JP6067232B2 - 網膜層特異的神経細胞を製造する方法 - Google Patents

Description

本発明は、網膜層特異的神経細胞を製造する方法等に関するものである。

これまでに、網膜組織を構成する網膜層特異的神経細胞（視細胞、水平細胞、アマクリン細胞、神経節細胞など）を多能性幹細胞から製造する報告が知られている（特許文献１）。

国際公開第2008/087917号

ヒト多能性幹細胞由来網膜層特異的神経細胞を化学物質の毒性や薬効評価スクリーニングなどに産業利用するためには、さらに高効率に網膜層特異的神経細胞を製造することが切望されていた。

本発明者らは、このような状況を鑑み鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は
［１］ 霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織に含まれる網膜前駆細胞に、Notchシグナル経路阻害物質を接触させることを特徴とする網膜層特異的神経細胞の製造方法。
［２］ 前記Notchシグナル経路阻害物質が、ガンマセクレターゼ活性阻害物質であることを特徴とする前項［１］記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
［３］ 前記Notchシグナル経路阻害物質が、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシン ｔ−ブチルエステル（以下、「ＤＡＰＴ」という場合がある）であることを特徴とする前項［１］又は［２］記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
［４］ 前記霊長類が、ヒトであることを特徴とする前項［１］〜［３］のいずれか記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
［５］ 網膜層特異的神経細胞が視細胞であることを特徴とする前項［１］〜［４］のいずれか記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
［６］ 網膜層特異的神経細胞が神経節細胞であることを特徴とする前項［１］〜［４］のいずれか記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
［７］ 霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織に含まれる網膜前駆細胞が、以下の工程で製造された網膜組織に含まれる網膜前駆細胞であることを特徴とする前項［１］〜［６］のいずれか記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
（１）霊長類多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより霊長類多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
（２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程
（３）第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程および
（４）第三工程で培養された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグ（以下、「Ｓｈｈ」という場合がある）シグナル経路作用物質とWntシグナル経路作用物質とを含む無血清培地中又は血清培地中で浮遊培養することにより、眼杯様構造体を形成させる第四工程
（５）第四工程で形成された眼杯様構造体を、浮遊培養する工程
［８］ 前項［１］〜［７］のいずれか記載の製造方法により製造される網膜層特異的神経細胞の毒性・薬効評価用試薬としての使用。
［９］ 前項［１］〜［７］のいずれか記載の製造方法により製造される網膜層特異的神経細胞の移植用生体材料としての使用。

本発明製造方法によれば、霊長類多能性幹細胞由来網膜組織から高効率に網膜層特異的神経細胞を製造することが可能である。従って、本発明製造方法は、培養細胞を用いた化学物質等の毒性・薬効評価スクリーニングや細胞治療などを目的として、網膜層特異的神経細胞（視細胞、神経節細胞など）を効率よく製造するという観点から非常に有用である。

図１は、Crx::GFPノックインヒトES細胞由来の浮遊培養開始29日目網膜組織を10μM DAPTを添加した条件で浮遊培養開始41日目まで浮遊培養した場合の蛍光顕微鏡（A）とDAPTを添加しない条件で浮遊培養開始41日目まで浮遊培養した場合の蛍光顕微鏡（B）、10μM DAPTを添加した条件で浮遊培養開始43日目まで浮遊培養した場合の凍結切片を坑Recoverin抗体で免疫染色した写真（C）と坑Brn3抗体で免疫染色した写真（E）、DAPTを添加しない条件で分化誘導43日目まで浮遊培養した場合の凍結切片を坑Recoverin抗体で免疫染色した写真（D）と坑Brn3抗体で免疫染色した写真（F）を示す図である。 図２は、Crx::GFPノックインヒトES細胞由来の浮遊培養開始33日目網膜組織を凍結融解した後の浮遊培養開始38日目網膜組織を10μM DAPTを添加した条件で浮遊培養開始49日目まで浮遊培養した場合の蛍光顕微鏡（A）とDAPTを添加しない条件で浮遊培養開始49日目まで浮遊培養した場合の蛍光顕微鏡（B）、10μM DAPTを添加した条件で浮遊培養開始49日目まで浮遊培養した場合の凍結切片を坑Recoverin抗体で免疫染色した写真（C）と坑Brn3抗体で免疫染色した写真（E）、DAPTを添加しない条件で浮遊培養開始49日目まで浮遊培養した場合の凍結切片を坑Recoverin抗体で免疫染色した写真（D）と坑Brn3抗体で免疫染色した写真（F）を示す図である。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。

本発明における「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターを意味する。このようなベクターとしては、例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体及び植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能であり、又は、染色体中への組込みが可能である、ポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているもの等を挙げることができる。
このようなベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」と記すこともある。このようなクローニングベクターは、通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。現在、遺伝子のクローニングに使用可能なベクターは、当該技術分野において多数存在しており、販売元により、微妙な違い（例えば、マルチクローニングサイトの制限酵素の種類や配列）から名前を代えて販売されている。例えば、「Molecular Cloning（3rd edition）」 by Sambrook, J and Russell, D.W., Appendix 3 (Volume 3)， Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor USA, 2001)） に代表的なものが記載（発売元も記載）されており、このようなものを当業者は適宜目的に応じて使用することができる。

本発明における「ベクター」は、「発現ベクター」、「レポーターベクター」、「組換えベクター」も含む。尚、「発現ベクター」とは、構造遺伝子及びその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主細胞の中で作動し得る状態で連結されている核酸配列を意味する。「調節エレメント」としては、例えば、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー、及び、エンハンサーを含むもの等を挙げることができる。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプ及び使用される調節エレメントの種類が宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。

本発明における「組換えベクター」としては、例えば、（ａ）ゲノムライブラリーのスクリーニングのためには、ラムダFIXベクター（ファージベクター）、（ｂ）cDNAのスクリーニングのためには、ラムダZAPベクター（ファージベクター）、（ｃ）ゲノムＤＮＡのクローニングするためには、例えば、pBluescript II SK＋/−, pGEM，pCR2.1ベクター（プラスミドベクター）等を挙げることができる。また「発現ベクター」としては、例えば、pSV2/neoベクター、pcDNAベクター、pUC18ベクター、pUC19ベクター、pRc/RSVベクター、pLenti6/V5-Destベクター、pAd/CMV/V5-DESTベクター、pDON-AI-2/neoベクター、pMEI-5/neoベクター等（プラスミドベクター）等を挙げることができる。また「レポーターベクター」としては、例えば、pGL2ベクター、pGL3ベクター、pGL4.10ベクター、pGL4.11ベクター、pGL4.12ベクター、pGL4.70ベクター、pGL4.71ベクター、pGL4.72ベクター、pSLGベクター、pSLOベクター、pSLRベクター、pEGFPベクター、pAcGFPベクター、pDsRedベクター等を挙げることができる。このようなベクターは、前述のMolecular Cloning誌を参考にして適宜利用すればよい。

本発明における核酸分子を細胞内に導入する技術としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション等を挙げることができる。このような導入技術としては、具体的には例えば、Ausubel F. A.ら編（１９８８）、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J.ら（１９８７）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.及びその第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７等に記載される方法等を挙げることができる。遺伝子が細胞内に導入されたことを確認する技術としては、例えば、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析又は他の周知慣用技術等を挙げることができる。

本発明における「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持する細胞のことであり、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。ここで幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞ともいう）、又は人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell細胞）であり得るがそれらに限定されない。上記の幹細胞由来の組織細胞は組織再生が可能なことから分かるように生体に近い正常な細胞を分化できることが知られている。

幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。マウス胚性幹細胞であるＥＢ５細胞は、独立行政法人理化学研究所より、Ｄ３株は、ＡＴＣＣより入手可能である。

幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、幹細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅconfidential- 11 -ｎｔ（ＫＳＲ）、ＬＩＦを添加した無フィーダー細胞による培養により維持できる。

本発明における「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、胎盤を除く生体を構成するすべての細胞（三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）由来の組織）に分化しうる能力（分化万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいい、胚性幹細胞（ES細胞）もこれに含まれる。「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞から得られる。また、体細胞に数種類の遺伝子を導入することにより、胚性幹細胞に似た分化万能性を人工的に持たせた細胞（人工多能性幹細胞ともいう）も含む。多能性幹細胞は、自体公知の方法で作成することが可能である。作成方法としては、例えばＣｅｌｌ １３１（５）ｐｐ．８６１−８７２や、Ｃｅｌｌ １２６（４）ｐｐ．６６３−６７６に記載の方法などが挙げられる。

本発明における「胚性幹細胞（ES細胞）」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性「pluripotency」）を有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。

本発明における「人工多能性幹細胞」とは、繊維芽細胞等分化した細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc等数種類の遺伝子の発現により直接初期化して多分化能を誘導した細胞であり、2006年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Takahashi K, Yamanaka S.Cell. 2006, 126(4), p663-676）。2007年、ヒト繊維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多分化能を有する（Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Cell.2007, 131(5),p861-872. 、Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA.,Science. 2007, 318(5858), p1917-1920. 、Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Nat Biotechnol., 2008, 26(1), p101-106）。

遺伝子改変した多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変多能性幹細胞の作製に際して改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法を用い、行うことができる。

具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離したゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製したターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子を改変した幹細胞を作製することができる。

標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭＫｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することができる。

標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。なお、ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができ、また、選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。

選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。

本発明における「組織」とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。

本発明における「網膜組織」とは生体網膜において各網膜層を構成する視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、これらの前駆細胞または網膜前駆細胞などの細胞が、少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した網膜組織を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現により確認できる。

網膜細胞マーカーとしては、Ｒaｘ（網膜の前駆細胞）、ＰＡＸ６（前駆細胞），ｎｅｓｔｉｎ（視床下部ニューロンの前駆細胞では発現されるが網膜前駆細胞では発現されない）、Ｓｏｘ１（視床下部神経上皮で発現され、網膜では発現されない）、Ｃｒｘ（視細胞の前駆細胞）、などが挙げられるが、これらに限定されない。また特に、上記網膜層特異的ニューロンのマーカーとしては、Ｃｈｘ１０（双極細胞）、Ｌ７（双極細胞）、 Ｔｕｊ１（節細胞）、Ｂｒｎ３ （節細胞）、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ（アマクリン細胞）、Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ（水平細胞）、Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ（視細胞）、Recoverin（視細胞）、ＲＰＥ６５（色素上皮細胞）、Ｍｉｔｆ （色素上皮細胞）Nrl（杆体細胞）、Rxr-gamma（錐体細胞）などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明における「網膜層」とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層および内境界膜を挙げることができる。

本発明における「網膜層特異的神経細胞」とは、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞を意味する。

本発明における「網膜前駆細胞」とは、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞のいずれの成熟な網膜細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。
一方、視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜節細胞前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。

本発明において用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。

本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に該当するものとする。

培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。しかしながら、調製の煩雑さを回避するという観点からは、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲを適量（例えば、１−２０％）添加した無血清培地（ＧＭＥＭ又はｄＭＥＭ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム）を使用できる。

また、無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。

また、浮遊培養で用いる無血清培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有できる。

本発明における「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。また、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有できる。

本発明における「浮遊培養」とは、細胞または細胞塊を培養器材等に接着させない条件で培養することをいう。

浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。そしてこれらの培養器は、浮遊培養する観点から、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものを使用できる。

本発明における「霊長類」とは、霊長目に属するほ乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザルやロリス、ツバイなどの原猿亜目と、サル、類人猿、ヒトなどの真猿亜目が挙げられる。

＜本発明製造方法について＞
次に、本発明製造方法について説明する。本発明製造方法は、霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織に含まれる網膜前駆細胞に、Notchシグナル経路阻害物質を接触させることを特徴とする網膜層特異的神経細胞の製造方法である。本発明製造方法によると、網膜前駆細胞から網膜層特異的神経細胞を製造することができる。

＜Notchシグナル経路阻害物質＞
本発明製造方法で用いるNotchシグナル経路阻害物質について説明する。

Notchシグナル経路作用物質は、Notchにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Notchシグナル経路作用物質としては、例えば、Notch受容体、Notch受容体アゴニスト、Notchリガンド（Delta様 (DLL1、DLL3、DLL4) 及びJagged (JAG1、JAG2) ファミリー）、ガンマセクレターゼ阻害剤などをあげることができる。

ガンマセクレターゼ阻害剤としては、例えば、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシン ｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）を挙げることが出来る。

ガンマセクレターゼ阻害剤の濃度は、網膜前駆細胞から視細胞前駆細胞又は視細胞への分化を促進し得る濃度である限り特に限定されない。かかる濃度は、例えば一般的なガンマセクレターゼ阻害剤の場合、約０．１〜１０００μＭ、好ましくは約１〜１００μＭ、より好ましくは約１０μＭであり得る。

ガンマセクレターゼ阻害剤は、霊長類多能性幹細胞から製造される網膜組織のうち、霊長類多能性幹細胞の浮遊培養開始後１５日目以降２００日目以内に培地中に添加される。好ましくは、ガンマセクレターゼ阻害剤は、分化誘導２０日目以降１５０日目以内、より好ましくは分化誘導２５日以降１００日以内の時期に培地に添加される。

ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下での接着培養の期間は、視細胞前駆細胞又は視細胞をより効率的に産生できる長さであり得る。かかる期間の長さは、例えば約３日間以上、好ましくは約５〜１００日間、より好ましくは約７〜３０日間であり得る。

＜霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織の製造方法＞
本発明製造方法で用いる「霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織」について説明する。

霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織は、例えば、以下の［１］（霊長類多能性幹細胞から網膜組織を製造する方法）又は［２］（霊長類多能性幹細胞から眼杯様構造体を製造し、さらに眼杯様構造体から網膜組織を製造する方法）の製造方法により製造することができる。

［１］．下記（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする網膜組織の製造方法。
（１）霊長類多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより霊長類多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
（２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程、及び
（３）第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程

Ｗｎｔシグナル経路阻害物質は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル経路阻害物質としては、例えば、Ｄｋｋ１、Cerberus蛋白、Ｗｎｔ受容体阻害剤、可溶型Ｗｎｔ受容体、Ｗｎｔ抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、ドミナントネガティブＷｎｔ蛋白、ＣＫＩ−７（Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロ−イソキノリン−８−スルホンアミド）、Ｄ４４７６（４−{４−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル）−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミイダゾール−２−イル}ベンズアミド）、IWR-1-endo（IWR1e）、IWP-2などが挙げられる。

上記［１］の製造方法に用いられるＷｎｔシグナル経路阻害物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体が形成する濃度であればよい。例えばIWR1e等の通常のＷｎｔシグナル経路阻害物質の場合は、約0.1μM 〜100μM、好ましくは約1μM〜10μM、より好ましくは3μM前後の濃度で添加する。

Ｗｎｔシグナル経路阻害物質は、浮遊培養前に無血清培地に添加されていてもよく、また、浮遊培養開始後数日以内（例えば、５日以内）に培地に添加してもよい。好ましくは、Ｗｎｔシグナル経路阻害物質は、浮遊培養開始後５日以内、より好ましくは３日以内、最も好ましくは浮遊培養開始と同時に無血清培地に添加する。また、Wntシグナル経路阻害物質を添加した状態で、浮遊培養開始後1８日目まで、より好ましくは１２日目まで培養する。

第一工程における培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃前後である。またＣＯ_２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％前後である。

本発明における「凝集体」とは、培地中に分散していた細胞が集合して形成した塊をいうが、本発明における「凝集体」には、浮遊培養開始時に分散していた細胞が形成した凝集体と浮遊培養開始時に既に形成されていた凝集体とが含まれるものとする。
「凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞の凝集体を形成させて培養させる際に、「一定数の分散した幹細胞を迅速に凝集」させることで質的に均一な細胞の凝集体を形成させることをいう。

凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えば、ウェルの小さなプレート（９６穴プレート）やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法などが挙げられる。

第一工程における多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように当業者であれば適宜設定することができる。凝集体形成時の多能性幹細胞の濃度は、幹細胞の均一な凝集体を形成可能な濃度である限り特に限定されないが、例えば９６穴マイクロウェルプレートを用いてヒトＥＳ細胞を浮遊培養する場合、１ウェルあたり約１×１０の３乗〜約５×１０の４乗細胞、好ましくは約３×１０の３乗〜約３×１０の４乗細胞、より好ましくは約５×１０の３乗〜約２×１０の４乗細胞、最も好ましくは９×１０の３乗細胞前後となるように調製した液を添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。

多能性幹細胞の凝集体が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき、当業者であれば判断することが可能である。

（２）第二工程
第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程について説明する。

「基底膜標品」としては、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播腫して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現などを制御する機能を有するような基底膜構成成分を含むものをいう。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層などとの間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリックス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて除去することで作成することができる。好ましい基底膜標品としては、基底膜成分として市販されている商品（例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（以下マトリゲルという場合もある））や、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子（例えばラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなど）を含むものが挙げられる。

Ｍａｔｒｉｇｅｌは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。Ｍａｔｒｉｇｅｌの主成分はＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンであるが、これらに加えてＴＧＦ−β、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、組織プラスミノゲン活性化因子、ＥＨＳ腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。Ｍａｔｒｉｇｅｌの「ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ製品」は、通常のＭａｔｒｉｇｅｌよりも増殖因子の濃度が低く、その標準的な濃度はＥＧＦが＜０．５ｎｇ／ｍｌ、ＮＧＦが＜０．２ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦが＜５ｐｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−１が５ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ−βが１．７ｎｇ／ｍｌである。本発明の方法では、「ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ製品」の使用が好ましい。

第二工程における浮遊培養で無血清培地に添加される基底膜標品の濃度としては、神経組織（例えば網膜組織）の上皮構造が安定に維持される限り特に限定されないが、例えばＭａｒｔｉｇｅｌを用いる場合には、好ましくは培養液の１／２０〜１／２００の容量、より好ましくは１／１００前後の容積を挙げることができる。基底膜標品は幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、好ましくは、浮遊培養開始後５日以内、より好ましくは浮遊培養開始２日以内に無血清培地に添加される。

第二工程で用いられる無血清培地は、第一工程で用いた無血清培地をそのまま用いることもできるし、新たな無血清培地に置き換えることもできる。
第一工程で用いた無血清培地をそのまま本工程に用いる場合、「基底膜標品」を培地中に添加すればよい。

第一工程及び第二工程における浮遊培養に用いられる無血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。しかしながら、調製の煩雑さを回避観点から、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を適量添加した無血清培地（ＧＭＥＭ又はｄＭＥＭ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの投与量としては特に限定されず、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常１〜２０％であり、好ましくは２〜２０％である。

第二工程における培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃前後である。またＣＯ_２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％前後である。

（３）第三工程
第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程について説明する。

第三工程で用いられる血清培地は、第二工程で培養に用いた無血清培地に血清を直接添加したものを用いてもよいし、新たな血清培地におきかえたものを用いてもよい。

第三工程で培地に添加される血清として、例えば、牛血清、仔牛血清、牛胎児血清、馬血清、仔馬血清、馬胎児血清、ウサギ血清。仔ウサギ血清、ウサギ胎児血清、ヒト血清など哺乳動物の血清などを用いることが出来る。

血清の添加は、浮遊培養開始後７以降、より好ましくは9日目以降、最も好ましくは12日目に行う。血清濃度については、約1〜30％、好ましくは約3〜20%、より好ましくは10%前後で添加する。

第三工程において、血清に加えてShhシグナル経路作用物質を添加することで網膜組織の製造効率を上昇させることが出来る。

第三工程で用いられる血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されないが、前記無血清培地（ＧＭＥＭ又はDＭＥＭ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム）に血清を添加したものを用いることが好ましい。
また、かかる血清培地として、市販のＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を適量添加したものを用いてもよい。

第三工程において、血清に加えてShhシグナル経路作用物質を添加することで網膜組織の製造効率を上昇させることが出来る。

Shhシグナル経路作用物質としては、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル経路作用物質としては、例えば、Hedgehogファミリーに属する蛋白（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、Purmorphamine、SAGなどが挙げられる。

上記［１］の製造方法に用いられるShhシグナル経路作用物質の濃度は、例えばSAG等の通常のＳｈｈシグナル経路作用物質の場合は、約0.1nM 〜10μM、好ましくは約10nM〜1μM、より好ましくは100nM前後の濃度で添加する。

このようにして製造された網膜組織は、凝集体の表面を覆うように存在する。上記［１］の製造方法により、網膜組織が製造されたことの確認は、免疫染色法等により確認することができる。
また、凝集体の表面に存在する網膜組織をピンセット等を用いて、凝集体から物理的に切り出すことも可能である。この場合、各凝集体の表面には、網膜組織以外の神経組織が形成される場合もあるため、凝集体から切り出した神経組織の一部を切り取り、これを用いて免疫染色法等により確認することで、その組織が網膜組織であることを確認することが出来る。

［２］．下記（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とする眼杯様構造体を製造する方法。
（１）霊長類多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
（２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程
（３）第二工程で培養された凝集体を血清培地中で浮遊培養する第三工程および
（４）第三工程で培養された凝集体を、Shhシグナル経路作用物質とWntシグナル経路作用物質とを含む無血清培地中又は血清培地中で浮遊培養することにより、眼杯様構造体を形成させる第四工程
（５）第四工程で形成された眼杯様構造体を、浮遊培養する工程

（１）第一工程
第一工程において用いられるWntシグナル経路阻害物質、培養条件および好ましい形態等は、上記［１］の製造方法の第一工程において用いられるものと同様のものが挙げられる。

（２）第二工程
第二工程において用いられる基底膜標品、培養条件および好ましい形態等は、上記［１］の製造方法の第二工程において用いられるものと同様のものが挙げられる。

（３）第三工程
第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程について説明する。

第三工程で用いられる血清培地は、第二工程で培養に用いた無血清培地に血清を直接添加したものを用いてもよいし、新たな血清培地におきかえたものを用いてもよい。

第三工程で培地に添加される血清として、例えば、牛血清、仔牛血清、牛胎児血清、馬血清、仔馬血清、馬胎児血清、ウサギ血清。仔ウサギ血清、ウサギ胎児血清、ヒト血清など哺乳動物の血清などを用いることが出来る。

血清の添加は、例えばヒトES細胞を浮遊する場合、浮遊培養開始後7日目以降、より好ましくは9日目以降、最も好ましくは12日目に行う。血清濃度については、約1〜30％、好ましくは約3〜20%、より好ましくは10%前後で添加する。

第三工程で用いられる血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されないが、前記無血清培地（ＧＭＥＭ又はDＭＥＭ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム）に血清を添加したものを用いることが好ましい。
また、かかる血清培地として、市販のＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を適量添加したものを用いてもよい。
（４）第四工程
第三工程で培養された凝集体を、Shhシグナル経路作用物質とWntシグナル経路作用物質とを含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養する第四工程について説明する。

Ｓｈｈシグナル経路作用物質としては、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル経路作用物質としては、例えば、Hedgehogファミリーに属する蛋白（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、Purmorphamine、SAGなどが挙げられる。

上記［２］の製造方法に用いられるShhシグナル経路作用物質の濃度は、例えばSAG等の通常のＳｈｈシグナル経路作用物質の場合は、約0.1nM 〜10μM、好ましくは約10nM〜1μM、より好ましくは100nM前後の濃度で添加する。

Wntシグナル経路作用物質としては、例えばWntファミリーに属するタンパク質、Wnt受容体、Wnt受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤（例えば、6-Bromoindirubin-3'-oxime（BIO）、CHIR99021、Kenpaullone）などが挙げられる。

上記［２］の製造方法に用いられるWntシグナル経路作用物質の濃度は、例えばCHIR99021等の通常のWntシグナル経路作用物質の場合には、約0.1μM 〜100μM、好ましくは約1μM〜30μM、より好ましくは3μM前後の濃度で添加する。

Shhシグナル経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質は、分化誘導開始後12日目以降25日目以内に添加する。好ましくは、15日目以降18日目以内に添加する。この際、第一工程で添加したWntシグナル経路阻害物質を含まない培地を使用することが好ましい。

浮遊培養開始から１８日目以降に、凝集体中から、眼杯様構造体が突起状に形成される。眼杯様構造体であるかは、当業者であれば顕微鏡、拡大鏡等による観察で確認が可能である。

（５）第四工程で形成された眼杯様構造体を、浮遊培養する工程
第四工程で形成された眼杯様構造体を、浮遊培養する工程について説明する。

眼杯様構造体は、上述の通り、凝集体中から突起状に形成されるので、当該突起を凝集体から物理的、形態的に切り出し、分離・培養することによって高純度の網膜組織を得ることができる。眼杯様構造体の切り出し方法としては特に限定されず、幹細胞の凝集体から微細ピンセットなどを用いて容易に切り出すことが可能である。

上述のように製造した眼杯様構造体には網膜前駆細胞が含まれており、前記網膜前駆細胞にNotchシグナル経路阻害物質を接触させることにより、網膜前駆細胞から網膜層特異的神経細胞を製造することができる。

＜網膜層特異的神経細胞の確認方法＞
上述のように製造された網膜層特異的神経細胞を確認する方法として、網膜層特異的神経細胞が視細胞、視細胞前駆体、神経節細胞である場合を例として、説明する。

製造された網膜層特異的神経細胞が、視細胞前駆細胞であるか否かは、公知の方法、例えば、視細胞前駆細胞マーカーの発現により確認できる。視細胞前駆細胞マーカーとしては、例えば、Ｃｒｘが挙げられる。

視細胞には桿体視細胞及び錐体視細胞が含まれる。製造された細胞が視細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、視細胞マーカーの発現により確認できる。視細胞マーカーとしては、例えば、ロドプシン（桿体視細胞）、赤／緑オプシン（錐体視細胞）、青オプシン（錐体視細胞）、リカバリン（桿体視細胞、錐体視細胞）等が挙げられる。

また、製造された網膜層特異的神経細胞が、神経節細胞であるか否かは、公知の方法、例えば、神経節細胞マーカーの発現により確認できる。神経節細胞マーカーとしては、例えば、Ｂｒｎ３が挙げられる。

接着培養の終了後、網膜組織から視細胞前駆細胞又は視細胞が単離され得る。この単離は視細胞前駆細胞又は視細胞の表面マーカーに対する抗体等を用いて、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。また、培養の終了後、網膜組織から神経節細胞が単離され得る。この単離は神経節細胞の表面マーカーに対する抗体等を用いて、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。あるいは、多能性幹細胞として、視細胞前駆細胞のマーカー（例えばCrx）をコードする遺伝子や視細胞のマーカー（例えばリカバリン）、神経節細胞のマーカー（Brn3）に標識遺伝子（例えばＧＦＰ等の蛍光タンパク質）がインフレームにノックインされた細胞を用い、その標識遺伝子の発現を指標に、自体公知の方法（セルソーター等）によりそれぞれの細胞を単離することが出来る。

＜網膜層特異的神経細胞の毒性・薬効評価用試薬としての使用＞
本発明製造方法により製造された網膜層特異的神経細胞は、網膜層特異的神経細胞の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニング、その他の原因による細胞損傷状態における治療薬に対しての細胞治療用移植用材料や疾患研究材料、創薬材料として利用可能である。また化学物質等の毒性・薬効評価においても、光毒性等の毒性研究、毒性試験等に活用可能である。
網膜層特異的神経細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、新生児網膜症、などが挙げられる。

＜網膜層特異的神経細胞の移植用生体材料としての使用＞
本発明製造方法により製造された視細胞及び／又は神経節細胞は、細胞損傷状態において、当該細胞や、障害を受けた組織自体を補充する（例えば、移植手術に用いる）ためなどに用いる移植用生体材料として用いることができる。

以下の比較例および実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
（CrxノックインヒトES細胞の樹立）
視細胞前駆細胞のマーカー遺伝子の1つであるCrx遺伝子座にGFPをノックインしたヒトES細胞株の作製を実施した。
ヒトES細胞株（KhES-1：京都大学が樹立したヒトES細胞株）のゲノムDNA上Crx遺伝子を特異的に切断するZinc Finger Nuclease（ZFN）をSigmaAldrich社から購入した。単一細胞化したヒトES細胞を用いて、エレクトロポレーション法により、ZFNをコードするmRNAとGFP及び薬剤選択遺伝子であるネオマイシン耐性遺伝子が搭載されたノックインベクターを共導入し、マイトマイシンＣ処理したネオマイシン耐性マウス線維芽細胞上へ播種した。播種翌日から培地中にG418を添加し、薬剤選択を行った。得られた耐性クローンのコロニーをピックアップして培養を続け、PCR法やサザンブロット法により、ノックイン細胞を選別し、Crx::GFPノックインヒトES細胞株を樹立した。

実施例１：ヒトES細胞由来網膜組織のNotchシグナル作用物質処理
Crx::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007」に記載の方法に倣って培養し、実験に用いた。培地にはDMEM/F12 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に20%ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、5〜10ng/ml bFGFを添加したものを用いた。０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０＾３細胞になるように１００μｌの無血清培地で３７℃、５％ＣＯ_２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｇ−ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、20μM Ｙ27632、Wntシグナル経路阻害物質（3μM IWR1e）を添加した無血清培地を用いた。また、浮遊培養2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加して浮遊培養した。浮遊培養12日目に容積あたり１／１０量の牛胎児血清及びShhシグナル経路作用物質（100nM SAG）を添加し浮遊培養することで、網膜組織を製造した。浮遊培養開始29日目の網膜組織にNotchシグナル作用物質（10μM DAPT（ガンマセクレターゼ活性阻害剤））を添加し、浮遊培養開始41日目（添加後12日目）に蛍光顕微鏡観察、浮遊培養開始43日目（添加後14日目）に4%パラホルムアルデヒド固定し凍結切片を製造した。製造した凍結切片は視細胞のマーカー遺伝子の１つであるRecoverin、神経節細胞マーカー遺伝子の１つであるBrn3について免疫染色を行い、DAPT添加の有無の結果を比較した。
その結果、DAPTを添加しない場合（図１A）と比較し、DAPTを添加した場合、GFP発現細胞が著しく増加していた（図１B）。また、凍結切片の免疫染色の結果から、DAPTを添加するとRecoverin陽性細胞が3〜5倍増加していることが明らかとなった（図1C,D）。 これらの結果は、視細胞が著しく増加したことを示している。また、Brn3の免疫染色結果から神経節細胞もDAPT添加により増加したことが分かった（図1E,F）。

実施例２：凍結融解後のヒトES細胞由来網膜組織のNotchシグナル作用物質処理
RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007」に記載の方法に倣って培養し、実験に用いた。培地にはDMEM/F12 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に20%ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、5〜10ng/ml bFGFを添加したものを用いた。浮遊培養による網膜組織の製造には、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０＾３細胞になるように１００μｌの無血清培地で３７℃、５％ＣＯ_２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｇ−ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、20μM Ｙ27632、Wntシグナル経路阻害物質（3μM IWR1e）を添加した無血清培地を用いた。また、浮遊培養開始2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加した無血清培地を用いた。また、培養2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加して浮遊培養した。浮遊培養開始12日目に容積あたり１／１０量の牛胎児血清及びShhシグナル経路作用物質（100nM SAG）を添加し浮遊培養することで、網膜組織を製造した。製造した浮遊培養開始33日目の網膜組織を凍結融解後、浮遊培養開始38日目の網膜組織にNotchシグナル作用阻害物質（10μM DAPT）を添加し、浮遊培養開始49日目（添加後11日目）に蛍光顕微鏡観察を実施した後、4%パラホルムアルデヒド固定し凍結切片を製造した。製造した凍結切片は視細胞マーカー遺伝子の１つであるRecoverin、神経節細胞マーカー遺伝子の１つであるBrn3について免疫染色を行い、DAPT添加の有無の結果を比較した。
その結果、DAPTを添加しない場合（図2A）と比較し、DAPTを添加した場合、GFP発現細胞が著しく製造されていた（図2B）。また、凍結切片の免疫染色の結果から、DAPTを添加するとRecoverin陽性細胞が5倍程度製造されていることが明らかとなった（図2C,D）。これらの結果は、視細胞が著しく製造されたことを示している。また、Brn3の免疫染色結果から神経節細胞もDAPT添加により製造されたことが分かった（図2E,F）。

実施例３：ヒトES細胞から製造した網膜層特異的神経細胞の眼への移植
眼球の強膜切開後、強膜切開創から硝子体中に注射針を挿入し、眼圧を低下させる。強膜切開創から網膜下腔に細胞移植針を用いて眼内灌流液を注入し、人工的に浅い網膜剥離の状態を形成する。形成した空間に細胞移植針または細胞移植デバイスを用いて網膜層特異的神経細胞を移植する。

本発明製造方法によれば、高効率に網膜層特異的神経細胞を製造することができる。また、本願発明製造方法により製造した網膜層特異的神経細胞は、化学物質等の毒性・薬効評価を行うための試薬として使用できるため、非常に有用である。

Claims (6)

1. 下記（１）〜（３）の工程により、霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織を製造し、
   製造された網膜組織に含まれる網膜前駆細胞に、Notchシグナル経路阻害物質を接触させることを特徴とする網膜層特異的神経細胞の製造方法。
   （１）霊長類多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質および血清代替物を含む無血清培地中で浮遊培養することにより霊長類多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
   （２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品および血清代替物を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程
   （３）第二工程で培養された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル経路作用物質を含む血清培地中で浮遊培養する第三工程
2. 前記Notchシグナル経路阻害物質が、ガンマセクレターゼ活性阻害物質であることを特徴とする請求項１記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
3. 前記Notchシグナル経路阻害物質が、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシン ｔ−ブチルエステルであることを特徴とする請求項１又は２記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
4. 前記霊長類が、ヒトであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
5. 網膜層特異的神経細胞が視細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。
6. 網膜層特異的神経細胞が神経節細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の網膜層特異的神経細胞の製造方法。

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