JP6018043B2 - 多孔質セルロースビーズの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、多孔質セルロースビーズを製造するための方法に関する。

多孔質セルロースビーズは、他の合成系高分子を用いる場合に比べて安全性が高く、非特異的吸着が少なく、多糖類でありながら機械的強度が大きく、また、吸着すべき目的物質と相互作用するリガンドを導入するのに利用できる水酸基を多く含有する等の利点から、各種吸着体として用いられている。例えば各種クロマトグラフィー用吸着体やアフィニティー吸着体が挙げられる。なかでも、アフィニティー吸着体は、効率よく目的物を精製、または不要物濃度を低減できることから、医療用吸着体や抗体医薬品精製用吸着体として利用されてきている。特に、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用（医療用）吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体が注目されている（例えば非特許文献１、非特許文献２）。一方、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に吸着、溶出できる吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体（抗体医薬品精製用吸着体）が注目されている。

このような多孔質セルロースビーズの製造は、セルロースの溶解が困難であるとされていたことから、通常の合成ポリマーと比べて煩雑な工程を含むものが多い。その一つとして、チオシアン酸カルシウム水溶液などの腐食性、毒性が高く、設備化の難易度を高くしてしまう溶媒に溶解し、凝固する方法が開示されている（例えば特許文献１）。この方法で用いられるセルロース溶液が特異な挙動を示し、また、この方法で得られる多孔質セルロースビーズは、かなり大きい細孔を有することが知られている（例えば非特許文献３）。よって、当該方法で得られた多孔質セルロースビーズを抗体などの吸着体として用いる場合、比表面積が小さいことから、高い吸着性能を示すことは期待できない。一方、セルロースの溶解性を上げるためにセルロースの水酸基に置換基を付与し、汎用の溶媒に溶解させて造粒を行い、造粒後に置換基を脱離させて多孔質セルロース系担体を得る方法が例示されている（例えば特許文献２）が、工程が煩雑であり、置換基を付与したり脱離させたりする過程で分子量の低下が起こり、近年求められている高速処理や大スケールで使用するのに適切な強度が得られ難い傾向がある。

また、セルロースを容易に溶解できる溶媒としてイオン液体が注目されており、非特許文献４においては、イオン液体にセルロースを溶解してセルロースビーズを得る方法が開示されている。しかしながら、イオン液体はかなり高価であり、産業レベルで副原料として使用するには不適であるし、微量とはいえ残留するであろうイオン液体の安全性については、毒性データ等が少なく、医療用や医薬品精製用の吸着体製造用として使用する場合は、安全性確認の検討を相当要することが予想される。

また、低温の水酸化ナトリウム水溶液のみにセルロースを溶解できるという方法が開示されている（例えば特許文献３、４）。しかしながら、特許文献３に記載の方法では、セルロースと水素結合切断剤（a hydrogen bond-cleaving solution）の混合物を、加圧下、１００〜３５０℃で加熱する工程を経てから、アルカリ水溶液に溶解している。このような工程は、工業的に不利である。また、特許文献４に記載の方法では、セルロースを強塩基溶液に分散させ、当該分散液をいったん凍結させた後に溶解するという工程が必要である。

さらに、特許文献５にはアルカリ溶液に溶解性を示すセルロースが開示されているが、当該セルロースはミクロフィブリルの繊維径が１μｍ以下、さらには５００ｎｍ以下に微細化されたものである。このような微細化処理は、工業的製造には適さない。

ごく最近、特許文献６に示されるように、微生物セルロースを特許文献４に記載の方法にて溶解して溶液を作製し、該溶液を凍結させる工程を介してセルロースビーズを得る方法が開示されているが、工程が煩雑で工業的な製法には適していない。

特表２００９−２４２７７０号公報 国際公開ＷＯ２００６／０２５３７１ 米国特許４６３４４７０号公報 米国特許５４１００３４号公報 特開平９−１２４７０２号公報 特開２０１０―２３６９７５号公報

Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００５． Ｖｏｌ．１０５１ Ｐ．６３５−６４６ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．１５２， Ｎｕｍｂｅｒ ４ ２００６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， １９５（１９８０）２２１−２３０ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ， １２１７（２０１０）１２９８−１３０４

本発明は、毒性、腐食性が高い副原料を使わず、工業的に不利である煩雑な工程を経ることなく、機械的強度が高い多孔質セルロースビーズの簡便な製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。詳しくは、従来、多孔質セルロースビーズの製造においては、まず、毒性の低い安価な溶媒に溶解し難いセルロースをいかに溶解するかが問題となっていた。本発明者らも、当初、セルロースを上記のような溶媒へ簡便に溶解する条件につき研究していた。ところが、本発明者らは、セルロース溶液を用いることなく、セルロースの分散液からでも多孔質セルロースビーズを良好に製造できることを見出して、本発明を完成した。

本発明に係る多孔質セルロースビーズの製造方法は、低温のアルカリ水溶液とセルロースとを混合して作製したセルロース分散液を、凝固溶媒に接触させることを特徴とする。

前記アルカリ水溶液のアルカリ濃度としては、５〜１５重量％が好ましい。この範囲であれば、セルロースのアルカリ水溶液への分散性と膨潤性が高くなる。

本発明方法としては、原料であるセルロースとして、メジアン粒径が１０μｍ以上、５００μｍ以下のものを用いることが好ましい。メジアン粒径が１０μｍ未満までセルロースを粉砕することは工業的に不利となり、全体の製造コストが上がってしまうおそれがあり得る。一方、当該メジアン粒径が過剰に大きなセルロースを用いると、安定的な分散液が得られず、ひいては多孔質セルロースビーズを良好に製造できない場合があり得るので、当該メジアン粒径としては５００μｍ以下が好ましい。

前記セルロース分散液中のセルロースの濃度としては、１〜１０重量％が好適である。当該濃度が１重量％未満であると、除去すべき溶液の量が多く、工業的に不利となるおそれがあり得る。一方、当該濃度が高過ぎると均一な分散液を製造するために攪拌時間が過剰に長くなり得るので、当該濃度としては１０重量％以下が好ましい。

前記凝固溶媒としては、アルコールを含有するものが好ましい。アルコールは安価である上に、アルコールを含む凝固溶媒であれば、本発明に係る多孔質セルロースビーズを良好に製造することが可能になる。

前記凝固溶媒としては、酸性であるものが好ましい。凝固溶媒が酸性であれば、アルカリ水溶液を含むセルロース分散液を中和することができる。また、本発明者らの知見によれば、凝固溶媒として酸性のものを用いれば、得られる多孔質セルロースビーズの細孔径分布が狭くなる。そのような細孔径特性が所望される場合、凝固溶媒を酸性とすることが好ましい。

前記セルロース分散液を作製・貯蔵する際における温度としては、−２０℃以上１０℃以下が好ましい。当該温度が−２０℃以上であればアルカリ水溶液の凍結を抑制することができる。一方、当該温度が１０℃以下であれば、セルロース分散液を効率的に調製でき、また、セルロース分散液の着色を抑制することができる。

前記セルロース分散液を分散媒に分散しエマルションを作製した後、該エマルションを凝固溶媒に接触させる態様も好適である。エマルションを調製することによって、より簡便に、より真球度の高い多孔質セルロースビーズが得られる。

前記凝固溶媒の体積としては、前記エマルションの０．０１倍〜１倍が好ましい。当該範囲内であれば、良好な細孔や表面孔を有する多孔質セルロースビーズを得られやすい。

エマルション作製時におけるＰｖ値（単位体積あたりの動力）としては、０．１ｋＷ／ｍ³以上が好適である。当該攪拌動力が０．１ｋＷ／ｍ³以上であれば、良好な真球性と細孔特性を得られ易い。

また、前記セルロース分散液と凝固溶媒の接触時のＰｖ値（単位体積あたりの動力）としては、０．１ｋＷ／ｍ³以上が好適である。当該Ｐｖ値が０．１ｋＷ／ｍ³以上であれば、良好な真球性と細孔特性の多孔質セルロースビーズが得られやすい。

エマルションへの凝固溶媒の添加所要時間としては１５０秒以内が好ましい。理由は定かではないが、驚くべきことに、当該時間が１５０秒以内であれば、得られる多孔質セルロースビーズの強度が向上する。

前記セルロース分散液は、水とセルロースからなる予備分散液とアルカリ水溶液とを混合させることにより調製されることが好ましい。それにより、セルロースのダマの発生を抑制でき、セルロース分散液の作製に要する時間を短縮できる。

少なくとも一つ以上の工程における攪拌操作においては、タービン翼を用いることが好ましい。攪拌翼として剪断力が大きいタービン翼を用いると、理由は定かではないが、驚くべきことに、良好な真球性と細孔特性を有する多孔質セルロースビーズが得られやすい。

本発明に係る架橋多孔質セルロースビーズの製造方法は、上記で説明した本発明製造方法により得られた多孔質セルロースビーズをさらに架橋することを特徴とする。

本発明によれば、毒性、腐食性が高い副原料を使わず、工業的に不利である煩雑な工程を経ることなく、機械的強度が高い多孔質セルロースビーズを簡便に製造することができる。

図１（１）は、本発明に係るセルロース分散液であり、図１（２）は、従来方法に係るセルロース溶液である。

本発明に係る多孔質セルロースビーズの製造方法は、低温のアルカリ水溶液とセルロースとを混合してセルロース分散液を調製する工程、および、当該セルロース分散液を凝固溶媒に接触させることにより、多孔質セルロースビーズを得る工程を含むことを特徴とする。

本発明者らは、低温のアルカリ水溶液にセルロースを分散させたセルロース分散液を、該セルロース分散液が凍結しない温度にて凝固溶媒に接触させると、毒性や腐食性が高い溶媒や溶解助剤を実質的に用いることなく、多孔質セルロースビーズが安価に簡便に製造できることを見出した。また驚くべきことに、低温のアルカリ水溶液に通常の大きさのセルロース粉末を投入すると、よく知られているように透明の溶解状態とは言い難い分散液が作製される場合が多いものの、鋭意検討の結果、このようなセルロース分散液からでさえ、多孔質セルロースビーズがより簡便に安価に製造できることを見出した。おそらくは、セルロースがアルカリ水溶液に溶解しなくても、水とアルカリ成分が低温下で形成する特殊なクラスタにセルロースが配位されて膨潤し、かかるクラスタが凝固溶媒に吸収および置換され、セルロースが凝固しながら多孔質化するものと考えられる。

以下、本発明を工程ごとに説明する。

（１） セルロース分散液の調製工程
本発明では、低温のアルカリ水溶液とセルロースとを混合する。セルロースが低温アルカリ水溶液に溶媒和される反応は発熱反応であるので、高温のアルカリ水溶液にセルロースを加えても均一で着色の無い分散液は得られない。そこで、セルロースとアルカリ水溶液の混合時には、低温を維持する。

ここで低温とは、常温より低い温度を指す。常温より低ければ大きな問題は無いが、−２０℃以上であれば温調設備が簡便でランニングコストも低くなるため好ましい。また１０℃以下であればセルロース分散液の着色が少なくなり、またセルロースの分散性・膨潤性が高くなるため好ましい。当該温度としては、−１０℃以上、２０℃以下が好ましい。−１０℃以上であればアルカリ水溶液の凍結を抑制することができる。一方、２０℃以下であれば、セルロース分散液を効率的に調製でき、また、セルロース分散液の着色を抑制することができる。当該温度としては、−５℃以上がより好ましく、−２℃以上がさらに好ましく、−１℃以上が特に好ましく、また、１５℃以下がより好ましく、９℃以下がさらに好ましく、５℃以下がさらに好ましく、４℃以下がさらに好ましく、１℃以下がさらに好ましい。また、当該温度が９℃以下であれば、得られる多孔質セルロースビーズの真球度が高くなるため好ましい。

アルカリは、水溶液となった際にアルカリ性を示すものであれば特に限定なく用いることができる。入手のしやすさから水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましく、製品安全性や価格の面から水酸化ナトリウムが最も好ましい。

前記アルカリ水溶液のアルカリ濃度に特に限定は無いが、３〜２０重量％であることが好ましい。アルカリの濃度がこの範囲であれば、セルロースのアルカリ水溶液への分散性・膨潤性が高くなるため好ましい。より好ましいアルカリの濃度は５〜１５重量％であり、さらに好ましくは７〜１０重量％、最も好ましくは８〜１０重量％である。

前記セルロースの種類には特に限定は無い。例えば、本発明方法では、セルロースを溶解させなくてもよいので、溶解性を上げるための置換基を導入したセルロースなど、置換セルロースを用いる必要はなく、通常の無置換セルロースを原料として用いることができる。

セルロースの分子量は特に制限されないが、重合度としては１０００以下であることが好ましい。重合度が１０００以下であれば、アルカリ水溶液への分散性・膨潤性が高くなり、好ましい。また重合度が１０以上であれば、得られる多孔質セルロースビーズの機械的強度が大きくなるため好ましい。より好ましい重合度の範囲は５０以上５００以下、さらに好ましくは１００以上４００以下、特に好ましくは２００以上３５０以下、最も好ましくは２５０以上３５０以下である。

本発明方法で用いるセルロースとしては、そのメジアン粒径が１０μｍ以上、５００μｍ以下のものを用いることが好ましい。本発明方法ではセルロースを溶解しなくてもよいため、溶解性向上のためセルロースを特殊な方法で粉砕する必要が無い。また、セルロースを過剰に粉砕すると、全体の製造効率が低下する。即ち、従来、セルロースを低温アルカリ水溶液に溶解するために爆砕処理や湿式粉砕などによりセルロースを極端に微細化することが行われていたが、これらの処理は製造コストを上げる原因となる。よって、原料セルロースのメジアン粒径は、１０μｍ以上が好ましい。また、メジアン粒径が１０μｍ以上であれば、セルロース分散液中にダマが発生し難くなるという効果もある。一方、当該メジアン粒径が過剰に大きなセルロースを用いると、安定的な分散液が得られず、ひいては多孔質セルロースビーズを良好に製造できない場合があり得るので、当該メジアン粒径としては５００μｍ以下が好ましい。当該メジアン粒径としては、１５μｍ以上がより好ましく、２０μｍ以上がさらに好ましく、４５μｍ以上が特に好ましく、また、２００μｍ以下がさらに好ましい。

その他、溶解性が向上されたセルロースの例としては、溶解パルプを挙げることができる。溶解パルプは本発明のセルロース分散液を作製するのに適した原料であることを否めないが、従来から知られているように、溶解パルプを得るためには環境負荷が大きい製法を採る場合が多く、また現在では、セルロース関連産業の構造上の問題のせいか、多孔質セルロースビーズを製造するための原料としては非常に入手困難な原料であることを本発明者らは知るに至っている。本発明方法では、溶解パルプを使用しなくても、多孔質セルロースビーズを良好に製造することができる。即ち本発明では、全体的な製造コストや製造効率から、一般的に入手容易なセルロースを用いることが好ましい。

アルカリ水溶液とセルロースとの混合条件に特に限定は無い。例えば、アルカリ水溶液へセルロースを加えてもよいし、セルロースへアルカリ水溶液を加えてもよい。予めアルカリ水溶液を低温に調節してからセルロースを投入することが好ましい。

セルロースは、アルカリ水溶液と混合する前に、水へ懸濁しておいてもよい。それにより、セルロースのダマの発生を抑制でき、セルロース分散液の作製に要する時間を短縮でき、また、より均一なセルロース分散液が得られ易い。当該懸濁液におけるセルロースの割合は適宜調整すればよいが、例えば、１重量％以上、４０重量％以下とすることができる。

アルカリ水溶液と混合する前に、セルロースまたはセルロース懸濁液の温度をアルカリ水溶液と同様に、低温に調節しておくことも好ましい。この際、アルカリ水溶液と、セルロースまたはセルロース懸濁液の温度は、同温度でなくてもよい。

セルロースまたはセルロース懸濁液を加えるべきアルカリ水溶液、および、アルカリ水溶液を加えるセルロース懸濁液は、攪拌しておくことが好ましい。この際の攪拌動力Ｐｖ値としては、０．０１ｋＷ／ｍ³以上、１００ｋＷ／ｍ³以下が好ましい。当該攪拌動力が０．０１ｋＷ／ｍ³以上であれば、両者を効率的に混合することが可能になる。また、当該攪拌動力が過剰に高いと、かえって混合し難くなるおそれがあり得るので、当該攪拌動力としては１００ｋＷ／ｍ³以下が好ましい。

また驚くべきことに、セルロースを水に懸濁して低温に調節した後、攪拌しながらアルカリ水溶液を添加すると、均一なセルロース分散液が瞬時に調製できることを本発明者らは見出しており、特にこの方法を好ましく用いることができる。このとき、添加するアルカリ水溶液が低温であることがより好ましい。セルロース分散液の作製中および貯蔵中も低温に保持しておくことが好ましい。当該温度は、アルカリ水溶液で説明した温度と同様にすることができる。

またセルロース分散液中のセルロースの濃度は１〜１０重量％であることが好ましい。１重量％以上であれば、得られる多孔質ビーズの機械的強度が大きくなるため好ましく、１０重量％以下であれば、セルロース分散液の粘度が低く、また分散・膨潤できない部分が少なくなるため、好ましい。より好ましくは３〜１０重量％、さらに好ましくは４〜８重量％、特に好ましくは５〜７重量％、最も好ましくは５〜６重量％である。なお、このセルロース分散液中のセルロース濃度は、分散・膨潤しきれず均一にならなかった分を含めない。

（２） エマルションの調製工程
セルロース分散液は、分散媒に分散することによりエマルションを作製した後、当該エマルションを凝固溶媒に接触させてもよい。かかるエマルションの調製は任意であるが、当該工程を経ることによって、セルロース含量が比較的多いセルロース分散液から多孔質セルロースビーズを得られ易くなり、また、機械的強度の高い多孔質セルロースビーズが得られ易くなる。

分散媒に特に限定は無く、セルロース分散液と相溶性が低いものであれば、好適に用いることができる。例えば、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）等の食用油；パーム油、ヤシ油、スクワランなどの天然油；イソステアリルアルコールやオレイルアルコールなどの高級アルコール；２−オクチルドデカノールなどの高級エステル；ジクロロベンゼンなどの親油性有機溶媒などを用いることができる。また、分散媒には、ソルビタンラウレート、ソルビタンステアレート、ソルビタンオレエート、ソルビタントリオレエートなどのソルビタン脂肪酸エステルなどの界面活性剤を適量添加してもよい。

分散媒の使用量は、セルロース分散液の液滴を十分に分散できる量とすればよい。例えば、セルロース分散液に対して１質量倍以上とすることができる。一方、分散媒の量が多過ぎると廃液量が過剰に増えるおそれがあり得るので、当該割合としては１０質量倍以下が好ましい。当該割合としては、２質量倍以上がより好ましく、４質量倍以上がより好ましく、また、８質量倍以下がより好ましく、７質量倍以下がさらに好ましく、６質量倍以下が特に好ましい。

分散時の温度はセルロース分散液と同等に調節しておくことが好ましい。即ち、分散媒の温度や、分散媒とセルロース分散液との混合時における温度、分散媒中へセルロース分散液を分散させる際の温度は、アルカリ水溶液と同様に低温にすることが好ましい。

エマルションを調製する際は、通常、攪拌した分散媒へセルロース分散媒を加えることが好ましい。この際の攪拌動力Ｐｖ値としては、０．１ｋＷ／ｍ³以上、１２ｋＷ／ｍ³以下が好ましい。当該攪拌動力が０．１ｋＷ／ｍ³以上であれば、良好な真球性と細孔特性を得られ易い。また、当該攪拌動力が過剰に高いとエマルションの流動状態が安定し難くなるおそれがあり得るので、当該攪拌動力としては１２ｋＷ／ｍ³以下が好ましい。当該攪拌動力としては、１．１Ｗ／ｍ³以上がより好ましく、３．１Ｗ／ｍ³以上がさらに好ましく、５．５Ｗ／ｍ³以上が特に好ましい。

（３） 凝固工程
次に、セルロース分散液を凝固溶媒に接触させることにより、セルロースを多孔質化する。

本発明の凝固溶媒には特に限定は無く、セルロース分散液と接触してセルロースビーズが得られるものであれば、好適に用いることができる。中でも水とアルコールはセルロース分散液の良溶媒であるアルカリ水溶液との親和性が高く、好適に用いることができる。特にアルコールを用いると、水を用いた場合に比べてセルロースビーズの孔を小さくできるため好ましい。またアルコールを用いると真球性が向上するため好ましい。また水とアルコールの混合溶媒を用いると、混合比によってセルロースビーズの孔の大きさを任意に調整できるため、より好ましい。本発明に用いることができるアルコールには特に限定は無いが、炭素数６以下のアルコールがアルカリ水溶液との親和性が高いため好ましく、炭素数４以下がより好ましく、最も好ましいのはメタノールである。また、凝固溶媒は、アルコール水溶液であってもよい。

また本発明の凝固溶媒は酸性であることも好ましい。凝固溶媒が酸性であれば、アルカリ水溶液を中和できるため好ましい。この中和が早く行なえると、得られるセルロースビーズへの化学的ダメージが軽減されるため好ましい。また、驚くべきことに、本発明者らは凝固溶媒を酸性とすることによって、得られる多孔質ビーズの細孔径分布が狭くなることを見出しており、こういった細孔径特性が所望される場合、凝固溶媒を酸性にしておくことが特に好ましい。酸性にするための薬剤には特に限定は無く、硫酸、塩酸などの無機酸や、酢酸、クエン酸、酒石酸などの有機酸や、リン酸、炭酸などの緩衝効果を持つものなど、幅広く用いることができる。なお、凝固溶媒が酸性であるとは、凝固溶媒のｐＨが７．０未満であることをいう。当該ｐＨとしては、５．０以下が好ましく、４．０以下がより好ましく、３．０以下がさらに好ましく、２．０以下が特に好ましい。なお、当該ｐＨの下限は特に制限されないが、０．０以上であることが好ましい。

凝固溶媒の使用量は特に制限されず、適宜調整すればよい。例えば、セルロース分散液に対して０．００１倍体積以上、１００倍体積以下程度とすることができる。また、エマルションに対しては、０．０１倍体積以上、１０倍体積以下程度とすることができる。これら範囲内であれば、多孔質セルロースビーズを得られやすい。また、良好な細孔や表面孔が得られやすい。凝固溶媒の使用量としては、エマルションに対して０．０２５倍体積以上がより好ましく、０．０５倍以上がさらに好ましく、０．０７倍以上が特に好ましく、また、０．４倍体積以下がより好ましく、０．２倍体積以下がさらに好ましく、０．１５倍体積以下が特に好ましい。上記使用量は、通常考えられる凝固溶媒量に比べてかなり少ないが、本発明者らは、驚くべきことに、本発明方法によれば凝固溶媒の使用量を低減しても多孔質セルロースビーズを良好に得られることを見出した。

前記凝固溶媒の温度については特に限定は無いが、凝固溶媒中でセルロース分散液が凍結し、その後融解すると、セルロースビーズが変形したり、セルロースが破砕しやすくなるため、前記セルロース分散液が凍結しない温度であることが好ましい。また、凝固溶媒の温度は前記セルロース分散液の温度以上であることが好ましい。通常、凝固溶媒は、凝固速度を速める等の効果から、セルロース分散液より低温であるが、本発明者らは驚くべきことに、凝固溶媒の温度をセルロース分散液の温度以上にした方が凝固が速く進行することを見出した。具体的な温度については特に限定は無いが、凝固溶媒の温度は０℃以上、１５０℃以下であることが好ましく、より好ましくは２５℃以上、１００℃以下、さらに好ましくは４５℃以上、８０℃以下であるが、凝固溶媒の沸点等を鑑みて、適切に調整することが好ましい。なお、セルロース分散液の温度は、エマルションを使用する場合ではエマルションの温度をいうものとする。

前記セルロース分散液またはエマルションと凝固溶媒の接触方法に特に限定はなく、気相法など従来公知の造粒方法を用いることができる。例えば、セルロース分散液またはエマルションを攪拌しておき、そこへ凝固溶媒を添加すればよい。気相法としては、例えば、特許文献２の実施例１として記載の振動法を挙げることができる。

セルロース分散液またはエマルションと凝固溶媒を接触させる際、攪拌しながら接触させることが、得られるビーズの真球性の観点から好ましい。攪拌条件に特に限定は無いが、接触時のＰｖ値（単位体積あたりの動力）が、良好な真球性と細孔特性を得られやすいことから、０．１ｋＷ／ｍ³以上であることが好ましい。より好ましくは１．１ｋＷ／ｍ³以上であり、特に好ましくは３．１ｋＷ／ｍ³以上であり、最も好ましくは５．５ｋＷ／ｍ³以上、１２ｋＷ／ｍ³以下である。１２ｋＷ／ｍ³を超えると、接触時の流動状態が安定し難くなる場合がある。これらＰｖ値は比較的ソフトな材質であるセルロースを用いた多孔質ビーズの製造方法としては、考えられないほど大きい範囲を含んでおり、ビーズの破砕等の問題が大いに懸念されるべきであるが、驚くべきことに、本発明者らはむしろＰｖ値をこれらの範囲にすれば、良好な真球性と細孔特性を有する多孔質セルロースビーズを得られる場合があり、本発明に好ましく用いることができることを見出した。

セルロース分散液またはエマルションへの凝固溶媒の添加所要時間は特に限定は無く、適宜調整すればよいが、１５０秒以内であることが好ましい。理由は定かではないが、驚くべきことに、当該時間が１５０秒以内であれば、得られる多孔質セルロースビーズの強度が向上する。その結果、多孔質セルロースビーズをカラムに充填して通液した際、高線速下でも圧密化が発生し難くなる。当該時間としては、６０秒以内がより好ましく、４０秒以内がさらに好ましく、２秒以内が特に好ましい。一方、当該時間が短過ぎるとセルロースの多孔質化が局所的に発生するおそれがあるので、当該時間としては０．１秒間以上が好ましい。なお、セルロース分散液またはエマルションへの凝固溶媒の添加所要時間とは、凝固溶媒の添加開始から添加完了までに要する時間をいうものとする。

（４） 架橋工程
上記方法により得られる多孔質セルロースビーズの強度をさらに高めるため、架橋剤を用いて強度をさらに向上させることが可能である。架橋されている多孔質セルロースビーズは特に強度に優れているため、高線速下や高圧力下の使用にも耐えることができる。なお、本工程は任意である。

架橋方法としては特に限定は無く、従来公知の方法を用いることができる。架橋剤や架橋反応条件に特に限定は無く、公知の技術を用いて行うことができる。例えば、架橋剤としては、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリンなどのハロヒドリン；２官能性ビスエポキシド（ビスオキシラン）；多官能性ポリエポキシド（ポリオキシラン）を挙げることができる。なかでも、特開２００８―２７９３６６に示される方法を特に好適に用いることができる。本発明者らは特開２００８―２７９３６６に示される方法をさらに発展させ、架橋反応を促進するアルカリ水溶液を分割添加することにより、さらに強度が向上することを見出しており、本発明における最も好適な架橋方法として用いることができる。これら公報は、本願に参考文献として援用される。

上記セルロース分散液の調製工程、エマルションの調製工程および凝固工程においては、攪拌操作を用いることが好ましい。このうち少なくとも一つ以上の工程における攪拌操作がパドル翼やタービン翼のような剪断力の大きい攪拌翼を用いて行なわれていることが好ましい。これらの攪拌翼を用いるとより好ましい工程は、エマルションの調製工程と凝固工程であり、最も好ましくは凝固工程である。常識的に考えれば、凝固工程において、剪断力の大きい攪拌翼を用いると、比較的ソフトな材質であるセルロースを用いた多孔質ビーズは破砕等のおそれがあるので、通常このような攪拌翼を用いることは考えられないが、本発明者らはむしろ、これら剪断力が大きい攪拌翼を用いると、理由は定かではないが、驚くべきことに、良好な真球性と細孔特性を有する多孔質セルロースビーズを得られる場合が多いことを見出した。また前述の常識外れなＰｖ値と組み合わせても、驚くべきことに良好な多孔質セルロースビーズが得られることも見出した。本発明に用いることができる剪断力の大きい攪拌翼としては特に限定は無いが、パドル翼、タービン翼を挙げることができる。なかでも傾斜パドル翼、傾斜パドル翼、ディスクタービン翼等を好適に用いることができる。また複数、複数種の翼を組み合わせて使うことも好ましい。また傾斜翼を用いる場合は、例えば、容器の下側は掻き揚げ、上側はかき下げといったような使い分けをすることも好ましい。また、エマルションの調製工程においては、常識的には大型翼を用いることが分散の均一性や粒度分布のシャープさといった点から好ましいとされているが、驚くべきことに、本発明者らは小型翼（例えば、パドル翼やタービン翼）を用いる方が、得られる多孔質セルロースビーズの粒度分布がシャープで、しかも真球性が高いことから、好ましいことを見出している。

本発明方法で製造された多孔質セルロースビーズは、着色が抑制されており、且つ機械的強度が高い。よって、特定のタンパク質などを結合させ、血液接触材料などとして利用することができる。

また、本発明方法によれば、毒性や腐食性が高い副原料を使わず、工業的に不利である煩雑な工程を経ることなく、上記のような高品質の多孔質セルロースビーズを製造することができる。また、条件によっては、多孔質セルロースビーズの真球度を高めたり、細孔を調整することも可能である。

本願は、２０１１年３月８日に出願された日本国特許出願第２０１１−０５０７１４号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１１年３月８日に出願された日本国特許出願第２０１１−０５０７１４号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。

以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

先ず、製造された多孔質セルロースビーズの物性の試験方法につき説明する。

試験例１ 表面孔径の測定
各実施例で得られた多孔質セルロースビーズを５倍体積量の３０％エタノールで洗浄し、多孔質セルロースビーズに含まれる液体部分を３０％エタノールで置換した。次いで、５０％エタノール、７０％エタノール、９０％エタノール、特級エタノール、特級エタノール、特級エタノールを順に用いて多孔質セルロースビーズを同様に処理し、液体部分をエタノールで置換した。さらにｔ−ブチルアルコール／エタノールが３／７の混合液を用いて多孔質セルロースビーズを同様に処理した。次いで、ｔ−ブチルアルコール／エタノール＝５／５、７／７、９／１、１０／０、１０／０、１０／０の混合液を用いて多孔質セルロースビーズを処理し、液体部分をｔ−ブチルアルコールで置換した後、凍結乾燥した。凍結乾燥を行なった多孔質セルロースビーズに蒸着処理を行い、２万５千倍のＳＥＭ像を撮影した。得られたＳＥＭ像からアメリカ国立衛生研究所製のソフトウェア・ＩｍａｇｅＪを用いて表面孔径を計測した。

試験例２ 最大細孔径の測定
（１） カラム充填
多孔質セルロースビーズをＲＯ水に分散させ、１時間脱気した。脱気した多孔質粒子を、線速１０５ｃｍ／ｈでカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製Ｔｒｉｃｏｒｎ １０／３００）に充填した。その後、ｐＨ７．５の溶出液（１２９ｍＬ）を線速２６ｃｍ／ｈでカラムに通液した。

（２） マーカー添加
マーカーとして次のものを用いた。

・Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＩｎｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ社製）
・Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ３，０００，０００
・Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ６６０，０００
・フェリチン（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ４４０，０００
・Ａｌｄｏｌａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ１５８，０００
・ＩｇＧ ヒト由来（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ１１５，０００（参考例１には不使用）
・Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｗａｋｏ社製），ＭＷ６，７００
・Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ（Ｗａｋｏ社製），ＭＷ１２，４００
・Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ （Ｗａｋｏ社製），ＭＷ１，４００
前記溶出液を線速２６ｃｍ／ｈでカラムに通液しながら、上記マーカーをｐＨ７．５のバッファーにて５ｍｇ／ｍＬに薄めたものを、各々１２μＬずつ注入した。なお、マーカーの濃度は都度微調整した。

（３） 測定
測定器として、ＤＧＵ−２０Ａ３、ＳＣＬ−１０Ａ、ＳＰＤ−１０Ａ、ＬＣ−１０ＡＤ、ＳＩＬ−２０ＡＣ、ＣＴＯ−１０ＡＣ（それぞれＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用い、測定ソフトウェアとして、ＬＣＳｏｌｕｔｉｏｎを用いた。液量測定には５０ｍＬメスシリンダーを用いた。

マーカー注入と同時にＵＶモニターおよび液量の測定を開始し、
１）ブルーデキストランの最初のピークに対応する液量をＶ₀（ｍＬ）とした。

２）各マーカーのピークに対応する液量をＶ_R（ｍＬ）とした。

３）カラム内の多孔質粒子のトータルボリュームをＶ_t（ｍＬ）とした。

（４） 算出
各マーカーの分配係数（Ｋ_av）を次式で算出した。

Ｋ_av＝（Ｖ_R−Ｖ₀）／（Ｖ_t−Ｖ₀）
（５）最大細孔径の算出
各マーカーのＫ_avと分子量の対数をプロットし、直線性を示す部分から下記式の傾きと切片を求めた。

Ｋ_av＝ｋ×Ｌ_n（分子量）＋ｂ

次いで、求めた傾きと切片からＫ_avが０の時の分子量、つまり排除限界分子量を求めた。次に、中性緩衝液中の球状タンパク質の直径と分子量の下記相関式に排除限界分子量を代入し、求まった値を試料粒子の細孔の最大径とした。

球状タンパク質の中性緩衝液中の直径（Å）＝２．５２３×分子量^0.3267

試験例３ 平均細孔径の算出
上記試験例２（５）において、直線性を示す部分の最大Ｋ_av／２に相当する分子量を前記中性緩衝液中の球状タンパク質の直径と分子量の相関式に代入し、求まった値を多孔質セルロースビーズの細孔の平均径とした。

なお、試験例２および試験例３において、吸着体の目的吸着物質に対するＫ_avを測定する場合、目的吸着物質が吸着されてしまい、正確な測定ができなくなるおそれがある。よって、吸着体の目的吸着物質に対するＫ_avは、目的吸着物質と近い分子量を有する２種以上のタンパク質のＫ_avを測定し、それらのデータから計算で求めた。例えば、目的吸着物質がＩｇＧの場合、フェリチンとアルブミンのデータからＫ_avを求めた。

試験例４ メジアン粒径の測定
レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置（堀場社製ＬＡ−９５０）を用いて、多孔質セルロースビーズの体積基準の粒度分布を測定し、メジアン粒径を求めた。

試験例５ 強度評価
ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １０Ｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに２２μｍのメッシュを取り付け、多孔質セルロースビーズをそれぞれ３ｍＬ入れ、線速４５０ｃｍ／ｈで２０％エタノール水溶液（和光純薬工業社製エタノールと蒸留水で調製）を１時間通液して充填した。次いでｐＨ７．４リン酸バッファー（シグマ製）を任意の線速で通液し、圧密化がおきる線速を求めて強度評価とした。

実施例１
（１） アルカリ水溶液Ａの作製
和光純薬社製の水酸化ナトリウムと蒸留水を用いて、９重量％の水酸化ナトリウム水溶液を作製し、その温度を４℃に調整した。

（２） セルロース分散液Ａの作製
４℃に調整した前記アルカリ水溶液Ａを４℃に保持したまま攪拌し、次いで４℃の環境に２時間静置したＪｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ社製微結晶性セルロース（メジアン粒径：７１μｍ）を投入し、セルロースが５重量％となるよう、少しずつ添加した。添加完了から４℃を保持したまま２時間攪拌を継続し、セルロースが均一に分散・膨潤したセルロース分散液を作製し、４℃で貯蔵した。得られたセルロース分散液の写真を図１（１）に示す。

（３） 多孔質セルロースビーズの作製
中鎖脂肪酸トリグリセリド（理研ビタミン社製アクターＭ−２）８５ｍＬを４℃、３００ｒｐｍで攪拌し、セルロース分散液Ａ１５ｍＬをこれに加え、４℃、３００ｒｐｍで１５分間攪拌した。得られた分散液を５０℃、３００ｒｐｍに調整した３００ｍＬの９０％メタノール水溶液に添加し、５０℃、３００ｒｐｍで１０分間攪拌した。吸引濾過を行なった後、エタノールを７５ｍＬ用いて洗浄を行い、次いで１５０ｍＬの水で洗浄を行い、多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズの表面孔径のメジアン径は７４７Åであった。このように、従来、セルロースが溶解しておらず、多孔質セルロースビーズの製造では用いられないと考えられていたセルロース分散液からでも、良好な物性を有する多孔質セルロースビーズを製造することができた。

実施例２
凝固溶媒に１．２Ｍクエン酸水溶液（和光純薬社製クエン酸一水和物と蒸留水にて作製）を用い、凝固溶媒の温度を７５℃とした以外は、実施例１と同様の方法で多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズの表面孔径のメジアン径は１０５７Åであった。

実施例３
凝固溶媒にメタノールと１．２Ｍクエン酸水溶液を９：１で混合した溶液を用いた以外は、実施例１と同様の方法で多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズの表面孔径のメジアン径は９３２Åであった。

実施例４
凝固溶媒にメタノールと和光純薬社製硫酸を８：２で混合した溶液を用いた以外は、実施例１と同様の方法で多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズの表面孔径のメジアン径は１２９８Åであった。

実施例５
（１） セルロース分散液Ｂの作製
セルロースを６重量％とした以外は、実施例１（２）のセルロース分散液Ａと同様に作製した。

（２） 多孔質セルロースビーズの作製
和光純薬社製オルトジクロロベンゼン８２ｍＬに和光純薬社製ソルビタンモノオレエート（ｓｐａｎ８０相当品）１．１５ｇを加え、４℃、３３０ｒｐｍで攪拌し、セルロース分散液Ｂ１８ｍＬをこれに加え、４℃、３３０ｒｐｍで１５分間攪拌した。得られたエマルションを５５℃、３００ｒｐｍに調整した３００ｍＬのメタノールに添加し、５５℃、３００ｒｐｍで１０分間攪拌し凝固させた。吸引濾過を行なった後、メタノール７５ｍＬを用いて洗浄を行い、次いで１５０ｍＬの水で洗浄を行い、多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズの表面孔径のメジアン径は６６７Åであった。

実施例６
凝固溶媒をエタノールに変更した以外は実施例５と同様の方法でセルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズの表面孔径のメジアン径は４５３Åであった。

比較例１
（１） セルロース溶液の作製
４℃に調整した実施例１（１）のアルカリ水溶液Ａを４℃に保持したまま攪拌し、次いで４℃の環境に２時間静置したＪｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ社製微結晶性セルロース（メジアン粒径：７１μｍ）を投入し、セルロースが９重量％となるよう、少しずつ添加した。添加完了から４℃を保持したまま２時間攪拌を継続し、セルロースが均一に分散・膨潤させ、−２０℃で完全に凍結させた。次いで４℃で融解し、体積が１．５倍になるように蒸留水で希釈し、攪拌を行い均一化した後、４℃で貯蔵した。得られたセルロース溶液を、図１（２）に示す。

（２） 多孔質セルロースビーズの作製
セルロース分散液Ｂの代わりに上記セルロース溶液を用いた以外は、実施例６と同様の方法で多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズの表面孔径のメジアン径は５０２Åであった。

比較例２
比較例１（１）のセルロース溶液を用いて、凝固溶媒を５５℃のメタノールから４℃の６０％メタノールに変更し、凝固溶媒の温度を４℃とした以外は実施例５と同様に多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズの表面孔径のメジアン径は４５１Åであった。

比較例３
凝固溶媒量を５．４ｍＬとし、凝固溶媒をメタノールとした以外は、比較例２と同様に多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズの表面孔径のメジアン径は５３１Åであった。

比較例１〜３のとおり、セルロース分散液を凍結した後に融解することによってセルロース溶液を調製し、当該溶液と凝固溶媒を接触させても、多孔質セルロースビーズは得られた。しかし、分散液の凍結と融解にはエネルギーや時間がかかり、工業的な大量生産には適さない。一方、本発明方法によれば、凍結工程と融解工程を経なくても、同様の多孔質セルロースビーズを製造することができる。

実施例７
エマルション調製時の温度を５５℃とし、凝固溶媒量を７．２ｍＬとした以外は、実施例５と同様に多孔質セルロースビーズを作製した。

実施例８
凝固溶媒を６０％メタノールとした以外は実施例７と同様に多孔質セルロースビーズを得た。

実施例９
凝固溶媒を蒸留水とした以外は実施例７と同様に多孔質セルロースビーズを得た。

実施例１０
凝固溶媒をエタノールとした以外は実施例７と同様に多孔質セルロースビーズを得た。

実施例１１
（１） アルカリ水溶液Ｂの作製
和光純薬社製の水酸化ナトリウムと蒸留水を用いて、３３重量％の水酸化ナトリウム水溶液を作製し、４℃に調整した。

（２） セルロース分散液Ｃの作製
旭化成ケミカルズ社製局方セルロースＰＨ−Ｆ２０ＪＰ（メジアン粒径：２１μｍ）９．２重量部と蒸留水１０４重量部を混合し、攪拌しながら４℃に調整した。次いで攪拌しながら４℃に調整したアルカリ水溶液Ｂを４０重量部投入し、３０分間４℃で攪拌した。

（３） 多孔質セルロースビーズの作製
４℃に調整されたセルロース分散液Ｃ１５４重量部と、４℃に調整されたオルトジクロロベンゼン７７６重量部と、４℃に調整されたソルビタンモノオレエート（ｓｐａｎ８０相当品）７．８重量部を混合し、ディスクタービン翼２枚を取り付けたセパラブルフラスコ内で３００ｒｐｍ（Ｐｖ値：０．２ｋＷ／ｍ³）で４℃、３０分間攪拌し、エマルションを作製した。温度と攪拌を維持しながら４℃に調整されたメタノール５７重量部を凝固溶媒として加えた。この時の凝固溶媒の体積はエマルションに対して０．１倍であった。また凝固溶媒の添加所要時間は２秒であった。その後、攪拌数と温度を維持しながら２０分間攪拌した。吸引濾過を行なった後、洗浄液としてエタノール２４０重量部を用いて洗浄を行い、次いで５００重量部の水で洗浄を行い、多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズを、３８μｍと９０μｍの篩を用いて湿式分級した。

（４） 架橋 − 方法Ａ（特開２００８−２７９３６６参考法）
上記多孔質セルロースビーズ１１体積部に蒸留水を加えて１６．５体積部として、反応容器に移した。ここに４Ｎ ＮａＯＨ水溶液（ナカライテスク社製と蒸留水で調製）を３．８６体積部加え、４０℃に昇温させた。ここに架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテックス社製）を１．７７重量部投入し、４０℃で４時間攪拌した。反応終了後、吸引濾過をしながら、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、架橋１回ビーズを得た。

得られた架橋１回ビーズを容器に移し、蒸留水を加えて、全量を架橋多孔質ビーズの１０倍体積量とし、オートクレーブを用いて、１２０℃で１時間加温した。室温まで放冷した後、ビーズの５倍体積量以上のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化したオートクレーブ済みの架橋１回ビーズを得た。

次いで、このオートクレーブ済みの架橋１回ビーズ１１体積部に蒸留水を加えて１６．５体積部とし、反応容器に移した。これに４Ｎ ＮａＯＨ水溶液（ナカライテスク社製と蒸留水で調製）を３．８６体積部加え、４０℃に昇温させた。ここにデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテックス社製）を１．７７重量部投入し４０℃で４時間攪拌した。反応終了後、吸引濾過しながら、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、架橋２回ビーズを得た。

得られた架橋２回ビーズを容器に移し、蒸留水を加えて、全量を架橋多孔質ビーズの１０倍体積量とし、オートクレーブを用いて１２０℃で６０分間加温した。室温まで放冷した後、ビーズの５倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、オートクレーブ済みの架橋２回ビーズを得た。

（５） 物性試験
上記架橋ビーズのメジアン粒径は７５μｍであった。また、平均細孔径は２１５Å、最大細孔径は１７５６Åで、排除限界分子量は５．０×１０⁸であった。

実施例１２
凝固溶媒を１５重量％クエン酸一水和物メタノール溶液とした以外は実施例１１と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍ、平均細孔径は１９０Å、最大細孔径は７１８Åで、排除限界分子量は３．２×１０⁷であった。

実施例１３
（１） 多孔質セルロースビーズの作製
攪拌速度を５００ｒｐｍ（Ｐｖ値：１．１ｋＷ／ｍ³）とし、９０μｍの篩を６３μｍの篩に変更した以外は、実施例１１と同様に、多孔質セルロースビーズを作製した。

（２） 架橋 − 方法Ｂ
上記多孔質セルロースビーズ２０体積部に蒸留水を加えて３０体積部とし、反応容器に移した。ここに架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテックス社製）を２．３重量部投入し、４０℃に調整しながら攪拌を続けた。４０℃に到達後、３０分間攪拌した。次いで、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液（ナカライテスク社製と蒸留水で調製）７．１体積部を用意し、１時間に１／４ずつ加えた。この間、温度を４０℃に維持し、攪拌も継続した。最後の１／４量を添加後、同温度で１時間攪拌した。反応終了後、吸引濾過をしながら、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、架橋１回ビーズを得た。

得られた架橋１回ビーズを容器に移し、蒸留水を加えて、全量を架橋多孔質粒子の１０倍体積量とし、オートクレーブを用いて、１２０℃で１時間加温した。室温まで放冷した後、ビーズの５倍体積量以上のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化したオートクレーブ済みの架橋１回ビーズを得た。

次いで、このオートクレーブ済みの架橋１回ビーズ２０体積部に蒸留水を加えて３０体積部とし、反応容器に移した。ここに架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテックス社製）を２．３重量部投入し、４０℃に調整しながら攪拌を続けた。４０℃に到達後、３０分間攪拌した。次いで、２ＮＮａＯＨ水溶液（ナカライテスク社製と蒸留水で調製）７．１体積部を用意し、１時間に１／４ずつ加えた。この間、温度を４０℃に維持し、攪拌も継続した。最後の１／４量を添加後、同温度で１時間攪拌した。反応終了後、吸引濾過をしながら、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、架橋２回ビーズを得た。

得られた架橋２回ビーズを容器に移し、蒸留水を加えて、全量を架橋多孔質粒子の１０倍体積量とし、オートクレーブを用いて１２０℃で６０分間加温した。室温まで放冷した後、ビーズの５倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、オートクレーブ済みの架橋２回ビーズを得た。

（３） 物性試験
上記架橋ビーズのメジアン粒径は５６μｍであった。また、平均細孔径は３３６Å、最大細孔径は３４００Åで、排除限界分子量は３．８×１０⁹であった。このビーズは線速３０５７ｃｍ／ｈでも圧密化しなかった。

実施例１４
凝固溶媒を１５重量％クエン酸一水和物エタノール溶液とした以外は実施例１１と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍ、平均細孔径は１６３Å、最大細孔径は１０４０Åで、排除限界分子量は１．０×１０⁸であった。

実施例１５
凝固溶媒量を２８重量部とした以外は実施例１１と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍ、平均細孔径は２３２Å、最大細孔径は１４１９Åで、排除限界分子量は２．６×１０⁸であった。

実施例１６
６３μｍの篩を９０μｍの篩に変更した以外は、実施例１３と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍであった。このビーズは装置で通液可能な最大線速である３０５７ｃｍ／ｈでも圧密化しなかった。

実施例１７
攪拌速度を７００ｒｐｍ（Ｐｖ値：３．１ｋＷ／ｍ³）とした以外は、実施例１６と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍであった。このビーズは線速３０５７ｃｍ／ｈでも圧密化しなかった。

実施例１８
攪拌速度を２５０ｒｐｍ（Ｐｖ値：０．１ｋＷ／ｍ³）とした以外は、実施例１６と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍ、平均細孔径は１３０Å、最大細孔径は５６２Åで、排除限界分子量は１．５×１０⁷であった。

実施例１９
攪拌翼をＷＨ型大型翼１枚とし、攪拌速度を３５０ｒｐｍ（Ｐｖ値：１．１ｋＷ／ｍ³）とした以外は、実施例１６と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。造粒直後の粒度分布は、実施例１６と比べて広かった。

実施例２０
凝固溶媒の添加所要時間を６０秒とした以外は、実施例１６と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍであった。

実施例２１
凝固溶媒の添加所要時間を１６０秒とした以外は、実施例１６と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍであった。このビーズは線速１９８７ｃｍ／ｈで圧密化した。また、カラムへの充填性が若干低下し、タンパク質は比較的早く流出した。

実施例２２
攪拌翼を傾斜パドル翼２枚とした以外は、実施例１７と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。

実施例２３
調整温度を９℃とした以外は、実施例２２と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。

実施例２４
調整温度を０℃とした以外は、実施例２２と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。

実施例２５
凝固溶媒の添加所要時間を１０秒とした以外は、実施例１６と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。

実施例２６
凝固溶媒の添加所要時間を３０秒とした以外は、実施例１６と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。

実施例２７
攪拌速度を１１８０ｒｐｍ（Ｐｖ値：１２ｋＷ／ｍ³）とした以外は、実施例１６と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。

実施例２８
攪拌速度を８００ｒｐｍ（Ｐｖ値：５．５ｋＷ／ｍ³）とした以外は、実施例１６と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。

実施例２９
分散液作製のための攪拌時間を３０分から１２０分に変更した以外は実施例１６と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。

実施例３０
（１） セルロース分散液Ｄの作製
旭化成ケミカルズ社製局方セルロースＫＧ−１０００（メジアン粒径：５４μｍ）を用いた以外は、実施例１１（２）のセルロース分散液Ｃと同様に作製した。

（２） 多孔質セルロースビーズの作製
上記セルロース分散液Ｄを用いた以外は実施例２７と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。

実施例３１
セルロース分散液Ｄを用いた以外は実施例２７と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。

実施例３１
凝固溶媒量を２２８重量部とした以外は実施例３０と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。

比較例４
和光純薬社製の水酸化ナトリウムと蒸留水を用いて、９重量％の水酸化ナトリウム水溶液を作製し、２５℃に調整した。２５℃に調整した前記水酸化ナトリウム水溶液を２５℃に保持したまま攪拌し、次いで２５℃の環境に２時間静置したＪｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ社製微結晶性セルロースを投入し、セルロースが５重量％となるよう、少しずつ添加した。添加完了から２５℃を保持したまま２時間攪拌を継続し、２５℃で貯蔵を行なったところ、セルロース粒子が沈降してしまい、セルロース分散液は得られなかった。また黄色に着色した。

比較例５
（１） セルロース溶液の作製
１００ｇのチオシアン酸カルシウム６０重量％水溶液に６．４ｇの結晶性セルロース（旭化成ケミカルズ社製セオラスＰＨ１０１，メジアン粒径：７３μｍ）を加え、１２０℃に加熱して溶解した。この温度で貯蔵することが困難なため、用時調整とした。

（２） 架橋多孔質セルロースビーズの作製
チオシアン酸カルシウムを用いて作製される多孔質セルロースビーズを、ＷＯ２０１０／０９５５７３の実施例を参考に、以下のように作製した。具体的には、上記セルロース溶液に界面活性剤としてソルビタンモノオレエート６ｇを添加し、１４０℃に予め加熱したオルトジクロロベンゼン４８０ｍＬ中に滴下し、３００ｒｐｍにて攪拌した。次いで上記分散液を４０℃まで冷却し、メタノール１９０ｍＬ中に注ぎ、凝固させた。吸引濾過を行なった後、メタノール１９０ｍＬにて洗浄した。このメタノール洗浄を数回行なった。さらに大量の蒸留水で洗浄した後、吸引濾過を行い多孔質セルロースビーズを得た。濾過後の多孔質セルロースビーズ１００ｇを１２１ｇの蒸留水に６０ｇの硫酸ナトリウムを溶解した液に加え、５０℃で２時間攪拌した。次いで、４５重量％の水酸化ナトリウム水溶液３．３ｇと水素化ホウ素ナトリウム０．５ｇを加えて攪拌した。５０℃で攪拌を継続しながら、４５重量％の水酸化ナトリウム水溶液４８ｇとエピクロロヒドリン５０ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きに添加した。添加終了後、５０℃で１６時間反応させた。反応後、４０℃に冷却し、酢酸２．６ｇを加えて中和し、吸引濾過を行い、蒸留水で洗浄した。５３μｍと９０μｍの篩を用いて湿式分級を行ない、平均粒子径７８μｍの架橋された多孔質セルロースビーズを得た。

（３） 物性試験
上記架橋多孔質セルロースビーズの表面孔径は１６４９Åで、平均細孔径は７９３Å、最大細孔径は１４１００Åで、排除限界分子量は２．９×１０¹¹であった。このビーズは線速３０５７ｃｍ／ｈでも圧密化しなかった。

このように、比較例５で得られた架橋多孔質セルロースは、かなり大き過ぎる細孔を有するものであった。また、毒性の高いチオシアン酸カルシウムを含む溶液が廃液として残ってしまった。

参考例１
比較的、モノクローナル抗体の吸着量が大きいタイプとして販売されている、プロテインＡが導入された多孔質アガロースビーズ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ（ジーイーヘルスケア社製）の平均細孔径は４２５Å、最大細孔径は２９７０Åで、排除限界分子量は２．５×１０⁹であった。

Claims (15)

1. −２０℃以上、１０℃以下のアルカリ水溶液とセルロースとを混合して作製したセルロース分散液（尿素またはチオ尿素を含むものを除く）を、凝固溶媒に接触させることを特徴とする、多孔質セルロースビーズの製造方法。
2. 前記アルカリ水溶液のアルカリ濃度が５〜１５重量％であることを特徴とする、請求項１に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
3. メジアン粒径が１０μｍ以上、５００μｍ以下のセルロースを用いる請求項１または２に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
4. 前記セルロース分散液中のセルロースの濃度が１〜１０重量％である請求項１〜３のいずれか一項に記載のセルロースビーズの製造方法。
5. 前記凝固溶媒がアルコールを含有するものである請求項１〜４のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
6. 前記凝固溶媒が酸性である請求項１〜５のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
7. 前記セルロース分散液を作製・貯蔵する温度が−２０℃以上１０℃以下である請求項１〜６のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
8. 前記セルロース分散液を分散媒に分散しエマルションを作製した後、該エマルションを凝固溶媒に接触させる請求項１〜７のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
9. 前記凝固溶媒の体積がエマルションの０．０１倍〜１倍である請求項８に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
10. エマルション作製時のＰｖ値（単位体積あたりの動力）が０．１ｋＷ／ｍ³以上である請求項８または９に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
11. 前記セルロース分散液と凝固溶媒の接触時のＰｖ値（単位体積あたりの動力）が０．１ｋＷ／ｍ³以上である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
12. 前記エマルションへの凝固溶媒の添加所要時間が１５０秒以内である請求項８〜１０のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
13. 前記セルロース分散液が、水とセルロースからなる予備分散液とアルカリ水溶液とを混合させることにより調製されたものである請求項１〜１２のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
14. 少なくとも一つ以上の工程における攪拌操作がタービン翼を用いて行なわれる請求項１〜１３のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
15. 請求項１〜１４に記載の製造方法により得られた多孔質セルロースビーズをさらに架橋することを特徴とする、架橋多孔質セルロースビーズの製造方法。