JP6087429B2

JP6087429B2 - 変形されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドの新規用途

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Publication number: JP6087429B2
Application number: JP2015518318A
Authority: JP
Inventors: ソンウクキム; スングクパク; ヨンジョンソン; ウンソンキム; ヘギョンアン; ジェガプチョン; フンギュンイ
Original assignee: Hanall Biopharma Co Ltd
Current assignee: Hanall Biopharma Co Ltd
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2013-02-07
Publication date: 2017-03-01
Anticipated expiration: 2033-02-07
Also published as: KR20130143484A; CN104394881B; CN104394881A; WO2013191352A1; BR112014031923A2; BR112014031923B1; JP2015525237A; KR101514238B1; US9580490B2; US20150119338A1

Description

本発明は、変形されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド（ＴＮＦＲＩ）の新しい用途、特に眼球乾燥症の予防及び治療に用いるための用途に関するものである。

乾燥角膜結膜炎（keratoconjunctivitis sicca）とも呼ばれる眼球乾燥症（「眼球乾燥（dry eye）」ともいう）は、毎年数百万人に影響を及ぼす眼科疾患である。特に可妊停止に伴うホルモン変化により閉経後女性に多く発生すると知られている。眼球乾燥は人によって様々な程度で現れる。軽症の場合、患者は灼熱感、乾燥した感じ及び異物感を感じることになって、重症の場合は、視力が大きく損傷することもある。シェーグレン症候群及び瘢痕性類天疱瘡などの他の疾病は、眼球乾燥複合症状を示すこともある。

現在までの研究結果を基に見ると、眼球乾燥症は多くのストレスによって眼球表面（ocular surface）でサイトカインと抗原提示細胞などが関連した自己免疫反応が発生して、角膜組織に免疫細胞が集中して、これに伴い、組織が損傷を受けて発生する疾患と理解されている。

眼球乾燥症の代表的な治療法は、人工涙液を用いることによって眼球の涙膜を補完して、涙の蒸発を減少させて安定化することであり、その他内部の涙産生の刺激を提供する涙挿入物を用いることができる。人工涙液の主な成分は、セルロースエーテル、カルボマー、ポリビニールアルコール、ポリビニールピロリドンまたは、ヒアルロン酸ナトリウムなどで、緩衝液や等張性食塩水溶液に含まれて製造される。これらの成分は、溶液を粘性で作って目から流れにくくしたり涙の蒸発を防いで潤滑剤の役割を果たすことになる。しかしながら、このような治療剤は根本的な治療でなく対症療法という限界を持つ。

一方、眼球乾燥を発生させる原因が眼球表面での炎症反応に関連しているとの事実が明らかになり、種々の抗炎症物質を治療に適用しようとする研究が進行されており、努力があってこれに対する効果が立証された。

具体的に、眼球乾燥症状に苦しんでいる患者の涙腺及びマイボーム腺（Meibomian gland）のような関連眼球組織で不均衡的に過度な炎症特性が現れると報告されたことがあって、多様な化合物、例えばステロイド、サイトカイン流出阻害剤、シクロスポリンＡ及び１５−ＨＥＴＥなどが眼球乾燥症に効果があると知られている。

腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor alpha、ＴＮＦα）は、炎症反応に関連した主な因子として、細胞表面に存在するヒト腫瘍壊死因子受容体（TNF receptor、ＴＮＦＲ）ＩまたはＩＩと結合して、アポトーシスと炎症反応を含んだ多様な細胞反応を起こす。ＴＮＦαと腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の結合を阻害することによって多様な自家免疫関連炎症疾患を治療できることが立証された以後、多様なＴＮＦα阻害剤が開発されてきたが、代表的なＴＮＦα阻害剤としては、ＴＮＦＲＩＩにＦｃを結合したエタネルセプト（Etanercept、商品名エンブレル（Enbrel））とＴＮＦαに対する抗体であるインプリキシマブ（Infliximab、商品名レミケード（Remicade））、アダルムマブ（Adalimumab、商品名ヒュミラ（Humira））等がある。これらは主にリューマチ関節炎、乾癬、クローン病などの治療剤として利用されている。

一方、ＴＮＦα阻害剤は、眼球乾燥の治療効果も提示されたことがある（米国特許第６，４２８，７８７号明細書、米国特許第６，３７９，６６６号明細書、米国特許第６，１７７，０７７号明細書、米国特許第６，２０４，２７０号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１２６３７２号明細書、国際公開第００／２７４２１号）。また、米国特許出願公開第２００９／００９８１３６号明細書には動物モデルで、エタネルセプトとインプリキシマブの眼球乾燥症の治療効果が記載されており、二つの物質の点眼投与によって涙発現時間（tear break up time）と角膜染色症状が改善される傾向が現れたことが記載されている。

しかしながら、現状は依然としてより高い治療効能を示す新しい眼球乾燥症の治療剤、特に新しいＴＮＦα阻害剤を有効成分とする眼球乾燥症治療剤に対する需要が多い。

本発明の発明者等は、ヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ＴＮＦＲＩ）の変異体中特定変異体及びこれらの切片が眼球乾燥症に臨床的に優れた効果を示すことを確認して本発明を完成した。これに伴い、本発明は変形されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその切片の新規な用途、特に眼球乾燥症治療のための用途に関する。

本出願人の特許出願である韓国公開特許第２０１１−００４３４８５号公報には、ＴＮＦα阻害剤として、生体内に存在するタンパク質分解酵素に対する抵抗性が向上した変形されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその切片が開示されて、韓国公開特許第２０１２−００２７６６６号公報にはＴＮＦα阻害剤として、ＴＮＦαとの結合力が増加した変形されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその切片が開示されている。

本発明者等は、新規の変形されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドに関する前記特許出願以後刻苦の研究を続けて、前記変形されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドに比べて向上した効能を持つ次世代ヒト腫瘍壊死因子受容体−１変異体を開発しており（韓国公開特許第２０１２−００７２３２３号公報参照）、このように開発されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１変異体中特定変異体が眼球乾燥症に臨床的に優れた効果を示すことを確認した。

特に、本発明者等は、動物モデルで、本発明に係る特定変異体が眼球乾燥治療に優れた効果を示す反面、驚くべきことに代表的なＴＮＦα阻害剤であるエタネルセプトの場合、明確な症状改善効果がないことを確認した。このような事実は、すべてのＴＮＦα阻害剤が眼球乾燥症に有意な効果を示すのではないことを意味して、本発明に係る特定変異体だけが眼球乾燥の治療に非常に有用に用いられることを立証するものである。

本発明に係る他の様態として、本発明は変形されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその切片の１種以上を有効成分として含有する眼球乾燥症の予防及び／または治療用組成物及びこれを利用した眼球乾燥症の予防及び／または、治療方法を提供する。

以下、本発明をより詳細に説明する前に、本発明の技術的特徴をより明確に説明するために、本発明で使われた用語を定義する。別途定義しない限り、下記の用語は、本発明の詳細な説明及び特許請求範囲で下記に定義された意味を持つ。

本発明における「全長ヒト腫瘍壊死因子受容体−１」または「全長ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド」（以下、「ＴＮＦＲＩ」または「ＴＮＦＲＩポリペプチド」という）は、ヒト由来で４５５個のアミノ酸で構成され、ＴＮＦαと結合するポリペプチドを意味する。特に天然型（野生型、wild type）ＴＮＦＲＩは、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を持つ。

本発明における「ヒト腫瘍壊死因子受容体−１切片」または「ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド切片」（以下、「ＴＮＦＲＩ切片」または「ＴＮＦＲＩポリペプチド切片」という）は、ＴＮＦＲＩの配列と互いに相応するアミノ酸の配列が１００％一致して、一つ以上のアミノ酸残基が欠如されたＴＮＦＲＩの一部分を意味する。ＴＮＦＲＩ切片において、アミノ酸残基（等）の欠如位置は、ＴＮＦＲＩＮ−末端またはＣ−末端または内部を含んでポリペプチド内のどこでもよい。このような切片は、ＴＮＦＲＩと一つ以上の生物学的特性、例えばＴＮＦα阻害剤としての機能や眼球乾燥症治療効能などを共有する。代表的なＴＮＦＲＩ切片の例は、ＴＮＦＲＩのＮ−末端４１番目アミノ酸から１０５個、または１２６個、または１７１個のアミノ酸残基を持つ切片で、これらは各々本発明でＴＮＦＲＩ１０５、ＴＮＦＲＩ１２６、ＴＮＦＲＩ１７１と命名される。

本発明における「ＴＮＦＲＩ（突然）変異体」、「ＴＮＦＲＩ（突然）変異体切片」または「変形されたＴＮＦＲＩポリペプチド」、「変形されたＴＮＦＲＩポリペプチド切片」とは、各々下記定義された通り天然または、組換え細胞から分離したＴＮＦＲＩまたはＴＮＦＲＩ切片と１００％未満の配列同一性を持つ変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片を意味して、「ＴＮＦＲＩ（突然）変異体切片」または「変形されたＴＮＦＲＩポリペプチド切片」は、「ＴＮＦＲＩ（突然）変異体」または「変形されたＴＮＦＲＩポリペプチド」と一つ以上の生物学的特性、例えばＴＮＦα阻害剤としての機能や眼球乾燥症治療効能などを共有する。通常、ＴＮＦＲＩ変異体は、野生型、または天然型ＴＮＦＲＩ、またはＴＮＦＲＩ切片と約７０％以上のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を持つ。配列同一性は、好ましくは約７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、最も好ましく９５％以上である。代表的なＴＮＦＲＩの変形形態は、特定位置で他のアミノ酸残基への置換である。

本発明における「４重変異体」とは、腫瘍壊死因子受容体−１、またはヒト腫瘍壊死因子受容体−１切片のアミノ酸配列のうち四つの位置に突然変異が起きた変異体を意味する。

本発明における「５重変異体」とは、腫瘍壊死因子受容体−１、またはヒト腫瘍壊死因子受容体−１切片のアミノ酸配列のうち五つの位置に突然変異が起きた変異体を意味する。

本発明における「６重変異体」とは、腫瘍壊死因子受容体−１、またはヒト腫瘍壊死因子受容体−１切片のアミノ酸配列のうち六つの位置に突然変異が起きた変異体を意味する。

本発明における「ＴＮＦＲＩｍ」とは、ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列のうちＮ−末端の４１番目アミノ酸からｍ個のアミノ酸配列からなるＴＮＦＲＩ切片を意味する。例えば、ＴＮＦＲＩ１０５切片は、ＴＮＦＲＩＮ−末端４１番目アミノ酸から１０５個のアミノ酸配列を持つＴＮＦＲＩ切片を意味して、他の例としてＴＮＦＲＩ１２６は、ＴＮＦＲＩＮ−末端４１番目アミノ酸から１２６個のアミノ酸からなるＴＮＦＲＩ切片を意味する。

本発明で提供されるアミノ酸の多様な配列内に存在するアミノ酸は、それらの公示された３−文字、または１−文字略語によって表示される。多様な核酸切片内に存在するヌクレオチドは、当分野において通常使われる標準単一−文字命名法で命名される。

本発明における「ｘＡｚ」とは、ＴＮＦＲＩまたはＴＮＦＲＩ切片のアミノ酸配列Ｎ末端からＡ番目アミノ酸ｘがｚに置換されたことを意味する。例えば、Ｋ４８Ｑは、配列番号１によるＴＮＦＲＩのアミノ酸配列Ｎ末端から４８番アミノ酸残基が、リシン（Ｌｙｓ）からグルタミン（Ｇｌｎ）に置換されたことを意味する。

本発明に係る眼球乾燥症の予防及び／または治療用組成物の有効成分である変形されたＴＮＦＲＩ、または変形されたＴＮＦＲＩ切片は、配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列またはＴＮＦＲＩ切片のアミノ酸配列において、
位置９２、９５、９７、及び９８の４個のアミノ酸残基の位置におけるアミノ酸の変形を含むアミノ酸配列（４重変異体）、
位置６８、９２、９５、９７、及び９８の５個のアミノ酸残基の位置におけるアミノ酸の変形を含むアミノ酸配列（５重変異体）、または
位置６８、９２、９５、９７、及び９８の５個のアミノ酸残基の位置及び、追加的に位置１６１、または２０７のアミノ酸残基の位置におけるアミノ酸の変形を含むアミノ酸配列（６重変異体）、を持つことが好ましい。

前記アミノ酸変形は、変形されなかった天然型ＴＮＦＲＩまたはＴＮＦＲＩ切片と比較して、ＴＮＦαとの結合力を維持、または増加させたり、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を維持、または増加させるための変形で、挿入、置換、欠如などのいずれの変形が用いられ、代表的にはアミノ酸の置換を用いることができる。また、増加した結合力を提供したり、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を維持、または増加させる限り、タンパク質翻訳−後変形（post-translational modification）のような特定位置におけるアミノ酸に対する他の化学的な変形、例えば炭水化物部位による糖化、アシル化（acylation）（例、アセチル化（acetylation）またはコハク化（succinylation）、メチル化（methylation）、リン酸化（phosphorylation）、ハシル化（hasylation）、カルバミル化（carbamylation）、硫酸化（sulfation）、プレニル化（prenylation）、酸化（oxidation）、グアニジル化（guanidination）、アミジン化（amidination）、カルバミル化（例、カルバモイル化（carbamoylation））、トリニトロフェニル化（trinitrophenylation）、硝酸化（nitration）、ペグ化（pegylation）等も用いられてもよいことは、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者（以下、「当業者」という）には自明である。

本発明に係る眼球乾燥症の予防及び／または治療用組成物の有効成分である変形されたＴＮＦＲＩ、または変形されたＴＮＦＲＩ切片は、配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列またはＴＮＦＲＩ切片のアミノ酸配列において、アミノ酸変形がアミノ酸置換である場合、配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列、またはこれのＴＮＦＲＩ切片のアミノ酸配列において、
９２位でＳのＩ、またはＭへの置換、
９５位でＨのＦへの置換、
９７位でＲのＰへの置換、及び
９８位でＨのＡ、またはＧへの置換、が必須的に含まれて、
好ましくは追加的に、
６８位でＬのＶへの置換、
１６１位でＫのＱ、またはＮへの置換、及び
２０７位でのＤのＮへの置換、から選択された一つ以上のアミノ酸残基の変形がさらに含まれてもよい。前記変形で、好ましくは前記９２位のＳは、Ｍに置換されて、９８位のＨは、Ｇに置換されて、１６１位のＫは、Ｎに置換される。

すなわち、９２位でＳのＩ、またはＭへの置換、９５位でＨのＦへの置換、９７位でＲのＰへの置換及び９８位でＨのＡ、またはＧへの置換を含む４重変異体、
前記４重変異体で追加的に６８位でＬのＶへの置換を含む５重変異体、または
前記５重変異体で追加的に１６１位でＫのＱ、またはＮへの置換、または、２０７位でのＤのＮへの置換を含む６重変異体が本発明に係る眼球乾燥症の予防及び／または治療用組成物の有効成分として利用されることが好ましい。

また、本発明に係る眼球乾燥症の予防及び／または治療用組成物は、前記変形されたＴＮＦＲＩまたはＴＮＦＲＩ切片の１種以上を含有してもよい。

すでに定義された通り、ＴＮＦＲＩ切片は、ＴＮＦＲＩと実質的に同等な効果を示すＴＮＦＲＩの一部分を意味して、特に本発明では配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜２１１番からなるアミノ酸配列（配列番号２、ＴＮＦＲＩ１７１）、配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜１６６番からなるアミノ酸配列（配列番号３、ＴＮＦＲＩ１２６）、配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜１４５番からなるアミノ酸配列（配列番号４、ＴＮＦＲＩ１０５）が好ましく利用される。参考として、ＴＮＦＲの四番目のドメインは、ＴＮＦαとの結合に必須でなく、二番目と三番目のドメインを欠如させる場合、ＴＮＦαとの結合活性を喪失すると知られ（Ｃｏｒｃｏｒａｎ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３３：８３１−８４０１９９４）、またＴＮＦＲＩとＴＮＦαの結合に三番目のドメインの一定部位が欠損されることがあり、天然型ＴＮＦＲＩ（配列番号１）の５９番から１４３番のアミノ酸からなる切片だけでもＴＮＦＲＩの生物学的活性が現れることは当分野に良く知られている（米国特許第６，９８９，１４７号明細書など参照）。

本発明の変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片の範疇には、前記変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片と実質的に同じポリペプチドも含まれることは当業者には自明である。前記「変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片と実質的に同じポリペプチド」とは、変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片の本質的な特性が維持される限り、変形が起きたアミノ酸残基の個数及び変形の種類には特に制限がなく、アミノ酸置換、欠如、付加またはその他変形を含むポリペプチドを意味する。

特に、「変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片と実質的に同じポリペプチド」には、変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片のアミノ酸配列と配列配列（sequence alignment）時に、機能的に不変であると把握される残基を持つ位置で、ＴＮＦαとの結合力向上及び／またはタンパク質分解酵素に対する抵抗性維持／向上のためのアミノ酸変形が起きたことが好ましく、当業者は保存的で同じアミノ酸残基をガイドとして用いてＴＮＦＲＩポリペプチドの配列を整列することによって相応する残基を同定ことができる。また、本発明に係る具体的な変形位置など本発明に係る変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片の機能に影響を及ぼし得る残基位置でも、保存的置換など本発明で目的とする特性が維持できる限り、そのような位置での変形が起きたポリペプチドも含まれてもよい。

好ましくは、配列番号１に記載された配列を持つポリペプチドと、本発明における具体的な位置でのアミノ酸変形を除いて、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または、９９％以上の配列相同性を持つことで、ＴＮＦＲＩの対立遺伝子型変異体同種型、組織−特異的な同種型そしてそれらの対立遺伝子型変異体、一つ以上のアミノ酸突然変異、置換、欠如、挿入、または、追加を持つ合成変異体、核酸を翻訳することによって製造された合成分子、ヒト及び非ヒト組織と細胞から抽出したタンパク質、キメラＴＮＦＲＩポリペプチド及びその変形された形態を含んでもよい。

本発明の変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片の範疇には、さらに前記言及された変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片を二つ以上含む多量体ポリペプチド（または、「ポリペプチド複合体」ともいう）も含まれる。
前記ポリペプチド複合体は、変形されたＴＮＦＲＩ又は変形されたＴＮＦＲＩ切片の少なくとも２つが結合、好ましくは共有結合された構造を有する。

本発明の好ましい実現形態として、本発明の組成物は、下記から選択されるアミノ酸配列を含む変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片の１種以上を有効成分として含有する：
配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ）でＳ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｑ、または、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎ中から選択されるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列；
配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜２１１番からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１７１）でＳ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｑ、または、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎ中から選択されるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列；
配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜１６６番からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１２６）でＳ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｑ、または、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎ中から選択されるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列；または
配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜１４５番からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１０５）でＳ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ、または、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ中から選択されるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列。

本発明のより好ましい実現形態として、本発明の組成物は、下記から選択されるアミノ酸配列を含む変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片の１種以上を有効成分として含有する：
配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ）でＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、または、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎ中から選択されるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列；
配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜２１１番からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１７１）でＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、または、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎ中から選択されるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列；または
配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜１６６番からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１２６）でＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、または、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎ中から選択されるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列。

本発明の最も好ましい実現形態として、本発明の組成物は、下記から選択されるアミノ酸配列を含む変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片の１種以上を有効成分として含有する：
配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ）でＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎ、または、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎであるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列；
配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜２１１番からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１７１）でＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎ、または、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎであるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列；または
配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜１６６番からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１２６）でＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎであるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列。

本発明の他の好ましい実現形態として、本発明の組成物は、配列番号５〜３０から選択されるアミノ酸配列を含む変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片の１種以上を有効成分として含有する。

前記本発明の変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片は、大腸菌や酵母などの微生物または動物細胞を利用して製造が可能で、このようなポリペプチド及びその製造に関する技術は当分野に公示されて、特に韓国公開特許第２０１２−００２７６６６号公報にも詳細に記載されている。

また、本発明の変形されたヒトＴＮＦＲＩまたはヒトＴＮＦＲＩ切片の範疇には、好ましくは大腸菌や酵母などの微生物や動物細胞での産生のために、ポリペプチドのアミノ酸配列アミノ末端に信号配列（signal sequence）またはメチオニン（Ｍｅｔ）が付加されたポリペプチドが含まれてもよい。

さらに本発明は、前記変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片を暗号化する遺伝子、前記遺伝子を含むベクター、または、前記ベクターで形質転換された微生物または動物細胞を提供して、前記遺伝子、ベクター及び微生物または動物細胞を利用した変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片の産生方法を提供する。

さらに本発明は、前記変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片を暗号化する遺伝子、前記遺伝子を含むベクターを含む眼球乾燥症の予防または治療用組成物を提供する。

本明細書で、眼球乾燥症は、乾性角結膜炎（ＫＣＳ）、加齢に伴う眼球乾燥をはじめとして、スチーブンス−ジョンソン症候群、シェーグレン症候群、眼球瘢痕類天疱瘡、眼瞼炎、角膜損傷、感染、ライリ−デイ症候群、先天性無歯症、栄養障害または欠乏（ビタミン含む）、薬品副作用、眼球ストレスと腺及び細胞損傷、スモッグ、タバコ、非常に乾燥した空気への環境露出、風媒粉塵、自己免疫及び他の免疫欠乏障害などによる眼球乾燥を含み広範囲に規定される。

一般に眼球乾燥症の治療または予防を用いられる本発明の変形されたＴＮＦＲＩまたはＴＮＦＲＩ切片の投与量は、投与対象の種類、年齢、体重、症状の重症度、望む治療効果、投与方法、治療期間などにより変わり、眼球乾燥の症状を除去または改善する薬剤学的有効量が用いられる。本明細書に用いられる「薬剤学的有効量」とは、患者の眼球乾燥症症状を改善させる量を意味する。一般に、全身的に投与する時、投与量は約０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１〜５００ｍｇで、これは一日に単一投与量または２〜４回の分割投与量で投与されたり遅延された方法で投与される。特に目に局所適用時、本発明の変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片を０．００１〜１０．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．０１〜１０．０ｗ／ｖ％の割合で含有する製剤を目に一日に数回適用して、好ましくは一日に１〜６回滴下したり適用するが、これに限定されるのではなく、当業者ならば多様な要素を勘案して適切な投与量や投与間隔などを調節できることは自明である。

本発明の組成物には、本発明の変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片に追加的に当分野で通常的に選択して使用できる生理的に適合した賦形剤及び／または添加剤が含まれてもよい。本発明に係る組成物には、このような賦形剤及び／または添加剤として、等張化剤、緩衝剤、界面活性剤、安定化重合体、保存剤、粘度増加剤、酸化防止剤などが追加的に含まれてもよいが、これに限定されるのではなく、当業界で通常用いられる他の成分が追加的に含まれてもよいことは、当業者には自明である。さらに、本発明の組成物には、界面活性剤及び／または緩和剤及び／または安定化重合体を含んでもよい。

前記等張化剤は、組成物の等張性（tonicity）、好ましくは眼科用組成物として用いられる天然涙の等張性に調整するために用いられ、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、単純糖、例えばデキストロース、フルクトース、ガラクトース、及び／または単純ポリオル、例えば糖アルコール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、ラクチトール、イソマルト、マルチトール、及び水素化されたデンプン加水分解物を組成物に添加して、生理的等張性と似ているように調整することができる。このような等張化剤の量は、添加される特定試薬により適切に選択されてもよい。

前記緩衝剤は、当分野で通常用いられるものなど、例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸から選択される一つ以上が用いられ、これを保存条件下に組成物のｐＨ変化を防止するために用いることができる。濃度は、用いられた試薬により異なるが、好ましくはｐＨ５〜８、より好ましくは５〜７に維持するように選択される。

前記界面活性剤は、有効成分を溶解してコロイド分散液、例えばミセル溶液、微細乳濁液、乳濁液及び懸濁液を安定化するために用いられるもので、例えば、ポリソルベート、ポロキサマー、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシルヒマシ油、チロキサポール、トリトン（例えば、トリトンＸ１１４）、及びソルビタンモノラウレートが用いられてもよい。

前記安定化重合体は、架橋ポリアクリレート系から選択された多価電解質、例えばカルボマー及びペミュレン（Pemulen、商品名）、具体的には、カルボマー９７４Ｐ（ポリアクリル酸）０．１％〜０．５％（ｗ／ｗ）が用いられてもよい。

前記保存剤は、使用途中微生物汚染を防止するために用いられるもので、例えば、ペンザルコニウムクロリド、クロロブタノール、ペンゾドデシニウムブロミド、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデンテートジナトリウム、ソルビン酸、ポリクオタニウム−１または当業界に公示された他の製剤が用いられてもよい。

前記粘度増加剤は、担体の粘度を増加させるために用いられるもので、例えば、多糖類、例えばヒアルロン酸及びその塩、コンドロイチンサルフェート及びその塩、デキストリン、セルロース系の多様な重合体、ビニール重合体、及びアクリル酸重合体が含まれるが、これらに限定されない。

酸化防止剤は、保存期間中に活性成分が酸化されることを防止するために、本発明の組成物に追加されてもよい。このような酸化防止剤の例は、ビタミンＥ及びその類似体、アスコルビン酸及び誘導体、及びブチル化されたヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）を含む。

本発明で用いられる変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片は、ヒトまたは動物に適用のための薬剤学的製剤として剤形化されて、経口投与、静脈内投与、皮下投与、直腸または膣内投与、局所的部位（目）への投与によって全身的にまたは局所的に投与されることができる。全身的影響、効果の有意的な発現などを考慮して、好ましくは、目に局所的投与形態で用いられる。

変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片が剤形化されて投与される場合、通常の方法によって生成された製剤の形態として投与されてもよい。投与形態は、例えば点眼剤（eye drop）、眼軟膏、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、注射剤、軟膏などであってもよく、好ましくは、点眼剤及び眼軟膏である。このような製剤は、当分野の一般的な方法により製造されることができる。前記眼科的局所投与形態として、点滴、スプレーまたはゲル形態が可能であり、また他の方法として、リポソームを利用して目に投与してもよい。また、ポンプ−カテーテル（pump-catheter）システムを介して涙膜に注入されてもよい。他の具現例として、連続的または選択的−放出装置、例えばＯｃｕｓｅｒｔ（商標名）Ｓｙｓｔｅｍ（ＡｌｚａＣｏｒｐ．，ＰａｌｏＡｌｔｏ．ＣＡ製）のようなシステムが利用されてもよい。付加的な具体例として、ＴＮＦＲＩ変異体は、目上のコンタクトレンズに含まれてもよく、それによって運搬されたりそれに付着してもよい。他の具現例として、眼球表面に加えられることができるスポンジまたは綿棒に含まれた形態が利用されてもよく、眼球表面に加えられることができる液体スプレーも利用されてもよい。さらに他の具体例として、眼球表面上にまたは涙組織に本発明の変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片を直接注入することができる。

前記局所投与方法に付加して、本発明の変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片を、全身的に投与する種々の方法が用いられてもよい。例えば、吸入可能な粒子のエアゾール懸濁液が挙げられる。本発明の変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片を肺を介して血流で吸収させるか、鼻涙管を介して涙組織に接触させるか、薬学的に有効な量で涙腺に接触させてもよい。他の方法としては、吸入可能な粒子の鼻スプレー（nasal spray）または液体配合物の鼻点滴または目洗浄または目点滴形態で液体／液体懸濁液を投与する形態が可能である。鼻スプレーまたは鼻または目での点滴を形成するための組成物は、当業者に公示された技術によって滅菌食塩水または滅菌注射用蒸留水のような適切な賦形剤と配合して製造されてもよい。

本発明の変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片の組織投与のための他の方法で経口投与も用いられ、精製、含糖錠剤、水性または油性懸濁液、分散可能な粉末または顆粒、乳濁液、硬質または軟質のカプセル、または、シロップまたはエリキシルの形態で利用が可能で、経口用組成物は、薬学的組成物の製造分野に公示された方法によって製造されてもよい。

さらに他の手段は、本発明の変形されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその切片をゲル、クリーム、または液体懸濁液形態で手術中直接点滴することが可能である。

以上記述された内容だけでなく、当技術分野において通常の知識を有する者が、本明細書の記載から発明の実現形態を適切に変更及び応用することができ、これらも本発明の範疇内に含まれる。

ＴＮＦＲＩ変異体の角膜損傷回復効果を示す図面。Ｌａｎｅ１：正常群、Ｌａｎｅ２：眼球乾燥誘発＋ｖｅｈｉｃｌｅ（局所投与）、Ｌａｎｅ３：眼球乾燥誘発＋エタネルセプト（２．５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）、Ｌａｎｅ４：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３５（２．５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）、Ｌａｎｅ５：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３７（２．５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）、Ｌａｎｅ６：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３２６（２．５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）、Ｌａｎｅ７：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６２２２（２．５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）、Ｌａｎｅ８：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３２９（２．５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）、Ｌａｎｅ９：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３０４（２．５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）、Ｌａｎｅ１０：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３０（２．５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）、Ｌａｎｅ１１：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６２２９（２．５／ｍＬ、局所投与）、Ｌａｎｅ１２：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６４０２（２．５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）、Ｌａｎｅ１３：眼球乾燥誘発＋シクロスポリンＡ（０．０５％、局所投与）。ＴＮＦＲＩ変異体濃度による角膜損傷回復効果を示す図面。Ｌａｎｅ１：正常群、Ｌａｎｅ２：眼球乾燥誘発、Ｌａｎｅ３：眼球乾燥誘発＋エタネルセプト（５ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）、Ｌａｎｅ４：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３７（０．５ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）、Ｌａｎｅ５：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３７（５ｍｇ／ｋｇ、局所投与）、Ｌａｎｅ６：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３７（０．６２５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）、Ｌａｎｅ７：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３７（６．２５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）。ＴＮＦＲＩ変異体の涙量増加効果を示す図面。Ｌａｎｅ１：正常群、Ｌａｎｅ２：眼球乾燥誘発、Ｌａｎｅ３：眼球乾燥誘発＋エタネルセプト（５ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）、Ｌａｎｅ４：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３７（０．５ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）、Ｌａｎｅ５：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３７（５ｍｇ／ｋｇ、局所投与）、Ｌａｎｅ６：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３７（０．６２５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）、Ｌａｎｅ７：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３７（６．２５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）。ＴＮＦＲＩ変異体の角膜での抗炎症効果を示す図面。Ｌａｎｅ１：正常群、Ｌａｎｅ２：眼球乾燥誘発、Ｌａｎｅ３：眼球乾燥誘発＋エタネルセプト（５ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）、Ｌａｎｅ４：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３７（０．５ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）、Ｌａｎｅ５：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３７（６．２５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）。ＴＮＦＲＩ変異体の眼球表面での抗炎症効果を示す図面。Ｌａｎｅ１：正常群、Ｌａｎｅ２：眼球乾燥誘発、Ｌａｎｅ３：眼球乾燥誘発＋エタネルセプト（５ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）、Ｌａｎｅ４：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３７（６．２５ｍｇ／ｍＬ、局所投与）。ＴＮＦＲＩ変異体の涙腺での抗炎症効果を示す図面。Ｌａｎｅ１：正常群、Ｌａｎｅ２：眼球乾燥誘発＋Ｖｅｈｉｃｌｅ（局所投与）、Ｌａｎｅ３：眼球乾燥誘発＋エタネルセプト（０．２５％、局所投与）、Ｌａｎｅ４：眼球乾燥誘発＋ＨＬ０３６３３７（０．２５％、局所投与）、Ｌａｎｅ５：眼球乾燥誘発＋シクロスポリンＡ（０．０５％、局所投与）、Ｌａｎｅ６：眼球乾燥誘発＋メチルプレドニゾロン（０．１％、局所投与）

本発明の利点及び特徴、及びそれらを達成する方法は、後述する製造例、実施例、実験例を参照すれば明確になるであろう。しかしこれらは本発明の理解を助けるためのものだけであって、本発明は以下で開示される実施例に限定されない。

［製造例］ＴＮＦＲＩ切片変異体の製造
（１）ＴＮＦＲＩ変異体の設計
本出願人の韓国特許出願第２０１０−００８９３９５号（公開番号第２０１２−００２７６６６号）及び韓国特許出願第２０１１−０１３８７５１号（公開番号第２０１２−００７２３２３号）から下記の表１のアミノ酸変形を含む変形されたＴＮＦＲＩ（「ＴＮＦＲＩ変異体」）を候補として選定した。

前記ＴＮＦＲＩ変異体を製造するためにすでに公開されているヒトＴＮＦＲＩ誘電体情報を利用した。前記表１の変形を適用したＴＮＦＲＩ１７１、ＴＮＦＲＩ１２６、ＴＮＦＲＩ１０５変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１３〜３０に示した（天然型は除く）。

（２）ＴＮＦＲＩ変異体をコードするＤＮＡの製造
位置特異的ＴＮＦＲＩ変異体を作製するために位置指定突然変異体作製（site-directed mutagenesis）方法によってＴＮＦＲＩ変異体を作製した。前記表１に記載されたアミノ酸変形を含むＴＮＦＲＩ変異体作製に用いられたプライマー及び鋳型を下記の表２に示した。

具体的には、ＴＮＦＲＩプラスミドを鋳型で下記の表２のプライマー各対を２０ｐｍｏｌｅになるべく蒸留水に溶かした後、Ｐｆｕポリメラーゼ（polymerase）を利用したＰＣＲ反応を進めて位置指定突然変異体を作製した。

ＴＮＦＲＩ変異体作製のためのＴＮＦＲＩ１７１切片遺伝子、及びＴＮＦＲＩ発現ベクター作製及びＴＮＦＲＩ１０５、ＴＮＦＲＩ１２６及びＴＮＦＲＩ１７１発現ベクターは、韓国公開特許第２０１２−００２７６６６号公報に記載されたとおり作製した。

作製されたｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１０５またはｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６またはｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１プラスミドを鋳型でＴＮＦＲＩ１０５−Ａ３０、ＴＮＦＲＩ−１２６−Ａ３０、ＴＮＦＲＩ−１７１−Ａ３０を暗号化するプラスミドを作製するために、表２のＡ３０に該当するプライマーを利用して、各増幅反応を行った（得られたプラスミドを各々ｐＥＴ−ＴＮＦＲＩ１０５＿Ａ３０、ｐＥＴ−ＴＮＦＲＩ１２６＿Ａ３０、ｐＥＴ−ＴＮＦＲＩ１７１＿Ａ３０という。アミノ酸配列の長さは、記載略）。次に、下記の表２に示したとおり、前記作製されたプラスミドを鋳型で表２のＡ２、Ａ９に該当するプライマーを利用して同様の方法でｐＥＴ−ＴＮＦＲＩ＿Ａ２、ｐＥＴ−ＴＮＦＲＩ＿Ａ９を作製した。同様の方法で先に作製されたプラスミドを鋳型で表２に記載されたプライマーを利用して残りのプラスミドを作製した。

各鋳型プラスミドＤＮＡ１．０μＬ、２０ｐｍｏｌｅＮ−プライマー１．０μＬ、２０ｐｍｏｌｅＣ−プライマー１．０μＬ、２ＸＰｒｉｍｅＳＴＡＲＰＣＲｂｕｆｆｅｒ２５．０μＬ、２００ｕＭｄＮＴＰ４．０μＬ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ，Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｒ０４４Ａ）０．５μＬと１７．５μＬ蒸留水を入れて、５０．０μＬの反応溶液を作って前記増幅反応に用いた。

ＰＣＲは、１次変性９８℃で５分、２次変性９８℃で３０秒、プライマー接合５５℃で３０秒、伸長７２℃で９分過程のうち２次変性から伸長反応までを１７回繰り返して進行させた後、最終酵素反応を７２℃で１０分行って反応を終了した。
ＰＣＲ産物は、ＤｐｎＩ酵素で３７℃で２時間処理して、大腸菌由来のＤＮＡを分解して、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを確保した。ＤＮＡ溶液２μＬを取ってＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞（competent cell）（ＲＢＣ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＲＨ１１９−Ｊ８０）に入れて、４２℃で１分間熱衝撃（heat shock）を加えて、形質転換して、アンピシリンが含まれたＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーをアンピシリンが含まれたＬＢ液体培地で培養した後、プラスミドを分離して、塩基配列分析を介して位置特異的ＴＮＦＲＩ変異体が完成されたことを確認した。

（３）大腸菌で生物学的活性があるＴＮＦＲＩ及びＴＮＦＲＩ変異体の産生
（イ）ＴＮＦＲＩ及びＴＮＦＲＩ変異体の発現
前記製造例で作製されたプラスミド溶液１μＬを取って、ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｃ６０１０−０３）コンピテント細胞に入れて、４２℃で１分間熱衝撃を加えて形質転換して、アンピシリンが含まれたＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。発現ベクターを含んでいる大腸菌ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンが入っている５０ｍＬＹＰ培地（ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ：Ｍｅｒｃｋ，Ｃａｔ．Ｎｏ：１０３７５３，ｐｅｐｔｏｎｅ：ＢＤ，Ｃａｔ．Ｎｏ：２４３６２０，ＮａＣｌ：Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１０６４０４９０２５）に接種して３７℃で１６時間通気培養した。培養された培地は、１００μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンが含まれた２５０ｍＬＹＰ培地がある１Ｌフラスコに６００ｎｍの吸光度が０．１になるよう接種した。３７℃で培養して６００ｎｍの吸光度が３〜４である時、最終濃度が１．０ｍＭ濃度になるようＩＰＴＧを添加して発現を誘導した。発現誘導後３７℃で３時間さらに通気培養を継続した後、細胞を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞を収集した。

（ロ）溶解しなかったＴＮＦＲＩ及びＴＮＦＲＩ変異体の回収
収集した細胞を再懸濁溶液（５０ｍＭトリス、０．５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．５））で再懸濁させた。懸濁された細胞は、ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｓｏｎｉｃｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＶＣＸ７５０）を使って破砕した。細胞破砕後、８０００ｘｇ、１０℃、３０分間の遠心分離と、上澄み液を捨て、沈殿したペレットを洗浄溶液１（５０ｍＭトリス、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％トリトンＸ−１００（Triton X-100）（ｐＨ８．０））で懸濁させて、８０００ｘｇ、１０℃、２０分間遠心分離した。上澄み液を捨て、ペレットを再懸濁溶液で再懸濁させて、８０００ｘｇ、１０℃、２０分間遠心分離した。前記洗浄されたペレットは直ちに使るか−８０℃で凍結保存した。

（ハ）ＴＮＦＲＩ及びＴＮＦＲＩ変異体の可溶化及びリフォールディング
前記得られたペレットに６ｍＬ変性溶液（６〜８Ｍ尿素（Urea）または６〜８Ｍ塩化グアニジン（Guanidine-HCl）、１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２．０ｍＭＥＤＴＡ、０．２ＭＮａＣｌ）を添加して溶解した。溶解後、０．４５μｍシリンジフィルターを使って溶解しなかったペレットを取り除いた。可溶化させたペレット溶液をリフォールディング（refolding）溶液（５０ｍＭトリス、１．０ｍＭＥＤＴＡ、０．５ＭＬ−アルギニン（Arginine）、６．０ｍＭＧＳＨ、４．０ｍＭＧＳＳＧ、２４０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＫＣｌ（ｐＨ９．０））に２０倍に希釈して４℃で１２〜２４時間穏やかに攪拌リフォールディングを誘導した。

（ニ）リフォールディングされたＴＮＦＲＩ及びＴＮＦＲＩ変異体精製
リフォールディングされたＴＮＦＲＩ及びＴＮＦＲＩ変異体を精製するために、リフォールディング溶液を３ｋＤのＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＵＦＣ９００３２４）を用いて２０倍に濃縮した。濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｒｅｐｇｒａｄｅ（ＧＥ）レジンをＸＫ２５／７０（ＧＥ，Ｃａｔ．Ｎｏ：１９−０１４６−０１）カラムにパッキングしたゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ：gel permeation chromatography）を用いて精製した。

具体的に、リフォールディングされた試料をカラムにローディングする前に４〜５カラム体積の平衡化溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．０））を用いてカラムを平衡化させた。カラムに２ｍＬ試料をローディングした後、５ｍＬ／ｍｉｎの流速で平衡化溶液を流しながら５ｍＬずつ分画して試料を採取した。採取した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した後、９０％以上の純度を示す分画だけを取った。前記過程を介してアミノ末端にＭｅｔが付加された変形されなかったＴＮＦＲＩ１０５、ＴＮＦＲＩ１２６及びＴＮＦＲＩ１７１、ＴＮＦＲＩ１０５変異体、ＴＮＦＲＩ１２６変異体及びＴＮＦＲＩ１７１変異体を精製した。

実施例１：ＴＮＦＲＩ変異体の眼球乾燥症治療効果確認
眼球乾燥症治療でＴＮＦαの阻害に伴う治療効果を確認するために、ＴＮＦα阻害剤をマウスを利用した眼球乾燥症動物モデルに投与した。ＴＮＦα阻害剤として、エタネルセプトとＴＮＦＲＩ変異体を用いて、ＴＮＦＲＩ変異体とエタネルセプトの治療効果を比較した。陽性対照群としてシクロスポリンＡを用いた。

眼球乾燥症動物モデルは既知の方法を参照して作製した（J Immunol 2011, 187, 3653-3662）。具体的に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１４日間４０％以下の湿度が維持されるＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｈａｍｂｅｒを用いて、副交感神経抑制剤であるスコポラミン（Scopolamine）を５ｍｇ／ｍＬの濃度で０．１ｍＬずつ１日３回、皮下適用して眼球乾燥症を誘発した。以後７日間試験物質を投与して症状改善程度を観察した。

眼球乾燥症が誘発されたマウスに各ＴＮＦＲＩ変異体とエタネルセプトを２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で４回／日、７日間点眼適用した。また、シクロスポリンＡ０．０５％を２回／日、７日間点眼投与して角膜傷での改善度を測定した。

角膜傷は、目で角膜状態を観察した後、表３のように症状によりスコアリングして測定した。

Ｇｒａｄｅ０の場合は、角膜に病変がない状態であり、Ｇｒａｄｅ１は約１／３程度の病変が観察され、Ｇｒａｄｅ２は約１／２、Ｇｒａｄｅ３は約２／３、Ｇｒａｄｅ４は略全般的に病変が観察されることを意味する。

その結果、ＴＮＦＲＩ変異体中ＨＬ０３６３３７、ＨＬ０３６３２６、ＨＬ０３６３３０三つの変異体が、エタネルセプト、ＨＬ０３６４０２（天然型ＴＮＦＲＩ）及びシクロスポリンＡに比べて角膜傷改善度において非常に効果的であることが確認された（図１参照）。

実施例２：眼球乾燥症動物モデルでＨＬ０３６３３７の治療効果確認
実施例２．１角膜損傷回復効果確認
ＴＮＦＲＩ変異体であるＨＬ０３６３３７をバッファーを利用して、各々０．６２５ｍｇ／ｍＬと６．２５ｍｇ／ｍＬ濃度で調製して、点眼適用の場合は、１回当たり８ｍｇ／ｍＬずつ、１日４回適用し、皮下投与の場合は、０．５ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇで１日１回投与した。また、対照群であるエタネルセプトは、５ｍｇ／ｋｇで１日１回皮下適用した。
前記実施例１のように製造された眼球乾燥症動物モデルに７日間試験物質を投与して、症状改善程度を観察した。エタネルセプトは、皮下投与方式で投与され、ＴＮＦＲＩ変異体は、皮下と点眼投与方式で投与された。
角膜損傷程度は前記実施例１と同様に評価した。
その結果、エタネルセプトを皮下投与した場合には、症状改善効果が殆どない反面、ＴＮＦＲＩ変異体を皮下及び点眼投与した場合、全角膜傷の回復効果を示しており、特に点眼投与時角膜傷を回復させる効果が優れたことが分かった（図２参照）。

また、ＴＮＦＲＩ変異体であるＨＬ０３６３２６及びＨＬ０３６３３０もＨＬ０３６３３７と似た程度の角膜傷回復効果を示すことを確認した。

実施例２．２涙量増加効果確認
試験物質投与による涙量増加程度を確認しようとフルオレセイン試験紙を下まぶたに入れて涙量を測定した。涙量による等級は、表４のとおりである。Ｇｒａｄｅ０の場合は涙が殆どない状態を意味し、Ｇｒａｄｅ１は、３ｍｍ、Ｇｒａｄｅ２は、４〜５ｍｍ、Ｇｒａｄｅ３は、６ｍｍだけ試験紙が濡れることを意味する。

各物質の投与方法は、前記実施例２．１と同様であった。その結果、同じ投与量を用いた場合、ＴＮＦＲＩ変異体ＨＬ０３６３３７は、エタネルセプトに比べて優秀な涙量回復程度を示し、特に角膜傷回復効果と類似してＴＮＦＲＩ変異体の点眼投与群で略正常なレベルまで涙量が回復する優れた効果を確認することができた（図３参照）。

ＴＮＦＲＩ変異体であるＨＬ０３６３２６及びＨＬ０３６３３０もＨＬ０３６３３７と似た程度の涙量回復効果を示すことを確認した。

実施例２．３角膜での抗炎症効能確認
抗炎症効能を確認するための炎症関連サイトカイン測定は、角膜組織からｍＲＮＡを抽出した後、ｑＰＣＲ法で測定してＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−２１とＩＬ−２２のｍＲＮＡのレベルを確認した。
各物質の投与方法は、前記実施例２．１と同様であった。その結果、眼球乾燥症誘発によって炎症に関連したサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２）が、角膜で顕著に増加することを確認することができた。しかし、ＴＮＦＲＩ変異体であるＨＬ０３６３３７を皮下に適用した場合には、炎症に関連したサイトカインが減少することが確認されて、特に点眼で適用時には炎症が改善されて、略正常レベルに回復する優れた効果を見せた。その反面、エタネルセプトを皮下に適用すると、殆ど炎症減少効果が観察されなかった（図４参照）。
ＴＮＦＲＩ変異体であるＨＬ０３６３２６及びＨＬ０３６３３０もＨＬ０３６３３７と似た程度で角膜での抗炎症効果を示すことを確認した。

実施例２．４眼球表面での抗炎症効能確認
眼球表面での炎症サイトカインの量を測定するために、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００を利用して測定して、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−２１とＩＬ−２２の量を測定した。
各物質の投与方法は、前記実施例２．１と同様であった。その結果、眼球乾燥症誘発によって炎症に関連したサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２）が眼球表面で顕著に増加した。しかし、ＴＮＦＲＩ変異体であるＨＬ０３６３３７を点眼で適用時優れた炎症改善効果が観察された反面、エタナセプトを皮下に適用する時炎症減少効果が殆ど観察されなかった（図５参照）。
ＴＮＦＲＩ変異体であるＨＬ０３６３２６及びＨＬ０３６３３０もＨＬ０３６３３７と似た程度で眼球表面での抗炎症効果を示すことを確認した。

実施例２．５涙腺での抗炎症効能確認
眼球乾燥症治療剤として使用中の０．０５％のシクロスポリンＡと０．１％メチルプレドニゾロン（methyl prednisolone）点眼液との効果を比較するために、涙腺での炎症サイトカインの量を測定した。炎症関連サイトカイン測定は、涙腺組織からｍＲＮＡを抽出した後、ｑＰＣＲ法で測定してＩＦＮ−γ、ＩＬ−６ｍＲＮＡのレベルを確認した。

その結果、眼球乾燥症誘発によって炎症に関連したサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６）が涙腺で顕著に増加して、ＴＮＦＲＩ変異体であるＨＬ０３６３３７を点眼で適用時メチルプレドニゾロンと同等な改善効果が観察された。しかし、シクロスポリンＡは、ＨＬ０３６３３７やメチルプレドニゾロンに達し得ない微弱な効果が観察された（図６参照）。
ＴＮＦＲＩ変異体であるＨＬ０３６３２６及びＨＬ０３６３３０もＨＬ０３６３３７と似た程度で涙腺での抗炎症効果を示すことを確認した。

以上説明した通り、本発明の変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片は、ＴＮＦα中和活性が優れて、患者の眼球表面でＴＮＦαの活性を阻害して眼球乾燥と関連した炎症性誘発効果を抑制することになる。従って、本発明に係る変形されたＴＮＦＲＩまたは変形されたＴＮＦＲＩ切片は、眼球乾燥症の予防及び治療に優れた効果を示すため、眼球乾燥症の予防及び治療に非常に有用に用いられる。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims

配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ）で、
ｉ）Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、または、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎ中から選択されるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列；
ｉｉ）配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜２１１番からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１７１）でＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎ、または、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎ中から選択されるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列；及び
ｉｉｉ）配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜１６６番からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１２６）でＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｉ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｋ１６１Ｎ、または、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎ中から選択されるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む変形されたＴＮＦＲＩの１種以上を含むことを特徴とする眼球乾燥症の予防または治療用組成物。
配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ）で
ｉ）Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎ、または、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎであるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列；及び
ｉｉ）配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜２１１番からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１７１）でＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎ、または、Ｌ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ａ／Ｄ２０７Ｎであるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む変形されたＴＮＦＲＩの１種以上を含むことを特徴とする請求項１に記載の眼球乾燥症の予防または治療用組成物。
配列番号１８又は２０から選択されるアミノ酸配列を含む変形されたＴＮＦＲＩの１種以上を含むことを特徴とする請求項１に記載の眼球乾燥症の予防または治療用組成物。
前記変形されたＴＮＦＲＩは、大腸菌発現系での産生のための変形がさらに含まれたことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の眼球乾燥症の予防または治療用組成物。
大腸菌発現系での産生のための変形は、アミノ酸配列のアミノ末端に信号配列またはメチオニン（Ｍｅｔ）が付加されたことを特徴とする請求項４に記載の眼球乾燥症の予防または治療用組成物。
請求項１から３のいずれかに記載の変形されたＴＮＦＲＩの二つ以上が共有結合によって連結された形態の変形されたＴＮＦＲＩ複合体１種以上を含む眼球乾燥症の予防または治療用組成物。
前記変形されたＴＮＦＲＩは、糖化、アシル化、メチル化、リン酸化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、プレニル化、酸化、グアニジル化、アミジン化、カルバミル化、トリニトロフェニル化、硝酸化、またはペグ化されていることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の眼球乾燥症の予防または治療用組成物。
請求項１から３のいずれかに記載の変形されたＴＮＦＲＩを暗号化する遺伝子を含む眼球乾燥症の予防または治療用組成物。
請求項１から３のいずれかに記載の組成物を含む局所点眼用製剤。
点眼剤または眼軟膏であることを特徴とする請求項９に記載の局所点眼用製剤。
変形されたＴＮＦＲＩを含む眼球乾燥症の予防または治療用組成物であって、前記の変形されたＴＮＦＲＩが、配列番号１に記載された天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番〜２１１番からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１７１）でＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎであるアミノ酸変形を含むアミノ酸配列を含む前記組成物。