JP6029366B2 - 前処理・電気泳動用一体型カートリッジ、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置及び前処理一体型キャピラリ電気泳動方法 - Google Patents

前処理・電気泳動用一体型カートリッジ、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置及び前処理一体型キャピラリ電気泳動方法 Download PDF

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Description

本発明は、例えば生体サンプルから核酸を抽出し、増幅・標識付加をする前処理から電気泳動までの全工程で使用可能な前処理・電気泳動用一体型カートリッジ、並びに、全工程を自動実行可能な前処理一体型キャピラリ電気泳動装置及び方法に関する。
遺伝子診断やDNA鑑定などの生体サンプルを遺伝子レベルで解析する手法では、一般に、(1) 生体サンプルから核酸を抽出する工程、抽出された核酸を増幅する工程、核酸に標識を付ける工程などの前処理反応を実行する段階と、(2) 前処理後の核酸の塩基配列を読み出す電気泳動の段階が順番に実行される。これらの各段階には、それぞれ複数の試薬を混合し、加熱し、分注する操作があり、解析にあたって多くの作業量が必要とされる。
そこで作業性向上などを目的として、前処理の各工程で必要になる操作を、展開液の貯蔵槽・流路などを組み入れたカートリッジ上で自動的に実行する手法が知られている（例えば特許文献１参照）。
また、核酸の電気泳動には、一般に、キャピラリ電気泳動装置が用いられる。従来のキャピラリ電気泳動装置の一例として、特許文献２に記載のものがある。
特開２００７−３３０１７９号公報 米国特許第５３６６６０８号明細書
ところが、特許文献１は、遺伝子解析の各工程を自動化する技術を記載しているが、生体サンプルから又は核酸から電気泳動を経て塩基配列を得るまでの一連の操作全体を自動化することは想定していない。このため、従来技術では、各工程で使用するカートリッジやサンプルを対応装置に載せ替える作業が必ず発生し、そのための作業が煩雑であった。
そこで、本発明は、サンプル液から核酸を抽出する段階又はその後の核酸を増幅し、標識を付ける前処理の段階から、核酸を電気泳動し塩基配列を読み出すまでの一連の操作を全自動で実行可能とする技術を提供する。
本発明は、１つ又は複数の工程から構成される前処理から電気泳動までの一連の反応に使用可能な一体型カートリッジと、当該カートリッジを使用して前処理から電気泳動までの一連の反応を１つの装置だけで実現する前処理一体型キャピラリ電気泳動装置及び方法を提供する。
本発明によれば、前処理から電気泳動までの一連の反応を１つの装置及び１つのカートリッジを用いて実行することができ、作業性の向上が期待される。前述した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
実施例１に係る前処理一体型キャピラリ電気泳動装置の構成例を示す図。 実施例１に係る前処理・電気泳動用展開液の一体型カートリッジの上面構成例を示す図。 キャピラリアレイの上面構成を示す図。 ポンプ・バッファユニットの断面構成例を示す図。 実施例１に係る前処理工程を説明する図。 核酸抽出区画の上面構成例を示す図。 ＰＣＲ区画の上面構成例を示す図。 サイクルシーケンス区画の上面構成例を示す図。 泳動区画の上面構成例を示す図。 前処理一体型キャピラリ電気泳動装置の動作手順を説明するフローチャート。 実施例２に係るカートリッジの上面構成例を示す図。 実施例４に係るカートリッジの上面構成例を示す図。
以下、図面に基づいて、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明の実施態様は、後述する実施例に限定されるものではなく、その技術思想の範囲において、種々の変形が可能である。
[実施例１]
［前処理一体型キャピラリ電気泳動装置の構成］
図１は、実施例１に係る前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００の構成を示す。前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００は、前処理から電気泳動までの一連の反応・操作を、本明細書で提案するカートリッジ２００を用いることにより、全自動で実行する装置である。カートリッジ２００の詳細については後述する。
前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００は、キャピラリアレイ４００、ポンプ・バッファユニット４５０、恒温ユニット４１０、ヒータ５００、送液ポンプ５２０、調節弁ユニット５５０、オートサンプラユニット６００、検出ユニット７００、高圧電源ユニット８００、コントローラ９００を有している。これらユニットの詳細については後述する。なお、コントローラ９００は、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００を構成する各部の動作を制御する。また、カートリッジ２００は、不図示の載置台に載置され、載置台の内部にヒータ５００が取り付けられる。
［カートリッジの構成］
本実施例で使用するカートリッジ２００は、その表面に流路や調節弁を形成した１枚の平板状の基板で構成される。本実施例では、１枚のカートリッジ２００を核酸抽出から泳動サンプルの準備までの一連の操作で使用する。各操作は、次項以降で詳細に説明する前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００の各ユニットの協働により全自動で実行される。本実施例では、１回の測定につき、原則、１枚のカートリッジ２００を使い切るものとする。
図２に、本実施例で使用するカートリッジ２００の全体構成を示す。カートリッジ２００は、大きく分けて４つの区画で構成される。生体サンプルから核酸を抽出するまでの反応に使用する核酸抽出区画２０１と、核酸の増幅と精製に使用するＰＣＲ区画２０２と、サイクルシーケンス反応により標識を核酸に付加する際に使用するサイクルシーケンス区画２０３と、キャピラリ電気泳動で使用する泳動区画２０４である。各区画の構造及び操作方法については後述する。
［キャピラリアレイの構成］
図３に、キャピラリアレイ４００の上面構成を示す。キャピラリアレイ４００は、１本以上のキャピラリ４０１を束ねた構成を有している。キャピラリ４０１は、内径が数十〜数百ミクロン、外径が数百ミクロンのガラス管で構成され、表面はポリイミド等でコーティングされている。キャピラリ４０１の内部には、電気泳動時に、サンプルに泳動速度差を与える分離媒体が充填されている。
キャピラリ４０１の一端には、キャピラリヘッド４０２が設けられる。キャピラリヘッド４０２は、キャピラリ４０１を束ねる部材である。このキャピラリヘッド４０２を通じ、ポンプ・バッファユニット４５０とキャピラリアレイ４００とが接続される。キャピラリ４０１の他端には陰極電極４０３が形成されている。陰極電極４０３は、サンプル・溶液等に接触する。なお、キャピラリヘッド４０２の近傍位置には検出部４０４が設けられている。この検出部４０４において、キャピラリ４０１内で泳動分離されたサンプルの読み取りが行われる。キャピラリ４０１が破損又は品質劣化したときは、必要に応じて取り換えられる。
［恒温ユニットの構成］
恒温ユニット４１０は、電気泳動時に、キャピラリアレイ４００の温度を設定温度に保つ機能を有している。恒温ユニット４１０は、ヒータが取り付けられた温度制御基板と断熱材とでキャピラリアレイ４００を挟み込む構成の平板状の部品である。温度制御基板には、フィードバック用の温度センサが取り付けられている。ここで、キャピラリアレイ４００の陰極電極４０３側の一端は、恒温ユニット４１０に固定されている。これにより、キャピラリヘッド４０２の先端を所望の位置に固定することができる。
［ポンプ・バッファユニットの構成］
ポンプ・バッファユニット４５０は、キャピラリアレイ４００（具体的には、個々のキャピラリ４０１）にポリマなどの分離媒体を充填するために用いられるポンプである。
図４に、ポンプ・バッファユニット４５０の詳細構造を示す。ポンプ・バッファユニット４５０は、ディスポーザ容器４５１と、容器内を密閉し内部へ圧力をかけるピストン４５２と、ディスポーザ容器４５１の先端とキャピラリアレイ４００とを接続するバルブ４５３と、バルブ４５３又はピストン４５２に固定された陽極電極４５４を有する。
陽極電極４５４の先端は、ディスポーザ容器４５１の底面（出力口の設けられた面）から内側に突き出ている。
ディスポーザ容器４５１の内部には、ピストン４５２を引いた状態（初期状態）で、分離媒体４５６が収容されている。なお、ピストン４５２の先端には薄膜４５５で囲まれた小袋が取り付けられており、その内部には陽極緩衝液４５７が充填されている。このように、ピストン４５２を引いた状態では、ディスポーザ容器４５１の内側は２つの区画に分割されている。従って、分離媒体４５６と陽極緩衝液４５７が混ざることはない。
分離媒体４５６をキャピラリアレイ４００内に充填する際には、外部から圧力を掛けてピストン４５２がディスポーザ容器４５１の内側に押し込まれる。この際、ディスポーザ容器４５１の内側には高い圧力が掛かる。これにより、分離媒体４５６がバルブ４５３を通過してキャピラリ４０１内に充填される。
電気泳動時には、さらに圧力をかけてピストン４５２をディスポーザ容器４５１のさらに内側に押し込む。この際、ピストン４５２のストローク量が一定量を超えると、陽極電極４５４の先端が薄膜４５５を突き破る。これにより、分離媒体４５６と陽極緩衝液４５７がディスポーザ容器４５１の内部で混合される。
なお、ポンプ・バッファユニット４５０においては、分離媒体４５６と陽極緩衝液４５７とが同一部品内の別領域に保存されていても良い。ただし、陽極電極４５４は、常時、陽極緩衝液４５７に接している必要がある。
［ヒータの構成］
ヒータ５００は、カートリッジ２００に保持される溶液の保温、熱サイクルなどの温度調整に用いられる。図１に示す例の場合、ヒータ５００は、カートリッジ２００の載置台の内側又は表面に配置される。例えばヒータ５００とカートリッジ２００は、固定具などで固定される。
［送液ポンプの構成］
送液ポンプ５２０は、カートリッジ２００に形成された調節弁に空気などを送り、カートリッジ内の流路・槽を加圧・減圧し、カートリッジ２００内での溶液の送液を調整する。
［調節弁ユニットの構成］
調節弁ユニット５５０は、カートリッジ２００に形成された調節弁を開閉する機構部である。
［オートサンプラユニットの構成］
オートサンプラユニット６００は、カートリッジ２００を、初期セット位置に、次に前処理反応ユニット部に、そしてキャピラリ４００のサンプル導入端に、順番に運搬するロボット装置である。
［検出ユニットの構成］
検出ユニット７００は、キャピラリアレイ４００の検出部４０４に対し、レーザやLEDなどの光源から出力された励起光７０１を照射し、キャピラリ４０１より発する散乱光７０２などを検出器７０３で検出する。検出した光は、不図示の測定装置に出力される。測定装置は、検出された散乱光７０２の信号強度に基づいてサンプルを分析する。
［高圧電源ユニットの構成］
高圧電源ユニット８００は、陽極電極４５４と陰極電極４０３に接続されており、ポリマが充填されたキャピラリ４０１に高電圧を印加することにより電気泳動を実行する。
［コントローラの構成］
コントローラ９００は、ヒータ５００と、送液ポンプ５２０と、調節弁ユニット５５０が連携して動作するように各部の動作を制御する。
［前処理から電気泳動までの動作の概要］
続いて、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置において自動的に実行される一連の動作について説明する。
（１）前処理動作
ここでは、図５を参照し、前処理の処理内容の概要を説明する。なお、前処理とは、スワブや血液などの生体サンプルから核酸を抽出し、分析用（キャピラリ電気泳動による塩基配列解析）にサンプルを処理する操作である。前処理は、大まかに３つの工程に分けることができる。核酸抽出１１００、ＰＣＲ反応１２００、サイクルシーケンス反応１３００である。なお、解析対象によっては、核酸抽出１１００とＰＣＲ反応１２００のみで前処理を終え、キャピラリ電気泳動１４００を実行する場合もある。
３つの工程は、どれも同じ手順で実行することができる。すなわち、(1)試薬とサンプルの混合１１０１、(2)反応の進行１１０２、(3)核酸と担体の吸着１１０３、(4)担体の洗浄１１０４、(5)核酸の溶出１１０５の５つである。このうち、(1)と(2)は反応の実施であり、(3)〜(5)は反応物の精製である。
以下、各段階で、コントローラ９００により実行される制御動作の内容を説明する。
（１−１）核酸抽出
核酸抽出１１００では、まず、(1)の制御動作１１０１が実行される。この制御動作１１０１では、まず、サンプルがカートリッジ２００に挿入される。サンプルは、試薬が貯蔵されている反応槽へと送液され、混合される。サンプルは例えば生体サンプルである。また、試薬は例えば細胞可溶化液、緩衝液などである。
次に、(2)の制御動作１１０２が実行される。この制御動作１１０２では、ヒータ５００により、カートリッジ２００の温度が適切な反応温度に過熱又は冷却される。この温度調整により、生体サンプルが溶解され、核酸が露出される。
続いて、(3)の制御動作１１０３が実行される。この制御動作１１０３では、溶解させたサンプルを担体槽に送液して担体と混合し、核酸を担体表面に吸着させる。次に、(4)の制御動作１１０４が実行される。この制御動作１１０４では、洗浄液が担体槽に送液され、担体に吸着している核酸以外の試薬・サンプルが洗い流される。なお、廃液は廃液槽に送液される。最後に、(5)の制御動作１１０５が実行される。この制御動作１１０５では、溶出液を担体槽に送液し、担体に吸着している核酸を回収する。
（１−２）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応１２００においても、まず、(1)の制御動作１１０１が実行される。この制御動作１１０１では、まず、核酸抽出後のサンプルが核酸抽出区画２０１からＰＣＲ区画２０２に送液される。サンプルは、試薬（プライマ、dNTP、緩衝液、酵素）が貯蔵されている反応槽へと送液され、混合される。
次に、(2)の制御動作１１０２が実行される。この制御動作１１０２では、ヒータ５００の熱サイクルにより、カートリッジ２００内の混合溶液の温度が適切な反応温度に過熱又は冷却される。この温度調整により、核酸のうち目的領域のみが増幅される。
続いて、(3)の制御動作１１０３が実行される。この制御動作１１０３では、反応産物を担体槽に送液して担体と混合し、核酸を担体表面に吸着させる。次に、(4)の制御動作１１０４が実行される。この制御動作１１０４では、洗浄液が担体槽に送液され、担体に吸着している核酸以外の試薬・サンプルが洗い流される。なお、廃液は廃液槽に送液される。最後に、(5)の制御動作１１０５が実行される。この制御動作１１０５では、溶出液を担体槽に送液し、担体に吸着している核酸を回収する。
（１−３）サイクルシーケンス反応
サイクルシーケンス反応１３００においても、まず、(1)の制御動作１１０１が実行される。この制御動作１１０１では、まず、ＰＣＲ反応後の産物がＰＣＲ区画２０２からサイクルシーケンス区画２０３に送液される。ＰＣＲ区画２０２からの産物は、試薬（プライマ、蛍光標識したdNTP、酵素、緩衝液など）が貯蔵されている反応槽へと送液され、混合される。
次に、(2)の制御動作１１０２が実行される。この制御動作１１０２では、ヒータ５００の熱サイクルにより、カートリッジ２００内の混合溶液の温度が適切な反応温度に過熱又は冷却される。この温度調整により、核酸に蛍光標識したdNTPをハイブリダイズする。
続いて、(3)の制御動作１１０３が実行される。この制御動作１１０３では、反応産物を担体槽に送液して担体と混合し、核酸を担体表面に吸着させる。次に、(4)の制御動作１１０４が実行される。この制御動作１１０４では、洗浄液が担体槽に送液され、担体に吸着している核酸以外の試薬・サンプルが洗い流される。なお、廃液は廃液槽に送液される。最後に、(5)の制御動作１１０５が実行される。この制御動作１１０５では、溶出液を担体槽に送液し、担体に吸着している核酸を回収する。すなわち、反応産物から余分な蛍光、プライマなどを除去し、核酸を回収する。核酸は、泳動区画２０４に回収される。
（２）泳動動作
泳動区画２０４に回収された核酸について、キャピラリ電気泳動１４００が実施される。
［各区画の構造と送液］
続いて、カートリッジ２００を構成する各区画内における送液手順について具体的に説明する。なお、核酸抽出区画２０１、ＰＣＲ区画２０２、サイクルシーケンス区画２０３のおおよその構成と送液のための手順は同じである。なお、カートリッジ２００は、生体サンプルが吸着し難い材料、例えば石英ガラス、PMMA、ポリカーボネートなどで構成することが望ましい。
図６に、核酸抽出区画２０１の構成例を示す。核酸抽出区画２０１は、試薬を内蔵する試薬槽２１１と、挿入した生体サンプルと試薬とを混合する反応槽２１２と、反応産物の精製に用いる担体を内蔵した担体槽２１３と、担体を洗浄する洗浄液を内蔵した洗浄液槽２１４と、担体槽から核酸以外の溶液を回収する廃液槽２１５と、担体から核酸を回収するための溶出液を内蔵した溶出液槽２１６とを有している。
試薬槽２１１は、試薬が保管された状態で運搬できるように、密閉構造を採用する。一方で、空の試薬槽２１１に対して分析直前に任意の試薬を注入し、分析しても良い。
各槽２１１〜２１６の間には、流路２４１〜２４６と、流路の開閉を調節する調節弁２３１〜２３７が設けられている。なお、流路２４６は、核酸抽出区画２０１とＰＣＲ区画２０２とを接続する流路である。この他、核酸抽出区画２０１には、送液ポンプ５２０による加圧により溶液を送液するために使用するポート２１７〜２２０と、ポート流路２２１〜２２４が形成されている。ポート流路２２１〜２２４は、ポート２１７〜２２０とそれぞれに対応する槽とを個別に接続する流路である。
調節弁２３１は、試薬槽２１１と反応槽２１２を接続する流路２４１に配置され、調節弁２３２は、反応槽２１２と担体槽２１３を接続する流路２４２に配置され、調節弁２３３は、洗浄液槽２１４と担体槽２１３を接続する流路２４３に配置され、調節弁２３４と調節弁２３５は、担体槽２１３と廃液槽２１５を接続する流路２４４に配置され、調節弁２３６は、溶出液槽２１６と担体槽２１３を接続する流路２４５に配置され、調節弁２３７は担体槽２１３とＰＣＲ区画２０２を接続する流路２４６に配置される。
担体槽２１３は、反応槽２１２、洗浄液槽２１４、廃液槽２１５、溶出液槽２１６とそれぞれ異なる流路２４２、２４３、２４４、２４５で接続されている。なお、全ての流路の流れ方向は決められており、原則として逆流を許さない。
また、試薬槽２１１、洗浄液槽２１４、廃液槽２１５、溶出液槽２１６は、それぞれポート流路２２１〜２２４を介して、ポート２１７〜２２０と接続されている。
担体槽２１３に配置される担体は、ガラスビーズ、グラスウール、多孔質ガラス等の核酸が特に吸着しやすいものが望ましい。より精製の度合いを上げる場合には、予めビオチンが付加されたプライマを反応に用い、担体槽２１３にストレプトアビジンを表面修飾しておく方法がある。洗浄液は、アルコールなどの有機溶剤を高濃度に含むものであり、担体を複数回洗浄することで担体から核酸以外の成分を取り除く。
図７に、ＰＣＲ区画２０２の構成例を示す。ＰＣＲ区画２０２は、試薬を内蔵する試薬槽２５１と、核酸抽出区画２０１の生成物と試薬とを混合し、熱サイクルを実施する反応槽２５２と、反応産物の精製に用いる担体を内蔵した担体槽２５３と、担体を洗浄する洗浄液を内蔵した洗浄液槽２５４と、担体槽から核酸以外の溶液を回収する廃液槽２５５と、担体から核酸回収するための溶出液を内蔵した溶出液槽２５６を有する。
各槽２５１〜２５６の間には、流路２８１〜２８６と、流路の開閉を調節する調節弁２７１〜２７７が設けられている。なお、流路２８６は、ＰＣＲ区画２０２とサイクルシーケンス区画２０３とを接続する流路である。この他、ＰＣＲ区画２０２には、送液ポンプ５２０による加圧により溶液を送液するために使用するポート２５７〜２６０と、ポート流路２６１〜２６４が形成されている。ポート流路２６１〜２６４は、ポート２５７〜２６０とそれぞれに対応する槽とを個別に接続する流路である。ＰＣＲ区画２０２の場合も、全ての流路の流れ方向は決められており、原則として逆流を許さない。
図８に、サイクルシーケンス区画２０３の構成例を示す。サイクルシーケンス区画２０３は、試薬を内蔵する試薬槽３１１と、ＰＣＲ区画２０２の生成物と試薬とを混合し、熱サイクルを実施する反応槽３１２と、反応産物の精製に用いる担体を内蔵した担体槽３１３と、担体を洗浄する洗浄液を内蔵した洗浄液槽３１４と、担体槽から核酸以外の溶液を回収する廃液槽３１５と、担体から核酸回収するための溶出液を内蔵した溶出液槽３１６を有する。
各槽３１１〜３１６の間には、流路３４１〜３４６と、流路の開閉を調節する調節弁３３１〜３３７が設けられている。なお、流路３４６は、サイクルシーケンス区画２０３と泳動区画２０４を接続する流路である。この他、サイクルシーケンス区画２０３には、送液ポンプ５２０による加圧により溶液を送液するために使用するポート３１７〜３２０と、ポート流路３２１〜３２４が形成されている。ポート流路３２１〜３２４は、ポート３１７〜３２０とそれぞれに対応する槽とを個別に接続する流路である。サイクルシーケンス区画２０３の場合も、全ての流路の流れ方向は決められており、原則として逆流を許さない。
図９に、泳動区画２０４の構成例を示す。泳動区画２０４は、泳動溶液槽３５１と、電解質を含む緩衝液を内蔵する陰極緩衝液槽３５２と、キャピラリの洗浄を行う洗浄水を内蔵した洗浄水槽３５３を有する。このうち、泳動溶液槽３５１は、流路３４６を介してサイクルシーケンス区画２０３と接続されている。この他、泳動区画２０４には、送液ポンプ５２０による加圧により溶液を送液するために使用するポート３５４と、ポート流路３５５が形成されている。ポート流路３５５は、ポート３５４と泳動溶液槽３５１を接続する。
なお、本実施例では、図６〜図８に示すように、核酸抽出区画２０１〜サイクルシーケンス区画２０３の各区画の洗浄液槽と廃液槽が別々に形成されている場合について説明した。しかし、該当区画の洗浄液槽と廃液槽は１つに共通化されていても良い。また、本実施例では、カートリッジ２００を構成する区画の数が４つの場合について説明したが、解析対象となるサンプル又はスタートとなるサンプルのタイプにより、区画の数は増減してもよい。
［送液に伴う調節弁の開閉］
以下では、カートリッジ２００を使用して、前処理とキャピラリ電気泳動を実施する手順について説明する。前処理からキャピラリ電気泳動までの一連の手順は、基本的に、送液による試薬の混合と加熱処理の組み合わせにより実現される。以下の説明では、溶液の送液に、最も一般的な方法である、ポンプによる加圧方式を採用するものとして説明する。
当初、カートリッジ２００に搭載された調節弁とポートは全て閉じた状態にあり、必要に応じて開く操作を行う。閉じた状態の調節弁は溶液類を通さない一方で、空気・ガス等の気体は通す機構を有している。この種の特性を有する調節弁は既知であるので詳細な説明については省略する。
核酸抽出区画２０１、ＰＣＲ区画２０２、サイクルシーケンス区画２０３における溶液の送液は、各区画についてそれぞれ５回の送液操作を順番に実施することで完了する。ここでは、１番目の核酸抽出区画２０１を例に説明する。ＰＣＲ区画２０２及びサイクルシーケンス区画２０３における送液操作はこれに倣う。
操作(1)
まず、スワブや血液などの生体サンプルを反応槽２１２に挿入し、シールなどで蓋をして系を密閉した状態にする。この状態で、調節弁２３１とポート２１７、２１８を開け、ポート２１７から空気を注入する。空気は、ポート２１７→試薬槽２１１→反応槽２１２→担体槽２１３→廃液槽２１５→ポート２１８の順番に流れる。空気がポート２１７に注入されると、試薬槽２１１に内蔵された試薬が流路２４１を通って反応槽２１２に流れ、生体サンプルと混ざり合わされる。このとき、必要に応じ、ヒータ５００を用いてカートリッジ２００を加熱し、反応槽２１２内の混合液の温度を適温になるよう調整しても良い。
操作(2)
続いて、更に調節弁２３２を開放した状態で、ポート２１７から空気を注入する。なお、空気の流路は操作(1)と同じである。この場合、反応槽２１２内の生体サンプルと試薬の混合液が流路２４２を通って担体槽２１３に流れる。このとき、混合液中の核酸は、担体槽２１３内の担体に付着する。
操作(3)
次に、調節弁２３２とポート２１７を閉じ、調節弁２３３〜２３５とポート２１９を開く。なお、ポート２１８は開いたままである。この状態でポート２１９から空気を注入する。この際、空気は、ポート２１９→洗浄液槽２１４→担体槽２１３→廃液槽２１５→ポート２１８の順番に流れる。空気がポート２１９に注入されると、担体槽２１３にあった混合液は流路２４４を通って廃液槽２１５へと流れ出す。代わりに、洗浄液槽２１４に内蔵された洗浄液が流路２４３を通って担体槽２１３へと流れ込む。さらに、空気のポート２１９への注入を継続すると、担体槽２１３に内蔵されていた洗浄液は、廃液槽２１５へ全て送られる。その後、逆流と混入を防ぐため、調節弁２３３〜２３５を閉じる。この操作は、複数回繰り返すことで精製の効果を高めることができる。
操作(4)
次に、ポート２１９を閉じ、調節弁２３６とポート２２０を開く。ここでも、ポート２１８は開いたままである。この際、空気は、ポート２１９→洗浄液槽２１４→担体槽２１３→廃液槽２１５→ポート２１８の順番に流れる。ポート２２０から空気を注入すると、溶出液槽２１６に内蔵されていた溶出液が流路２４５を通って担体槽２１３へと流れ込む。
操作(5)
溶出液槽２１６の溶出液を担体槽２１３に流し込んだ後は、担体に付着した核酸が溶出液に溶けだすのに十分な時間だけ放置する。その後、ポート２１８を閉じ、調節弁２３７とポート２５８を開ける。この際、ＰＣＲ区画２０２に設けられたポート２５８を開く。これにより、空気は、ポート２２０→溶出液槽２１６→担体槽２１３→反応槽２５２→担体槽２５３→廃液槽２５５→ポート２５８に順番に流れる。この状態で、ポート２２０から空気を注入する。すると、担体槽２１３の溶液は、流路２４６を通って次の区画、すなわちＰＣＲ区画２０２の反応槽２５２に流れ込む。このように、核酸抽出区画２０１からＰＣＲ区画２０２への送液が完了すると、ポート２２０及び２５８を閉じる。
本実施例の場合、ＰＣＲ区画２０２とサイクルシーケンス区画２０３は、核酸抽出区画２０１と同じ構造を有している。従って、ＰＣＲ区画２０２とサイクルシーケンス区画２０３についても、前述した操作(1)〜(5)と同様の操作が繰り返し実施される。
続いて、泳動区画２０４における溶液の送液を説明する。泳動区画２０４の泳動溶液槽３５１には、予めホルムアミドなどの変性剤が封入されている。サイクルシーケンス区画２０３から送液された溶出液は、泳動溶液槽３５１において変性剤と混合される状態となる。なお、泳動区画２０４には、泳動溶液槽３５１の他に、陰極緩衝液槽３５２と洗浄水槽３５３が設けられているが、各槽からの溶液の蒸発と外部からのコンタミネーションを防ぐため、シールなどの薄膜で各槽の開口が覆われている。
キャピラリ電気泳動を行う際には、キャピラリ４０１の先端が泳動溶液槽３５１の開口を覆う薄膜を突き破り、槽内の溶液に浸される。薄膜は、キャピラリ先端ではなく、別に用意したニードルを用いて破っても良い。また、各槽の開口はシールで覆う替わりに、スリットが切られたゴム膜で覆い、その切れ目からキャピラリの先端を挿入しても良い。
［前処理一体型キャピラリ電気泳動装置の処理動作］
図１０に、本実施例に係る前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００の動作手順を示す。各ステップについて、図を補足しながら説明する。
（ステップ２００１）
前提として、まず、サンプルを導入したカートリッジ２００を、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００の載置台に取り付ける。また、ポンプ・バッファユニット４５０を前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００に取り付ける。この状態で、装置本体の電源をオンにすると、本動作手順が開始される。まず、生体サンプル及び試薬が封入されたカートリッジ２００が、オートサンプラユニット６００に固定される。その際、カートリッジ２００の底面とヒータ５００は接触している。カートリッジ２００の調節弁２３１〜２３７、２７１〜２７７、３３１〜３３７は調節弁ユニット５５０に接続され、ポート２１７〜２２０、２５７〜２６０、３１７〜３２０は送液ポンプ５２０に接続される。また、ポンプ・バッファユニット４５０を、キャピラリアレイ４００の一端部と高圧電源ユニット８００とにそれぞれ接続する。
（ステップ２００２）
この状態で、ヒータ５００による温度調整が開始される。温度は、ユーザが使用毎に手動で設定しても良いし、測定の内容に応じて予め定めた温度に自動的に設定しても良い。また、この段階で、レーザ７０１の照射も開始される。なお、レーザの照射直後は出力が不安定である。従って、検出感度を維持するためには、電気泳動を開始する前に、レーザの照射を開始しておけば良い。
（ステップ２００３）
カートリッジ２００、ヒータ５００、調節弁ユニット５２０の３つを固定しているオートサンプラユニット６００のアームが動き、陰極緩衝液槽３５２にキャピラリアレイ４００の先端が浸される。
（ステップ２００４）
次に、ポンプ・バッファユニット４５０のピストン４５２に対し、手動又は自動制御により外力が加えられ、内蔵していた分離媒体４５６がキャピラリアレイ４００に充填される。同時に、陽極電極４５４が陽極緩衝液４５７に浸された状態になる。
（ステップ２００５）
カートリッジ２００では、核酸抽出、ＰＣＲ反応、サイクルシーケンス反応が連続で実施される。実施方法については前記の通りである。また、高圧電源ユニット８００により、キャピラリの両端に電圧を印加する。この操作は、プレラン（pre-run）と呼ばれる。プレランを長時間実施することにより、キャピラリ電気泳動の分析性能を向上させる効果がある。
（ステップ２００６）
調節弁ユニット５５０と送液ポンプ５２０により、サイクルシーケンス区画２０３のサンプルが後段に位置する泳動溶液槽３５１に送液される。カートリッジ２００において試薬・混合液・反応液を送液する際、ポンプ５２０から注入する空気の量を調整すれば、送液量を調整することができる。なお、各区画における溶出液の全量を、次の槽に送るのではなく、一部を保管しておくことが望ましい、そうすれば、途中から分析を再実施することが可能である。
（ステップ２００７）
ここでは、一時的に、電圧の印加が停止される。この状態で、オートサンプラユニット６００が動作し、キャピラリアレイ４００の先端が泳動溶液槽３５１に挿入される。
（ステップ２００８）
高圧電源ユニット８００からキャピラリアレイの両端に弱い電圧を短時間印加することにより、適量のサンプルを分離媒体が充填されたキャピラリアレイ４００に導入する。
（ステップ２００９）
再度、オートサンプラユニット６００が動作し、キャピラリアレイ４００の先端を陰極緩衝液槽３５２内に封入された陰極緩衝液に浸す。
（ステップ２０１０）
高圧電源ユニット８００からキャピラリアレイ４００に高電圧を印加し、電気泳動を実施する。電気泳動中、キャピラリ４０１の検出部４０４には、励起光７０１が照射される。検出器７０３は、励起光７０１によってサンプルが蛍光している様子を検出し、不図示の測定装置に検出結果を出力する。測定装置は、検出結果に基づき、サンプルを分析する。
（ステップ２０１１）
この段階で、電気泳動が終了する。
（ステップ２０１２）
電圧印加の終了後、オートサンプラユニット６００が動作し、キャピラリアレイ４００の先端を洗浄液槽３５３に浸す。洗浄水槽３５３にはキャピラリの先端及び内部を洗浄する洗浄水が封入されている。
（ステップ２０１３）
ポンプ・バッファユニット４５０のピストン４５２を手動又は自動制御により引き、キャピラリアレイの内部を洗浄液で満たす。この操作を数回繰り返すと、洗浄効果を向上させることができる。
［まとめ］
以上説明したように、本実施例に係るカートリッジ２００と、前処理（核酸抽出、増幅反応、サイクルシーケンス反応など）一体型キャピラリ電気泳動装置１００を組み合わせて用いれば、前処理から電気泳動までの全反応工程の自動化を、１台の装置と１個のカートリッジだけを用いて実行することができる。
[実施例２]
本実施例では、精製した核酸からキャピラリ電気泳動を実施し、フラグメント解析を行う場合に適したカートリッジ２００の構成例を示す。前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００の基本的な構成や動作は実施例１と同様である。以下では、本実施例と実施例１との差異点を中心に説明する。
図１１に、本実施例に係るカートリッジ２００の構成例を示す。図１１に示すカートリッジ２００は、ＰＣＲ区画２０２と泳動区画２０４のみで構成されており、核酸抽出区画２０１、サイクルシーケンス区画２０３は省かれている。
この実施例の場合、精製された核酸の溶液を反応槽２５２に導入し、その後、シールなどで蓋をして系を密閉した状態にすることで処理工程が開始される。以降の工程は、実施例１と同じである。この場合にも、実施例１と同様の効果を実現することができる。
[実施例３]
本実施例では、槽内に封入する試薬を異なるものにすることで、別の解析の実施を可能とする。先に述べたように、ＰＣＲ区画２０２の試薬槽２５１には、試薬が保管された状態で運搬が可能なように密閉されている。一方で、空の試薬槽２５１に対し、分析直前に任意の試薬を注入して解析しても良い。
一例として、精製した核酸からＳＴＲ（ショートタンデムリピート）解析を実施する方法を説明する。なお、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００の基本的な構成や動作は実施例２と同様である。
本実施例と実施例２との相違点は、試薬槽２５１にはＰＣＲ反応のための酵素、ｄＮＴＰ、緩衝液等の混合溶液、反応液槽２５２にはＳＴＲ領域に対応した蛍光標識プライマ混合液を封入しておく点である。この場合にも、実施例２と同様の効果を実現することができる。
[実施例４]
本実施例では、精製した核酸からＰＣＲ反応、サイクルシーケンス反応を行える構成について説明する。前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００の基本的な構成や動作は実施例１と同様である。以下では、実施例１と本実施例との差異点を中心に説明する。
図１２に、本実施例に係るカートリッジ２００の構成例を示す。図１２に示すカートリッジ２００は、ＰＣＲ区画２０２と、サイクルシーケンス区画２０３と、泳動区画２０４の３つのみで構成され、核酸抽出区画２０１は省かれている。
本実施例の場合、反応動作は、反応槽２５２に精製された核酸の溶液を挿入し、シールなどで蓋をして系を密閉した状態から開始される。以降の工程は実施例１と同様である。この場合にも、実施例１と同様の効果を実現することができる。
[他の実施例]
本発明は上述した実施例に限定されるものでなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上述した実施例は、本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも全ての構成を備えるものに限定されない。また、ある実施例の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成を追加、削除又は置換することも可能である。
１００：前処理一体型キャピラリ電気泳動装置、２００：カートリッジ、２０１：核酸抽出区画、２０２：ＰＣＲ区画、２０３：サイクルシーケンス区画、２０４：泳動区画、２１１、２５１、３１１：試薬槽、２１２、２５２、３１２：反応槽、２１３、２５３、３１３：担体槽、２１４、２５４、３１４：洗浄液槽、２１５、２５５、３１５：廃液槽、２１６、２５６、３１６：溶出液槽、２１７〜２２０、２５７〜２６０、３１７〜３２０、３５４：ポート、２２１〜２２４、２６１〜２６４、３２１〜３２４：ポート流路、２３１〜２３７、２７１〜２７７、３３１〜３３７：調節弁、２４１〜２４６、２８１〜２８６、３４１〜３４６、３５１:泳動溶液槽、３５２:陰極緩衝液槽、３５３:洗浄水槽、３５５：流路、４００：キャピラリアレイ、４０１：キャピラリ、４０２：キャピラリヘッド、４０３：陰極電極、４０４：検出部、４１０：恒温ユニット、４５０：ポンプ・バッファユニット、４５１：ディスポーザ容器、４５２：ピストン、４５３：バルブ、４５４：陽極電極、４５５：薄膜、４５６：分離媒体（ポリマ）、４５７：陽極緩衝液、５００：ヒータ、５２０：送液ポンプ、５５０：調節弁ユニット、６００：オートサンプラユニット、７００：検出ユニット、７０１：励起光、７０２：散乱光、７０３:検出器、８００：高圧電源ユニット、９００：コントローラ。

Claims (10)

  1. 生体サンプルから核酸を抽出する工程、目的の領域についてＰＣＲ反応を行う工程、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程の少なくとも１つと、キャピラリ電気泳動により核酸を分析する工程とにそれぞれ対応する複数の区画構造を１枚の基板上に有し、前記複数の区画構造として、（１）生体サンプルを注入する反応槽と、前記反応に用いる試薬を内蔵した試薬槽と、前記反応槽の反応産物を精製する担体を内蔵する担体槽と、各槽間を接続する複数の流路と、前段に位置する区画構造の前記担体槽と前記反応槽を接続する流路と、前記担体槽と次段に位置する区画構造の前記反応槽を接続する流路と、前記流路を開閉して送液を調整する複数の調節弁とを有する１つ又は複数の第１の区画と、（２）泳動溶液を内蔵する泳動溶液槽と、キャピラリ電気泳動で使用する電解質を含む緩衝液を内蔵した陰極緩衝液槽と、キャピラリの先端部を洗浄してサンプル間のコンタミネーションを防止する洗浄液を内蔵した洗浄液槽と、前段に位置する前記第１の区画の前記担体槽と前記泳動溶液槽とを接続する流路と、前記流路を開閉して送液を調整する調整弁とを有する第２の区画と、を有する前処理・電気泳動用一体型カートリッジと、
    前記前処理・電気泳動用一体型カートリッジを載置する載置台と、
    前記載置台の内部又は表面に配置され、前記前処理・電気泳動用一体型カートリッジ内の溶液温度を調整する温度調整機構と、
    キャピラリ電気泳動機構と、
    前記調節弁の開閉を制御し、前記第１及び第２の区画内及び間の送液を制御すると共に、前記キャピラリ電気泳動機構の制御を通じ、電気泳動動作を制御するコントローラであって、電気泳動動作に際し、前記キャピラリの先端部を前記泳動溶液槽に挿入して生体サンプルを前記キャピラリに導入した後、前記キャピラリの先端部を前記陰極緩衝液槽に浸して高電圧を印加させる、コントローラと
    を有し、
    前記生体サンプルから核酸を抽出する工程と、目的の領域についてＰＣＲ反応を行う工程と、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程の少なくとも１つと、キャピラリ電気泳動により核酸を分析する工程までの全工程を、１枚の前記前処理・電気泳動用一体型カートリッジを用い、自動で実行する前処理一体型キャピラリ電気泳動装置。
  2. 請求項１に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動装置において、
    前記第１の区画はＰＣＲ反応を行う工程に対応する１つの区画構造を有し、前記第２の区画は電気泳動の工程に対応する１つの区画構造を有するとき、
    前記コントローラは、生体サンプルから精製された核酸の溶液を、前記第１の区画の前記反応槽に注入して前処理を開始する
    ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動装置。
  3. 請求項１に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動装置において、
    前記第１の区画はＰＣＲ反応を行う工程とサイクルシーケンス反応を行う工程に対応する２つの区画構造を有し、前記第２の区画は電気泳動の工程に対応する区画構造を有するとき、
    前記コントローラは、生体サンプルから精製された核酸の溶液を、前記第１の区画を構成する前記２つの区画構造のうち前段に位置する区画構造の前記反応槽に注入して前処理を開始する
    ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動装置。
  4. 請求項１に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動装置において、
    （１）前記キャピラリ電気泳動機構を構成する前記キャピラリに供給する緩衝液及びポリマを保持するディスペンサ容器であり、その出力口が前記キャピラリの先端に接続されるディスペンサ容器と、（２）前記緩衝液と前記ポリマの前記ディスペンサ容器内における初期状態での混合を妨げる隔壁と、（３）前記ディスペンサ容器の内部を加圧及び減圧するピストンと、（４）先端部分が前記ディスペンサ容器の内部に突き出た状態で設置され、前記ピストンによる加圧操作時に前記先端部分で前記隔壁を破り、前記緩衝液と前記ポリマを混合する陽極端子とを含むポンプ・バッファユニット
    を有することを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動装置。
  5. 生体サンプルから核酸を抽出する工程、目的の領域についてＰＣＲ反応を行う工程、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程の少なくとも１つと、キャピラリ電気泳動により核酸を分析する工程とにそれぞれ対応する複数の区画構造を１枚の基板上に有し、
    前記複数の区画構造として、
    生体サンプルを注入する反応槽と、前記反応に用いる試薬を内蔵した試薬槽と、前記反応槽の反応産物を精製する担体を内蔵する担体槽と、各槽間を接続する複数の流路と、前段に位置する区画構造の前記担体槽と前記反応槽を接続する流路と、前記担体槽と次段に位置する区画構造の前記反応槽を接続する流路と、前記流路を開閉して送液を調整する複数の調節弁とを有する１つ又は複数の第１の区画と、
    泳動溶液を内蔵する泳動溶液槽と、キャピラリ電気泳動で使用する電解質を含む緩衝液を内蔵した陰極緩衝液槽と、キャピラリの先端部を洗浄してサンプル間のコンタミネーションを防止する洗浄液を内蔵した洗浄液槽と、前段に位置する前記第１の区画の前記担体槽と前記泳動溶液槽とを接続する流路とその調整弁とを有する第２の区画と
    を有する前処理・電気泳動用一体型カートリッジ。
  6. 請求項５に記載の前処理・電気泳動用一体型カートリッジにおいて、
    前記第１の区画はＰＣＲ反応を行う工程に対応する１つの区画構造を有し、前記第２の区画は電気泳動の工程に対応する１つの区画構造を有する
    ことを特徴とする前処理・電気泳動用一体型カートリッジ。
  7. 請求項５に記載の前処理・電気泳動用一体型カートリッジにおいて、
    前記第１の区画はＰＣＲ反応を行う工程とサイクルシーケンス反応を行う工程に対応する２つの区画構造を有し、前記第２の区画は電気泳動の工程に対応する区画構造を有する
    ことを特徴とする前処理・電気泳動用一体型カートリッジ。
  8. 生体サンプルから核酸を抽出する工程、目的の領域についてＰＣＲ反応を行う工程、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程の少なくとも１つと、キャピラリ電気泳動により核酸を分析する工程とにそれぞれ対応する複数の区画構造を１枚の基板上に有し、前記複数の区画構造として、（１）生体サンプルを注入する反応槽と、前記反応に用いる試薬を内蔵した試薬槽と、前記反応槽の反応産物を精製する担体を内蔵する担体槽と、各槽間を接続する複数の流路と、前段に位置する区画構造の前記担体槽と前記反応槽を接続する流路と、前記担体槽と次段に位置する区画構造の前記反応槽を接続する流路と、前記流路を開閉して送液を調整する複数の調節弁とを有する１つ又は複数の第１の区画と、（２）泳動溶液を内蔵する泳動溶液槽と、キャピラリ電気泳動で使用する電解質を含む緩衝液を内蔵した陰極緩衝液槽と、キャピラリの先端部を洗浄してサンプル間のコンタミネーションを防止する洗浄液を内蔵した洗浄液槽と、前段に位置する前記第１の区画の前記担体槽と前記泳動溶液槽とを接続する流路と、前記流路を開閉して送液を調整する調整弁とを有する第２の区画と、を有する前処理・電気泳動用一体型カートリッジと、前記前処理・電気泳動用一体型カートリッジを載置する載置台と、前記載置台の内部又は表面に配置され、前記前処理・電気泳動用一体型カートリッジ内の溶液温度を調整する温度調整機構と、キャピラリ電気泳動機構と、前記調節弁の開閉を制御し、前記第１及び第２の区画内及び間の送液を制御すると共に、前記キャピラリ電気泳動機構の制御を通じ、電気泳動動作を制御するコントローラとを有する前処理一体型キャピラリ電気泳動装置における前処理一体型キャピラリ電気泳動方法において、
    前記コントローラは、
    前処理・電気泳動用一体型カートリッジを構成する前記第１の区画の構造に応じ、前記生体サンプルから核酸を抽出する工程と、目的の領域についてＰＣＲ反応を行う工程と、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程の少なくとも１つと、キャピラリ電気泳動により核酸を分析する工程までの全工程を、１枚の前記前処理・電気泳動用一体型カートリッジの上で自動実行させるように制御し、
    電気泳動動作に際し、前記キャピラリの先端部を前記泳動溶液槽に挿入して生体サンプルを前記キャピラリに導入した後、前記キャピラリの先端部を前記陰極緩衝液槽に浸して高電圧を印加させる
    ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動方法。
  9. 請求項８に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動方法において、
    前記前処理に対応する区画が、ＰＣＲ反応を行う工程に対応する１つの区画構造のみを有するとき、
    前記コントローラは、生体サンプルから精製された核酸の溶液を、前記第１の区画の前記反応槽に注入した後に前記前処理を開始する
    ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動方法。
  10. 請求項８に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動方法において、
    前記前処理に対応する区画が、ＰＣＲ反応を行う工程とサイクルシーケンス反応を行う工程に対応する２つの区画構造を有するとき、
    前記コントローラは、生体サンプルから精製された核酸の溶液を、前記第１の区画を構成する前記２つの区画構造のうち前段に位置する区画構造の前記反応槽に注入して前処理を開始する
    ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動方法。
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