JP6044941B2 - 光学顕微鏡、および、光学顕微鏡のオートフォーカス装置 - Google Patents

Description

本開示は、撮像装置により撮像された観察対象物の光像を画像信号として送出可能な光学顕微鏡に関し、特に、オートフォーカス光を用いて対物レンズのフォーカス調整を行うオートフォーカス装置を備えた光学顕微鏡、および、光学顕微鏡のオートフォーカス装置に関する。

光学顕微鏡とその周辺装置は、さまざまな分野での研究に貢献しているが、近年は特に観察対象物を撮像装置により撮像する機能を備え、撮像した静止画像や動画像の画像データをコンピュータや大型モニタなどの外部機器に送出して、画像解析や現象解析に供されるようになっている。また、光学顕微鏡により取得された画像を解析しながら光学顕微鏡の調整を行うために、観察対象物が載置されるステージの位置調整や装着された異なる倍率を有する複数の対物レンズの交換操作を遠隔操作として行うことができるなど、光学顕微鏡の全体の機能に対する自動化も進んでいる。

例えば、生命科学研究の分野では、高解像度の光学顕微鏡を用いて細胞内部の微細構造の変化や細胞分化パターンの解析など行うために、高解像度な解析画像を長時間経過観察するタイムラプス観察が行われることが多い。光学顕微鏡は、その高倍率性故にレンズの焦点範囲が極めて狭く、わずかな振動や環境温度の変化により観察対象物が対物レンズの焦点位置から外れてしまうこととなる。また、上記のような細胞内部の構造変化を観察するためには、観察対象の細胞に外部から熱的な刺激が加えられることも多く、その結果として環境温度の変化が生じると観察対象物へのフォーカス状態が崩れてしまい、正確に細胞構造の変化が観察できないという不都合を生じる。

このため、対物レンズのフォーカス状態を自動的に維持することができる、オートフォーカス装置を備えた光学顕微鏡が開発されている。光学顕微鏡の分野におけるオートフォーカス装置としては、高速追従性を備えたアクティブオートフォーカス方式が用いられている。このアクティブオートフォーカス方式は、観察対象物を載せるスライドガラスと観察対象物に被せられるカバーガラスとの界面に設けられた反射膜や界面自体によって、対物レンズを介して照射されるオートフォーカス光を反射させ、その反射光を受光して対物レンズと観察対象物との間隔を正確に測距し、この間隔を一定に保ち続けるというものである。

近年では、生命科学研究分野で行われるような細胞中の一つの核のみを観測対象とする場合などの、スライドガラスの界面と観察対象物である細胞核とが、対物レンズとの間隔が微妙に異なる位置にある場合でも正確なオートフォーカスを行うことができる光学顕微鏡が提案されている。このような光学顕微鏡として、アクティブオートフォーカス方式によるスライドガラス等へのフォーカス操作と、操作者が観察光学系を用いて行う観察対象物へのフォーカス操作によって取得されるデータとに基づいて、アクティブオートフォーカス方式により得られたフォーカス位置から一定量シフトさせた位置にフォーカスさせる技術が提案されている（特許文献１参照）。

また、アクティブオートフォーカス方式において、オートフォーカス光学系内にフォーカス調整レンズ系を備え、アクティブオートフォーカス方式によるスライドガラス等への自動フォーカス操作が行われた状態で操作者によるフォーカス操作を行ってフォーカスオフセット量を設定し、以降はフォーカス調整レンズによってフォーカスオフセット量を保ったままアクティブオートフォーカス方式によるフォーカス操作が行われる技術が提案されている（特許文献２参照）。

特開２０１１−１２３５１８号公報 特開２００７−１４８１６１号公報

上記従来の光学顕微鏡によれば、高速追従性と正確性とを備えたアクティブオートフォーカス方式によって、対物レンズと観察対象物が載置されたスライドガラス等との間隔を一定に保つことができるため、環境温度が変化しても良好なフォーカス状態を保つことができる。この結果、特に、動画像による観察や長時間にわたるタイムラプス観察を好適に行うことができる。

従来のアクティブオートフォーカス方式では、オートフォーカス光学系のフォーカス用光源として可視光領域外の赤外光が用いられている。このため、観察光学系の照射光源としてタングステンランプやハロゲンランプなどが用いられる通常の光学顕微鏡や、励起光として近紫外光や青色光が照射される蛍光観察用の顕微鏡などにおいて、フォーカス用光源からの赤外光が観察光学系での監視や撮像装置による撮影画像に実用上の悪影響を及ぼすことが回避されている。

しかし、バイオイメージングの一手法である化学発光観察を行う場合には、励起光発光を用いる蛍光発光観察に比べて観察対象物の発光輝度が弱いため、観察光学系内のフィルタなど減光要因を極力取り除いたうえで、さらに高感度な検出器を用いることが必要となる。この場合には、わずかな光でも検出してしまうため、従来のアクティブオートフォーカス方式に用いられる赤外光であっても、観察対象物の画像を得る上での妨害光となってしまう。一方、微弱な発光を検出するためには長時間露光が必要となるが、オートフォーカス装置を停止させた状態での光学顕微鏡で長時間露光を行うと、径時変化等によるフォーカスずれが生じることを回避できず、所望するクリアな撮像画像を得ることができない。

そこで本願では、上記した従来の課題を解決して、微弱な発光を有する物質を観察対象物とする場合でも、撮像画像に悪影響を与えることなく対物レンズをフォーカス状態に保つことができる光学顕微鏡を得ること、また、光学顕微鏡に用いられて良好な化学発光観察を可能とすることができるオートフォーカス装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本願で開示する光学顕微鏡は、対物レンズで得られた観察対象物の光像を撮像装置で撮像し、画像信号として送出可能な観察光学系と、フォーカス用光源から照射されたオートフォーカス光に基づいて前記対物レンズの焦点位置を調整し、前記観察対象物に対してフォーカスさせるオートフォーカス装置とを備え、前記撮像装置が、撮像期間と非撮像期間とを繰り返しながら前記撮像期間の撮像画像を連続して得ることで前記観察対象物の動画像を撮像するとともに、前記撮像期間と前記非撮像期間との動作タイミングを出力し、前記動作タイミングに基づいて、前記撮像装置が前記観察対象物の画像を撮像していない前記非撮像期間に前記フォーカス用光源から前記オートフォーカス光を照射することを特徴とする。

また、本願で開示する光学顕微鏡のオートフォーカス装置は、対物レンズで得られた観察対象物の光像を画像信号として送出可能な撮像装置を備えた光学顕微鏡に用いられ、フォーカス用光源から照射されるオートフォーカス光の反射光に基づいて前記対物レンズのフォーカス位置を調整するオートフォーカス装置であって、前記撮像装置が、撮像期間と非撮像期間とを繰り返しながら前記撮像期間の撮像画像を連続して得ることで前記観察対象物の動画像を撮像するとともに、前記撮像期間と前記非撮像期間との動作タイミングを出力し、前記動作タイミングに基づいて、前記撮像装置が前記観察対象物の画像を撮像していない前記非撮像期間に前記フォーカス用光源から前記オートフォーカス光を照射することを特徴とする。

本願で開示する光学顕微鏡、および、光学顕微鏡のオートフォーカス装置によれば、撮像装置が観察対象物の画像を撮像しない非撮像期間にオートフォーカス光が照射されるため、高感度の検出器を用いた場合でも撮像画像にオートフォーカス光が影響するおそれを回避することができる。このため、観察対象物の発光輝度が弱い場合でも正しくフォーカスされた状態の観察対象物の観察画像を得ることができる。

本実施形態にかかる第１の構成例の光学顕微鏡の概略構成を示すブロック構成図である。 本実施形態にかかる光学顕微鏡における、カメラの露光タイミングとオートフォーカス光の照射タイミングとの関係を示す図である。 本実施形態にかかる第２の構成例の光学顕微鏡の概略構成を示すブロック構成図である。 従来の光学顕微鏡により取得された、蛍光観察と化学発光観察との観察対象の画像例を示す図である。 本実施形態にかかる光学顕微鏡により取得された、蛍光観察と化学発光観察との観察対象の画像例を示す図である。

従来のアクティブオートフォーカス形式においては、オートフォーカス光を常に照射して位置を検出し続けることで、常にフォーカス位置補正を行っている。しかし、必ずしも常にオートフォーカス動作を行う必要はなく、間欠的にオートフォーカス動作を行うことでも十分に観察対象物へのフォーカス状態を維持することができる。本願で開示する光学顕微鏡は、対物レンズで得られた観察対象物の光像を撮像装置で撮像し、画像信号として送出可能な観察光学系と、フォーカス用光源から照射されたオートフォーカス光に基づいて前記対物レンズの焦点位置を調整し、前記観察対象物に対してフォーカスさせるオートフォーカス装置とを備え、前記撮像装置が前記観察対象物の画像を撮像していない非撮像期間に、前記フォーカス用光源から前記オートフォーカス光が照射される。

このようにすることで、撮像装置では、オートフォーカス光が照射されていない状態の観察対象物の画像を撮像することになる。このため、撮像された画像にオートフォーカス光が悪影響を与えることを効果的に回避することができる。

本願で開示する光学顕微鏡では、前記撮像装置において前記観察対象物の画像を撮像する撮像期間と前記非撮像期間とが繰り返され、前記オートフォーカス装置が前記非撮像期間においてオートフォーカス動作を行いながら、前記撮像装置が前記撮像期間における前記観察対象物の画像を連続して撮像することが好ましい。このようにすることで、長期間の画像撮影時における焦点ドリフトの影響を回避して、正しくフォーカスされた状態での観察対象物の連続した撮像画像を得ることができる。

また、前記オートフォーカス装置は、複数回の前記非撮像期間の内の所定の非撮像期間を選択し、選択された前記非撮像期間においてのみオートフォーカス動作を行うことが好ましい。このようにすることで、例えばフォーカス変動の度合いに応じて必要な間隔で間欠的にオートフォーカス動作を行うことができ、オートフォーカス光が観察対象試料や撮像画像な与え得る不所望な影響を効果的に回避することができる。

本願で開示する光学顕微鏡において、前記撮像装置が、撮像素子としてＣＣＤイメージセンサを備え、前記非撮像期間が前記撮像素子が撮像データを転送する読出期間であることが好ましい。このようにすることで、撮像素子として一般的なＣＣＤイメージセンサを用いて、オートフォーカス光の影響の無い観察対象物の画像データを得ることができる。

また、前記フォーカス用光源が照射する前記オートフォーカス光が可視領域外の赤外光であることが好ましい。

さらに、本願で開示する光学顕微鏡を、化学反応で発光する発光物質を前記観察対象物として観測する化学発光観察に用いることが好ましい。観察対象物の発光輝度が弱く高感度な検知器を用いた場合でも、オートフォーカス光の影響のない観察対象物の画像を得ることができる。

また、前記観察対象物が載置されるガラス基板の界面から所定の距離離れた位置に存在する観測対象部分に対し、前記ガラス基板の界面で反射された前記オートフォーカス光によりオートフォーカスを行うフォーカス調整レンズを備えることが好ましい。このようにすることで、培養液内に配置された細胞の細胞核など、観察対象物の観察対象部位がオートフォーカスの基準面から離れて位置する場合でも、良好なフォーカス状態を維持することができる。

さらに、本願で開示する光学顕微鏡を、前記対物レンズが前記観察対象物の下方に位置する倒立型顕微鏡とすることができる。

また、本願で開示する光学顕微鏡のオートフォーカス装置は、対物レンズで得られた観察対象物の光像を画像信号として送出可能な撮像装置を備えた光学顕微鏡に用いられ、フォーカス用光源から照射されるオートフォーカス光の反射光に基づいて前記対物レンズのフォーカス位置を調整するオートフォーカス装置であって、前記撮像装置が前記観察対象物の画像を撮像していない非撮像期間に、前記フォーカス用光源から前記オートフォーカス光を照射する。

このようにすることで、撮像装置によってオートフォーカス光が照射されていない状態の観察対象物の画像を撮像することができ、撮像された画像に対して悪影響を与えることを効果的に回避したオートフォーカス装置を得ることができる。

（実施の形態）
以下、本願にかかる光学顕微鏡、および、光学顕微鏡のオートフォーカス装置の実施形態について、図面を参照しながら説明する。

図１は、本実施形態にかかる光学顕微鏡の第１の構成例として、観察対象物の上方に対物レンズが配置された正立型の光学顕微鏡の概略構成を説明するためのブロック図である。

図１に示す第１の構成例の光学顕微鏡では、観察対象物１は、ステージ２上に載置されたガラス基板としてのスライドガラス３に載せられ、観察対象物１を覆うカバーガラス４とに挟まれた状態で配置されている。

ステージ２は、観察対象物１の上方に位置する対物レンズ５の光軸６に対し、垂直な平面内のＸ−Ｙ方向において移動可能となっている。なお、ステージ２を対物レンズ５の光軸方向（Ｚ方向）に移動可能とすることもできる。また、ステージ２のＸ方向およびＹ方向、場合によってはＺ方向への移動を、モータを用いて電動とすることができ、その場合には、ステージ２の移動を制御するステージ制御部を設けて、光学顕微鏡全体を制御する制御部３１から、他の部材の操作、例えば対物レンズ５の焦点位置の操作と連動してステージの移動を制御可能とすることができる。

本構成例の光学顕微鏡は、対物レンズ５、光路切り替えミラー７、接眼レンズ８、カメラ用レンズ９、撮像装置であるカメラ１０により構成される観察光学系と、オートフォーカス光源部１１、ハーフミラー１２，ダイクロイックミラー１３、オートフォーカス集光部１４、オートフォーカス受光部１５により構成されるオートフォーカス光学系とを備えている。

観察光学系は、対物レンズ５により得られた観察対象物１の光像を目視、若しくは、撮像装置であるカメラ１０によって静止画像または動画像として観察可能とするものである。本構成例の光学顕微鏡では、観察光学系に光路切り替えミラー７を配置して、接眼レンズ８を介して目視する場合と、カメラ用レンズ９を経てカメラ１０により画像データを得る場合とを切り替える構成としているが、目視と画像データの取得とを同時に行える構成とすることも可能である。

カメラ１０は、ＣＣＤイメージセンサ（Charge Coupled Device Image sensor）を撮像素子として備えた撮像装置である。本構成例にかかる光学顕微鏡のカメラ１０は、後述するように、カメラ用レンズ９を介して得られた対物レンズ５による観察対象物１の光像を、多数個の受光素子がそれぞれ光の信号として受光する撮像期間と、それぞれの受光素子で得られた電荷を電気信号として外部に送出する読出期間との２つの動作期間が交互に繰り返されるものであり、光信号を電気信号に変換して送出可能なものである。また、カメラ１０は、動作期間の内の読出期間と撮像期間との動作タイミングを、光学顕微鏡の制御部３１に伝達する。

カメラ１０で得られた観察対象物１の撮像画像は、電気信号として、光学顕微鏡に付随する、若しくは、外部機器として別個に配置されるモニタ３２に送出され、モニタ３２において観察対象物１の拡大画像をリアルタイムで観察することができる。なお、モニタ３２は、図１に示すようにコンピュータのモニタ部として、得られた画像信号に対してコンピュータによる画像処理を行った後の画像を表示してもよいし、光学顕微鏡に物理的に一体となって付随して、観察対象物１の画像をそのまま表示する機能のみを持つ表示部としてもよい。

オートフォーカス光学系のオートフォーカス光源部１１は、例えば近赤外光を発光する赤外ＬＥＤからなるフォーカス用光源１６と、スリット１７、コリメータレンズ１８、図示しない瞳制限部などにより構成されていて、オートフォーカス光を照射する。

オートフォーカス光源部１１から照射されたオートフォーカス光は、ハーフミラー１２、赤色光を反射するダイクロイックミラー１３を介して対物レンズ５に入射し、観察対象物１と同じ平面位置にあるスライドガラス２とカバーガラス４の界面部分に集光する。スライドガラス２またはカバーガラス４の界面部分自体、もしくは、より正確にオートフォーカスを行うために設けられることがある反射膜で反射したオートフォーカス光は、ダイクロイックミラー１３、ハーフミラー１２を経て、オートフォーカス集光部１４に入射する。

オートフォーカス集光部１４に入射したオートフォーカス光は、オートフォーカス対物レンズ１９で集光されて、スリット部やリレーレンズを備えた結像部２０でスリット像として一旦結像され、シリンドリカルレンズ２１を経てオートフォーカス受光部１５で再び結像する。

オートフォーカス受光部１５は、カメラ部１０と同様ＣＣＤイメージセンサなどの受光素子により光信号を電気信号に変換するものであり、結像したオートフォーカス光のスリット像を電気信号として検知し、フォーカス状態を制御部３１に伝達する。

制御部３１は、オートフォーカス受光部１５から伝達されたオートフォーカス光におけるスリット像の状態から、対物レンズ５でのフォーカス状態を判断し、フォーカスにずれが生じているようであれば、対物レンズ５の焦点位置を修正して常にフォーカス状態であるように制御する。対物レンズ５の焦点位置を修正する方法としては、対物レンズ５自体の配置位置を光軸に沿って移動させる方法や、対物レンズ５が複数枚のレンズ群として構成されている場合には、レンズ同士の間隔を変更させる方法など、光学的に利用可能なさまざまな方法を用いることができる。

このように、図１に示した光学顕微鏡においては、オートフォーカス光学系と、制御部３１、対物レンズ５、および、その焦点位置の調整機構が、光学顕微鏡のオートフォーカス装置を構成することになる。

なお、上記説明した本構成例における光学顕微鏡の観察光学系は、通常の光学顕微鏡の観察光学系の構成要素をそのまま適用できるものである。このため、図１では図示していないが、透過式の場合にはスライドガラス３の下方から、若しくは、落射式の場合には対物レンズ５を介してスライドガラス３の上方から観察光学系の一部を介して、観察対象物１を照射するように照射光源を配置することができる。また、図１においては、対物レンズ５として単体のものを例示したが、倍率の異なる複数の対物レンズをリボルバーによって交換可能に配置することができ、リボルバーを回転させるモータを配置することによって、制御部３１からの信号によって、電動で対物レンズを交換可能として観察倍率を変更可能とすることができる。

観察光学系と同様に、上記説明した本構成例にかかる光学顕微鏡のオートフォーカス光学系も、通常のアクティブフォーカス方式によるオートフォーカス光学系の構成要素をそのまま用いることができ、オートフォーカス受光部１４で得られた画像データからフォーカス状態を判断し、対物レンズ５のフォーカス位置を修正してフォーカス状態を保つように制御する制御内容も、一般的なものである。したがって、本実施形態の光学顕微鏡にかかるオートフォーカス光学系は、上記図示説明した構成例に限定されるものではない。

図２は、本実施形態の光学顕微鏡における、観察光学系のカメラ１０における各撮像素子での露光タイミングと、オートフォーカス光学系のフォーカス光源１６における、オートフォーカス光の照射タイミングとの関係を示すものである。

図２に示すように、本実施形態の光学顕微鏡では、オートフォーカス光をカメラ１０に用いられたＣＣＤイメージセンサにおける、電気信号の読出期間の間に照射するものである。

一般に、撮像素子としてＣＣＤイメージセンサを用いた場合には、それぞれの受光素子で撮像期間にチャージされた電荷を、所定のタイミングの読出期間に転送電極を介して外部に読み出す。読出期間では、全ての受光素子の電荷を順次転送して読み出すため、読出期間の間受光素子は電荷をチャージせず、この期間は対物レンズ５で得られた光像は電気信号に変換されない。このため、この読出期間に観察対象物１にオートフォーカス光を照射しても、カメラ１０で得られる撮像画像に悪影響を与えることはない。上記説明した、オートフォーカス光学系で得られたフォーカス画像に基づくフォーカス動作において、オートフォーカス光の照射タイミングをカメラ１０の読出期間内に終了させることで、カメラ１０では、オートフォーカス光が照射されていない期間のみの撮像期間の画像データを得ることができる。

なお、カメラによっては読出期間の長さをユーザが調整可能なものがあるが、その場合には、光学顕微鏡が備えるオートフォーカス装置における、オートフォーカス光の照射時間とオートフォーカス動作の所要時間を勘案して、カメラがオートフォーカス光を受光しない範囲でなるべく短い読出期間を設定することで、観察対象物のより良好な画像観察が可能となる。

本実施形態の光学顕微鏡では、オートフォーカス光の照射時間を一例として１００μｓと設定した。また、対物レンズの焦点位置を調整する手段として、ピエゾ素子やステッピングモータなどの高速追従性を備えた手段を用いることで、オートフォーカス動作の所要時間は極めて短時間に完了させることができるため、本実施形態の光学顕微鏡の場合にはカメラ１０の非撮像期間にオートフォーカス動作を完了させることができた。なお、オートフォーカス光の照射タイミングは、読出期間内に照射が完了するように設定するのであれば、読出期間の期間中のどのタイミングに設定してもよい。

なお、観察対象物１の動画像を撮像する場合には、撮像装置であるカメラ１０において撮像期間と非撮像期間とが繰り返されながら、撮像期間の撮像画像を連続して得ることになる。この場合においても、非撮像期間にオートフォーカス動作を行うことで、常に正しいフォーカス状態の撮像画像を得ることができる。特に、長時間の撮像の場合には、環境条件の変化による焦点ドリフトと呼ばれるフォーカスのずれが生じやすいが、本開示の光学顕微鏡では、この焦点ドリフトに追従して良好な動画像を得ることができる。

また、この場合において、複数の撮像期間と非撮像期間とが交互に現れるが、複数の非撮像期間の全てにおいてフォーカス動作を行うことができ、また、複数の非撮像期間の内のいずれか選択された非撮像期間においてのみフォーカス動作を行うことができる。例えば長時間の撮像時間における焦点ドリフト量が少ないことが予め判明している場合などでは、オートフォーカス動作を行うタイミングを選択された非撮像期間に限定して間引くことで、観察対象物１にオートフォーカス光が照射される頻度が低減する。この結果、オートフォーカス光が与える観察対象物１への刺激や、オートフォーカス光の撮像画像への不所望な混入があった場合でも、これを効果的に低減することができる。なお、オートフォーカス動作を行うタイミングは、所定回数の非撮像期間ごとに設定してオートフォーカス動作のタイミングを一定の間隔とすることができ、また、オートフォーカス動作を行う非撮像期間をランダムに選択して、オートフォーカス動作を行うタイミングを不定期間隔とすることもできる。

上記のように、本実施形態の光学顕微鏡では、撮像装置における非撮像期間にオートフォーカス光を照射することで、例えば化学発光観察のように観察対象物の発光輝度が弱く、高感度の検出器を用いた撮像や長時間の撮像が必要な場合であっても、オートフォーカス光の影響を受けない観察対象物の画像データを得ることができる。

図３は、本実施形態の光学顕微鏡の第２の構成例として、観察対象物の上方に対物レンズが配置された倒立型の構成における概略構成を説明するためのブロック図である。

図３に示す本実施形態の第２の構成例の光学顕微鏡では、観察対象物５１は、例えば試料５２としての細胞の核であり、試料５２である細胞はシャーレ５３内の培養液５４内に配置されている。シャーレ５３は、載置台を兼ねるガラス基板としてのカバーガラス５５上に載置されていて、シャーレ５３とカバーガラス５５との間に界面５６が形成される。

カバーガラス５５は、対物レンズ装置５７の上に、所定の光学的カップリング部材５８を介して配置されている。なお、対物レンズ装置５７内の図示しない対物レンズの光軸を、観察対象物５１に対して相対的に移動可能とすることもできる。

第２の構成例の光学顕微鏡は、対物レンズ装置５７内の対物レンズ、第１ミラー５８、ハーフミラー５９、第２ミラー６０、接眼レンズ６１、カメラ用レンズ６２、撮像装置であるカメラ６３により構成される観察光学系と、オートフォーカス光源部７１、ハーフミラー７２，フォーカス光路調整部７３、ダイクロイックミラー７４、オートフォーカス集光部７５、オートフォーカス受光部７６により構成されるオートフォーカス光学系とを備えている。

観察光学系は、対物レンズ装置５７内の対物レンズにより得られた観察対象物５１の光像を目視、若しくは、カメラ６３で静止画像または動画像として観察可能とするものである。本構成例の光学顕微鏡では、観察光学系にハーフミラー５９を配置して、接眼レンズ６１を介する目視と、カメラ用レンズ６２とを介するカメラ６３による画像データの取得とを同時に行うことが可能である。

カメラ６３は、ＣＣＤイメージセンサを撮像素子として備えた撮像装置である。本構成例の光学顕微鏡のカメラ６３も、図２で示したように、観察対象物５１の光像を多数個の受光素子がそれぞれ受光する撮像期間と、それぞれの撮像素子で得られた電荷等の電気信号を外部に送出する読出期間との２つの動作期間を、露光タイミングとして持っている。また、カメラ６３は、露光タイミング中の撮像期間と撮像期間との動作タイミングを、光学顕微鏡の制御部９１に伝達する。

カメラ６３で得られた観察対象物５１の撮像画像は、電気信号として、例えば外部機器であるコンピュータ９２に送出され、所望の画像処理が行われた後にコンピュータモニタに表示される。なお、カメラ部６３により得られた撮像画像のデータを、光学顕微鏡に付随するモニタ部に映出させることも可能であるのは、図１を用いて説明した第１の構成例の光学顕微鏡と同様である。

オートフォーカス光学系のオートフォーカス光源部７１は、図１で示した第１の構成例のものと同様、一例として近赤外光を発光する赤外ＬＥＤからなるフォーカス用光源７７と、スリット７８、コリメータレンズ７９、図示しない瞳制限部などにより構成されていて、オートフォーカス光を、カメラ部６３の非撮像期間である読み出し期間中に照射する。

オートフォーカス光源部７１から照射されたオートフォーカス光は、ハーフミラー７２、フォーカス光路調整部７３、赤色光を反射するダイクロイックミラー７４を介して対物レンズ装置５７の対物レンズに入射し、シャーレ５３とカバーガラス５４との間の界面５６に集光される。シャーレ５３とカバーガラス５４との間の界面５６で反射したオートフォーカス光は、ダイクロイックミラー７４、フォーカス光路調整部７３、ハーフミラー７２を経て、オートフォーカス集光部７５に入射する。

オートフォーカス集光部７５に入射したオートフォーカス光は、オートフォーカス対物レンズ８０で集光されて、スリット部やリレーレンズを備えた結像部８１でスリット像として一旦結像され、シリンドリカルレンズ８２を経てオートフォーカス受光部７６で再び結像する。

オートフォーカス受光部７６は、ＣＣＤイメージセンサなどの受光素子により光信号を電気信号に変換するものであり、結像したオートフォーカス光のスリット像を電気信号として検知し、フォーカス状態を制御部９１に伝達する。

制御部９１は、オートフォーカス受光部７６から伝達されたオートフォーカス光におけるスリット像の状態から、対物レンズ装置５７でのフォーカス状態を判断し、フォーカスにずれが生じているようであれば、対物レンズ装置を調整して対物レンズの焦点位置を修正しフォーカス状態を保つように制御する。なお、第２の構成例の光学顕微鏡では、特許文献２に開示されたオートフォーカス装置と同様に、フォーカス光学系内にフォーカス調整レンズ７３を備えていて、シャーレ５３とカバーガラス５４との間の界面５６で反射したオートフォーカス光に所定のフォーカスオフセット量を設定することで、オートフォーカス光の実際の反射面である界面５６から所定の間隔を隔てて位置する、観察対象物５１に対するフォーカス状態を維持することができる構成となっている。

図３に示す第２の構成例の光学顕微鏡においても、制御部９１が、観察光学系のカメラ６３における各撮像素子からの画像信号の読み出しのタイミングと、オートフォーカス光学系のフォーカス光源７７におけるオートフォーカス光の照射タイミングとを、図２に示すように、オートフォーカス光がカメラ部６３の受光素子からの電気信号の読出期間の間に照射されるように制御している。このため、図３に示した第２の構成例の光学顕微鏡においても、オートフォーカス光学系で得られたフォーカス画像に基づくフォーカス動作において、オートフォーカス光の照射をカメラ部６３の撮像素子の読出期間内に終了させることで、カメラ部６３では、オートフォーカス光が照射されていない期間のみの観察対象物５１の画像データを得ることができる。

なお、図１で示した第１の構成例と同様に、図３に示した倒立型の第２の構成例においても、観察光学系、オートフォーカス光学系として、従来公知の構成を用いることができる。このため、図３に示した構成はあくまで構成例に過ぎない。また、図３に示した第２の構成例の光学顕微鏡においても、図示していない照射光源を、観察光学系の一部を介して観察対象物５１を照射するように配置することができる。また、図３に示した対物レンズ装置５７内で、倍率の異なる複数の対物レンズを自動的に交換可能に配置することができる。これとは逆に、図３を用いて説明した第２の構成例で採用しているフォーカス調整レンズを、オートフォーカス光学系内に備えることで、図１を用いて説明した第１の構成例の光学顕微鏡においても、オートフォーカス光に所定のフォーカスオフセット量を設定可能とすることができる。

以上説明したように、本実施形態の光学顕微鏡では、オートフォーカスを行うために照射されるフォーカス光源からのオートフォーカス光の照射タイミングを、観察対象物の画像データを取得する撮像装置における、画像データを撮像しない非撮像期間に照射するように制御する。このようにすることで、撮像装置で撮像される観察対象物の撮像画像にオートフォーカス光の影響が及ぶことを確実に回避することができる。

図４は、従来の光学顕微鏡によって得られた、細胞膜に蛍光タンパク質を発現するHeLa細胞の蛍光画像（図４（ａ））と、細胞膜に化学発光タンパク質を発現する同一細胞の化学発光画像（図４（ｂ））とを比較するものである。なお、対物レンズとしては、６０倍のものを用いている。図４に示すように、化学発光観察では観察対象物の輝度が小さいため、細胞の構成がほとんど観察できない。

これに対して、図５は、化学発光タンパク質から高輝度蛍光タンパク質への高効率ＦＲＥＴにより高輝度化された発光タンパク質Nano-lanternによるミトコンドリアの、蛍光観察による画像（図５（ａ））と、化学発光観察による画像（図５（ｂ））とを示すものである。なお、対物レンズとしては、６０倍のものを用いている。

図５に示すように、化学発光観察においても蛍光観察と同等の鮮明な観察画像を得ることができた。このため、励起光である紫外光を照射する必要があるため観察対象の細胞にダメージを与えてしまうおそれのある蛍光観察と比較して、より好適な細胞観察が可能となる。Nano-lanternは高輝度化学発光プローブであるため、ビデオレートでの観察が可能である。したがって本実施形態の光学顕微鏡と組み合わせることで、温度変化やステージ変動によるフォーカスずれを気にすることなく、高速な細胞観察が可能となる。

なお、蛍光観察を行うための励起光を照射する構成を備えることで、本実施形態で説明した光学顕微鏡を蛍光観察に用いることができる。また、上記実施形態で説明したオートフォーカス照射光は、観察対象である細胞に刺激を与えるための照射エネルギー０．１〜１Ｗ／ｃｍ²と比較して照射エネルギーが十分に小さいため、オートフォーカス光の照射によって観察対象の細胞が不所望な反応を起こしてしまうおそれはない。

さらに、本開示にかかる光学顕微鏡では、オートフォーカス光が照射されているタイミングが画像データの取得タイミングとは異なるため、オートフォーカス光として可視領域範囲外の光に限らず、可視光を用いることも可能である。このため、オートフォーカス光として、オートフォーカスを正確に、かつ、短時間で行うことができる所望の波長の光を用いることができ、オートフォーカス精度の向上を図ることが可能となる。また、化学発光観察の場合のように観察対象物の発する光量が小さい場合には、オートフォーカス光を照射するために観察光学系内に配置されるダイクロイックミラーを、より透過率の高いものを用いるようにして、観察対象物の発光をなるべく減光せずに検出できるようにすることが考えられる。

さらにまた、上記本実施形態の光学顕微鏡では、撮像装置としてＣＣＤイメージセンサを用いる例を開示したが、例えばＣＭＯＳイメージセンサなどの他の半導体型の撮像素子を備えた撮像装置を使用することができる。ＣＭＯＳイメージセンサの場合には、ＣＣＤイメージセンサのように受光素子に蓄えられた電荷を一括して読み出す読出期間が設けられず、ライン順次方式での読み出しとなるが、いわゆるブランク期間が非撮像期間となるため、この非撮像期間にオートフォーカス光を照射することができる。さらに、本実施形態の光学顕微鏡に用いられる撮像装置は、これらの半導体型撮像素子を備えたものに限らない。例えばフォトマルなどの真空管方式の撮像素子、その他各種の撮像素子を備えた撮像装置を用いることができる。この場合、撮像装置によっては、ＣＣＤの読出期間のような非撮像期間を動作期間中に備えることが必須ではない場合もあり得るが、その場合には、動作期間中に強制的に非撮像期間を形成して、この非撮像期間にタイミングを合わせてオートフォーカス光を照射するようにすればよい。

本願で開示する光学顕微鏡、および、光学顕微鏡のオートフォーカス装置は、化学発光観察をはじめとする各種方法での画像イメージ化ができる光学顕微鏡、そのオートフォーカス装置として、幅広い分野での用途が期待できる。

Claims (8)

1. 対物レンズで得られた観察対象物の光像を撮像装置で撮像し、画像信号として送出可能な観察光学系と、
   フォーカス用光源から照射されたオートフォーカス光に基づいて前記対物レンズの焦点位置を調整し、前記観察対象物に対してフォーカスさせるオートフォーカス装置とを備え、
   前記撮像装置が、撮像期間と非撮像期間とを繰り返しながら前記撮像期間の撮像画像を連続して得ることで前記観察対象物の動画像を撮像するとともに、前記撮像期間と前記非撮像期間との動作タイミングを出力し、
   前記動作タイミングに基づいて、前記撮像装置が前記観察対象物の画像を撮像していない前記非撮像期間に前記フォーカス用光源から前記オートフォーカス光が照射されることを特徴とする光学顕微鏡。
2. 前記オートフォーカス装置は、複数回の前記非撮像期間の内の所定の非撮像期間を選択し、選択された前記非撮像期間においてのみオートフォーカス動作を行う請求項１に記載の光学顕微鏡。
3. 前記撮像装置が、撮像素子としてＣＣＤイメージセンサ、または、ＣＭＯＳイメージセンサを備え、前記非撮像期間が前記撮像素子が撮像データを転送する読出期間である請求項１または２に記載の光学顕微鏡。
4. 前記フォーカス用光源が照射する前記オートフォーカス光が可視領域外の赤外光である請求項１〜３のいずれかに記載の光学顕微鏡。
5. 化学反応で発光する発光物質を前記観察対象物として観測する化学発光観察に用いられる請求項１〜４のいずれかに記載の光学顕微鏡。
6. 前記観察対象物が載置されるガラス基板の界面から所定の距離離れた位置に存在する観測対象部分に対し、前記ガラス基板の界面で反射された前記オートフォーカス光によりオートフォーカスを行うフォーカス調整レンズを備えた請求項１〜５のいずれかに記載の光学顕微鏡。
7. 前記対物レンズが前記観察対象物の下方に位置する倒立型顕微鏡である請求項１〜６のいずれかに記載の光学顕微鏡。
8. 対物レンズで得られた観察対象物の光像を画像信号として送出可能な撮像装置を備えた光学顕微鏡に用いられ、フォーカス用光源から照射されるオートフォーカス光の反射光に基づいて前記対物レンズのフォーカス位置を調整するオートフォーカス装置であって、
   前記撮像装置が、撮像期間と非撮像期間とを繰り返しながら前記撮像期間の撮像画像を連続して得ることで前記観察対象物の動画像を撮像するとともに、前記撮像期間と前記非撮像期間との動作タイミングを出力し、前記動作タイミングに基づいて、前記撮像装置が前記観察対象物の画像を撮像していない前記非撮像期間に前記フォーカス用光源から前記オートフォーカス光を照射することを特徴とする光学顕微鏡のオートフォーカス装置。