JP6096884B2 - 完全生物体マラリアワクチンのためのプラットフォームとしての齧歯類プラスモジウム寄生虫 - Google Patents

Description

本発明は、脊椎動物宿主に対して、該宿主に生きた齧歯類プラスモジウム生物体を投与することによりマラリアに対する予防接種をし、その異種間防御能力を利用する方法を提供する。本発明はさらに、１種又は数種のヒトプラスモジウム寄生虫由来の免疫特異的な単段階（肝臓、血液又はガメトサイト）又は多段階（肝臓及び血液、又は肝臓及びガメトサイト、又は血液及びガメトサイト、又は肝臓及び血液及びガメトサイト）免疫エフェクターを発現するように遺伝子組換えされている齧歯類プラスモジウム生物体を含むワクチン組成物を提供する。本発明はまた、好適な薬学的に許容可能なキャリア溶液中に野生型又は遺伝子組換えの齧歯類プラスモジウム生物体を懸濁することによる、ワクチン組成物の製造を提供する。

マラリアに対する有効なワクチンという長年の目標は、近年の推計によれば年間百万人を超える人が死亡するという疾患を撲滅しようとする努力の重要な要素をなしている。マラリアワクチンには、有性生殖期及び蚊体内発育期の寄生虫抗原を標的化し得るもの、無性生殖期及び有性生殖期の寄生虫負荷量を低減する前赤血球期ワクチン、血液期寄生虫密度を低減する無性生殖赤血球期ワクチン、及びベクター中での寄生虫成長を妨害するワクチンがある。これまでのところ、スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質ベースの主要ワクチン候補ＲＴＳ，Ｓを含む、初期前赤血球期に対するワクチンが、現在のワクチン候補の中で最も成功を示している［１］。しかしながら、このサブユニットワクチンの第３相試験の最近の結果は、重篤なマラリアに対してわずかな防御有効性しか示さなかった［２］。

サブユニットワクチン候補に代わる方法として、完全生物体アプローチ（whole-organism approach）の使用がある。かかる戦略は、弱毒化された、感染した蚊によりその脊椎動物宿主に注入されるプラスモジウム形態である、スポロゾイトによる免疫の生成に基づいている。自然のマラリア感染の間においては、肝細胞内での無症状性の寄生虫成熟及び大規模複製期が、プラスモジウム赤血球外形態（ＥＥＦ）の生成を引き起こし、その後、疾患を引き起こす赤血球感染性メロゾイトの放出が起こる（［３］でレビューされた）。数十年前に、Ｐ．ファルシパルム放射線弱毒化スポロゾイト（ＲＡＳ）の注射により、ヒトの滅菌防御が達成され得ることが示された［４］。もっと最近になって、特定の遺伝子が欠失し肝臓肝細胞内での完全なプラスモジウム成長が損なわれた状態になるスポロゾイト（ＧＡＳ）が、齧歯類動物においてマラリアに対する長期にわたる防御を与え得ることが示された［５］。これは、遺伝子的に弱毒化されたプラスモジウムスポロゾイト（ＧＡＳ）に基づくマラリアに対する完全生物体ワクチンへの新たな希望を生じた。ＲＡＳ及びＧＡＳの両方が、肝細胞に侵入することはできるが、肝臓内でそれらの成長過程を完結することはできない。重要なことに、末期肝臓期阻止寄生虫は、ブレークスルー感染（breakthrough infection）の危険性を増大させ得るものの、早期阻止変異体よりも優れた抗マラリア免疫を誘発するようである［６］。

ＲＡＳ及びＧＡＳの防御有効性は、防御には抗体も寄与するが、保存された機序が関与するものであり、主として、誘導されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性を介してもたらされるようである。プラスモジウムＣＳは、ＲＡＳ及びＧＡＳの両方において免疫優性防御抗原であり［７］、先の研究により、ＣＳのみによる免疫により防御が達成され得ることが示された。しかしながら、完全生物体アプローチにより誘発される免疫において、作用している免疫原がＣＳのみではないことも明らかとなっている［８、９］。

現在の前赤血球期完全生物体マラリアワクチン接種戦略の主要な潜在的欠点は、そうした戦略が、最も命に関わるヒト感染性寄生虫種であるＰ．ファルシパルムの弱毒化に依拠していることである。有効なＲＡＳを生成するのに必要とされる放射線線量は、最低限必要な条件を満たすように微妙に調整されなければならないことが示された。実際、高放射線レベルに曝露されたスポロゾイトは防御を誘導せず、低レベルに曝露された寄生虫はブレークスルー感染を誘導するであろう。後者と同様に、異なるＧＡＳによるブレークスルー感染が報告されている［１０］。肝臓内で完全な成長を経たただ１つのスポロゾイトが血液感染及びマラリア症状を起こさせ得るので、Ｐ．ファルシパルムスポロゾイトの弱毒化に基づくワクチン接種は、無視され得ない安全性の懸念を提起する。

この文脈において、我々は、本明細書により、ヒトの免疫の非病原性ベクターとしての齧歯類プラスモジウム寄生虫の使用に基づく、マラリアに対する前赤血球期完全生物体ワクチンの開発のための代替的戦略を提案する。本明細書において、我々は、Ｐ．ベルゲイは、最適な抗原提示に必要とされるヒト肝細胞への感染は可能であるが、血液期感染を引き起こすことができず、その結果、提案したアプローチの安全性の向上を確実にするものであることを実証する。また、我々は、齧歯類プラスモジウム種とヒトプラスモジウム種との間の異種間防御の可能性を実証した。

我々はさらに、そのような異種間防御が、齧歯類プラスモジウム生物体を、それらのヒト感染性対応物の抗原を発現するように遺伝子組換えすることにより高められ得ることを提案する。我々は、内因性ＣＳがＰ．ファルシパルムのＣＳに置き換えられたトランスジェニックＰ．ベルゲイ寄生虫（ＰｂＣＳ_Ｐｆ）［１１］を使用して、この遺伝子組換えされた齧歯類プラスモジウム生物体が、Ｐ．ファルシパルムに結合して感染を阻害することができる特異的免疫応答を誘発できるということを実証した。これらの結果は、マラリアワクチン接種戦略における新たなパラダイムを、最適な免疫原性特性と組み合わせるものである。

発明の概要
本発明は、一次免疫用ベクターとしての齧歯類寄生虫の使用に基づく、マラリアに対する前赤血球期完全生物体ワクチンの開発のための代替的戦略を提案する。齧歯類プラスモジウム生物体は、齧歯類寄生虫の相同分子により生成される異種間防御能力を利用することにより、ヒト感染性プラスモジウム属種への感染に対して防御することが可能な免疫応答をヒト宿主において誘導するために使用され得る。さらに、これらの齧歯類プラスモジウム生物体の免疫能力は、選択された免疫原性抗原を遺伝子組換えにより導入することにより高められ得る。この戦略において、齧歯類プラスモジウム生物体は、進化的に保存された分子により提供されるそれらの自然の異種間防御能に加えて、ヒトプラスモジウム寄生虫に対する特異的防御免疫応答を誘発するために、ヒト感染性プラスモジウム属種の抗原を有し得る。

本発明は、ヒトマラリアに対する使用のための生きた齧歯類プラスモジウム生物体を記述する。

本発明の好ましい実施形態は、ヒトマラリアに対する免疫特異的な単段階又は多段階免疫エフェクターとしての使用のための、ヒトプラスモジウム寄生虫の１種以上の種の遺伝子又は部分遺伝子を発現するように遺伝子組換えされた生きた齧歯類プラスモジウム生物体を提供する。

本発明の別の実施形態において、先の生きた齧歯類プラスモジウム生物体は、自然宿主が齧歯類動物である原生動物プラスモジウム属（Ｐ．ベルゲイ、Ｐ．ヨエリ、Ｐ．ビンケイ及びＰ．シャバウディを含む）の任意のメンバーである。

本発明の好ましい実施形態は、単段階又は多段階免疫エフェクターが、肝臓期抗原（例えば、スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳ）、肝臓期抗原１（ＬＳＡ−１）、トロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）、及び肝臓期抗原３（ＬＳＡ−３））又は血液期抗原（例えば、赤血球結合抗原−１７５（ＥＢＡ−１７５）、頂端膜抗原−１（ＡＭＡ−Ｉ）、メロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ−１）、ダッフィ結合タンパク質（ＤＢＰ）、及び網状赤血球結合タンパク質（ＲＢＰ））、又はガメトサイト特異的抗原（例えば、ｐ４８／４５）、又は他の免疫原性抗原である、生きた齧歯類プラスモジウム生物体の使用を提供する。

本発明の別の実施形態において、ヒトマラリアは、原生動物プラスモジウム属からのヒトプラスモジウム寄生虫（Ｐ．ファルシパルム、Ｐ．ビバックス、Ｐ．マラリアエ、Ｐ．オヴァレ及びＰ．ノウレシを含む）のうちの任意のものによって引き起こされる。

本発明の好ましい実施形態は、薬学的に許容可能なキャリアとの混合物の製造のための、生きた齧歯類プラスモジウム生物体の使用を提供する。

本発明の別の実施形態において、生きた齧歯類プラスモジウム生物体は、マラリアに対するワクチンの製造のために使用される。
以下の図は、明細書を説明するための好ましい実施形態を提供するものであり、発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。

ヒト肝細胞内の齧歯類プラスモジウム寄生虫感染及び成長。Ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ。ヒト肝癌細胞系（Ｈｕｈ−７及びＨｅｐＧ２）及びヒト不死化肝細胞（ＨＣ−０４）において感染後４８時間成長したＰｂ（ＷＴ）寄生虫の代表的な写真；Ｂ）ｅｘ ｖｉｖｏ成長。ヒト一次肝細胞のマイクロパターン化共培養において感染後４８時間（上方パネル）及び感染後７２時間（下方パネル）成長したＰｂ（ＷＴ）寄生虫の代表的な写真（縮尺線は１０μｍを示す）。Ｃ）面積測定により定量化された、Ｈｕｈ−７及びＨｅｐＧ２肝癌細胞系並びにＨＣ−０４不死化ヒト肝細胞におけるＰｂ（ＷＴ）寄生虫の赤血球外形態の感染後４８時間の成長（線は面積の平均を示し、バーは９０及び１０パーセンタイルを表す）；Ｄ）細胞コンフルエンスについて正規化後の赤血球外形態の数の％として表される、１００００個のスポロゾイトへの感染後４８時間にＨｕｈ−７及びＨｅｐＧ２肝癌細胞並びにＨＣ−０４肝細胞において成長した赤血球外形態の数（バーは標準偏差を示す）；Ｅ）ＦＲＧヒト化マウスの肝臓中のマウス肝細胞（黒色バー）及びヒト移植（engraphed）肝細胞（灰色バー）内で感染後４８時間成長したＰｂ（ＷＴ）寄生虫からの赤血球外形態の相対的割合；Ｆ）面積測定により定量化された、ＦＲＧヒト化マウスにおけるマウス肝細胞（黒色バー）又はヒト肝細胞（灰色バー）内のＰｂ（ＷＴ）寄生虫の赤血球外形態の感染後４８時間における成長（線は面積の平均を示し、バーは９０及び１０パーセンタイルを表す）；Ｇ）肝臓ヒト化マウスのヒト肝細胞内で感染後４８時間成長した寄生虫の写真及び投影図。Ｐ．ベルゲイ寄生虫（赤色）が、明らかにヒトのフマリルアセトアセテートヒドロラーゼ染色肝細胞（白色）内にあることに留意されたい。縮尺バーは１０μｍに相当する。 図２ａ及び２ｂ。ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト赤血球の齧歯類プラスモジウム寄生虫感染。Ａ１、Ａ２及びＡ３）ヒト赤血球が移植されたキメラ及び非キメラマウスの末梢血中の寄生虫血の測定の代表的なフローサイトメトリープロット。核酸についてのＳＹＴＯ−１６（ｘ軸）及びマウス赤血球系統についてのＴＥＲ−１１９ｍＡＢ（ｙ軸）での同時染色は、ヒト赤血球とマウス赤血球との間、および感染赤血球と非感染赤血球との間の区別を可能にする。Ｐ．ベルゲイ寄生虫に感染したヒト赤血球はＰ．ファルシパルムに感染したヒト赤血球のポジティブコントロールと同じゲートに落ちることが予想されるので、この戦略を用いてそれらを特定することが可能である。（ｍＥ：マウス赤血球；ｈＥ：ヒト赤血球；ｉｍＥ：感染マウス赤血球；ｉｈＥ：感染ヒト赤血球；ｂｉｍＥ：感染マウス赤血球についてのバックグラウンド；ｂｉｈＥ：感染ヒト赤血球についてのバックグラウンド、Ａ１）Ｐ．ファルシパルムに感染したヒト赤血球が移植されたキメラマウス；Ａ２）Ｐ．ベルゲイに感染した非キメラマウス；Ａ３）Ｐ．ベルゲイに感染したヒト赤血球が移植されたキメラマウス；Ｂ１、Ｂ２及びＢ３）Ｐｂ（ＷＴ）又はＰ．ファルシパルムに感染したキメラ及び非キメラマウスにおける、ヒト又はマウス起源のいずれかからの感染赤血球の経時的平均百分率；Ｂ１）Ｐ．ファルシパルムに感染したヒト赤血球が移植されたキメラマウスにおける感染ヒト赤血球の平均百分率（実線）及び感染マウス赤血球についての予想される領域で得られたシグナルバックグラウンド（小点線）。Ｂ２）Ｐ．ベルゲイに感染した非キメラマウスにおける感染マウス赤血球の平均百分率（長点線）及び感染ヒト赤血球についての予想される領域で得られたシグナルバックグラウンド（小点線）；Ｂ３）Ｐ．ベルゲイに感染したヒト赤血球が移植されたキメラマウスにおける感染ヒト赤血球の平均百分率（実線）及び感染マウス赤血球の平均百分率（長点線）；Ｃ１及びＣ２）Ｐ．ベルゲイに感染したヒト赤血球が移植されたキメラマウスからのｉｍＥ及びｉｈＥの磁気分離後に得られた赤血球個体群。Ｃ１）ヒト赤血球が移植されたキメラマウスの末梢血中に存在する磁気分離されたＰ．ベルゲイ感染ヒト赤血球の代表的なフローサイトメトリープロット。Ｃ２）ヒト赤血球が移植されたキメラマウスの末梢血中に存在する磁気分離されたＰ．ベルゲイ感染マウス赤血球の代表的なフローサイトメトリープロット；Ｄ１及びＤ２）Ｐ．ベルゲイに感染したヒト赤血球が移植されたキメラマウスからのｉｍＥ及びｉｈＥの磁気分離後に得られた赤血球個体群の培養。Ｄ１）ヒト赤血球内での培養におけるＰ．ベルゲイ寄生虫の経時的な代表的な写真；Ｄ２）マウス赤血球内での培養におけるＰ．ベルゲイ寄生虫の経時的な代表的な写真；磁気分離の直後に得られたｉｈＥ中のＰ．ベルゲイ寄生虫は、培養下において２０時間後に最終的に退化する核濃縮（picnotic）形態しか示さないが、Ｐ．ベルゲイ−ｉｍＥは、分離の時に既に成熟しており、培養下において完全な栄養体分裂（trophozoite segmentation）に向けて経時的に進むということに留意されたい。Ｅ）同じマウス内で複数のＰ．ベルゲイ感染マウス赤血球及び異常な核濃縮Ｐ．ベルゲイ感染ヒト赤血球を示す感染キメラマウスからの血液塗抹の光学及び免疫蛍光顕微鏡検査観察により得られた代表的な写真。 同上 齧歯類プラスモジウム寄生虫異種間防御（interspecies cross-protection）。Ａ１及びＡ２）ヒトマラリア患者（ｎ＝２１）からの血清中のＣＳ特異的抗体力価；黒色はＰ．ファルシパルムＣＳについて陽性の血清試料を表す；Ａ１）Ｐ．ファルシパルムＣＳ特異的ＩｇＧ力価；Ａ２）Ｐ．ベルゲイＣＳ特異的ＩｇＧ力価。黒色はＰ．ファルシパルムＣＳについて陽性の血清試料を表す；Ｂ１及びＢ２）ヒトマラリア患者からの血清のＰ．ファルシパルムスポロゾイト及びＰ．ベルゲイスポロゾイトに対する認識及び結合；Ｂ１）Ｐ．ファルシパルムスポロゾイト（右）及びＰ．ベルゲイスポロゾイト（左）に対して認識及び結合するヒト血清試料の割合；スポロゾイトに結合する割合（黒）スポロゾイトに結合しない割合（灰色）；Ｂ２）Ｐ．ファルシパルムスポロゾイト結合アッセイの代表的な画像（上）及びＰ．ベルゲイスポロゾイト結合アッセイの代表的な画像（下）。 ヒトプラスモジウム寄生虫抗原を発現する遺伝子組換え齧歯類プラスモジウム寄生虫。Ａ）ｅｘ ｖｉｖｏ。齧歯類一次肝細胞のスポロゾイト感染から４８時間後の肝臓齧歯類プラスモジウム寄生虫形態の免疫蛍光顕微鏡検査；Ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏ。Ｃ５７ＢＬ／６齧歯類マラリアモデルのｉｎ ｖｉｖｏスポロゾイト感染から４５時間後の免疫蛍光顕微鏡検査。Ｐｂ（ＰｆＣＳ）寄生虫中のＰ．ファルシパルムＣＳタンパク質（緑色）の存在に留意されたい。 遺伝子組換え齧歯類プラスモジウム寄生虫の免疫原性。Ａ及びＢ）モック感染唾液腺注射マウス（ＳＧ）又は野生型Ｐ．ベルゲイ（ＷＴ）若しくは遺伝子組換えＰｂＣＳ_Ｐｆ．（ＰｆＣＳ）に感染したマウスのいずれかを用いて、異なる寄生虫系からのスポロゾイトに感染したマウスからの血清試料を、攻撃されたマウスにおいてスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳ）に対して誘導されるＩｇＧ及びＩｇＭ応答をアッセイするためにＥＬＩＳＡにより分析した；力価は、陽性染色をもたらす試験された血清の最も高い希釈として蛍光の任意単位（ＡＵ）で表される；Ａ）Ｐ．ファルシパルム−ＣＳに対して誘導されたＩｇＧ及びＩｇＭ応答；Ｂ）Ｐ．ベルゲイ−ＣＳに対して誘導されたＩｇＧ及びＩｇＭ応答；Ｃ）モック感染唾液腺注射マウス（ＳＧ）又は野生型Ｐ．ベルゲイ（ＷＴ）若しくは遺伝子組換えＰｂＣＳ_Ｐｆ．（ＰｆＣＳ）に感染したマウスのいずれかを用いた、攻撃されたマウスにおけるＣＳ特異的Ｔ細胞応答のＥＬＩＳＰＯＴ分析；１０＾６個の膵細胞中のＩＦＮ−γ分泌細胞の数が示されている；Ｄ）モック感染唾液腺注射マウス（ＳＧ）又は野生型Ｐ．ベルゲイ（ＷＴ）若しくは遺伝子組換えＰｂＣＳ_Ｐｆ．（ＰｆＣＳ）に感染したマウスのいずれかを用いた、攻撃されたマウスからの免疫血清の、野生型Ｐ．ベルゲイスポロゾイト、又は遺伝子組換えＰｂＣＳ_Ｐｆ若しくはＰ．ファルシパルムスポロゾイトへの結合親和性；Ｅ）モック感染唾液腺注射マウス（ＳＧ）又は野生型Ｐ．ベルゲイ（ＷＴ）若しくは遺伝子組換えＰｂＣＳ_Ｐｆ．（ＰｆＣＳ）に感染したマウスのいずれかを用いた、攻撃されたマウスからの血清の存在下でのＰ．ファルシパルムスポロゾイトの滑走運動性阻害アッセイ；Ｆ）モック感染唾液腺注射マウス（ＳＧ）又は野生型Ｐ．ベルゲイ（ＷＴ）若しくは遺伝子組換えＰｂＣＳ_Ｐｆ（ＰｆＣＳ）に感染したマウスのいずれかを用いた、攻撃されたマウスからの血清の存在下でのＰ．ファルシパルムの肝臓感染性阻害アッセイ。

本発明は、完全な安全性を確保しつつ先例のない汎用性と高い有効性とを組み合わせた、マラリアワクチン接種への代替的アプローチに関する。我々は、（ｉ）齧歯類マラリアスポロゾイト（ｓｐｚ）は、ヒト肝細胞中で成功裏に感染し成長することができるため、強力な免疫応答を生成することが可能な完全生物体前血内期ワクチンとして使用され得ること；（ｉｉ）齧歯類マラリア寄生虫は、ヒト赤血球内でそれらの生活環を完結することが全くできず、したがって、疾患誘発性ヒト血液期感染を引き起こせなくなっているため、極めて安全な抗原送達プラットフォームであること；（ｉｉｉ）齧歯類マラリア寄生虫は、ヒト免疫系により認識され得る保存された分子を有するため、ヒトプラスモジウム種に対する高いレベルの異種間防御を誘導し得ること；ｉｖ）遺伝子組換えされた齧歯類プラスモジウム寄生虫は高度に免疫原性であり、ヒトプラスモジウム寄生虫を認識してヒトプラスモジウム感染を阻害することが可能な特異的な免疫応答を操作されたヒトプラスモジウム抗原に対して誘発することができることを実証した。齧歯類プラスモジウム生物体又は齧歯類プラスモジウム寄生虫により、自然宿主が齧歯類動物である原生動物プラスモジウム属（４つの既知の種、すなわち、Ｐ．ベルゲイ、Ｐ．ヨエリ、Ｐ．ビンケイ及びＰ．シャバウディを含む）の任意のメンバーが意味される。ヒトプラスモジウム生物体又はヒトプラスモジウム寄生虫は、ヒトマラリアを引き起こすことが知られている原生動物プラスモジウム属（Ｐ．ファルシパルム、Ｐ．ビバックス、Ｐ．マラリアエ、Ｐ．オヴァレ及びＰ．ノウレシを含む）の任意のメンバーを意味する。

（ｉ）齧歯類プラスモジウム寄生虫はｉｎ ｖｉｖｏでヒト肝細胞に感染する。
我々は、並行して、齧歯類プラスモジウム生物体である野生型Ｐ．ベルゲイによる、１つのマウス肝癌細胞系及び２つのヒト肝癌細胞系（Ｈｅｐａ１−６、ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７）並びに１つのヒト不死化肝細胞系（ＨＣ０４）のｉｎ ｖｉｔｒｏ感染と、マウス一次肝細胞及びヒト一次肝細胞／線維芽細胞共培養物のｅｘ ｖｉｖｏ感染とをモニタリングした。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）及び蛍光顕微鏡検査による感染評価は、Ｐ．ベルゲイが、調査した全てのｉｎ ｖｉｔｒｏ系において同様の程度まで通過（traverse）、侵入及び成長すること、並びにＰ．ベルゲイが、ｅｘ ｖｉｖｏで齧歯類及びヒト一次肝細胞内に侵入し成長することができることを示した（図１Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。

Ｐ．ベルゲイがｉｎ ｖｉｖｏの文脈においてヒト肝細胞に感染することができるか否かを確かめるために、我々は、肝臓ヒト化マウス（^ＬＨマウス）にスポロゾイトを注射し、共焦点蛍光顕微鏡検査により肝臓感染をモニタリングした。我々の結果は、Ｐ．ベルゲイがキメラ^ＬＨマウスの肝臓内に移植されたヒト肝細胞に効果的に感染し得ることを示す。キメラ肝臓中のヒト及びマウス肝細胞の感染の間の比較は、寄生虫がどちらの種類の細胞内においても同様の成長が可能であることを明らかにする（図１Ｅ〜Ｇ）。

さらに、我々は、内因性ＣＳがＰ．ファルシパルムのものに置き換えられた遺伝子組換えされた齧歯類Ｐ．ベルゲイ寄生虫（ＰｂＣＳ_Ｐｆ）［１１］を使用した。我々は、この遺伝子組換え寄生虫の肝臓感染挙動を評価し、それがｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト肝細胞に感染する能力、並びにヒト一次肝細胞及び^ＬＨマウスの肝臓に感染する能力を保持することを証明した。

全体的に見て、これらの結果は、齧歯類Ｐ．ベルゲイ寄生虫には、ヒト肝細胞に感染する能力が十分にあること、及びこの能力が、遺伝子組換えされたＰｂＣＳ_Ｐｆ寄生虫においても保持されており、その結果、マラリアワクチンについての免疫生成条件を満たすことを示す。

（ｉｉ）齧歯類プラスモジウム寄生虫は病変に繋がるヒト血液期感染を引き起こすことができない。
安全であるために、齧歯類プラスモジウム生物体ベースのマラリアワクチンは、免疫用寄生虫がヒトにおいて疾患を引き起こすことが確実にできないようにしなければならない。これは、齧歯類プラスモジウムメロゾイトが、ヒト赤血球（ＲＢＣ）内に効果的に侵入し増殖することができないことを必要とする。これを確かめるために、我々は、Ｐ．ファルシパルム感染に対する薬物有効性を評価するためのモデルとして開発された特定割合のヒト赤血球が移植された血液ヒト化マウス（^ＢＨマウス）［１２］の使用に基づく戦略を使用した。この系は、感染細胞と非感染細胞とを、及びヒト赤血球と齧歯類赤血球とをそれぞれ見分けるための、核ＳＹＴＯ−１６染料及びマウス特異的ＴＥＲ−１１９染料の使用と合わされ、それにより、フローサイトメトリーによってどちらの種類の細胞の感染もモニタリングし得る（図２Ａ１、２Ａ２、２Ａ３）。

我々は、Ｐ．ベルゲイ感染マウス血液の輸血によって異なる程度のキメラ現象を有する^ＢＨマウスに感染させることにより開始し、非キメラマウスをコントロールとして用いて、これらのマウスにおける寄生虫血を定期的にモニタリングした。我々の結果は、ＳＹＴＯ−１６^＋／ＴＥＲ−１１６^＋個体群は約５％の値まで増加し、予想された通りマウスＲＢＣ（^ｍＲＢＣ）個体群の感染を示したが、感染したヒトＲＢＣ（^ｈＲＢＣ）に対応するであろうＳＹＴＯ−１６^＋／ＴＥＲ−１１６⁻個体群は０．２％を決して超えず、非ヒト化マウスについて観察されたバックグラウンドレベルの範囲内に留まったことを示す（図２Ａ１、２Ａ２、２Ａ３、２Ｂ１、２Ｂ２、２Ｂ３）。

この結果は、Ｐ．ベルゲイが^ｈＲＢＣに感染することができないこと、又はＰ．ベルゲイが非常に低いレベルでそうし得ることを示唆した。これが、多数のメロゾイトの生成のための効果的なリザーバとして機能する^ｍＲＢＣを著しい個体数を含有するキメラマウスの文脈において起こることは、特筆するに値する。これらの条件下におけるヒトＲＢＣ感染の可能性をさらに調査するために、我々は、核染料ＤＡＰＩでの染色及びＴＥＲ−１１６での染色後に、これらのマウスからの血液試料を分析した。我々は、^ｈＲＢＣの小程度の侵入が実際に起こり得たということを示す、ＤＡＰＩ^＋／ＴＥＲ−１１６⁻細胞の非常に稀な場合を認めた。しかしながら、我々は、１つより多くの寄生虫核を有する^ｈＲＢＣを何ら認めることができず、これにより、Ｐ．ベルゲイが、それが侵入し得るそのごく少数の^ｈＲＢＣ内で複製することができないことが示唆された（図２Ｅ）。

とりわけ重要なことには、フローサイトメトリーにより単離された感染^ｈＲＢＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養は、これらの寄生虫が実際に^ｈＲＢＣ内でそれらの赤血球内生活環を完結することができないことを示した（図２Ｃ１、２Ｃ２、２Ｄ１、２Ｄ２）。このことにより、それらはヒトにおける使用に安全なものとなる。同様の結果は、感染がＰｂＣＳ_Ｐｆ寄生虫により行われた場合にも得られた。

これらの実験において、感染は感染ＲＢＣの輸血によって得られる第２世代のメロゾイトにより開始されたので、我々は、肝臓内で生成される第１世代のメロゾイトの挙動を調査することにした。これを行うために、我々は、Ｐ．ベルゲイ感染蚊又はＰｂＣＳ_Ｐｆ感染蚊の唾液腺から採取されたスポロゾイトを^ＢＨマウスに感染させ、そして、非キメラマウスをコントロールとして用いて、上に記述したような同じ種類の分析を実施した。我々の結果は、肝臓内で生成されたメロゾイトが、第２世代のメロゾイトと同様に挙動することを示しており、このことにより、齧歯類Ｐ．ベルゲイ寄生虫がヒトにおける使用に安全であり、Ｐ．ファルシパルムスポロゾイトの不十分な弱毒化に伴う危険を呈さないことが証明される。

（ｉｉｉ）齧歯類プラスモジウム寄生虫はヒトプラスモジウム寄生虫に対する高い異種間防御能力を有する。
我々は、カメルーン及びタンザニアからのアフリカ人マラリア感染個体からの血清試料を、Ｐベルゲイ及びＰ．ファルシパルムＣＳタンパク質に対する抗体の存在について、並びにこれらの種の両方からのｓｐｚを認識するそれらの能力について評価した。我々の結果は、これらの試料はいずれもＰ．ベルゲイＣＳに対する抗体を含有していなかった（図３Ａ１、３Ａ２）が、それらのうちの７１％が、Ｐ．ファルシパルム及びＰ．ベルゲイｓｐｚの両方を認識することができた（図３Ｂ１、３Ｂ２）ことを示した。これらのデータは、マラリアに対する自然獲得免疫が、ＣＳタンパク質以外のｓｐｚ上の保存されたヒトプラスモジウム寄生虫及び齧歯類プラスモジウム寄生虫エピトープに対する抗体応答を含むことを示す。全体的に見て、これらの結果は、ワクチン接種プラットフォームとしての齧歯類プラスモジウム寄生虫の使用が、現在のところ知られていない保存された抗原に対する免疫応答を惹起する可能性を有することを明らかに示す。

（ｉｖ）遺伝子組換え齧歯類プラスモジウム寄生虫による免疫はヒトプラスモジウム感染に対して特異的な極めて効果的な防御を誘発する。
我々が提案するワクチン接種方法のさらなる利点は、我々は、極めて効果的な特異的免疫応答を誘発するであろうヒトプラスモジウム寄生虫の抗原の遺伝子組換えによる導入により、齧歯類プラスモジウム寄生虫によって提供される固有の異種間防御を向上させ得るという考えに依拠するものである。

我々が提案する戦略のコンセプトを証明するために、我々は、齧歯類ＰｂＣＳ_Ｐｆ寄生虫を使用した。我々は、免疫蛍光顕微鏡検査を用いて、ＰｂＣＳ_Ｐｆがｅｘ ｖｉｖｏ（図４Ａ）又はｉｎ ｖｉｖｏ（図４Ｂ）のどちらにおいても肝細胞内でＰ．ファルシパルムＣＳを発現することを確認した。次いで、我々は、感染の齧歯類モデルにおいてこれらのトランスジェニック寄生虫の免疫原性を評価し、操作されたＰ．ファルシパルムＣＳ抗原に対するこの応答の特異性を判断した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＰｂＣＳ_Ｐｆスポロゾイトに感染させ、続いてクロロキンで処理して、血液寄生虫血及び疾患の進行を防止した。クロロキン処理の開始から５日後に、マウスを犠牲にし、採取血液から免疫血清を得た。感染していないマウスからの免疫前血清及び野生型Ｐ．ベルゲイにより免疫されたマウスからの血清を得、これらの実験においてコントロールとして使用した。血清中のＰ．ファルシパルムＣＳに対する抗体を、ＥＬＩＳＡにより定量化した（図５Ａ、５Ｂ）。我々の結果は、ＰｂＣＳ_Ｐｆ寄生虫により免疫されたマウスが、著しい量のこの抗体を産生したことを示しており、このことにより、齧歯類動物のＰｂＣＳ_Ｐｆによる免疫が、ヒト感染性寄生虫に対する防御をもたらすことが知られている［１３］Ｐ．ファルシパルムＣＳに向けられた抗体の生成を誘発したことが証明される。

さらに、我々は、Ｐ．ファルシパルムＣＳエピトープに対する明らかな細胞性免疫応答を実証した（図５Ｃ）。最後に、我々は、遺伝子組換え齧歯類ＰｂＣＳ_Ｐｆにより免疫されたマウスの血清が、ヒトプラスモジウムスポロゾイトに対して高いアビディティで認識及び結合し得ることを証明した（図５Ｄ）。さらに、我々は、この免疫血清が、ヒトプラスモジウム寄生虫の滑走運動性（図５Ｅ）及び肝細胞進入（図５Ｆ）を機能的に阻害することができることを証明した。

全体的に見て、我々のデータは、齧歯類プラスモジウム寄生虫の遺伝子組換えが、ヒトプラスモジウム寄生虫に対するこれらの寄生虫の免疫能力を実質的に高め得ることを示す。

結論
放射線弱毒化スポロゾイト（ＲＡＳ）及び遺伝子的に弱毒化されたスポロゾイト（ＧＡＳ）により提供されるものなどの完全生物体アプローチは、そのような弱毒化スポロゾイトワクチンの製造、製剤化及び送達に関する多大な技術的課題にもかかわらず、サブユニットベースの前赤血球期ワクチン接種戦略に代わる非常に魅力的な代替法と見られている。しかしながら、これらのアプローチの両方が、それらが最も命に関わるヒトマラリア寄生虫であるＰ．ファルシパルムの弱毒化に基づくものであるという事実から生じる不可避の安全性の懸念を提起する。

我々は、齧歯類プラスモジウム寄生虫とヒトプラスモジウム寄生虫との間の異種間防御能力に基づく、マラリアに対する前赤血球期完全生物体ワクチンの開発のための代替的戦略を提案する。そのようなワクチンは、ヒトプラスモジウム属種対応物に対して免疫原性であり得る齧歯類抗原による異種間防御を誘発し得る。照射マラリアスポロゾイトによる免疫に続いてＣＳ以外の成分により誘導される異種間防御の例が利用可能である。例えば、体液性及び細胞性免疫応答による防御免疫を誘導する能力に基づく前赤血球期ワクチンの標的抗原として近年特定された、ＣｅｌＴＯＳ（オーキネート及びスポロゾイトの細胞透過タンパク質（cell-traversal protein）を表す）がこれに該当し得る。ＣｅｌＴＯＳは、プラスモジウム属種の間で高度に保存されており、Ｐ．ファルシパルムからの前赤血球期抗原ＣｅｌＴＯＳによる免疫は、Ｐ．ベルゲイによる異種攻撃に対する異種間防御を誘発することが示され、これにより、逆の作用も起こり得ることが示唆された。

それらの異種間防御能力に加えて、齧歯類プラスモジウム寄生虫の免疫原性は、遺伝子組換えにより、それらを効果的に、極めて効率的な特異的免疫応答を誘発することが可能なヒト感染性プラスモジウム属種の免疫原性抗原の送達のためのプラットフォームに変えて高められ得る。当然、既に知られているか又はまだ知られていない２種以上の抗原が、プラスモジウム生活環の単段階又は多段階のいずれかに対して及びヒトプラスモジウム生物体の単一種又は複数種に対して導入され得る。というのは、そのような重複は寄生虫血の感染に対するさらなる程度の防御を確実にし得るからである。

本発明において、我々は、齧歯類寄生虫Ｐ．ベルゲイが、ヒト肝細胞には感染し得るがヒト血液期感染を引き起こすことはできないことを実証する。これらは、ワクチン接種戦略として評価されるべき齧歯類動物ベースの寄生虫の必須の前提のうちの２つを構成する。第３の前提は、トランスジェニック齧歯類プラスモジウム寄生虫がヒト感染性プラスモジウム種による攻撃に対する応答を誘発し得ることである。この仮定を実証するために、我々は、Ｐ．ベルゲイのＰ．ファルシパルムＣＳ発現変異体（ＰｂＣＳ_Ｐｆ）を使用し、それが、Ｐ．ファルシパルム攻撃に対する特異的防御応答を誘発しながらもその野生型対応物の主要な特徴を保持することを証明した。これは、我々が提案する戦略の概念実証を確立し、同じ原理に基づく他のワクチン候補の設計及び製造へのさらなる道を開くものである。

ＰｂＣＳＰｆ自体は、それが比較的少ない数の唾液腺スポロゾイトをもたらしかつ野生型Ｐ．ベルゲイよりも低い肝臓感染性をもたらすという欠点を有する。これは、この寄生虫におけるＰ．ファルシパルムタンパク質の不適切なコンフォメーションと合わせ、内因性ＣＳの欠如のせいである可能性が最も高い。したがって、いくつかの代替法（例えば、内因性タンパク質の置き換えとしてではなくさらに加えての、内因性ＣＳプロモーターの制御下における、中立遺伝子座でのＰ．ファルシパルムＣＳの異種発現）が、ＰｂＣＳＰｆの感染収率（infection yield）を改善するために企図され得る。

ヒトマラリア遺伝子のための「ピギーバック」としての齧歯類寄生虫の使用は、ＣＳ以外の抗原を含むように拡張され得る。前赤血球期免疫応答を生成するための明らかな候補の中には、トロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）及び肝臓期抗原１（ＬＳＡ−１）があり、その両方が、免疫原性能力を呈することが予想される。

さらに、マラリアに対する滅菌防御免疫は、１つの抗原単独ではなく新規のＰ．ファルシパルム抗原の一団に向けられる。或いは、戦略はまた、血液期抗原を含めることも考慮に入れる。これらの中で、頂端膜抗原Ｉ（ＡＭＡ−Ｉ）、赤血球結合抗原−１７５（ＥＢＡ−１７５）、及びメロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ−１）が、それらの確立又は提案されている免疫原性を考慮すると、最も有力な候補である。これらの抗原は、感染の肝臓期の間のそれらの発現を可能にするプロモーターの制御下に置かれた場合、Ｐ．ファルシパルム血液期に対して宿主の免疫系に抗原刺激を与えて、さらなる防御層を生成することが予想される。さらに、このアプローチは、ガメトサイト特異的遺伝子（例えば、ｐ４８／４５）を齧歯類プラスモジウムプラットフォーム内に操作して入れることにより、偽弱毒化ワクチン（pseudo-attenuated vaccine）中に伝染阻止成分を導入するために使用され得る。

この戦略は、Ｐ．ビバックス抗原（例えば、ＣＳ、上記のＰ．ファルシパルム遺伝子のオルソログ、ダッフィ結合タンパク質（ＤＢＰ）、又は網状赤血球結合タンパク質（ＲＢＰ））を免疫原性プラットフォーム中に含めることが企図され得るように、Ｐ．ファルシパルムに対する免疫の生成を超えて拡張され得る。

Claims (5)

1. 生きた齧歯類プラスモジウム生物体を含む、ヒトマラリアを予防するためのワクチンであって、
   前記齧歯類プラスモジウム生物体が、ヒトプラスモジウム寄生虫由来のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質を発現するように遺伝子組換えされている、ワクチン。
2. 前記齧歯類プラスモジウム生物体が、自然宿主が齧歯類動物である、Ｐ．ベルゲイ（P. berghei）、Ｐ．ヨエリ（P. yoelii）、Ｐ．ビンケイ（P. vinckei）及びＰ．シャバウディ（P. chabaudi）を含む原生動物プラスモジウム属のいずれかのメンバーである、請求項１に記載のワクチン。
3. 前記ヒトマラリアが、原生動物プラスモジウム属のＰ．ファルシパルム（P. falciparum）、Ｐ．ビバックス（P. vivax）、Ｐ．マラリアエ（P.malariae）、Ｐ．オヴァレ（P. ovale）及びＰ．ノウレシ（P. knowlesi）を含むヒトプラスモジウム寄生虫のうちのいずれかによって引き起こされる、請求項１または２に記載のワクチン。
4. ヒトプラスモジウム寄生虫の前赤血球期感染を阻害するための、生きた齧歯類プラスモジウム生物体を含む、医薬組成物であって、前記齧歯類プラスモジウム生物体が、ヒトプラスモジウム寄生虫由来のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質を発現するように遺伝子組換えされている、医薬組成物。
5. 薬学的に許容可能なキャリアを含む、請求項４に記載の医薬組成物。

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