JP6082901B2 - ワクチン・アジュバント - Google Patents

Description

本発明は、ワクチン療法の効果増強剤（ワクチン・アジュバント）やワクチン療法キット、より詳しくは、対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウム（ＴＣＰ：Tricalcium phosphate）を有効成分とする、ワクチン組成物を用いるワクチン療法の効果増強剤や、β−リン酸三カルシウムを含む組成物とワクチン組成物とからなるワクチン療法キットに関する。

免疫は表面のバリアを越えて外から体内に侵入した細菌やウィルスを排除し、生体を防御するシステムである。免疫応答の誘起と制御は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、抗体、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）などによって複合的に行われる。まず、ＡＰＣに取り込まれ、プロセシングを受けた外来抗原は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びII分子に結合した状態でヘルパーＴ細胞に提示される。ＭＨＣに結合した外来抗原がヘルパーＴ細胞により認識されると、Ｔ細胞の活性化が起こり、サイトカインが分泌され、抗原で刺激されたＢ細胞が抗体産生細胞へと分化するのを助けると共に、キラーＴ細胞の分化を促す。Ｂ細胞から分泌された抗体、及び活性化されたＴ細胞によって、抗原を提示する細胞が排除され、外来抗原を排除する細胞性・体液性の反応が進行する。

そして、免疫は体外から進入する病原菌だけでなく、元来は自己の細胞であった、がん化した細胞や、ウィルスや細菌が感染した細胞など、異常な自己の細胞に対してもはたらいている。そして、近年、このような生体が本来持つ免疫システムを利用し、宿主の免疫系が標的抗原として認識し得る異常な細胞の成分を抗原として宿主に人為的に与えることで、異常な細胞に対する免疫を誘導し、疾患を治療または予防する、ワクチン療法が期待されている。従来のがん治療においては、手術や放射線療法が主な治療となっているが、微小ながん組織が残存し、それががんの再発を引き起こすという問題がある。そこで、ワクチン療法による残存している可能性のある微小ながん組織の根絶、再発防止が期待されている。

ワクチン療法に使用されるワクチン抗原として、例えば、腫瘍の予防または治療で使用するためのワクチンＴＬＰペプチド（特許文献１）や、血清を使用したｃＤＮＡディスプレイライブラリーの選択による特異的腫瘍抗原の同定方法及び、同定された腫瘍抗原（特許文献２）や、メゾテリンのＭＨＣクラスＩ結合エピトープを含むポリペプチドを含むワクチン（特許文献３）が開示されている。現在まで、様々な腫瘍抗原を用いたがんワクチン療法に対する研究が試みられているが、がん患者に対する治療効果は、期待されるほど十分には認められていないのが現状である。アジュバントは、抗原性補強剤とも呼ばれ、抗原性を増強するために用いられる試薬である。そこで、抗原性を増強し、十分なワクチン療法の効果を得るためのワクチン療法の補助剤、アジュバントが求められていた。

他方、β−リン酸三カルシウムを含むリン酸カルシウム系化合物は、その優れた生体親和性により人工骨、人工歯根などの生体材料として応用研究が盛んに行われている（特許文献４、５）。本発明者らは、多孔体のβ−リン酸三カルシウムがマクロファージの活動を活発化させることにより悪性腫瘍を抑制することを明らかにし、気孔率７５％のβ−リン酸三カルシウムの粉末をシートにコーティングした癌細胞抑制シートからなる癌細胞抑制剤（特許文献６、非特許文献１）を開発している。しかしながら、β−リン酸三カルシウムとワクチン組成物を併用する効果については全く知られていなかった。

その他、これまでに人工的にリンパ節を構築する試みは幾つかあったが、自然のリンパ節と非常に類似した構造を持ち、しかも実際に生体内で強力な免疫機能を発揮する免疫装置の開発の成功は全くなかった。例えば、特許文献７には、コラーゲンスポンジを用いた支持体に支持細胞（ストローマ細胞）を播き、かかる支持体を腎臓の被膜の下に埋め込むことで、人工リンパ節となり、抗体産生、癌細胞の排除などの免疫反応を強力に起こすことが開示されている。しかしこれらはいずれも細胞を使用しており、試験管の細胞培養や、人工材料を用いた構築などの工程が必要であった。

特表２００３−５２３７５９号公報 特表２００５−５０８３０９号公報 特表２００６−５２１０９０号公報 特開２０１０−２３３９１４号公報 特開平７−１１６１７５号公報 特開２０１０−１２６４３４号公報 特開２００８−１６３０１５号公報

J. Cheng et al., J. Biomed. Mater. Res. A, 92(2):542-547 (2010)

近年、生体が本来持つ免疫システムを利用し、宿主の免疫系が標的抗原として認識し得る異常な細胞の成分を抗原として宿主に人為的に与えることで、異常な細胞に対する免疫を誘導し、疾患を治療または予防する、ワクチン療法が期待されている。しかしながら、例えばがん患者に対する治療効果は、期待されるほど十分には認められていないのが現状である。この問題を解決するために、抗原性を増強し、十分なワクチン療法の効果を得るための安価で安全なワクチン療法の補助剤が求められている。本発明の課題は、ワクチン組成物の効果を増強することができる安価で安全なアジュバントを提供することにある。

発明者らは、病変部位近傍に移植されたβ−リン酸三カルシウム緻密体（ここでは気孔率５０％以下のものを指す）により活性・誘導・集積されたＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などのリンパ球や樹状細胞が高度に組織化された三次元構造をとることを見出した。これを利用することにより、リンパ球が抗原及び抗原提示細胞と相互作用して抗原特異的な免疫反応（適応免疫）を開始し、ワクチン組成物によるがん治療効果を増強できる。

すなわち、本発明は［１］対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする組成物と、ワクチン組成物とを備えたワクチン療法キットや、［２］体内が、皮内、皮下、又は筋肉内であることを特徴とする［１］記載のワクチン療法キットや、［３］β−リン酸三カルシウムが病変近傍に移植されることを特徴とする［１］又は［２］記載のワクチン療法キットや、［４］病変近傍が、病変から０．１〜１５ｃｍの距離にある領域であることを特徴とする［３］記載のワクチン療法キットや、［５］ワクチン組成物が、がん特異的抗原ワクチンであることを特徴とする［１］〜［４］のいずれか記載のワクチン療法キットや、［６］がん特異的抗原ワクチンが、ＴＲＰ−２（Tyrosinase-related protein 2）、ＷＴ１（Wilms tumor 1）、オバルブミン（ＯＶＡ）、又はがん細胞抽出液（Tumor lysate）由来の抗原ペプチド又はタンパク質であることを特徴とする［１］〜［６］のいずれか記載のワクチン療法キットに関する。

また、本発明は［７］β−リン酸三カルシウムが、気孔率５０％以下の緻密体であることを特徴とする［１］〜［６］のいずれか記載のワクチン療法キットや、［８］β−リン酸三カルシウムが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及びマクロファージを活性化、誘導、又は集積することを特徴とする［７］記載のワクチン療法キットや、［９］β−リン酸三カルシウムが、錠剤又は柱状体であることを特徴とする［１］〜［８］のいずれか記載のワクチン療法キットや、［１０］β−リン酸三カルシウムが、粒径０．０５〜２５μｍの粒子または顆粒であることを特徴とする［１］〜［８］のいずれか記載のワクチン療法キットに関する。

また、本発明は［１１］対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする、ワクチン組成物を用いるワクチン療法の効果増強剤や、［１２］体内が、皮内、皮下、又は筋肉内であることを特徴とする［１１］記載のワクチン療法の効果増強剤や、［１３］β−リン酸三カルシウムが病変近傍に移植されることを特徴とする［１１］又は［１２］記載のワクチン療法の効果増強剤や、［１４］病変近傍が、病変から０．１〜１５ｃｍの距離にある領域であることを特徴とする［１３］記載のワクチン療法の効果増強剤や、［１５］ワクチン組成物が、がん特異的抗原ワクチンであることを特徴とする［１１］〜［１４］のいずれか記載のワクチン療法の効果増強剤や、［１６］がん特異的抗原ワクチンが、ＴＲＰ−２（Tyrosinase-related protein 2）、ＷＴ１（Wilms tumor 1）、オバルブミン（ＯＶＡ）、又はがん細胞抽出液（Tumor lysate）由来の抗原ペプチド又はタンパク質であることを特徴とする［１５］記載のワクチン療法の効果増強剤に関する。

また、本発明は［１７］β−リン酸三カルシウムが、気孔率５０％の緻密体であることを特徴とする［１１］〜［１６］のいずれか記載のワクチン療法の効果増強剤や、［１８］β−リン酸三カルシウムが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及びマクロファージを活性化、誘導、又は集積することを特徴とする［１７］記載のワクチン療法の効果増強剤や、［１９］β−リン酸三カルシウムが、錠剤又は柱状体であることを特徴とする［１１］〜［１８］のいずれか記載のワクチン療法の効果増強剤や、［２０］β−リン酸三カルシウムが、粒径０．０５〜２５μｍの粒子又は顆粒であることを特徴とする［１１］〜［１８］のいずれか記載のワクチン療法の効果増強剤に関する。

本発明によれば、対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）を有効成分とする組成物、及びワクチン組成物とからなるワクチン療法キットや、対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムを有効成分とするワクチン療法の効果増強剤を提供することができ、ワクチン療法の効果を増強し、疾患を治療することができる。

免疫細胞とβ−ＴＣＰ顆粒（サイズ２５〜７５μｍ）の結合を走査型電子顕微鏡にて観察した結果を示す。 β−ＴＣＰ緻密体（緻密体錠剤：φ５×２ｍｍ）を、走査型電子顕微鏡にて観察した結果を示す。直径２μｍの粒子は、マーカーとして用いられている。 β−ＴＣＰ緻密体（緻密体棒剤：φ０．９×５ｍｍ）を、走査型電子顕微鏡にて観察した結果を示す。 β−ＴＣＰ緻密体（錠剤）を正常マウスの皮下に移植して２週間経過後、組織サンプルをＨＥ染色し、顕微鏡にて観察した。リンパ球が集積し、天然のリンパ節と似た構造となっていることを示す図である。 β−ＴＣＰ緻密体（顆粒）サイズ０．０５〜１０５μｍを正常マウスの皮下に移植して２週間経過後、組織サンプルをＨＥ染色し、顕微鏡にて観察した。サイズ７５μｍ以上のβ−ＴＣＰ顆粒はマクロファージを誘導し（Ｎ＝１３）、７５μｍ以下の顆粒はリンパ球を集め（Ｎ＝１１）、サイズ０．０５〜２５μｍの微小顆粒はリンパ球集塊を形成すること（図中矢印）を示す図である 円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗ＣＤ４５Ｒ抗体を用いてＢ細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりＢ細胞が誘導されることを示す図である（左：弱拡 ×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。 円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗ＣＤ３抗体を用いてＴ細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりＴ細胞が誘導されることを示す図である（左：弱拡 ×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。 円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗ＣＤ４９ｂ抗体を用いてＮＫ細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりＮＫ細胞が誘導されることを示す図である（左：弱拡 ×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。 円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗ＣＤ１１ｃ抗体を用いて樹状細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体により樹状細胞が誘導されることを示す図である（左：弱拡 ×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。 円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗Ｆ４／８０Ｒ抗体を用いてマクロファージを免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりマクロファージが誘導されることを示す図である（左：弱拡 ×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。 円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗Ｄ２−４０抗体を用いてリンパ管内皮細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりリンパ管形成が誘導されることを示す図である（左：弱拡 ×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。 ワクチンの実験系として、C57BL/6系統のマウスとトリ・オバルブミンを発現するマウスのリンパ腫細胞であるE.G7-OVA（ＡＴＣＣ社より購入）を用いる腫瘍モデル実験系において、以下の３群、すなわち、１）コントロール群、２）ＯＶＡ投与群、３）ＯＶＡ＋ＴＣＰ群を設定し、６週齢の雄性マウス（C57BL/6）側腹部皮下にφ５ｍｍ×厚さ２ｍｍの円板状のβ−ＴＣＰの錠剤を移植した（ＯＶＡ＋ＴＣＰ群）。７日後および１４日後に、移植したβ−ＴＣＰ錠剤周囲の皮内（ＯＶＡ＋ＴＣＰ群）または側腹部皮内（ＯＶＡ投与群）に１００μｇのＯＶＡ蛋白を投与し、２１日後、側腹部皮下に１×１０^５個のE.G7-OVA細胞を移植し、腫瘍の形成及び増殖について観察した。図中の＊は、β−ＴＣＰ移植後にＯＶＡタンパク質で免疫したＯＶＡ＋ＴＣＰ群では、実験開始４２日後及び４５日後においてコントロール群に比べて有意に腫瘍増殖が抑制されたことを示す（t test、p<0.05）。

本発明のワクチン療法キットとしては、体内に移植されて用いられる、換言すれば体内に移植するためのβ−リン酸三カルシウム（以下、「β−ＴＣＰ」という）を有効成分とする組成物と、ワクチン組成物とを備えたものであれば特に制限されず、また本発明のワクチン組成物を用いるワクチン療法の効果増強剤としては、β−ＴＣＰを有効成分とする組成物であれば特に制限されず、本発明の一形態として、対象の体内にβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする組成物を移植した後に、ワクチン組成物を投与するワクチン療法や、ワクチン組成物を用いるワクチン療法の効果増強剤製造のための、対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムの使用を挙げることができる。上記β−ＴＣＰはＣａ_３（ＰＯ_４）_２で表される組成物の一結晶形態であって、常温において安定であり生体親和性のある化合物である。β−ＴＣＰとしては、市販のβ−ＴＣＰ粉末やβ−ＴＣＰブロック、例えば人工骨として利用されるβ−ＴＣＰブロックなどを用いてもよいし、公知の方法（特開２００４−２６６４８など）により製造してもよく、またα−ＴＣＰ粉末から製造する（特開２００６−８９３１１など）こともできる。また、本発明のβ−ＴＣＰ組成物は、実質的にβ−ＴＣＰ組成からなるものや、界面活性剤や水などを混入して製造されたものでもよいが、β−ＴＣＰブロックを粒子又は顆粒状に加工したβ−ＴＣＰの粉末の他、β−ＴＣＰ粉末を打錠により緻密化、あるいは焼結により脱泡の上緻密化した、高強度、高密度、低気孔率である、多結晶体のβ−ＴＣＰ緻密体、中でも気孔率５０％以下のβ−ＴＣＰ緻密体であることが好ましい。本発明において、β−ＴＣＰ緻密体とは気孔率５０％以下のβ−ＴＣＰをいう。また本発明において、粉末、粒子、顆粒はいずれも粒状の形態を指し、実質的な区別はない。

かかるβ−ＴＣＰ緻密体を構成する多結晶体の粒子サイズとして、好ましくは０．００１〜５０μｍ、より好ましくは０．０１〜２０μｍ、さらに好ましくは０．７５〜１０．０μｍであり、平均の多結晶体の粒子サイズは好ましくは１．８０μｍである。さらに、多結晶体の粒子の隙間は好ましくは０．００１〜１０μｍ、より好ましくは０．００５〜５μｍ、０．０１〜１．０μｍであり、平均の多結晶体の粒子の隙間は好ましくは０．０５〜０．２μｍ、より好ましくは０．１μｍである。かかる多結晶体の粒子の隙間の大きさや数により、β−ＴＣＰ緻密体の気孔が定められる。

β−ＴＣＰの気孔率は、細孔に水銀を浸入させるために圧力を加え、圧力と圧入された水銀量から比表面積や細孔分布を求める水銀法や、検量線を用いて密度から測定することもできる。また、気孔率が０％のβ−ＴＣＰ石（測定対象の焼結体と同じ組成、結晶形の気孔をもたないβ−ＴＣＰ焼結体）の真密度ρを測定しておき、測定対象の焼結体の体積と重さから算出した見かけ密度ρ’とから気孔率Ｐ（％）＝（１−ρ’／ρ）×１００として算出することができる。また、気孔率Ｐは、例えば、アキュピック１３３０シリーズ（株式会社島津製作所製）を用いて測定することもできる。β−ＴＣＰブロックの水銀法にて計測した気孔率は、好ましくは５０〜９０％、より好ましくは６０〜８５％、さらに好ましくは７０〜８０％である。粒径７５〜１０５μｍのβ−ＴＣＰ粉末はβ−ＴＣＰブロックを粉砕して作製することもでき、これを水銀法にて計測したそれぞれの粉末の気孔率は、好ましくは５０〜９０％、より好ましくは５５〜８５％、さらに好ましくは５７〜８０％であり、好ましい平均気孔率は６０〜７０％である。また、粒径２５μｍ以下のβ−ＴＣＰミクロン顆粒はβ−ＴＣＰブロックを粒子状に粉砕して作製することもでき、これを水銀法にて計測した気孔率は好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下であり、好ましい平均気孔率は３．５〜４．５％である。β−ＴＣＰ緻密体としては、気孔率が５０％以下であるβ−ＴＣＰ粉末、粒子、顆粒、錠剤、柱状体等を例示することができ、これらはβ−ＴＣＰのみからなるものであっても、β−ＴＣＰを有効成分とし、他の成分を含むものであってもよい。５０％以下のβ−ＴＣＰの気孔率は、４０％以下が好ましく、３０％以下がより好ましく、中でも２０％以下が特に好ましい。β−ＴＣＰ粉末を打錠により緻密化したβ−ＴＣＰ緻密体の、密度から算定した気孔率としては、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、中でも２０％以下を好適に例示することができる。また、焼結により脱泡の上緻密化したβ−ＴＣＰ緻密体は、密度から算定した気孔率が、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、中でも２０％以下を好適に例示することができる。

焼結による緻密化は、好ましくは６００℃超〜２０００℃、より好ましくは７５０〜１５００℃、さらに好ましくは９００〜１３００℃で、また好ましくは１〜１００時間、より好ましくは１０〜８０時間、さらに好ましくは２０〜５０時間焼結する例を挙げることができる。また、焼結は複数の温度にて複数回に分けて行ってもよい。例えば、棒状のβ−ＴＣＰ緻密体は以下の方法で製造することもできる。リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム及び水を適切な割合で混合してスラリーを調製し、調製したスラリーを摩砕しながら反応させた後に乾燥させる。次に、乾燥して得られた固形物を粉砕して仮焼し、β−ＴＣＰ粉末が得られる。得られたβ−ＴＣＰ粉末を圧縮形成されることにより柱状体に賦形される。圧縮形成された柱状体を６００℃〜１３００℃で２０時間焼結する。

上記気孔率５０％以下の緻密体であるβ−ＴＣＰ粉末や粒子、顆粒の製造方法としては、例えば、リン酸水素カルシウムと炭酸カルシウムの粉末をモル比で１：１〜３、好ましくは１：１．５〜２．５になるように秤量して混合し、かかるリン酸水素カルシウム−炭酸カルシウム混合物に純水を添加してスラリーを調製し、調製されたスラリーをボールミルにより約２４時間湿式磨砕処理を行うことでメカノケミカル法による反応をすすめ、磨砕処理されたスラリーを、７０〜９０℃、好ましくは７５〜８５℃にて乾燥し、乾燥して得られた固形物を粉砕して得られたβ−ＴＣＰ粉末を７００〜８００℃にて、数時間仮焼することで、β−ＴＣＰ仮焼粉末を作製し、得られたβ−ＴＣＰ仮焼粉末をふるいにかけることで各粒径の分画を得ることができ、分画ごとの気孔率を測定することで、気孔率５０％以下の分画を得ることができる。具体的には、まずふるい目が１０５μｍのふるいを通過し、かつ、ふるい目が７５μｍのふるいにかけ残ったβ−ＴＣＰを分画（Ａ）とし、次にふるい目が７５μｍのふるいを通過し、かつ、ふるい目が２５μｍのふるいにかけ残ったβ−ＴＣＰを分画（Ｂ）とし、さらに２５μｍのふるいを通過したβ−ＴＣＰを分画（Ｃ）とした場合に、分画（Ｃ）は、気孔率が確実に５０％以下のβ−ＴＣＰとなる。

上記β−ＴＣＰ錠剤やβ−ＴＣＰ柱状体の製造方法としては、気孔率が５０％以下の、単一相又はほぼ単一相のβ−ＴＣＰの錠剤や柱状体を製造することができる方法を挙げることができる。具体的には、前述のようにβ−ＴＣＰ仮焼粉末を作製し、得られたβ−ＴＣＰ仮焼粉末を圧縮成形（打錠）することにより錠剤や柱状体に賦形し、かかる賦形されたβ−ＴＣＰ仮焼錠剤や柱状体を４５０〜６５０℃、好ましくは６００℃にて２．５〜３．５時間、好ましくは３時間焼結し、次いで８５０〜９５０℃、好ましくは９００℃で０．５〜１．５時間、好ましくは１時間焼結し、さらに１０００〜１３００℃で０．７５〜１．５時間、好ましくは１時間焼結することで燒結体としてのβ−ＴＣＰの錠剤や柱状体を得る方法を挙げることができ、また上記β−ＴＣＰ仮焼粉末を燒結し、β−ＴＣＰの焼結体としての粉体を得た後に圧縮成形（打錠）してβ−ＴＣＰの錠剤や柱状体を作製してもよい。なお、β−ＴＣＰ柱状体は、β−ＴＣＰ錠剤を柱状に打ち抜くことにより作製してもよい。

本発明のβ−ＴＣＰ組成物には、β−ＴＣＰの他に薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を含んでいてもよく、ゲル状やペースト状、微粒子の懸濁液や、固形状の製剤とすることができるが、好ましくは固形状であり、その形状としては、顆粒状、粉末状、粒子状の他、円板状（短円柱状）、棒状（長円柱状）の錠剤などを挙げることができる。

また、固形状のβ−ＴＣＰ組成物の粒径としては、例えば、β−ＴＣＰブロックを粒子状に加工したβ−ＴＣＰ粉末の場合は、粒径が好ましくは５０〜１２０μｍ、より好ましくは６０〜１１０μｍ、さらに好ましくは７５〜１０５μｍである。また、β−ＴＣＰブロックを粒子状に加工したβ−ＴＣＰミクロン顆粒の場合は、粒径が好ましくは５０μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以下、さらに好ましくは３０μｍ以下、である。中でも、粒径が０．０５〜５μｍのβ−ＴＣＰミクロン顆粒や、粒径が０．０５〜２５μｍのβ−ＴＣＰミクロン顆粒を好適に例示することができる。本発明において粒径０．０５〜２５μｍの粒子は、２５μｍのふるいを通過したものを指す。円板状又は柱状や棒状の錠剤のβ−ＴＣＰ組成物の大きさとしては、直径が好ましくは０．０１〜３０ｍｍ、より好ましくは０．１〜２０ｍｍ、さらに好ましくは１〜１０ｍｍであり、長さが好ましくは０．１〜４０ｍｍ、より好ましくは０．５〜３０ｍｍ、さらに好ましくは１〜２０ｍｍであるが、中でも直径５ｍｍで長さ２ｍｍの円板状の錠剤や、直径０．９ｍｍで長さ１０ｍｍの柱状の棒剤を好適に例示することができる。

本発明における体内としては、骨や歯以外の部位であれば特に制限されず、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、脳内を挙げることができ、好ましくは皮下であり、治療対象である病変の近傍を挙げることもできる。病変の近傍に移植して用いられる場合は、好ましくは病変から１μｍ〜３０ｃｍ、より好ましくは１００μｍ〜２０ｃｍ、さらに好ましくは１ｍｍ〜１５ｃｍの距離にある領域に移植して用いることができる。本発明の治療対象の病変は、骨や歯以外における病変であれば特に制限はされず、がん、アレルギー免疫、感染症その他を例示することができ、中でもがんを好適に挙げることができ、頭蓋骨内組織、肺、偏平上皮細胞、皮膚、軟組織、膀胱、胃、すい臓、頭部、頸部、腎臓、前立腺、大腸、小腸、食道、女性器（例えば卵巣、子宮）又は甲状腺のがんを特に好適に例示することができる。

本発明のβ−ＴＣＰの投与方法としては、外科的処置により体内へ直接移植する方法であれば特に制限されず、他の目的の手術の際に、切開箇所に本発明のβ−ＴＣＰを移植することもできる。また生体への負担を軽減する観点から、通常の注射器や固形物の挿入用注射器によって、最小限の開口部から本発明のβ−ＴＣＰ組成物を体内に移植する方法を好適に例示することができる。この場合、本発明のβ−ＴＣＰ組成物としては、β−ＴＣＰ顆粒を含む懸濁液や、ゲル状やペースト状に調製されたβ−ＴＣＰや固形β−ＴＣＰを充填した注射器、例えば棒状（長円柱状）のβ−ＴＣＰ緻密体が充填されたデバイス（導入装置）や、棒状（長円柱状）β−ＴＣＰ緻密体とそのデバイス（導入装置）のセットを挙げることができる。また、投与量は、疾病の種類、病変の大きさ、患者の体重等により適宜選定することができ、好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｇ、さらに好ましくは１ｍｇ〜１ｇを例示することができる。

本発明におけるワクチン組成物としては、ワクチンを含む組成物であれば特に制限されず、好ましくはがん細胞に特異的に発現している抗原ペプチド、あるいは正常細胞では低い発現を示すが、がん細胞で高い発現を示す抗原ペプチドを含む組成物であり、がん細胞抽出液を用いることも、人工的に合成したり、遺伝子工学的手法を用いて作製した抗原ペプチドを使用することも、あるいは市販品を入手して利用することもできる。例えば、子宮頸がん予防用でパピローマウイルスに対するワクチンのサーバリックス（グラクソ・スミスクライン社）及びガーダシル（メルク社、治験実施中）、非小細胞肺がん治療用でＭＵＣ-1（mucin 1）に対するワクチンのStimuvax（メルクセローノ社、治験実施中）など、既に市場に出ているあるいは開発途中のワクチンをはじめ、悪性黒色腫（メラノーマ）で発現するＭＡＧＥ（melanoma-associated antigen）、ｇｐ１００（glycoprotein 100)、ＴＲＰ−２（tyrosinase-related protein 2）、様々ながんで発現するＮＹ−ＥＳＯ−１（cancer/testis antigen 1B）やＣＥＡ（carcinoembryonic antigen）などの腫瘍関連抗原、また、最近同定されたＵＲＬＣ１０（up-regulated lung cancer 10），ＴＴＫ（TTK protein kinase）、ＫＯＣ１（ＩＧＦ II ｍＲＮＡ結合タンパク質３)、ＲＮＦ４３（ring fingerタンパク質４３）、ＴＯＭＭ３４（translocase of outer mitochondrial membrane 34）、ＣＤＣＡ１（cell di- vision cycle associated 1）、ＫＩＦ２０Ａ（kinesin family member 20A）、ＤＥＰＤＣ１（ＤＥＰ domain-containing protein 1）、ＭＰＨＯＳＰＨ１（M phase phosphoprotein 1）など腫瘍特異的に発現する遺伝子群、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（上皮成長因子受容体２）やＷＴ１（Wilms tumor 1）などのがん遺伝子やｐ５３とその変異体などのがん抑制遺伝子の産物である蛋白、または腫瘍への血管新生に関与するＶＥＧＦＲ１（血管内皮細胞増殖因子受容体−１）及びＶＥＧＦＲ２（血管内皮細胞増殖因子受容体−２）などの増殖因子受容体蛋白等、腫瘍または腫瘍周辺組織（ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２）で特異的あるいは優先的に発現される蛋白由来の抗原ペプチドを含む医薬組成物を例示することができる。かかる抗原ペプチドの長さも１アミノ酸からタンパク質全長まで、適宜調製することができ、好ましくは１〜１０００アミノ酸、より好ましくは２〜３００アミノ酸、さらに好ましくは３〜１００アミノ酸を挙げることができる。かかるワクチン組成物は薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を含んでいてもよく、経口的又は非経口的に投与することができ、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射により非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできるが、注射や点滴による非経口投与を好適に例示することができる。

本発明のワクチン療法キットや本発明のワクチン療法の効果増強剤は、ａ）対象の体内にβ−リン酸三カルシウムを移植するステップ；及びｂ）対象にワクチン組成物を投与するステップ；を備えたワクチン組成物によるワクチン療法に用いることもできる。ワクチン組成物は、β−ＴＣＰが移植されると同時、又はその前後に対象に投与され、投与量や投与回数はワクチン組成物の活性の強さ、疾病の種類、患者の体重、投与形態等により適宜選定することができ、例えば好ましくは１日あたり０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、より好ましくは０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、さらに好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）を挙げることができる。好ましくは本発明のβ−ＴＣＰが移植されると同時、又はその後にワクチン組成物を対象への投与を開始し、一定期間ごとに数回、好ましくは、２週ごとに、計２回投与する例を挙げることができる。また、本発明におけるワクチン組成物はコンプリートアジュバントやインコンプリートアジュバントを含んでもよく、例えばフロイントのコンプリートアジュバントやフロイントのインコンプリートアジュバントの併用を挙げることもできる。また、本発明におけるワクチン組成物は、ワクチン組成物以外の他の薬剤、サプリメントなどの投与と併用してもよく、手術などの外科療法と併用することもできる。

本発明のワクチン組成物を用いるワクチン療法の効果増強剤は、ワクチン組成物の投与のみによるワクチン療法と、コントロール又は本発明のβ−ＴＣＰ組成物及びワクチン組成物の投与を併用した場合の治療効果とを比較した場合に、β−ＴＣＰ組成物を併用した方が高い治療効果が得られるという効果を有する。例えば腫瘍マーカーの値の減少や、例えば腫瘍サイズを指標として比較した場合に、ワクチン療法のみに比べ、ワクチン療法に加えてβ−ＴＣＰを併用した方が、腫瘍サイズが縮小、あるいは増加しないことを調べることにより、本発明の効果を具体的に確認することができる。

また本発明は、β−ＴＣＰを移植したマウスを、新たなワクチン組成物の効果の検証や、候補物質の段階では薬効の弱いワクチン組成物のスクリーニングにも用いることもできるという効果を有する。例えば、抗腫瘍効果の検証には多くの場合ヌードマウスが用いられるが、ヌードマウスでは抗腫瘍効果をもたらす可能性のあるエフェクター細胞がＮＫ細胞だけであるのに対し、本発明における実験系では正常なマウスを用いて、ＮＫ細胞だけでなくＴ細胞及びＢ細胞の関与についても検討できるため、よりヒトの臨床（がん患者など）に近い試験を行うことができる。

以下に、具体例によってさらに説明する。
［β−ＴＣＰを用いたワクチン組成物によるワクチン療法］
＜具体例１＞
例えば、以下の実験群を設定することができる。
１群：対照群
２群：アジュバント投与群
３群：β−ＴＣＰ移植群
４群：アジュバント投与＋β−ＴＣＰ移植群
５群：アジュバント−ＯＶＡペプチド投与群
６群：アジュバント−ＯＶＡペプチド投与＋β−ＴＣＰ移植群

（１）６週齢の雄性マウス（C57BL/6）側腹部皮下にφ５ｍｍ×厚さ２ｍｍの円板状のβ−ＴＣＰの錠剤（３，４，６群）または同サイズのプラスチック片（１，２，５群）を移植する。
（２）７日後、移植したβ−ＴＣＰ錠剤またはプラスチック片の近傍にアジュバントＦＣＡ（Freund’s complete adjuvant）又はＦＩＡ（Freund’s incomplete adjuvant）に懸濁したＯＶＡ（オバルブミン）ペプチド（アミノ酸配列：ＳＩＩＮＦＥＫＬ）１〜１００μｇを皮内投与する。
（３）１４日後、上記（２）の手順を再度繰り返す。
（４）２１日後、移植及び投与を行った反対側の側腹部皮下に１×１０^４〜１×１０^５個のマウス・リンパ腫細胞E.G7-OVA（ＡＴＣＣ社より購入）を移植し、腫瘍の形成及び生存期間について観察する。

本実験で使用するE.G7-OVA細胞は、遺伝子導入によりニワトリ・オバルブミンを発現し、ＭＨＣクラスＩ上にＯＶＡペプチドを提示することが知られている。ＯＶＡペプチドによる免疫が有効に作用した場合、マウス体内にはＯＶＡペプチド特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が誘導され、免疫後にE.G7-OVAを移植しても腫瘍の生着は阻止される。したがって、１〜５群に比べて６群において腫瘍の形成が抑えられれば、β−ＴＣＰはワクチン・アジュバンドとして機能したと評価することができる。

＜具体例２＞
本実験では例えば以下の実験群を設定することができる。
１群：対照群
２群：アジュバント投与群
３群：β−ＴＣＰ移植群
４群：アジュバント投与＋β−ＴＣＰ移植群
５群：アジュバント−ＴＲＰ−２ペプチド投与群
６群：アジュバント−ＴＲＰ−２ペプチド投与＋β−ＴＣＰ移植群

（１）６週齢の雄性マウス（C57BL/6）側腹部皮下にφ５ｍｍ×厚さ２ｍｍの円板状のβ−ＴＣＰの錠剤（３，４，６群）または同サイズのプラスチック片（１，２，５群）を移植する。
（２）７日後、移植したβ−ＴＣＰ錠剤またはプラスチック片の近傍にアジュバントＦＣＡ（Freund’s complete adjuvant）又はＦＩＡ（Freund’s incomplete adjuvant）に懸濁したＴＲＰ−２（Tyrosinase-related protein 2）ペプチド（アミノ酸配列：ＶＹＤＦＦＶＷＬ）１〜１００μｇを皮内投与する。
（３）１４日後、上記（２）の手順を再度繰り返す。
（４）２１日後、移植及び投与を行った反対側の側腹部皮下に１×１０^４〜１×１０^５個のマウス・メラノーマ細胞B16（ＡＴＣＣ社より購入）を移植し、腫瘍の形成及び生存期間について観察する。１〜５群に比べて６群において腫瘍の形成が抑えられれば、β−ＴＣＰはワクチン・アジュバンドとして機能したと評価することができる。

＜具体例３＞
本実験では例えば以下の実験群を設定することができる。
１群：対照群
２群：アジュバント投与群
３群：β−ＴＣＰ移植群
４群：アジュバント投与＋β−ＴＣＰ移植群
５群：アジュバント−ＷＴ１ペプチド投与群
６群：アジュバント−ＷＴ１ペプチド投与＋β−ＴＣＰ移植群

（１）６週齢の雄性マウス（C57BL/6）側腹部皮下にφ５ｍｍ×厚さ２ｍｍの円板状のβ−ＴＣＰの錠剤（３，４，６群）または同サイズのプラスチック片（１，２，５群）を移植する。
（２）７日後、移植したβ−ＴＣＰ錠剤またはプラスチック片の近傍にアジュバントＦＣＡ（Freund’s complete adjuvant）又はＦＩＡ（Freund’s incomplete adjuvant）に懸濁したＷＴ１ペプチド（アミノ酸配列：ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ）１〜１００μｇを皮内投与する。
（３）１４日後、上記（２）の手順を再度繰り返す。
（４）２１日後、移植及び投与を行った反対側の側腹部皮下に１×１０^４〜１×１０^５個のmWT1-C1498（ＷＴ１発現マウス白血病細胞；ＡＴＣＣ社より購入）を移植し、腫瘍の形成及び生存期間について観察する。１〜５群に比べて６群において腫瘍の形成が抑えられれば、β−ＴＣＰはワクチン・アジュバンドとして機能したと評価することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

［β−ＴＣＰの作製方法］
β−ＴＣＰブロックは、人工骨として製品を購入することもできるが、原料のβ−ＴＣＰと水、界面活性剤、発泡剤を混ぜ、焼結することにより作製することもできる。かかるβ−ＴＣＰブロックは、気孔率７５％や気孔率６０％であった。また、β−ＴＣＰ粉末やβ−ＴＣＰ顆粒については、前記気孔率７５％のβ−ＴＣＰブロックを粉砕し、篩にかけて粒径７５〜１０５μｍのβ−ＴＣＰ粉末（気孔率：６０〜７０％）を得た。また、同様に篩にかけて得られた２５〜７５μｍのβ−ＴＣＰ（気孔率：４０〜５０％）とＰＢＳ溶液を混合後、すぐに液体上部４分の３部分の液体を採取し、１０００ｒｐｍにて３分間の遠心操作で沈殿から０．０５〜２５μｍのβ−ＴＣＰミクロン顆粒（気孔率：３５〜５０％）を、上清から０．０５〜５μｍのミクロン顆粒を採取した（気孔率：２０〜３０％）。また、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム及び水を適切な割合で混合してスラリーを調製し、調製したスラリーを摩砕しながら反応させた後に乾燥させ、得られた固形物を粉砕して仮焼することでβ−ＴＣＰ粉末が得られ、その粉末を圧縮形成することによりφ５×２ｍｍ錠剤に賦形し、６００〜１５００℃で３０時間焼結することで、円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤を作製した（気孔率：０．１〜２０％）。また、β−ＴＣＰの原料粉末３０ｇ、界面活性剤６．０ｍＬ、水１０ｍＬとを遠心管に注入し、２５０ｒｐｍで４分間処理することで脱泡処理をし、型に注入して自然乾燥させ、離型後、１３００℃にて焼結することで、φ０．９×１０ｍｍの柱状のβ−ＴＣＰ緻密体棒剤を作製した（気孔率:１０〜３０％）。なお、作製した各β−ＴＣＰの気孔率は、水銀法にて、初期圧に対応する直径約１８０μｍの細孔にまで水銀が圧入された時の試料体積に対する値として測定された。

作製したβ−ＴＣＰ顆粒（サイズ２５〜７５μｍ）と免疫細胞の結合を走査型電子顕微鏡にて観察した結果を図１に示す。また、作製したβ−ＴＣＰ緻密体錠剤、及び緻密体棒剤を、走査型電子顕微鏡にて観察した結果を図２、図３に示す。また、β−ＴＣＰ緻密体を皮下に移植した正常マウスから組織サンプルを採取し、ＨＥ染色し、顕微鏡にて観察した結果を図４に示す。リンパ球が集積し、天然のリンパ節と似た構造となっていることがわかった。また、サイズ０．０５〜１０５μｍのβ−ＴＣＰ顆粒（気孔率０〜７０％）を皮下に移植したマウスから組織サンプルを採取し、ＨＥ染色し、顕微鏡にて観察した結果を図５に示す。サイズ７５μｍ以上のβ−ＴＣＰ顆粒はマクロファージを誘導し（Ｎ＝１３）、７５μｍ以下の顆粒はリンパ球を集め（Ｎ＝１１）、サイズ０．０５〜２５μｍの微小顆粒はリンパ球集塊を形成した。また、φ５×２ｍｍのβ−ＴＣＰ緻密体（気孔率：１８％）を皮下に移植したマウスの組織サンプルを抗ＣＤ４５Ｒ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４９ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗Ｆ４／８０Ｒ抗体、又は抗Ｄ２−４０抗体を用いて、それぞれＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージ、リンパ管を免疫組織染色して顕微鏡にて観察した。結果を図６〜図１１に示す。以上の結果から、皮下に移植された焼結により緻密化したβ−ＴＣＰは、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）、樹状細胞、マクロファージを誘導し、人工リンパ節として利用できることが確認された。抗腫瘍効果の検証には、多くの場合ヌードマウスが用いられる。しかしながらヌードマウスでは抗腫瘍効果をもたらす可能性のあるエフェクター細胞がＮＫ細胞だけであるのに対し、本発明のβ−ＴＣＰを移植したマウスは、Ｔ細胞及びＢ細胞の関与についても検討できるため、よりヒトの臨床（癌患者）に近い状態での試験を行うことができることが確認できた。

［β−ＴＣＰを用いたワクチン組成物によるワクチン療法：その１］
（１）ワクチンの実験系には、C57BL/6系統のマウスとトリ・オバルブミンを発現するマウスのリンパ腫細胞であるE.G7-OVA（ＡＴＣＣ社より購入）を用いる腫瘍モデル実験系を用いた。この系を用いて、以下の３群を設定した。
１）コントロール群：無処置動物にE.G7-OVAを移植した群
２）ＯＶＡ投与群：ＯＶＡ蛋白を投与後にE.G7-OVAを移植した群
３）ＯＶＡ＋ＴＣＰ群：ＴＣＰを移植、及びＯＶＡ蛋白を投与後にE.G7-OVAを移植した群
６週齢の雄性マウス（C57BL/6）側腹部皮下にφ５ｍｍ×厚さ２ｍｍの円板状のβ−ＴＣＰ緻密体（気孔率：０．１〜１２％）の錠剤を移植した（ＯＶＡ＋ＴＣＰ群）。
（２）７日後、移植したβ−ＴＣＰ錠剤周囲の皮内（ＯＶＡ＋ＴＣＰ群）または側腹部皮内（ＯＶＡ投与群）に１００μｇのＯＶＡ蛋白を投与した。
（３）１４日後、上記（２）の手順を再度繰り返した。
（４）２１日後、側腹部皮下に１×１０^５個のE.G7-OVA細胞を移植し、腫瘍の形成及び増殖について観察した。
結果を図１２に示す。図１２中の＊は、β−ＴＣＰ移植後にＯＶＡ蛋白で免疫したＯＶＡ＋ＴＣＰ群では、実験開始４２日後及び４５日後においてコントロール群に比べて有意に腫瘍増殖が抑制されたことを示す（t-test、p<0.05）。本実験で使用するE.G7-OVA細胞は、遺伝子導入によりニワトリ・オバルブミンを発現し、ＭＨＣクラスＩ上にＯＶＡペプチドを提示することから、３）群においてはＯＶＡペプチドによる免疫が有効に作用し、マウス体内でＯＶＡペプチド特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が誘導され、腫瘍増殖が抑制されたと考えられる。

本発明は、ワクチン療法や、ワクチン療法の補助療法、腫瘍治療法などの医療分野や、アジュバントなどの分野などに好適に利用することができる。

Claims (18)

1. 対象の体内に移植されて用いられる気孔率０．１〜１２％のβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする組成物と、ワクチン組成物とを備え、前記β−リン酸三カルシウムを有効成分とする組成物の投与後にワクチン組成物を投与することを特徴とするワクチン療法キット。
2. 体内が、皮内、皮下、又は筋肉内であることを特徴とする請求項１記載のワクチン療法キット。
3. β−リン酸三カルシウムが病変近傍に移植されることを特徴とする請求項１又は２記載のワクチン療法キット。
4. 病変近傍が、病変から０．１〜１５ｃｍの距離にある領域であることを特徴とする請求項３記載のワクチン療法キット。
5. ワクチン組成物が、がん特異的抗原ワクチンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のワクチン療法キット。
6. がん特異的抗原ワクチンが、ＴＲＰ−２（Tyrosinase-related protein 2）、ＷＴ１（Wilms tumor 1）、又はがん細胞抽出液（Tumor lysate）由来の抗原ペプチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のワクチン療法キット。
7. β−リン酸三カルシウムが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及びマクロファージを活性化、誘導、又は集積することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のワクチン療法キット。
8. β−リン酸三カルシウムが、錠剤又は柱状体であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のワクチン療法キット。
9. β−リン酸三カルシウムが、粒径０．０５〜２５μｍの粒子又は顆粒であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のワクチン療法キット。
10. 対象の体内に移植されて用いられる気孔率０．１〜１２％のβ−リン酸三カルシウムを有効成分とするワクチン組成物を用いるワクチン療法の効果増強剤であって、前記β−リン酸三カルシウムを有効成分とする組成物の投与後に前記ワクチン組成物を投与することを特徴とする、ワクチン療法の効果増強剤。
11. 体内が、皮内、皮下、又は筋肉内であることを特徴とする請求項１０記載のワクチン療法の効果増強剤。
12. β−リン酸三カルシウムが病変近傍に移植されることを特徴とする請求項１０又は１１記載のワクチン療法の効果増強剤。
13. 病変近傍が、病変から０．１〜１５ｃｍの距離にある領域であることを特徴とする請求項１２記載のワクチン療法の効果増強剤。
14. ワクチン組成物が、がん特異的抗原ワクチンであることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか記載のワクチン療法の効果増強剤。
15. がん特異的抗原ワクチンが、ＴＲＰ−２（Tyrosinase-related protein 2）、ＷＴ１（Wilms tumor 1）、又はがん細胞抽出液（Tumor lysate）由来の抗原ペプチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項１４記載のワクチン療法の効果増強剤。
16. β−リン酸三カルシウムが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及びマクロファージを活性化、誘導、又は集積することを特徴とする請求項１０〜１５のいずれか記載のワクチン療法の効果増強剤。
17. β−リン酸三カルシウムが、錠剤又は柱状体であることを特徴とする請求項１０〜１６のいずれか記載のワクチン療法の効果増強剤。
18. β−リン酸三カルシウムが、粒径０．０５〜２５μｍの粒子又は顆粒であることを特徴とする請求項１０〜１６のいずれか記載のワクチン療法の効果増強剤。