JP6073337B2 - レセプター型チロシンキナーゼｅｒｂＢ−４タンパク質（ＨＥＲ４）に対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ - Google Patents

レセプター型チロシンキナーゼｅｒｂＢ−４タンパク質（ＨＥＲ４）に対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ Download PDF

Info

Publication number
JP6073337B2
JP6073337B2 JP2014534729A JP2014534729A JP6073337B2 JP 6073337 B2 JP6073337 B2 JP 6073337B2 JP 2014534729 A JP2014534729 A JP 2014534729A JP 2014534729 A JP2014534729 A JP 2014534729A JP 6073337 B2 JP6073337 B2 JP 6073337B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
her4
protein
amount
peptide
peptides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2014534729A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2014528586A (ja
Inventor
デイビッド、ビー．クリズマン
トッド、ヘンブロー
シーノ、ティパランビル
ウェイ−リャオ、リャオ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Expression Pathology Inc
Original Assignee
Expression Pathology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Expression Pathology Inc filed Critical Expression Pathology Inc
Publication of JP2014528586A publication Critical patent/JP2014528586A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6073337B2 publication Critical patent/JP6073337B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/82—Translation products from oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

序論
レセプター型チロシンキナーゼerbB-4タンパク質（以下ERBB4と呼び、HER4としても知られる）の下位配列から派生する特異ペプチドが提供されている。ペプチド配列および各ペプチドの断片化／遷移イオンは、質量分析ベースの選択反応モニタリング（SRM）アッセイで特に有用であり、これは多重反応モニタリング（MRM）アッセイとも呼ばれる。このようなアッセイは本明細書ではSRM／MRMと呼ばれる。HER4タンパク質のSRM／MRMによる定量分析に対するペプチドの使用が記述されている。
このSRM／MRMアッセイは、HER4タンパク質からの1つ以上の特異ペプチドの相対的または絶対的定量レベルの測定のために使用できる。これは、質量分析によって、生体試料から取得された所定のタンパク質調製品中のHER4タンパク質の量を測定する手段を提供する。
より具体的には、SRM／MRMアッセイは、ホルマリン固定がん患者組織などの患者組織サンプルから入手した細胞から調製された複合タンパク質溶解物中のこれらのペプチドを直接測定できる。ホルマリン固定組織からタンパク質サンプルを調製する方法は、米国特許第7,473,532号に記述されており、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第7,473,532号に記述されている方法は、Liquid TissueTM試薬およびOncoPlexDx（旧Expression Pathology Inc.、メリーランド州ロックビル）から入手可能なプロトコルを使用して都合よく実施されうる。
最も幅広く有利に入手できるがん患者組織からの組織形態は、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織である。外科的に除去された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、がん組織サンプルを保存するための世界でもはるかに最も一般的な方法であり、標準的病理技法の許容された慣習である。ホルムアルデヒドの水溶液はホルマリンと呼ばれる。「100%」ホルマリンは、ホルムアルデヒドの飽和水溶液（これは約40体積%または37質量%）と、少量の安定剤（通常は、酸化および重合の程度を制限するためのメタノール）から成る。組織が保存される最も一般的な方法は、組織全体を長時間（8時間〜48時間）ホルムアルデヒド水溶液（一般的には10%中性緩衝ホルマリンと呼ばれる）に浸し、次に固定された組織全体を、室温での長期保存のためにパラフィンワックス中に包埋することである。このように、ホルマリン固定がん組織を分析するための分子分析法は、がん患者組織の分析のために最も許容され多く利用される方法となるであろう。
SRM／MRMアッセイの結果は、組織（生体試料）が採取・保存された患者または被験者の特定組織サンプル（例えば、1つ以上のがん組織サンプル）中のHER4タンパク質の正確・精密な定量を関連付けるために使用できる。これは、がんについての診断情報を提供するだけでなく、これにより医師またはその他の医療専門家は患者に対して適切な治療を決定することが可能となる。例えば、このようなアッセイは、がんの病期または程度を診断し、患者が反応する可能性の最も高い治療薬を決定するように設計されうる。罹患組織またはその他の患者サンプルのタンパク質発現レベルについての診断的で治療上重要な情報を提供するこのようなアッセイは、コンパニオン診断アッセイと呼ばれる。
本明細書に記述のアッセイは、HER4タンパク質からの未修飾特異ペプチドの相対的または絶対的レベルを測定し、HER4タンパク質からの修飾特異ペプチドの絶対的または相対的レベルも測定できる。修飾の例には、ペプチドに存在するリン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリンおよびホスホトレオニン）およびグリコシル化アミノ酸残基（例えば、グリコシル化アスパラギン残基）が含まれる。
HER4タンパク質の相対的定量レベルは、例えば、異なるサンプル中の個別HER4ペプチドのSRM／MRMの特徴ピーク面積（例えば、特徴ピーク面積または積分断片イオン強度）を比較するなど、SRM／MRM手法によって決定される。または、各ペプチドがそれ自体の特異的SRM／MRM特徴ピークを持つ場合は、複数のHER4特徴ペプチドに対する複数のSRM／MRM特徴ピーク面積を比較して、1つ以上の追加的または異なる生体試料中のHER4タンパク質含量で、1つの生体試料中の相対的HER4タンパク質含量を決定することが可能である。このように、HER4タンパク質からの特定ペプチドの量、従ってHER4タンパク質の量が、同じ実験条件下の2つ以上の生体試料にわたる同じHER4ペプチドと比較して決定される。さらに、単一サンプル中のHER4タンパク質からの所定のペプチドに対して、相対的定量は、SRM／MRM手法で、そのペプチドの特徴ピーク面積を、同じ生体試料からの同じタンパク質調製品中の異なるタンパク質からの別の異なるペプチドの特徴ピーク面積と比較することによって決定できる。こうして、HER4タンパク質からの特定のペプチドの量、従ってHER4タンパク質の量が、同じサンプル内で互いに対して決定される。これらのアプローチは、サンプル間およびサンプル内の、HER4タンパク質からの個別ペプチドの別のペプチドに対する定量をもたらすが、ここで生体試料からのタンパク質調製品のHER4ペプチドの容積に対する絶対重量または重量に対する重量に関わらず、ピーク面積によって決定される量は互いに対するものである。異なるサンプル間の個別の特徴ピーク面積についての相対的定量データは、サンプルあたりの分析されたタンパク質量に対して正規化される。相対的定量は、単一サンプルおよび／または多くのサンプルにわたって、複数のタンパク質およびHER4タンパク質からの多くのペプチドにわたって同時に実施でき、1つのペプチド／タンパク質のその他のペプチド／タンパク質に対する相対的タンパク質量についての見識を得ることができる。
HER4タンパク質の絶対的定量レベルは、例えば、1つの生体試料中のHER4タンパク質からの個別ペプチドのSRM／MRM特徴ピーク面積が、外部から追加された「混入」内部標準のSRM／MRM特徴ピーク面積と比較される、SRM／MRM手法によって決定される。1つの実施形態では、内部標準は、1つ以上の重同位体で標識された1つ以上のアミノ酸残基を含む全く同一のHER4ペプチドの合成版である。適切な同位体標識内部標準は、質量分析で分析された時、各標準が天然HER4ペプチド特徴ピークとは異なりかつ区別できるため対照ピークとして使用できる、予測可能で一貫性のあるSRM／MRM特徴ピークを生成するように合成される。従って、生体試料からのタンパク質調製品に既知量の内部標準が混入され、質量分析で分析される時、そのサンプルからの天然ペプチドのSRM／MRM特徴ピーク面積を、内部標準ペプチドのSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することができる。この数的比較によって、生体試料からの最初のタンパク質調製品に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度および／または絶対重量のいずれかが提供される。断片ペプチドの絶対的定量データは、サンプルあたりの分析されたタンパク質量に従って示されている。絶対的定量は、多くのペプチド、従ってタンパク質にわたって、単一サンプルおよび／または多くのサンプルにわたって同時に実施でき、個別の生体試料および個別サンプルのコホート全体の絶対的タンパク質量についての見識を得ることができる。
SRM／MRMアッセイ法は、例えば、ホルマリン固定組織などの患者由来組織中のがんの病期を直接診断するのに役立ち、また、その患者の治療に使用するために最も有利な治療薬の決定の一助として使用できる。腫瘍の部分的または全体の治療的除去などの手術によって、または疑われる疾患の有無を決定するために実施される生検方法のいずれかによって、患者から取り出されるがん組織を分析し、特異タンパク質がその患者組織に存在するかどうか、またどの形態のタンパク質が存在するかを決定する。さらに、タンパク質または複数のタンパク質の発現レベルを決定し、健常組織に見られる「正常」または参照レベルと比較できる。健常組織に見られるタンパク質の正常または参照レベルは、例えば、がんを持たない1人以上の人の関連組織から由来しうる。または、がんを持つ人の正常または参照レベルは、がんの影響を受けていない関連組織の分析によって得られうる。
タンパク質レベル（例えば、HER4レベル）のアッセイは、がんと診断された患者または被験者のがんの病期を、HER4レベルを使用して診断するためにも使用できる。タンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、SRM／MRMアッセイで決定されたタンパク質またはペプチドの質量または重量である、モルで表される数量として定義される。レベルまたは量は、分析された溶解物中のタンパク質または別の成分の合計レベルまたは量に対して正規化されうる（例えば、タンパク質のマイクロモル／マイクログラムまたはタンパク質のマイクログラムで表される）。さらに、タンパク質またはペプチドのレベルまたは量は容積基準で決定でき、例えばマイクロモルまたはナノグラム／マイクロリットルで表される。SRM／MRMアッセイで決定されるタンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、分析される細胞の数に対しても正規化できる。このようにHER4に関する情報は、HER4タンパク質（またはHER4タンパク質の断片ペプチド）のレベルを正常組織で見られたレベルと関連付けることによって、がんの病期または悪性度を決定するために使用できる。がんの病期および／または悪性度、および／またはHER4タンパク質発現特性が決定されたら、その情報を、例えば、分析されたタンパク質（例えば、HER4）の異常発現によって特徴付けられるがん組織を特に治療するために開発された治療薬（化学的および生物学的）のリストに適合させることができる。HER4タンパク質アッセイと、例えばHER4タンパク質またはそのタンパク質を発現する細胞／組織を特に標的とする治療薬のリストの適合情報は、疾患治療に対するオーダーメイド医療アプローチと呼ばれるものを定義する。本明細書に記述されたアッセイ法は、患者自身の組織からのタンパク質の分析を診断および治療決定のソースとして使用することによって、オーダーメイド医療アプローチの基礎を形成する。
発明の具体的な説明
原則として、例えば既知の特異性を持つプロテアーゼ（例えば、トリプシン）で消化することによって調製されたHER4タンパク質から由来する任意の予測ペプチドは、サンプル中のHER4タンパク質の存在量を、質量分析ベースSRM／MRMアッセイを使用して決定するための代理レポーターとして使用できる。同様に、HER4タンパク質中で修飾されている可能性のあることが知られている部位にアミノ酸残基を含む任意の予測ペプチド配列も、サンプル中のHER4タンパク質の修飾の程度を分析するために使用しうる。
HER4断片ペプチドは、例えば、米国特許第7,473,532号に記述されているLiquid TissueTMプロトコルを使用するなど、さまざまな方法で生成しうる。Liquid TissueTMプロトコルおよび試薬は、組織／生体試料のタンパク質消化によって、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から質量分析に適したペプチドサンプルを生成する。適切な試薬およびプロトコルは、OncoPlexDx（旧Expression Pathology Inc.、メリーランド州ロックビル）からも市販されている。
Liquid TissueTMプロトコルでは、タンパク質架橋結合を逆転または解除するために、組織／生体試料は緩衝液中長時間（例えば、約80°C〜約100°Cで約10分〜約4時間）加熱される。使用される緩衝液は、中性緩衝液（例えば、トリスベース緩衝液、または洗剤を含む緩衝液）である。熱処理に続いて、組織／生体試料は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、およびエンドプロテイナーゼLys-Cを含むがこれに限定されない1つ以上のプロテアーゼで、前記の生体試料の組織および細胞構造を破壊し、サンプルを液化するのに十分な時間処理される。プロテアーゼ処理の模範的条件は、約37°C〜約65°Cの温度で約30分〜約24時間である。同時または連続的のいずれかで使用されるエンドプロテアーゼ、および特に2つまたは3つのエンドプロテアーゼの組み合わせを、サンプルを液化するために用いることが好ましい。例えば、プロテアーゼの適切な組み合わせは、トリプシンとエンドプロテイナーゼLys-Cなど、トリプシン、エンドプロテイナーゼLys-Cおよびキモトリプシンの組み合わせを含みうるがこれに限定されない。加熱およびタンパク質消化の結果は、液体で可溶性の希釈可能な生体分子溶解物である。有利なことに、この液体溶解物は、遠心分離で溶解物から分離できる固体または粒子状物質を持たない。
驚くべきことに、HER4タンパク質からの多くの潜在的ペプチド配列は、理由はすぐには明らかでないが、質量分析ベースのSRM／MRMアッセイでの使用には不適切または無効であることが判明した。MRM／SRMアッセイに対して最も適したペプチドを予測することは不可能であったので、実際のLiquid TissueTM溶解物中の修飾および未修飾ペプチドを実験的に特定して、HER4タンパク質の確実で正確なSRM／MRMアッセイを開発する必要があった。いかなる理論にも束縛されるものではないが、一部のペプチドは、例えば、うまくイオン化しないか、またはその他のタンパク質から生成されるものと異なる断片を生成しないために、質量分析で検出することが困難な場合があると考えられている。ペプチドは、分離（例えば、液体クロマトグラフィー）でうまく分割できないか、またはガラスもしくはプラスチック容器に接着することもあり、これはSRM／MRMアッセイの誤った結果につながる。
本開示のさまざまな実施形態で見られるHER4ペプチド（例えば、以下の表1および2）は、ホルマリン固定がん組織から調達された細胞から調製される複合Liquid TissueTM溶解物内のすべてのタンパク質のプロテアーゼ消化によって、HER4タンパク質から派生した。特に断りのない限り、各例でのプロテアーゼはトリプシンであった。Liquid TissueTM溶解物は次に質量分析で分析され、質量分析で検出・分析されるHER4タンパク質から派生するペプチドを決定した。質量分析のために好ましいペプチドの特定のサブセットの特定は、1）Liquid TissueTM溶解物の質量分析で、タンパク質からのどのペプチドが質量分析でイオン化するかについての実験的決定、および2）Liquid TissueTM溶解物の調製に使用されるプロトコルおよび実験条件で生き残るためのペプチドの能力に基づく。この後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列だけでなく、サンプル調製中に修飾された形態で生き残るためのペプチド内の修飾アミノ酸残基の能力にも及ぶ。
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接生成された細胞からのタンパク質溶解物は、Liquid TissueTM試薬およびプロトコルを使用して調製された。これには、組織の顕微解剖によって試験管に細胞を採取し、その後Liquid TissueTM緩衝液中、細胞を長時間加熱することを伴う。ホルマリン誘導架橋結合が悪影響を受けると、次に組織／細胞は、トリプシンなどのプロテアーゼを使用して、予想可能な方法で最後まで消化される。当業者であれば、その他のプロテアーゼ、特にエンドプロテアーゼは、トリプシンの代わり、またはそれに加えて使用されうることを理解するであろう。各タンパク質溶解物は、プロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせを使用した無傷のポリペプチドの消化によって、一群のペプチドを調製するために使用された。各Liquid TissueTM溶解物は、ペプチドの複数の全体的プロテオーム調査を実施するために（例えば、イオントラップ質量分析によって）分析され、各タンパク質溶解物中にあるすべての細胞タンパク質の質量分析によって特定できる可能な限り多くのペプチドの同定としてデータが提示された。イオントラップ質量分析計または単一の複合タンパク質／ペプチド溶解物からできるだけ多くのペプチドの同定に対する全体的プロファイリングを実施できる別の形態の質量分析計を採用しうる。しかし、イオントラップ質量分析計が、ペプチドの全体的プロファイリングを実行するために最適なタイプの質量分析計でありうる。SRM／MRMアッセイは、MALDI、イオントラップ、または三連四重極を含む任意のタイプの質量分析計で開発・実施できるが、SRM／MRMアッセイのために有利な機器プラットフォームは、多くの場合、三連四重極機器プラットフォームであると考えられる。
用いられた条件下での単一溶解物の単一質量分析で、できるだけ多くのペプチドが特定されると、次にペプチドのリストが照合され、その溶解物で検出されたタンパク質を決定するために使用された。そのプロセスは、複数のLiquid TissueTM溶解物に対して反復され、ペプチドの非常に大きなリストが単一のデータセットへと順に並べられた。結果得られたデータセットは、分析されたタイプの生体試料で（プロテアーゼ消化後に）、特に生体試料のLiquid TissueTM溶解物で検出できるペプチドを表し、従って、例えばHER4タンパク質などの特異タンパク質に対するペプチドを含む。
1つの実施形態では、HER4受容体の絶対的または相対的量の決定に有用なHER4トリプシンペプチドには、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、およびSEQ ID NO:10の1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、または9つ以上が含まれ、このそれぞれの配列が表1に記載されている。これらのペプチドはそれぞれ、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織から調製されたLiquid TissueTM溶解物の質量分析によって検出された。このように、表1のペプチドのそれぞれ、またはこれらのペプチドの任意の組み合わせ（例えば、表1に記載のこれらのペプチドの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、および特に表2に見られるペプチドの組み合わせ）は、ホルマリン固定患者組織への直接的なものを含め、ヒト生体試料中のHER4タンパク質の定量的SRM／MRMアッセイで使用するペプチドの候補である。表2は、表1に示されるペプチドのうち3つに関する追加情報を示す。
Figure 0006073337
Figure 0006073337
表1に記載されているHER4トリプシンペプチドには、前立腺、結腸および胸部を含むヒトの異なる臓器の複数の異なるホルマリン固定組織の複数のLiquid TissueTM溶解物から検出されたものを含む。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定組織のHER4タンパク質の定量的SRM／MRMアッセイのために有用である。これらの実験のさらなるデータ分析で、任意の特定臓器部位からのいかなる特異ペプチドに対しても優先傾向がないことが示された。従って、これらのペプチドのそれぞれは、任意の生体試料または身体の任意の臓器部位に由来する任意のホルマリン固定組織のLiquid TissueTM溶解物についてのHER4タンパク質のSRM／MRMアッセイの実施に適している。
1つの実施形態では、表1のペプチドまたはそれらのペプチドの任意の組み合わせ（例えば、表1に記載されているペプチドの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、8つ以上、または9つ以上、および特に表2でも見られるペプチドとの組み合わせ）は、免疫学的方法（例えば、ウェスタンブロットまたはELISA）を含むがこれに限定されない、質量分析に依存しない方法によって分析される。ペプチドの量（絶対的または相対的）を対象とする情報はその取得方法に関わらず、被験者におけるがんの存在の示唆（診断）、そのがんの病期／悪性度／状態の決定、予後診断の提供、または被験者／患者に対する治療薬または治療レジメンの決定を含む、本明細書に記載の任意の方法で用いられうる。
本開示の実施形態には、表1のペプチドの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、または9つ以上を含有する組成物を含む。一部の実施形態では、組成物は表2のペプチドを含む。ペプチドを含む組成物は、同位体標識された1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、または9つ以上のペプチドを含みうる。ペプチドのそれぞれは、18O、17O、34S、15N、13C、2Hまたはその組み合わせから成るグループから独立して選択される、1つ以上の同位体で標識されうる。HER4タンパク質からのペプチドを含む組成物は、同位体標識されているかどうかに関わらず、そのタンパク質からのペプチドすべて（例えば、トリプシンペプチドの全セット）を含む必要はない。一部の実施形態では、組成物は、HER4からの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、8つ以上、または10以上のペプチド、および特に表1または表2にあるペプチドを含む。ペプチドを含む組成物は、乾燥または凍結乾燥した材料、液体（例えば、水性）溶液もしくは懸濁液、アレイ、またはブロットの形態でありうる。
SRM／MRMアッセイを実施するための1つの考慮事項は、ペプチドの分析に用いられうる機器のタイプである。SRM／MRMアッセイは、MALDI、イオントラップ、または三連四重極を含む任意のタイプの質量分析計で開発・実施できるが、SRM／MRMアッセイのために最も有利な機器プラットフォームは、多くの場合、三連四重極機器プラットフォームであると考えられる。その質量分析計のタイプは、細胞内に含まれるすべてのタンパク質からの何百何千から何百万もの個別ペプチドから成りうる非常に複雑なタンパク質溶解物中の単一単離標的ペプチドを分析するために最も適した機器であると考えられうる。
HER4タンパク質に由来する各ペプチドに対してSRM／MRMアッセイを最も効率的に実施するためには、分析のペプチド配列に加えて情報を利用することが望ましい。その追加情報は、質量分析計（例えば、三連四重極質量分析計）に指図・指示し、特異的標的ペプチドの分析を集中的に正しい方法で実施することで、アッセイが効率的に実施されるようにする。
標的ペプチド一般について、および特異HER4ペプチドについての追加情報には、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体の荷電状態、前駆体のm/z値、m/z遷移イオン、および各遷移イオンのイオン型の1つ以上を含みうる。例として表1のリストの3つのHER4ペプチドについて、HER4タンパク質に対するSRM／MRMアッセイを開発するために使用されうる追加的なペプチド情報を表2に示す。例として表2に示されたこれらの3つのHER4ペプチドに対して記述された同様の追加情報を用意・取得して、表1に含まれるその他のペプチドの分析に適用することができる。
下記の方法は、1）HER4タンパク質に対する質量分析ベースのSRM／MRMアッセイに使用しうるHER4タンパク質から候補ペプチドを特定するため、2）HER4タンパク質からの標的ペプチドに対して個別のSRM／MRMアッセイまたは複数のアッセイを開発するため、および3）定量分析をがん診断および／または最適な治療の選択に適用するために使用された。
アッセイ方法
1. HER4タンパク質に対するSRM／MRM候補断片ペプチドの特定
a.タンパク質を消化するために、プロテアーゼ（トリプシンを含むことも含まないこともある）を使用してホルマリン固定生体試料からLiquid TissueTMタンパク質溶解物を調製する。
b.Liquid TissueTM溶解物のすべてのタンパク質断片をイオントラップタンデム質量分析計で分析し、個別の断片ペプチドがリン酸化またはグリコシル化などのいかなるペプチド修飾も含まない、HER4タンパク質からの断片ペプチドをすべて特定する。
c.Liquid TissueTM溶解物のすべてのタンパク質断片をイオントラップタンデム質量分析計で分析し、例えばリン酸化またはグリコシル化残基などのペプチド修飾を持つHER4タンパク質からのすべての断片ペプチドを特定する。
d.全長HER4タンパク質の全体から特定の消化方法で生成されたすべてのペプチドを測定できる可能性があるが、SRM／MRMアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製された複合Liquid TissueTMタンパク質溶解物中で直接、質量分析によって特定されるものである。
e.患者組織で特異的に修飾（リン酸化、グリコシル化など）され、イオン化し、そのためホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物を分析する時に、質量分析計内で検出されるペプチドは、HER4タンパク質のペプチド修飾のアッセイのための候補ペプチドとして特定される。
2. HER4タンパク質からの断片ペプチドに対する質量分析アッセイ
a. Liquid TissueTM溶解物で特定された個別の断片ペプチドに対する三連四重極質量分析計でのSRM／MRMアッセイが、HER4タンパク質からのペプチドに適用される。
i. ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、または逆相高性能液体クロマトグラフィーを含むがこれに限定されない、最適なクロマトグラフィー条件に対して、断片ペプチドの最適保持時間を決定する。
ii. 各ペプチドに対するSRM／MRMアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドの前駆体の荷電状態、各ペプチドの前駆体のm/z値、各ペプチドのm/z遷移イオン、および各断片ペプチドの各遷移イオンのイオン型を決定する。
iii. 次にSRM／MRMアッセイは、（i）および（ii）からの情報を使用して三連四重極質量分析計で実施できるが、ここで各ペプチドは、三連四重極質量分析計で実施した時、固有のSRM／MRMアッセイを正確に定義する特徴および固有SRM／MRM特徴ピークを持つ。
b. SRM／MRM質量分析からの固有SRM／MRM特徴ピーク面積の関数として検出されるHER4タンパク質の断片ペプチドの量が、特定のタンパク質溶解物中のタンパク質の相対的および絶対的量の両方を示すことができるように、SRM／MRM分析を実施する。
i. 相対的定量は以下によって達成しうる：
1. 1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物中で検出される所定のHER4ペプチドからのSRM／MRM特徴ピーク面積を、少なくとも第二、第三、第四またはそれ以上のホルマリン固定生体試料からの少なくとも第二、第三、第四またはそれ以上のLiquid TissueTM溶解物中の同じHER4断片ペプチドの同じSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって、HER4タンパク質の存在の増加または減少を決定する。
2. 1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物で検出された所定のHER4ペプチドからのSRM／MRM特徴ピーク面積を、異なる別の生体起源から由来するその他のサンプルのその他のタンパク質の断片ペプチドから作成されたSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって、HER4タンパク質の存在の増加または減少を決定するが、ここでペプチド断片に対する2つのサンプル間のSRM／MRM特徴ピーク面積の比較は、各サンプルで分析されたタンパク質の量に対して正規化される。
3. さまざまな細胞条件下で発現レベルが変化しないその他のタンパク質に対して、HER4タンパク質の変化するレベルを正規化するために、所定のHER4ペプチドに対するSRM／MRM特徴ピーク面積を、ホルマリン固定生体試料の同じLiquid TissueTM溶解物内の異なるタンパク質に由来するその他の断片ペプチドからのSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって、HER4タンパク質の存在の増加または減少を決定する。
4. これらのアッセイは、HER4タンパク質の未修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドの両方に適用でき、修飾には、リン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれに限定されず、修飾ペプチドの相対的レベルは、未修飾ペプチドの相対的量を決定するのと同じ方法で決定される。
ii. 所定のペプチドの絶対的定量は、個別の生体試料のHER4タンパク質からの所定の断片ペプチドに対するSRM／MRM特徴ピーク面積を、その生体試料からのタンパク質溶解物に添加した断片ペプチド内部標準のSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって達成されうる。
1. 内部標準は、調査しているHER4タンパク質からの断片ペプチドの標識合成版である。この標準は既知量をサンプルに添加し、SRM／MRM特徴ピーク面積は、生体試料中の断片ペプチド内部標準および天然断片ペプチドの両方に対して別々に決定して、その後両方のピーク面積を比較できる。
2. 修飾にリン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれに限定されず、修飾ペプチドの絶対レベルが未修飾ペプチドの絶対レベルを決定するのと同じ方法で決定できる場合、これは未修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドに適用できる。
3. がん診断および治療への断片ペプチド定量の適用
a. HER4タンパク質の断片ペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量を実施し、がん分野でよく知られた、HER4タンパク質発現と患者腫瘍組織のがんの病期／悪性度／状態との、以前に決定された関連性が確認されることを実証する。
b. HER4タンパク質の断片ペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量を実施し、異なる治療戦略の臨床転帰との相関関係を実証するが、この相関関係は本分野ですでに実証されているか、または患者のコホートおよびこれらの患者からの組織にわたる相関関係研究を通して将来実証できる。以前に確立された相関関係または将来生じる相関関係のいずれかがこのアッセイによって確認されたら、次にこのアッセイ方法を使用して最適な治療戦略を決定できる。
ホルマリン固定した患者由来組織の分析に基づいた、組織中のHER4タンパク質レベルの評価で、各特定患者についての診断、予後、および治療に関連する情報を提供できる。1つの実施形態では、本開示は、生体試料中のHER4タンパク質のレベルを測定する方法を記述しており、これには生体試料から調製されたタンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾HER4断片ペプチドの量を、質量分析を使用して検出および／または定量すること、およびそのサンプル中の修飾または未修飾HER4タンパク質のレベルを計算することを含み、レベルは相対的レベルまたは絶対的レベルである。関連する実施形態では、1つ以上のHER4断片ペプチドの定量化には、既知量の追加内部標準ペプチドと比較することによって、生体試料中のHER4断片ペプチドのそれぞれの量を決定することを含み、生体試料中のHER4断片ペプチドのそれぞれが、同じアミノ酸配列を持つ内部標準ペプチドと比較される。一部の実施形態では、内部標準は、18O、17O、34S、15N、13C、2Hまたはその組み合わせから選択される1つ以上の安定重同位体を含む同位体標識内部標準ペプチドである。
本明細書に記述された生体試料（またはその代理としての断片ペプチド）中のHER4タンパク質のレベルの測定方法は、患者または被験者のがんの診断指標として使用しうる。1つの実施形態では、HER4タンパク質レベルの測定結果を用いて、組織で見られたHER4タンパク質のレベルと、正常および／またはがんもしくは前がん組織で見られたそのタンパク質レベルを関連付ける（例えば、比較する）ことにより、がんの診断病期／悪性度／状態を決定しうる。また別の実施形態では、HER4タンパク質のレベルの測定結果は、その生体試料が取得された患者を治療するための治療戦略を決定するために用いられうる。
実施形態：
1. 生体試料中のレセプター型チロシンキナーゼerbB-4タンパク質（HER4）タンパク質レベルを測定する方法であって、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾HER4断片ペプチドの量を、質量分析を使用して検出および／または定量すること、および前記試料中の修飾または未修飾HER4タンパク質のレベルを計算することを含み、
前記量が相対的量または絶対的量である方法。
2. 1つ以上の修飾または未修飾HER4断片ペプチドの量を検出および／または定量する前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、実施形態1の方法。
3. 前記分画ステップが、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、または逆相高性能液体クロマトグラフィーから成るグループから選択される、実施形態2の方法。
4. 前記生体試料の前記タンパク質消化物がLiquid TissueTMプロトコルによって調製される、実施形態1〜3のいずれかの方法。
5. 前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、実施形態1〜3のいずれかの方法。
6. 前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、実施形態5の方法。
7. 前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、MALDI-TOF質量分析、MALDI質量分析、および／または飛行時間型質量分析を含む、実施形態1〜6のいずれかの方法。
8. 使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング（SRM）、多重反応モニタリング（MRM）、および／または多重選択反応モニタリング（mSRM）、またはその任意の組み合わせである、実施形態7の方法。
9. HER4断片ペプチドが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、およびSEQ ID NO:10として規定されるアミノ酸配列を含む、実施形態1〜8の方法。
10. 生体試料が血液サンプル、尿サンプル、血清サンプル、腹水サンプル、喀痰サンプル、リンパ液、唾液サンプル、細胞、または固体組織である、実施形態[0]〜9のいずれかの方法。
11. 組織がホルマリン固定組織である、実施形態10の方法。
12. 組織がパラフィン包埋組織である、実施形態10または11の方法。
13. 組織が腫瘍から取得される、実施形態10の方法。
14. 腫瘍が原発腫瘍である、実施形態13の方法。
15. 腫瘍が二次腫瘍である、実施形態13の方法。
16. 修飾または未修飾HER4断片ペプチドを定量することをさらに含む、実施形態[0]〜15のいずれかの方法。
17. HER4断片ペプチドの定量に、1つの生体試料中の、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、またはSEQ ID NO:10に示されるようなHER4のアミノ酸残基約8〜約45のアミノ酸配列を持つ1つ以上のHER4断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同じHER4断片ペプチドの量と比較することを含む、実施形態16の方法。
18. 1つ以上のHER4断片ペプチドの定量に、既知量の追加内部標準ペプチドと比較することによって、生体試料中のHER4断片ペプチドのそれぞれの量を決定することを含み、生体試料中のHER4断片ペプチドのそれぞれが、同じアミノ酸配列を持つ内部標準ペプチドと比較される、実施形態17の方法。
19. 内部標準ペプチドが同位体標識ペプチドである、実施形態18の方法。
20. 同位体標識内部標準ペプチドが、18O、17O、34S、15N、13C、2Hまたはその任意の組み合わせから選択される1つ以上の安定重同位体を含む、実施形態19の方法。
21. タンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾HER4断片ペプチドの量の検出および／または定量が、修飾または未修飾HER4タンパク質の存在および被験者におけるがんとの関連性を示す、実施形態1〜20のいずれかの方法。
22. 1つ以上の修飾または未修飾HER4断片ペプチドの量の前記検出および／または定量の結果、または前記HER4タンパク質の量を、がんの診断病期／悪性度／状態と関連付けることをさらに含む、実施形態21の方法。
23. 1つ以上の修飾または未修飾HER4断片ペプチドの量の前記検出および／または定量の結果、または前記HER4タンパク質の量を、がんの診断病期／悪性度／状態と関連付けることが、その他のタンパク質、またはその他のタンパク質からのペプチドの量の検出および／または定量と多重フォーマットで組み合わされて、前記がんの診断病期／悪性度／状態についての追加情報を提供する、実施形態22の方法。
24. 前記生体試料が取得された被験者に対して、1つ以上のHER4断片ペプチドの有無またはその量、またはHER4タンパク質の量に基づいて治療を選択することをさらに含む、実施形態1〜23のいずれか1つに記載の方法。
25. 前記生体試料が取得された患者に治療有効量の治療薬を投与することをさらに含み、治療薬および／または投与された治療薬の量が、1つ以上の修飾または未修飾HER4断片ペプチドの量またはHER4タンパク質の量に基づいている、実施形態1〜24のいずれか1つに記載の方法。
26. 治療または治療薬が、HER4タンパク質を発現しているがん細胞に対するものである、実施形態24および25の方法。
27. 生体試料が、Liquid TissueTMプロトコルおよび試薬を用いて、1つ以上の修飾または未修飾HER4断片ペプチドの量を定量するために処理されたホルマリン固定腫瘍組織である、実施形態1〜26の方法。
28. 前記1つ以上の修飾または未修飾HER4断片ペプチドが、表1のペプチドの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、または9つ以上である、実施形態1〜27のいずれかの方法。
29. 表2のペプチドの量の定量を含む、実施形態1〜28のいずれかの方法。
30. 表1のペプチドまたはその抗体の1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、または9つ以上を含む組成物。
31. 表2のペプチドまたはその抗体の1つ以上、または2つ以上を含む、実施形態30の組成物。

Claims (14)

  1. ホルマリン固定組織のヒト生体試料中のヒトレセプター型チロシンキナーゼerbB-4タンパク質（HER4）タンパク質レベルを測定する方法であって、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中のHER4断片ペプチドの量を、質量分析を使用して検出および定量すること、および前記試料中のHER4タンパク質のレベルを計算することを含み、ここで、前記HER4断片ペプチドは配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記量が相対的量または絶対的量である、方法。
  2. 前記HER4断片ペプチドの量を検出および定量する前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、請求項1または２に記載の方法。
  4. 前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記組織が腫瘍から取得される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記HER4断片ペプチドの定量に、1つの生体試料中の前記HER4断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同じHER4断片ペプチドの量と比較することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記HER4断片ペプチドの定量に、同じアミノ酸配列を持つ既知量の追加内部標準ペプチドと比較することによって、生体試料中の前記HER4断片ペプチドの量を決定することを含み、該内部標準ペプチドが同位体標識ペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記タンパク質消化物中の前記HER4断片ペプチドの量の検出および定量が、HER4タンパク質の存在および前記試料が取得された被験者におけるがんとの関連性を示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記HER4断片ペプチドの量の前記検出および定量の結果、または前記HER4タンパク質の量を、前記がんの診断病期／悪性度／状態と関連付けるためのデータを提供することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記HER4断片ペプチドの量の前記検出および定量の結果、または前記HER4タンパク質の量を、前記がんの診断病期／悪性度／状態と関連付けるデータを提供することが、前記がんの診断病期／悪性度／状態についての追加情報を提供するために、その他のタンパク質、またはその他のタンパク質からのペプチドの量の検出および／または定量と多重フォーマットで組み合わされて、前記がんの診断病期／悪性度／状態についての追加情報を提供する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記生体試料が取得された前記被験者に対して、前記HER4断片ペプチドの有無またはその量、またはHER4タンパク質の量に基づいて治療を選択するための指標を提供することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記生体試料が取得された患者に投与するために、治療薬および／または投与される治療薬の量を、前記HER4断片ペプチドの量またはHER4タンパク質の量に基づいて選択するための指標を提供することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記治療または前記治療薬が、前記HER4タンパク質を発現しているがん細胞に対するものである、請求項１２または１３に記載の方法。
JP2014534729A 2011-10-04 2012-10-04 レセプター型チロシンキナーゼｅｒｂＢ−４タンパク質（ＨＥＲ４）に対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ Expired - Fee Related JP6073337B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161543092P 2011-10-04 2011-10-04
US61/543,092 2011-10-04
PCT/US2012/058782 WO2013052686A1 (en) 2011-10-04 2012-10-04 Srm/mrm assay for the receptor tyrosine-protein kinase erbb-4 protein (her4)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2014528586A JP2014528586A (ja) 2014-10-27
JP6073337B2 true JP6073337B2 (ja) 2017-02-01

Family

ID=48044159

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014534729A Expired - Fee Related JP6073337B2 (ja) 2011-10-04 2012-10-04 レセプター型チロシンキナーゼｅｒｂＢ−４タンパク質（ＨＥＲ４）に対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9470696B2 (ja)
EP (1) EP2764359B1 (ja)
JP (1) JP6073337B2 (ja)
AU (1) AU2012318567B2 (ja)
CA (1) CA2850667A1 (ja)
ES (1) ES2670651T3 (ja)
IL (1) IL231912B (ja)
WO (1) WO2013052686A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017184905A1 (en) * 2016-04-20 2017-10-26 Expression Pathology, Inc. Method for improved hepatocellular cancer diagnosis

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2103323A1 (en) * 1992-11-24 1994-05-25 Gregory D. Plowman Her4 human receptor tyrosine kinase
PT1601450E (pt) 2003-03-10 2013-09-06 Expression Pathology Inc Preparação líquida de tecido a partir de amostras biológicas, de tecidos e de células tratados histopatologicamente
US7807789B2 (en) * 2004-12-21 2010-10-05 Cell Signaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in EGFR-signaling pathways
WO2006127861A2 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 Expression Pathology, Inc. Diagnosis of diseases and conditions by analysis of histopathologically processed biological samples using liquid tissue preparations
WO2007027867A2 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Cell Signaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in carcinoma signaling pathways
EP2049568A2 (en) * 2006-04-07 2009-04-22 Københavns Universitet Erbb receptor-derived peptide fragments
AU2007257683A1 (en) * 2006-06-12 2007-12-21 Symphogen A/S Pan-cell surface receptor- specific therapeutics
WO2008064884A1 (en) * 2006-11-28 2008-06-05 U3 Pharma Gmbh Activated her3 as a marker for predicting therapeutic efficacy
US7981998B2 (en) 2006-12-14 2011-07-19 Aileron Therapeutics, Inc. Bis-sulfhydryl macrocyclization systems
WO2011031982A1 (en) 2009-09-10 2011-03-17 Myriad Genetics, Inc. Methods and compositions for predicting cancer therapy response
EP2517010B1 (en) * 2009-12-22 2019-06-05 Expression Pathology, Inc. Epidermal growth factor receptor (egfr) protein srm/mrm assay

Also Published As

Publication number Publication date
ES2670651T3 (es) 2018-05-31
WO2013052686A1 (en) 2013-04-11
CA2850667A1 (en) 2013-04-11
AU2012318567B2 (en) 2018-02-22
JP2014528586A (ja) 2014-10-27
IL231912A0 (en) 2014-05-28
IL231912B (en) 2018-11-29
US9470696B2 (en) 2016-10-18
US20140213478A1 (en) 2014-07-31
EP2764359A1 (en) 2014-08-13
EP2764359B1 (en) 2018-03-21
AU2012318567A1 (en) 2014-05-22
EP2764359A4 (en) 2015-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6047502B2 (ja) ｃＭＥＴタンパク質ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ
US20130011408A1 (en) Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Protein SRM Assay
US10725051B2 (en) Multiplex MRM assay for evaluation of cancer
JP2013515273A (ja) インスリン様増殖因子１受容体（ｉｇｆ−１ｒ）タンパク質ｓｒｍ／ｍｒｍアッセイ
JP6046151B2 (ja) エフリンａ型受容体２タンパク質に対するｓｒｍ／ｍｒｍアッセイ
EP3260859A1 (en) Inuslin receptor substrate 1 (irs1) protein srm/mrm assay
US9804164B2 (en) SRM/MRM assay for the fatty acid synthase protein
JP6046145B2 (ja) 死受容体５タンパク質に対するｍｒｍ／ｓｒｍアッセイ
EP3267194A1 (en) Secreted protein acidic and rich in cysteine (sparc) protein srm/mrm assay
US9470696B2 (en) SRM/MRM assay for the receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 protein (HER4)
JP2018519501A (ja) メソテリン（ｍｓｌｎ）タンパク質のためのｓｒｍ／ｍｒｍアッセイ
AU2015215981B2 (en) Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC) protein SRM/MRM assay

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20150427

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20160225

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160318

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20160620

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20160818

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160920

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20161101

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20161201

R155 Notification before disposition of declining of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R155

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20170104

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6073337

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees