8-PE、抗-CD25-FITC(BD Bioscience社)あるいは関連するアイソタイプ・コントロールを用いて標識された。特異的な抗体染色の前に、細胞はFcブロッカー(抗-CD16/CD32mAb)とともに10分間インキュベートされた。前記細胞は、0.01%のアジ化ナトリウムと1%のFCSを含むHBSS中で二度洗浄され、1%のパラホルムアルデヒドで固定され、分析前は暗所で4℃にて貯蔵された。バックグラウンド染色は、適切な蛍光色素-結合もしくは非結合マウスIgG1、IgG2aまたはIgG2b(BD Bioscience社)を含むアイソタイプ・コントロールを用いて評価された。腋窩、上腕リンパ節および脾臓内のTreg細胞の数は、製造者のプロトコルに従って、抗-FoxP3-AlexaFluor 647 mAb(カリフォルニア州、サンディエゴ、eBioscience社)を用いたCD4⁺CD25⁺リンパ球の細胞内染色によって決定された。INF-γあるいはTNF-αを分泌するCD4⁺およびCD8⁺脾細胞の数は、抗-IFN-γ-PEあるいは抗-TNF-α-PE mAb(BD Bioscience社)と協同した抗-CD4-FITCおよび抗-CD8-FITC mAbsを用いて決定された。LPS-刺激DCsにおけるIL-12p70の細胞内発現は、IL-12p35サブユニット内のエピトープを検出し、IL-12p40と交差反応しないラット抗マウスIL-12p70 mAb(R&D Systems社)を用いた染色によって測定した。LPS-刺激DCsにおけるCCL22の細胞内発現は、ラット抗マウスCCL22 mAb(R&D Systems社)を用いた染色によって決定した。47-LDA-Fcγ2a⁺、47-LDAポリトープ⁺あるいはCD86⁺DCsの選別は、BD FACSAria(登録商標)フローサイトメーター(ニュージャージー州、フランクリン・レイクス、BD社)を用いて実施された。全てのフローサイトメトリー評価は、FACScanもしくはFACSCaliburフローサイトメーターを用いて実施された。前方および側方散乱パラメーターにゲーティング(gating)後、少なくとも10,000のゲート化イベント(gated events)がルーチン的に獲得され、CellQuestソフトウェア(BD Bioscience社)を用いて分析された。

Ｔ細胞の養子移入とDCワクチン
A/Jマウス(１グループあたりn＝8〜10)は、図１Ａに描写されるように、2×10⁶のNXS2神経芽細胞腫細胞を皮下注射され、15日後、47-LDA-Fcγ2a-もしくは47-LDAポリトープ-DC-免疫化マウスから単離したCD8⁺強化脾細胞を用いた静脈内注射で治療された。CD8⁺脾細胞は、製造者の説明書に従って、抗マウスCD4(L3T4)および抗マウスCD45R(B220)mAbsと結合した常磁性ミクロビーズ(Miltenyi Biotec社のMACS)を使用してネガティブに選択された。単離されたCD8⁺脾細胞(2×10⁷)は、LPS-成熟47-LDAポリペプチド-もしくは47-LDA-Fc融合タンパク質-被覆DCsとともにインキュベートされた。Ｔ細胞およびDCsの混合物(比率20:1)は、下記の文献に記載されるように、rmIL-2(1μg/dose)の存在下、リンパ球枯渇NXS2担がんマウスに静脈内注射された(Zeng, R., R. Spolski, S. E. Finkelstein, S. Oh, P. E. Kovanen, C. S. Hinrichs, C. A. Pise-Masison, M. F. Radonovich, J. N. Brady, N. P. Restifo, J. A. Berzofsky, and W. J. Leonard. 2005. Synergy of IL-21 and IL-15 in regulating CD8+ T cell expansion and function. J Exp Med 201: 139-148)。担がんマウスにおけるリンパ球減少症は、ACTおよびワクチン接種の一日前に、5Gyの骨髄非破壊的なTBIもしくは9Gyの骨髄破壊的なTBIおよびBM移入(10⁷細胞)によって誘発された(図１Ｂ)。確立された皮下NXS2腫瘍を有するコントロールマウスは、5 Gyもしくは9Gyで照射され、且つBM 移植された。マウスは、2週間間隔で、下記の文献に記載されるように、IL-15およびIL-21ベクターの存在下、DCワクチンで免疫化された(Kowalczyk, A., A. Wierzbicki, M. Gil, B. Bambach, Y. Kaneko, H. Rokita, E. Repasky, R. Fenstermaker, M. Brecher, M. Ciesielski, and D. Kozbor. 2007. Induction of protective immune responses against NXS2 neuroblastoma challenge in mice by immunotherapy with GD2 mimotope vaccine and IL-15 and IL-21 gene delivery. Cancer Immunol Immunother 56: 1443-1458)。腫瘍増殖は、週に一度から三度、マイクロキャリパーを用いて皮下腫瘍を測定し、腫瘍体積(幅×長さ×幅/2＝mm³)を決定することによってモニターされた。

播種性疾患の免疫療法のために、NXS2-担持マウスは、腫瘍切除時に、骨髄非破壊的な(5Gy)もしくは骨髄破壊的な(9Gy)TBIを受けた(図１Ｃ)。腫瘍切除の１日後、前記マウスは、免疫化された若しくは未処置のマウス由来の脾細胞(2×10⁷)のACTをDCワクチンとともに受けた。マウスは、2週間間隔で、下記の文献に記載されるように、IL-15およびIL-21ベクターの存在下、DCワクチンで免疫化された(Kowalczyk, A., A. Wierzbicki, M. Gil, B. Bambach, Y. Kaneko, H. Rokita, E. Repasky, R. Fenstermaker, M. Brecher, M. Ciesielski, and D. Kozbor. 2007. Induction of protective immune responses against NXS2 neuroblastoma challenge in mice by immunotherapy with GD2 mimotope vaccine and IL-15 and IL-21 gene delivery. Cancer Immunol Immunother 56: 1443-1458)。コントロールマウスは、TBIおよびBM移植有りまたは無しで、原発腫瘍を切除された。生存時間は、マウスが広範な腫瘍増殖のために犠牲になった時点と定義された。カプラン・マイヤー生存プロットが作成され、有意性が、ログランクMantel-Cox法を使用して判定された。

ワクチン-誘発INF-γおよびTNF-α発現およびＴ細胞増殖のインビトロ分析
47-LDA-Fcγ2a-もしくは47-LDAポリペプチド-被覆DCsで免疫化されたA/Jマウスから得られた脾細胞は、20:1の比率にて47-LDA発現DCsで一晩刺激された後、INF-γおよびTNF-α発現について分析された。偽ベクター免疫化マウスから単離された細胞は、コントロールとして利用された。47-LDA-DCおよび47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンで免疫化されたマウスにおけるTreg細胞の誘発を研究するために、脾臓、腋窩および上腕リンパ節が最後の免疫化の３週間後に免疫化マウスから除去され、抗-CD4-PE、抗-CD25-FITCおよび抗-FoxP3-Alexa Fluor 647 mAbs、または関連するアイソタイプ・コントロールを用いた染色によってTreg細胞の数が分析された。Teff細胞増殖へのTreg細胞の効果を分析するために、47-LDA-DCもしくは47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンで免疫化されたマウス由来のCD8⁺Ｔ細胞は、37℃にて10分間、25μMのカルボキシフルオセインサクシニミジルエステル(CFSE：オレゴン州、ユージーン、Molecular Probes社)を負荷され、Treg細胞の存在下もしくは不存在下(比率1：1)、72時間、47-LDA-発現同系DCs(比率20：1)とともに培養された。細胞は、PE-結合抗-CD8 mAbsで染色され、フローサイトメトリーで分析された。Treg細胞集団は、製造者のプロトコルに従って、CD4⁺CD25⁺調節性Ｔ細胞単離キットを用いて単離された(Miltenyi社)。

ACTおよびDCワクチン接種後の担がんマウスおよび無腫瘍マウスにおける増殖性CD4⁺およびCD8⁺Ｔ細胞応答を分析するために、脾細胞は25μMのCFSEで標識され、47-LDA発現DCsとともに72時間インキュベートされた。細胞は、PE-結合-抗-CD4もしくは抗-CD8 mAbsで染色され、フローサイトメトリーによって分析された。

CTLアッセイ
脾細胞は、外因性IL-2のソースとして、15%のＴ細胞刺激因子(T-STIM[登録商標] カルチャー・サプリメント；マサチューセッツ州、ベッドフォード、Collaborative Biomedical Products社)中で20:1の比率にて47-LDA発現DCsとともに培養された。刺激の３日後、細胞は分裂され、マウスのrIL-2(0.3ng/ml)(BD Bioscience社)を追加した培地中で培養された。刺激前に、CD8⁺Ｔ細胞は、製造者のプロトコルに従ってＴ細胞富化カラム(Miltenyi社)を使用したネガティブ・セレクションによって単離された。NXS2腫瘍細胞に対するCTLsの細胞溶解活性は、スタンダード4-h⁵¹Cr-リリース・アッセイによって５日後に分析された。特異的溶解のパーセントは、次のように算定された：([cpm実験的リリース−cpm自発的リリース]／[cpm最大リリース−cpm自発的リリース])×100。最大リリースは、5%のTriton X-100の添加によって、溶解された細胞の上清から定量された。自発的リリースは、培地のみとインキュベートされた標的細胞から定量された。

腫瘍ウイルス療法(腫瘍溶解性ウイルス療法)に基づく癌ワクチンのための、rOVVs発現高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)および47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質の産生
本発明における使用に好適なrOVVsを作成できる種々の方法が存在する。ある特定の実演において、rOVVs発現EGFPおよび47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質が、VSC20ワクシニアウイルスおよびワクシニア・シャトル・プラスミドpSEL-EGFP並びにpCB023-47-LDA-Fcγ2aをそれぞれ使用してCV-1細胞における相同組換えによって産生された。親ワクシニアウイルスは、VGF遺伝子の代わりにクローン化されたLacZ遺伝子を有するVSC20であった。VSC20ワクシニアウイルスは、米国特許公開公報2007/0154458号に記述されており、そのVSC20ウイルスに関する記述は参照により本明細書に組み込まれる。

pCB023-47-LDA-Fcγ2aシャトル プラスミドは、pCB023のEcoRIおよびSmaI制限酵素サイトに47-LDA-Fcγ2a 融合タンパク質遺伝子をクローン化することによって産生された。DNA配列検証後、293Ｔ細胞トランスフェクタントの培養上清中での47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質の分泌が、14G2a mAbを用いた免疫ブロット法によって確認された。組換えウイルスの複数のプラークが、BrdU選択によってTK^-細胞内で単離された。HeLa細胞での増幅後、rOVV-EGFPおよびrOVV-47-LDA-Fcγ2aウイルスは、ショ糖密度勾配で精製され、力価測定され、NXS2細胞でのインビトロおよびインビボの研究で使用された。rOVV-EGFP-感染NXS2細胞におけるEGFPの発現は、免疫蛍光顕微鏡によって確認され、一方では、rOVV-47-LDA-Fcγ2a-感染NXS2細胞からの47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質の分泌が、14G2a mAbを用いた免疫ブロット法によって決定された。

腫瘍ウイルス療法に基づくワクチンのために、A/Jマウス(n＝10)は、2×10⁶ NXS2細胞を皮下注射され、15日後、10⁸プラーク形成単位 (PFUs)のrOVV-47-LDA-Fcγ2aまたはrOVV-EGFP ベクターの静脈内注射で治療された。PBSで治療された担がんマウスはコントロールとして使用された。生存時間は、マウスが広範な腫瘍増殖のために犠牲になった時点と定義された。カプラン・マイヤー生存プロットが作成され、有意性が、ログランクMantel-Cox法を使用して判定された。

統計解析
グループ間の差異の統計的有意性が、等しい分散を想定する両側スチューデントt検定を用いて実施された。平均腫瘍増殖の対(ペアワイズ)グループ比較のためのP値は、ノンパラメトリック・ウィルコクソン順位和検定を使用してコンピューターで計算された。カプラン・マイヤー生存プロットが作成され、生存期間中央値が、マウスのNXS2-チャレンジグループについて決定された。複数のグループにわたる生存時間の統計的有意差は、ログランクMantel-Cox法を用いて評価された。データは、算術的な平均値±標準偏差として表され、ウィンドウズ・ベースのプラットフォーム上でJMPプログラム(ノースカロライナ州、カリー、SAS Institute社)を用いて分析された。

マウス47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質の特性評価
マウスの 47-LDA-Fcγ2a 融合タンパク質は、EcoRIおよび BglII制限酵素切断部位を使用して、pFUSE-mIgG2Aa-Fc1ベクターのhEF1-HTLVプロモーターと、マウスIgG2a Fc領域との間のインフレームに、関連するコード配列[組織プラスミノーゲン活性化因子分泌性(tPA)シグナル配列、２つの普遍的なThペプチド、および47-LDAミモトープを含む]を挿入することによって産生された。無損傷のオープン・リーディング・フレームの存在を確認するための47-LDA-Fcγ2a構築物の配列決定後、14G2a mAbを用いた47-LDA-Fcγ2-トランスフェクト293Ｔ細胞の免疫蛍光染色と、それに続くフローサイトメトリー分析が、融合タンパク質の発現を判定するためにトランスフェクションから48時間後に行われた(図示せず)。ゼオシン-含有培地中で選択された、47-LDA-Fcγ2a安定発現株からの融合タンパク質の分泌は、14G2a mAbを用いて培養上清の免疫ブロット法によって確認された。図２Ａに示すように、31.9kDaの顕著なバンドが、47-LDA-Fcγ2aトランスフェクタントから収集された培養上清中で、14G2a mAbを用いて検出された。偽プラスミドをトランスフェクトされた細胞から調製された上清にはバンドは存在しなかった。ポジティブ・コントロールとして分析に含まれた、6.6kDaの分子量の47-LDAポリペプチドは、14G2a mAbによってはっきりと認識された。ようするに、これらの結果は、47-LDA-Fcγ2a 融合タンパク質と関連して発現されたGD2ミモトープが、14G2a mAbによって認識される合成ペプチドの生来の抗原決定基を保持することを示した。

BM由来の未熟DCsへの47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質および47-LDAポリペプチドの結合が、フローサイトメトリー分析によって判定された。図２Ｂに示すように、50%を超えるCD11c⁺DCsが、ビオチン化47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質もしくはビオチン標識47-LDAポリペプチドと反応した。47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質の結合（47-LDAポリペプチドではなく）は、47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質とその細胞リガンドの間で特異的な相互作用を示すFc遮断抗体CD16/32によって抑制された。しかしながら、LPSの添加が、CD86、CD40およびCD86抗原の表面発現を上方制御するのに必要であったため、FcγRsへの47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質の結合が、DC成熟に影響がなかったことは注目に値する(図示せず)。

活性化および抑制型FcγRsが、免疫複合体の形でDCsに抗原を投与する間、エフェクター免疫応答の調節に重要な意味を持ち、およびIL-12が１型免疫の産生に関与する重要なサイトカインであるので、我々は、47-LDAポリペプチドもしくは47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質と相互作用するDCsがLPSでの刺激によりIL-12p70を発現する能力に差があるかどうか研究した。これらの実験のために、47-LDA⁺および47-LDA-Fcγ2a⁺DCs並びにそれらのネガティブな対応物が、細胞選別によって得られた。CD86発現に対してポジティブまたはネガティブなDCsが、特異性コントロールとして含まれた(図２ＢおよびＣ)。選別されたDC集団は、1μg/mlのLPSで一晩刺激され、細胞内染色およびフローサイトメトリー分析によってIL-12p70発現を分析された。図２Ｃは、同程度レベルのIL-12p70が、47-LDA⁺および47-LDA^-DC集団またはCD86抗原発現の存在もしくは不存在で選別されたものにおいて測定されたのに対し、47-LDA-Fcγ2a⁺DCsが、LPSでの刺激後、それらのネガティブ対応物より有意に高いレベルのIL-12p70を発現したこと(P＝0.008)を示す。選別され、LPSで刺激された47-LDA⁺および47-LDA-Fcγ2a⁺DCsにおけるTreg-誘引性CCL22ケモカインの平行発現研究は、前者のDC集団における約２倍多い数のCCL22-ポジティブ細胞を明らかにした(図３ＡおよびＢ；P＝0.037)。

インビボにおける47-LDA-Fcγ2a-パルス樹状細胞の増強された免疫賦活活性
LPS-刺激47-LDA-Fcγ2a⁺DCおよび47-LDA⁺DCsの間のIL-12とCCL22の発現レベルの差は、これらの細胞が、インビボでTeffおよびTreg細胞と相互作用する能力が異なる可能性が有ることを示唆する。それゆえ、我々は、47-LDA-Fcγ2a-および47-LDA-DCワクチンを用いたA/Jマウスの免疫化後の、腫瘍特異的なTh1およびCTL応答の誘発を研究した(図１Ａ)。各DCワクチンは、２週間間隔で３回静脈内注射によって送達され、これとともにDNAプラスミド-コード化IL-15およびIL-21がワクチン接種時および５日後にそれぞれ筋肉内に送達された(Kowalczyk, A., A. Wierzbicki, M. Gil, B. Bambach, Y. Kaneko, H. Rokita, E. Repasky, R. Fenstermaker, M. Brecher, M. Ciesielski, and D. Kozbor. 2007. Induction of protective immune responses against NXS2 neuroblastoma challenge in mice by immunotherapy with GD2 mimotope vaccine and IL-15 and IL-21 gene delivery. Cancer Immunol Immunother 56: 1443-1458)。最後の免疫化の３週間後、免疫化されたマウス由来のCD4⁺脾細胞は、47-LDA発現DCsで一晩刺激した後、細胞内染色およびフローサイトメトリーによってINF-γおよびTNF-α産生について分析された。DCsおよびIL-15ならびにIL-21ベクターを用いて免疫化されたマウスから単離された細胞は、コントロールとして含まれた。図３Ｃに示すように、IFN-γ-およびTNF-α-産生CD4⁺細胞の数は、47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質-被覆DCsで免疫化されたマウスにおいて、コントロールの動物より４倍以上高く、47-LDA-DCワクチンによって誘発された応答より２倍以上高かった(それぞれ、P＝0.002およびP＝0.003)。E:T比の広範囲にわたって、47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質ワクチン後のIFN-γ-産生CD4⁺Ｔ細胞応答の増加は、NXS2神経芽細胞腫瘍に対するより高いCD8⁺Ｔ細胞性細胞傷害活性(47-LDAポリトープ-被覆DCsで誘発されたものと比較して)と関連した(図３Ｄ)。

我々は、腋窩、上腕リンパ節および脾臓におけるCD4⁺CD25⁺FoxP3⁺リンパ球のフローサイトメトリー分析によって47-LDAおよび47-LDA-Fcγ2a-DCワクチン後のTreg細胞の誘発も試験した。47-LDA-免疫化マウスの腋窩リンパ節では、CD4⁺CD25⁺集団内のFoxP3⁺細胞の絶対数は、0.31×10⁶から0.42×10⁶細胞にわたり(図４Ａ)、47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンで免疫化された動物と比較して２倍近く高かった(0.36±0.06 vs 0.19±0.04；P＝0.03)。後者のグループのマウスでは、細胞内FoxP3発現がポジティブなCD4⁺CD25⁺リンパ球の数は、0.17×10⁶から0.24×10⁶細胞にわたった(図４Ｃ)。Treg細胞の発生頻度における同様の違いは、免疫化マウスの上腕リンパ節と脾臓で検出された(データは示さない)。47-LDA-DC-および47-LDA-Fcγ2a-DC-免疫化マウスから調製されたCFSE-標識CD8⁺リンパ球とTreg細胞が、1:1の比率で混合され、それぞれLPS-成熟47-LDA⁺DCsおよび47-LDA-Fcγ2a⁺DCsとともに共培養された場合、両方の集団のTreg細胞は、Teff細胞の増殖を抑制した(それぞれ、図４ＢおよびＤ)。しかしながら、47-LDA-Fcγ2a⁺DC-刺激された培養物におけるエフェクターＴ細胞の増殖率は、47-LDA⁺DCsで誘発された刺激と比較して有意に高かった(P＝0.02)。

47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンとの併用における骨髄破壊的TBIは、ACT治療を増強する
47-LDA-および47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンの治療的有効性を比較するために、我々は、NXS2担癌A/Jマウスにおいて、抗原経験CD8⁺脾細胞を用いたACT実験を行った(図１B)。CD8⁺Ｔ細胞が、Teff細胞の増殖を誘発するために、およびリンパ球枯渇ホストへの養子移入による二次応答を開始するために、47-LDA-もしくは47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンとともに、NXS2-担持マウスに静脈内注射された。図５Ａは、ACTおよび47-LDAポリペプチド-被覆DCワクチンに先立つ骨髄非破壊的な(5 Gy)投与計画でのリンパ球枯渇が、腫瘍増殖の抑制にバックグラウンド作用を持つことを示す(P＝0.28)。養子導入CD8⁺Ｔ細胞の抗腫瘍有効性は、治療マウスの全生存期間が25日から70日に延長したことから判定されるように、骨髄破壊的な(9 Gy)TBI後に増強された(図５Ａ；P＝0.007)。我々は、骨髄破壊的な投与計画が、7-LDA-Fcγ2a-DCsとともに送達された養子導入CD8⁺脾細胞との組み合わせで特に効果的であることを見い出した。図５Ｂに示すように、後者の治療は、未処置マウス由来の同系BMの移植を伴う骨髄破壊的な量のTBIを受けたNXS2-担持動物の22%において腫瘍増殖の完全寛解をもたらした(P＝0.0003)。骨髄非破壊的な状況において47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンで刺激されたCD8⁺Ｔ細胞を用いた治療は、完全な腫瘍の消散を示さなかったが、コントロール群と比較した際、治療マウスにおいて生存期間の有意な延長があったことは注目に値する(図５Ｂ；P＝0.015)。全てのコントロールマウスが、進行性に増大する腫瘍を発症し、25日までに屠殺されなければならなかったので、ACTの抗腫瘍効力は特異的であった。

養子導入CD8 ⁺ 脾細胞および47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンによる転移性疾患のコントロール
原発腫瘍の切除後、自然転移を起こすNXS2神経芽細胞腫の能力は、播種性疾患をコントロールするために、養子導入CD8⁺脾細胞の有効性を研究するためのモデルを提供した(図１Ｃ)。Treg細胞の枯渇と協同した根治目的の手術が、持続的な腫瘍保護の発展とCD8⁺細胞記憶を可能にするという累積証拠を考慮して(9)、NXS2担癌マウスは、腫瘍切除および抗原経験CD8⁺脾細胞のACT時に骨髄非破壊的な(5 Gy)もしくは骨髄破壊的な(9 Gy)TBIを受けた。図５Ｃに示すように、47-LDAポリペプチド-被覆DCsによって増殖されたCD8⁺Ｔ細胞の移入は、骨髄破壊マウスにおいてのみ観察された転移性疾患の進行を遅延した(P＝0.024)。無腫瘍生存率は、この動物のグループでは観察されなかった。

ACTおよび47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンに先立ち5Gy TBIを受けたNXS2チャレンジマウス6匹のうち2匹のみが、50日の治療期間内に自然転移を発生したので、養子導入CD8⁺Ｔ細胞の抗腫瘍有効性は、ACTおよび47-LDA-Fcγ2a-DCワクチン接種によって有意に増強された(図５Ｄ；P＝0.003)。このグループの残りのマウスは、90日の最長生存期間を有し、転移性疾患の進行の遅延を示した。予想通り、養子導入脾細胞の最も高い抗腫瘍有効性(120日の期間の間80%を超える無腫瘍生存率を伴う)は、骨髄破壊的な投与計画と47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンを用いたACT後に観察された(図５Ｄ；P＜0.001)。他方、原発腫瘍が切除され、TBIを受けたコントロールマウスは、疾患の進行のため、40日までに屠殺されなければならなかった。NXS2-反応14G2a mAbを用いた染色およびRT-PCR分析によって判定されるように、転移巣は、主に上腕および腋窩のリンパ節で発達し、および、肝臓、脾臓およびBMではより頻度が低かった(データは示さず)。

47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンによって誘発された一次免疫応答による転移性疾患の抑制
我々は、次に、治療開始前に原発腫瘍が切除された骨髄破壊マウスへの未処置脾細胞の養子移入後に、転移性疾患を抑制できる抗腫瘍性免疫応答を誘発する、47-LDA-および47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンの能力を研究した(図５Ｅ)。CD4⁺Ｔ細胞は、増殖因子を有するCD8⁺Ｔ細胞を提供するため、および抗腫瘍性応答を誘発するためにも要求されるので、これらの実験では、未処置脾細胞の全集団が、ACTのために使用された。図５Ｅは、NXS2-担持マウスにおいてインビボで刺激した未処置のＴ細胞の測定可能な治療的影響は、抗原経験CD8⁺Ｔ細胞によって媒介されたものと比較して低かったものの、20%の治療マウスは、47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンを用いたACT後100日間、腫瘍が無いままであったことを示す(P＝0.007)。47-LDA⁺DCワクチンは、たとえより小さい程度でも、抗腫瘍性Ｔ細胞応答を誘発する能力もあった。原発腫瘍が切除されたコントロールマウスは、治療の最初の二ヵ月以内に転移性疾患を発症し、NXS2-担持マウスにおける47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンを用いた能動免疫によって誘発される腫瘍特異的Ｔ細胞の有意な効果を示した。

ACTおよびDCワクチン接種後の、担がんマウスおよび腫瘍の無いマウスにおける細胞応答
我々は、次に、ACTおよびDCワクチン後の、担がんマウスおよび腫瘍の無いマウスにおける細胞応答を研究した。治療的な47-LDA-および47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンの両方が、養子導入される未処置脾細胞と一緒に、原発性NXS2腫瘍の切除後、骨髄破壊マウスに送達され、Teff細胞の誘発を分析された。ACTおよび47-LDA⁺DCワクチンでの免疫化後、無腫瘍生存率は観察されなかったので、リンパ節に可視の転移巣を有する動物は、脾臓における抗腫瘍性免疫応答について試験された。図６Ａに示すように、担がんマウス中のCD4⁺あるいはCD8⁺脾細胞の15％未満が、47-LDA発現DCsでの72時間の刺激後、インビトロで分裂し、NXS2細胞へのCTL応答は、バックグラウンドレベルであった(図６Ｂ)。対照的に、CD4⁺およびCD8⁺脾細胞の力強い増殖(それぞれ、55%から69%および39%から46%の範囲)が、ACTおよび47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンを受けた後で腫瘍の無いマウスにおいて検出された(図６Ｃ)。増殖応答は、NXS2細胞に対する抗腫瘍性CTL活性も伴っていた(図６Ｄ)。

rOVV発現47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質を用いたウイルス療法に基づく癌ワクチン
47-LDA-Fcγ2a-DCワクチンの抗腫瘍性効果が照射された担がんホストにおけるACTに限定されないことを決定するために、我々は次に、rOVVワクシニアウイルスによって発現された47-LDA-Fcγ2a融合タンパク質の治療的な有効性を試験した。ワクシニアrOVV-47-LDA-Fcγ2aの腫瘍退縮性TK^-,VGF^-変異体が腫瘍特異的な複製を示すため、融合タンパク質が感染細胞から分泌され、腫瘍退縮部位で、腫瘍浸潤DCsによって交差提示されるであろうことが予測された。並行研究において、NXS2担がんマウスの追加グループが、ウイルス感染したNXS2細胞からリリースされる腫瘍関連抗原によって誘発される保護の程度を決定するために、特異性コントロールとして、rOVV-EGFPベクターを注射された。動物は、一週間に一度〜三度、皮下腫瘍を測定することによって腫瘍増殖を試験された。図７Ａに示すように、コントロールrOVV-EGFPベクターを用いて治療されたNXS2担持マウスの約25%が、腫瘍が無い状態になった。対照的に、ウイルスベクターの代わりにPBSを用いて治療された全ての担がんマウスは、進行性に増大する腫瘍を発症し、20日までに屠殺されなければならなかった。最も高い抗腫瘍有効性は、rOVV-47-LDA-Fcγ2aベクターを用いた腫瘍退縮性免疫ウイルス療法後、担がんマウスで観察された、100日の間60%を超える無腫瘍生存率によって特徴付けられる(図７Ａ；P＝0.0004)。

担がんホストでの免疫記憶細胞の発達への腫瘍ウイルス療法の効果をより総合的に理解するために、rOVV-EGFPあるいはrOVV-47-LDA-Fcγ2a治療後に少なくとも40日間腫瘍がないままであった、NXS2-チャレンジマウス(n＝6)を、10⁶のNXS2細胞を用いて皮下に再チャレンジした。図７Ｂは、NXS2腫瘍での再負荷で、全てのrOVV-EGFP治療マウスが、進行性に増大する腫瘍を発症したことを示す。しかしながら、無処置の動物と比較して、rOVV-EGFP-治療マウスでの腫瘍増殖の開始には、20日間の遅延があった。この発見は、腫瘍ウイルス療法の間、DCsによるアポトーシス細胞の取込みと、腫瘍抗原の交差提示に起因して抗腫瘍性免疫応答を誘発するrOVVの能力と一致する(Li, Q. X., G. Liu, and F. Wong-Staal. 2008. Oncolytic virotherapy as a personalized cancer vaccine. Int J Cancer 123: 493-499.)。他方、6匹のrOVV-47-LDA-Fcγ2a-治療およびNXS2再-チャレンジマウスのうち1匹のみが、腫瘍接種の35日後に、ゆっくり進行する腫瘍を発症し、これはrOVV-EGFP-もしくはPBS-治療マウスと比較して、47-LDA-Fcγ2a-誘導免疫の有意な抗腫瘍性の影響を反映している(図７Ｂ，P＜0.001)。

本実施例は、臨床的に意義のあるマウスモデルにおいて２つの明瞭な腫瘍の成長を阻害するために使用される方法の一実施形態を実証するものである。

我々は、CXCR4ケモカインレセプター・アンタゴニストである新規な抗がん剤CTCE-9908を発現させた。このCXCR4(アミノ酸配列：KGVSLSYR-K-RYSLSVGK；配列番号５)のペプチド・アンタゴニストは、SDF-1(CXCL12)ケモカインのN-末端領域の二量体である。CTCE-9908は、CXCR4レセプターのCXCL12との相互作用(転移細胞による器官組織の浸潤に重要な意味を持つ)をブロックし、それによって腫瘍転移を減少させる。CXCR4レセプターは、多くの腫瘍細胞タイプで発現される。CTCE-9908ペプチドは、カナダのバンクーバーでChemokine Therapeutics社によって開発され、後期のがん患者でフェースI/II臨床治験で使用されてきた。

我々は、DNAプラスミドあるいは腫瘍退縮性組換えワクシニアウイルスを使用して、活性化マウスおよびヒトのIgG2aとIgG1のFcフラグメント、それぞれとの関連でCTCE-9908 ペプチド(配列番号６)を発現した。天然に存在するジスルフィド結合を有するFcレセプターは、CTCE-9908ペプチドの二量体構造を保存するために使用される。したがって、本発明は、それぞれ配列番号６からなる単量体ユニットを空間的に近接させるために、Fc重鎖の間に生じる自然発生のジスルフィド結合を活用する。これは、同じペプチドにおける単量体ユニットの２つのコピーを提供する必要なく、CTCE-9908ペプチド(配列番号５)の二量体化を模倣する(ここで、配列番号５と同じように、C末端ユニットはN末端ユニットと比べて逆の配向を有する)。それは、CTCE-9908ペプチドにおけるR-K-R配列中のKなどのように、連結しているアミノ酸を有する必要性も除去する。さらなる利点は、ここにさらに記載するように、Ｔヘルパー・エピトープとの物理的な関連における(すなわち、同じポリペプチドにおける)前記二量体の提示を含むが、必ずしもこれに限定されない。

図８から分かるように、CTCE-融合タンパク質のマウスバージョン(200μg/マウス)を用いたマウスの同系(T41乳がん)および異種移植(FADUヒト頭頸部がん)モデルで行われた我々の実験は、活性化Fc融合タンパク質との関連でCTCE-9908ペプチドの抗腫瘍有効性を示した。

乳がんおよびストロマ細胞(がん関連線維芽細胞(CAFs)、血管内皮細胞および骨髄由来サプレッサー細胞(MDSCs))上のCXCR4を標的にするために、我々は同系マウスにおける非常に攻撃的なトリプル-ネガティブマウス4T1腫瘍の原発性および転移性増殖の抑制を導く戦略を考案した。無腫瘍生存率を導いた戦略(我々が残存腫瘍をなんら検出しなかったことを意味する)は、CXCR4のアンタゴニストを発現するOVVと腫瘍ウイルス療法との組み合わせであり、その後、腫瘍に栄養を与える血管を標的とする腫瘍血管破壊剤(腫瘍VDA)(ASA404；(vadimezan))を用いた治療が続く。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、個体に腫瘍血管破壊剤を投与することを含む。一実施形態では、腫瘍血管破壊剤は、当技術分野でASA404(vadimezan)と呼ばれている化合物であり、Tozer, G. M., Kanthou, C. and Baguley, B. C., Disrupting tumour blood vessels. Nat Rev Cancer 2005. 5: 423-435に記載されている。ASA404は、市販されている化合物である。例えば、Selleck社(米国、テキサス州、ヒューストン)が、カタログ番号S1537、製品名DMXAAとしてASA404を提供している。

ASA404が誘発する血管シャットダウンの主要なメカニズムは、増加する血管透過性が、腫瘍内で、体液の血管外漏出、血漿の損失および大きな圧力差をもたらし、それが最終的な血流の損失に寄与すると信じられている。この関連で、我々は、ASA404への4T1血管応答の分析のために造影MRIを使用した。画像のパネルは、治療の2時間後に、明らかに、増加した造影剤の血管外漏出を示した(治療前の測定と比べて)。造影剤濃度のさらなる増加は、血管透過性における変化が原因で4時間後となった(データは示さず)。

我々は、VSC20ワクシニアウイルスおよびワクシニアシャトルプラスミドpSEL-EGFPとpCB023-CXCR4A-Fcをそれぞれ使用して、CV-1細胞での相同組換えによってOVV-EGFP(コントロールとして使用される高感度緑色蛍光タンパク質を発現している)およびOVV-CXCR4A-Fcを作成した[McCart, J. A., Ward, J. M., Lee, J., Hu, Y., Alexander, H. R., Libutti, S. K., Moss, B. and Bartlett, D. L., Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes. Cancer Res 2001. 61: 8751-8757]。融合タンパク質は、OVV-CXCR4A-Fc-感染TK^-細胞の培養上清から精製され、還元および非還元の状況下でウエスタンブロット法によって分析され、前記融合タンパク質が、28.9kDaのモノマーからなる二量体であることを明らかにした(図９Ａ)。前記融合タンパク質は、SupT-1細胞上に発現したCXCR4レセプターに結合する能力があり、前記結合は、CTCE-9908ペプチドを用いてこれらの細胞のプレ-インキュベーションによって抑制され、このことは両方のリガンドがCXCR4の同じエピトープに結合することを示している(図９Ｂ)。8.0μmの孔のフィルターを用いた直径24mmのチャンバーにおける4T1細胞のインビトロ遊走アッセイは、CXCR4A-Fc融合タンパク質あるいはCTCE-9908ペプチド(100μg/ml；ケンタッキー州、ルーイビル、AAPPTec有限会社)のいずれかの添加が、1000ng/mlの濃度で使用されたSDF1に向かう腫瘍細胞の遊走を80％より多く抑制することを明らかにした(図９Ｃ；P＜0.0001)。両方のアンタゴニストが、SUPT-1細胞におけるSDF-1-誘導カルシウム動員を抑制する能力もあった(図９Ｄ)。

BALB/cマウスにおける4T1原発性および転移性増殖の抑制
メスのBALB/c(n＝8〜12)は、胸部の乳房脂肪体中に、50μlのPBS中7×10⁴の4T1細胞を接種された。100〜150mm³の腫瘍体積を有する4T1-担持マウスは、OVV-EGFPもしくはOVV-CXCR4A-Fc(10⁸PFU)単独で、または前記ウイルスの24時間後腹腔内に送達される最大耐用量のASA404(20mg/kg)との組み合わせで、静脈内に注射された。今回のASA404送達は、前記ウイルスの４時間前または同時に送達された薬物で治療された動物と比較して最適な抗腫瘍効率を示した(データは示さず)。図１０Ａは、OVV-CXCR4-A-Fcもしくは ASA404を用いた単独療法は、腫瘍増殖を有意に抑制したが(P＜0.05)、無腫瘍生存率は、併用療法で治療された動物でのみ達成されたことを示す(図１０Ｂ)。OVV-EGFPとASA404を用いた治療は、13%の生存者をもたらし、一方、OVV-CXCR4-FcとASA404は、42%の腫瘍の無い動物をもたらした(図１０Ｂ)。転移性疾患の治療のために、4T1担持マウス（V＝〜200mm³）は、腫瘍ウイルス療法を単独でもしくはASA404との併用で受け、腫瘍は8日後(ウイルス感染が、ホストの自然および獲得免疫が原因で除去された時点；データは示さない)に切除された。コントロールマウスは、治療なしで原発腫瘍を切除された。図１０Ｃに示すように、転移性疾患に対する最も高い保護は、OVV-CXCR4-FcとASA404の組み合わせで治療された動物で観察された(80%生存率)。腫瘍ウイルス療法またはASA404治療単独では、保護効果はより小さかった。生存特性における変化に対応して、治療の４日後に切除された4T1腫瘍中のGr1⁺CD11b⁺(Ly6G⁺)MDSCsの数は、コントロール動物での数とは異なった。

図１０Ｄに示すように、MDSCs(CD11b⁺Ly6G⁺)の数は、OVV-CXCR4-A-Fc治療後、コントロール腫瘍と比較して、4倍程度低かった。対照的に、ASA404治療後の腫瘍は、MDSCsの最も高い蓄積を含んだ(コントロールと比較して3倍増加した)。これは、薬剤による炎症が原因で末梢からのMDSCsの遊走が増加するか、血管の損傷のためにこれらの細胞が腫瘍を離れることができないか、いずれかに起因する可能性が有る。ASA404治療腫瘍におけるSDF-1の高レベルおよびOVV-CXCR4-A-Fc治療後のその低下した発現は、前者の可能性をサポートする(図１０Ｅ)。このように、腫瘍微小環境に存在するがん関連線維芽細胞におけるSDF-1の発現が、パラクリン(腫瘍CXCR4の直接刺激)、および内分泌性(骨髄からのMDSCsの補充)メカニズムの両方を介して腫瘍血管新生を誘導することによって原発腫瘍増殖を促進するので、本発明の方法によるCXCR4のターゲティングは、悪性の腫瘍増殖および遠隔転移を抑制するのに効果的であると予期されることが、当業者に認識されるであろう。

当業者は、前述した内容から、様々な実施形態において本発明が、少なくとも３つの独特の試薬を利用し、かつそれぞれが作用の直接的または間接的メカニズムを通して腫瘍増殖を抑制する特徴的な役割を果たすことができることを認識するであろう。理論に拘束されることを意図しないが、腫瘍増殖の破壊は、主に、腫瘍退縮性ワクシニアウイルスによって発揮される悪性細胞への細胞溶解効果、およびASA404による腫瘍血管系のシャットダウンを通じて達成され、一方では、間接的な抗腫瘍効果が、腫瘍とストロマ細胞間のクロス-コミュニケーションを妨げることによって、一部分において、炎症およびCXCR4レセプターの標的化を通じて、達成されると考えられる。我々は、この戦略が生存期間、特に、同系マウスの高転移性マウス4T1乳がんの、手術後の移転性パラダイムにおいて、深刻な影響を持つことを示す。我々は、悪性細胞とストロマ細胞の両方を攻撃する併用療法が、より効果的であり、形質転換細胞に持続性の獲得免疫を誘発することもできると予期する。

前述の実験は、本発明を具体的に説明することを目的とする、当業者は、本発明の精神を逸脱することなく、マイナーな変更が可能であることを理解するであろう。

Claims (2)

1. 融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、
   前記融合タンパク質が、免疫グロブリンFc部および腫瘍細胞によって発現されるレセプターのアンタゴニスト・ペプチドを含むこと、
   前記アンタゴニスト・ペプチドが、配列 KGVSLSYR（配列番号６）からなること、
   前記融合タンパク質の発現後、２つの融合タンパク質のFc部の間にジスルフィド結合が生じ、２つの前記アンタゴニスト・ペプチドの単量体ユニットに空間的な近接をもたらすこと、
   前記単量体ユニットの間に連結アミノ酸が存在しないこと
   を特徴とする組成物。
2. 請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含む組成物。
   

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