JP6096885B2 - ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断を用いたターゲット核酸配列の検出｛ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＴａｒｇｅｔＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅｂｙＰＴＯＣｌｅａｖａｇｅａｎｄＥｘｔｅｎｓｉｏｎ−ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＳｉｇｎａｌｉｎｇＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＣｌｅａｖａｇｅ｝ - Google Patents

Description

本特許出願は、２０１２年４月１９日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１２−００４０８６４号に対して優先権を主張し、上記特許出願の開示事項は本明細書に参照として組み込まれる。
本発明は、ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ： ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイによるターゲット核酸配列の検出に関するものである。

ＤＮＡハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は分子生物学の基本的な過程であり、イオン強度、塩基構成、核酸断片の長さ、ミスマッチの程度及び変性剤の存在によって影響される。

ＤＮＡハイブリダイゼーション基盤技術は特定の核酸配列の決定に非常に有用な道具になるはずであり、臨床診断、遺伝子研究及び法医学的な実験分析に明らかに役立つだろう。しかしながら、ハイブリダイゼーションのみに依存する従来の方法及び過程では、プローブと非ターゲット配列との非特異的なハイブリダイゼーションによる偽陽性結果が発生する可能性が高い。よって、従来の方法及び過程は、信頼度を改善しなければならない問題点が残っている。

プローブハイブリダイゼーション過程の以外にも追加で酵素的反応を用いたいくつかの接近法、例えば、ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ法が提示された。

ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ法において、ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされた標識プローブは上流プライマー依存的なＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断されて、ターゲット配列の存在を示すシグナルを発生させる（特許文献１〜３）。ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ法はシグナル発生のための２つの接近法を提示する：重合依存的な切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｅａｖａｇｅ）及び重合独立的な切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｅａｖａｇｅ）。重合依存的な切断において、上流プライマーの伸長は必ず核酸ポリメラーゼが標識プローブの５’末端に接触する前に発生しなければならない。伸長反応が進行されながら、ポリメラーゼは標識プローブの５’末端を次第に切断する、重合独立的な切断において、上流プライマー及び標識プローブは非常に近接してターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上流プライマーの３’末端と核酸ポリメラーゼとの結合は上記核酸ポリメラーゼが標識プローブの５’末端に接触するようにして標識が放出される。また、ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ法は、それの５’末端部位にターゲット配列とハイブリダイゼーションされない５’テール区域を持つ標識プローブが切断されて、５’テール区域を含む断片が形成されることを開示している。

ターゲット配列に非相補的な５’テール区域を持つプローブが５’ヌクレアーゼによって切断されて、５’テール区域を含む断片が放出されるいくつかの方法が報告された。

例えば、特許文献４は、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断される切断構造を開示している。鋳型に対して非相補的な５’部位及び鋳型に対して相補的な３’部位を含むオリゴヌクレオチドが鋳型にハイブリダイゼーションされ、上流オリゴヌクレオチドは非常に近接して鋳型にハイブリダイゼーションされる切断構造が例示されている。切断構造は５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼ又は減少された合成活性を持つ変形ＤＮＡポリメラーゼによって切断されて、鋳型に非相補的な５’部位が放出される。その後、放出された５’部位はヘアピン構造を持つオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションされて切断構造を形成し、これによって漸進的な切断反応が誘導されてターゲット配列が検出される。

特許文献５は、３’末端がブロッキングされた上流オリゴヌクレオチドを持つ切断構造が、５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼ又はＦＥＮヌクレアーゼによって切断されて非相補的な５’フラップ（ｆｌａｐ）部位が放出され、放出された５’フラップ部位は大きさの分析又は相互作用的な二重標識によって検出される過程を開示している。特許文献６は、検出可能な放出されたフラップが核酸合成依存的な、フラップ媒介連続的な増幅方法によって生成されることを開示している。この方法において、一番目の切断構造から放出されたフラップは、核酸合成依存的な方式で二番目の切断構造を切断して二番目の切断構造からフラップを放出させ、放出されたフラップを検出する。特許文献７は、核酸合成によって生成された放出されたフラップの生成、放出されたフラップの伸長、フラップ伸長中にオリゴヌクレオチドの切断及びオリゴヌクレオチド切断によって生成されたシグナル検出を含む方法を開示している。

液相での蛍光標識プローブのハイブリダイゼーションによって、一種類の蛍光標識を用いても融解曲線分析によって多数のターゲット核酸配列を同時に検出することができる。しかしながら、相互作用的な二重標識プローブの５’ヌクレアーゼ媒介切断によってターゲット配列を検出する従来の技術は、マルチプレックスターゲット検出で互いに異なるターゲット配列に対して互いに異なる種類の蛍光標識を必要とし、このような蛍光標識種類の数の限界のため、検出されるターゲット配列の数は制限される。

特許文献８は、ターゲット核酸配列に非相補的な５’部位を持つプローブの切断及びキャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅ）プローブのハイブリダイゼーションを用いたターゲット検出方法を開示している。標識は非相補的な５’部位に位置する。ターゲット配列にハイブリダイゼーションされた標識プローブは切断されて断片を放出し、その後、断片はキャプチャープローブにハイブリダイゼーションされてターゲット配列の存在が検出される。この方法において、非切断された／無傷な（ｕｎｃｌｅａｖｅｄ／ｉｎｔａｃｔ）プローブはキャプチャープローブにハイブリダイゼーションされないことが必須である。このためには、短い長さを持つキャプチャープローブが固相基質上に固定化されなければならない。しかしながら、このような制限は固相基質でのハイブリダイゼーションの効率性を低くし、また反応条件の最適化も難しくする。

したがって、より便利で、信頼性及び再現性のある方式で、ハイブリダイゼーションだけでなく、５’核酸分解反応（５’ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のような酵素的反応によって液相及び固相でターゲット配列、より好ましくは複数のターゲット配列を検出するための新規な接近法に対する開発要求が浮上している。さらに、当業界で標識（特に、蛍光標識）の種類の数に制限されない新規なターゲット検出方法が要求されている。

本明細書の全体にかけて多数の引用文献及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。このような文献及び特許の開示内容はその全体が本明細書に参照により組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

米国特許第５，２１０，０１５号 米国特許第５，５３８，８４８号 米国特許第６，３２６，１４５号 米国特許第５，６９１，１４２号 米国特許第７，３８１，５３２号 米国特許第６，８９３，８１９号 米国特許第７，３０９，５７３号 米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号

本発明者らは、より改善した正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発すべく鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列を検出するための新規なプロトコルを定立し、この新規なプロトコルによれば、ターゲット検出はプローブのハイブリダイゼーションだけでなく、５’核酸分解反応（５’ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）及び伸長のような酵素的な反応と伸長依存的なハイブリダイゼーション及び切断反応を用いて達成され、ターゲット特異性、過程の便宜性及びマルチプレックス検出可能性を改善させる。

したがって、本発明の目的は、ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ： ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイによるＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ： ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイによるＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、下記の実施例、請求の範囲及び図面によってより明らかにされる。

本発明は、ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ： ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイによるターゲット核酸配列を検出する新規な方法に関するものである。

本発明のＰＣＥ−ＳＣアッセイは、次においてより詳しく説明されることができる：
Ｉ． ＰＣＥ−ＳＣアッセイによるターゲット核酸配列の検出
本発明の一様態によれば、本発明は、次のステップを含むＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ： ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイによる ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ） 上記ターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及びプロービングアンドタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記上流オリゴヌクレオチドは、上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み；上記ＰＴＯは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；上記３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ＰＴＯより上流に位置し；
（ｂ） 上記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に上記ステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって；上記上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ上記酵素による上記ＰＴＯの切断を誘導して、上記５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出し；
（ｃ） 上記ＰＴＯから放出された上記断片とキャプチャリングアンドテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；上記ＰＴＯから放出された断片は、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；
（ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び上記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた上記断片は伸長され、上記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成されて伸長二重体を形成し；
（ｅ） 上記伸長鎖とシグナリングオリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＳＯ）とをハイブリダイゼーションさせて伸長鎖／ＳＯハイブリッドを生成させるステップであって；上記ＳＯは、上記伸長鎖に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列及び少なくとも１つの標識を含み；
（ｆ） 核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）を用いて上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの上記ＳＯを切断して、上記ＳＯの切断された断片を生成させるステップ；及び
（ｇ） 上記ステップ（ｆ）で上記切断反応の発生を検出するステップであって；上記検出は、上記ＳＯに連結された標識から提供されるシグナルを測定して行い、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの上記ＳＯに対する切断反応の発生は、上記ターゲット核酸配列の存在を示す。

本発明者らは、より改善した正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発すべく鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列を検出するための新規なプロトコルを定立し、この新規なプロトコルによれば、ターゲット検出はプローブのハイブリダイゼーションだけでなく、５’核酸分解反応（５’ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）及び伸長のような酵素的な反応及び伸長依存的なハイブリダイゼーション及び切断反応を用いて達成され、ターゲット特異性、過程の便宜性及びマルチプレックス検出可能性を改善させる。

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次のとおりである：
（ａ） 本発明は、ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションしてターゲットシグナルを提供するプローブを使用しない。本発明は、ターゲット核酸配列の存在に依存的な鋳型として任意的な配列を持つ上記ＣＴＯ上に伸長鎖が生成される方式で行われ、結局、プローブとして上記ＳＯが上記伸長鎖とハイブリダイゼーションされ切断されてシグナルを提供する。本発明は、ＰＴＯハイブリダイゼーション及び切断、ＣＴＯハイブリダイゼーション及び伸長、及びＳＯハイブリダイゼーション及び切断を含む一連の反応を用い、これによって本発明の特異性が高く向上する。
（ｂ） ＳＯの配列は、ターゲット核酸配列を考慮することなく選択されることができる。よって、関心のある核酸分解酵素に対する切断位置を生成することができる。それによって、本発明は、５’ヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ及び制限酵素のような核酸分解酵素によるプローブ切断を用いる従来のターゲット検出技術を採択して、ターゲット核酸配列を検出することができる。
（ｃ） ＳＯの配列はターゲット核酸配列に関らず選択されるため、シグナル生成に関する条件は、ターゲット核酸配列を考慮することなく便利に調節されることができる。このような特徴は多重ターゲット検出で著しい長所を提供し、これはマルチプレックスに対する反応条件がこれ以上困難な問題にならずに偽陽性シグナルの発生を防ぐためである。
（ｄ） 本発明は、伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断によって提供されるシグナルを測定するため、上記伸長鎖とＳＯとのハイブリダイゼーション維持のための条件下でシグナルを測定する必要がない。標識された断片を生成することで、いずれの温度条件でも上記断片の標識から発生したシグナルを検出することができる。それによって、本発明は、多様な検出条件下で行われることができる（例えば、広範囲な温度）。
（ｅ） ターゲット核酸配列と直接ハイブリダイゼーションするプローブを用いる従来の技術で、プローブは相補的な配列と競争的な方式でターゲット核酸配列に結合する。これに対し、本発明は、このような競争的なハイブリダイゼーションを避けることができる。本発明においては、テンプレートであるＣＴＯを用いて伸長鎖のみを増幅させることができるので、より一層効率的なプローブハイブリダイゼーションが可能であり、結局、効果的にターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを得ることができる。
（ｆ） ＰＴＯの５’タギング部位、ＣＴＯ及びＳＯの配列はターゲット核酸配列を考慮することなく選択されることができる。これはＰＴＯの５’タギング部位、ＣＴＯ及びＳＯに対する配列プールを予めデザインできるようにする。ＰＴＯの３’ターゲッティング部位はターゲット核酸配列を考慮して製造すべきであるが、ＣＴＯ及びＳＯの場合は、ターゲット核酸配列の情報又は考慮なしで既存の方式（ｒｅａｄｙ−ｍａｄｅ）で製造することができる。

ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ： ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイで用いられるＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｅｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及びＳＯ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の図式的な構造を示す。ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＳＯの３’末端は伸長されることを防止するためにブロッキングされることができる。 ＰＣＥ−ＳＣアッセイの一実現例を図式的に示す。ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含み、５’ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ又は切断酵素によって切断される。 ＳＯに対する上流オリゴヌクレオチドとして上流プローブを使用するＰＣＥ−ＳＣアッセイの他の一実現例を図式的に示す。ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含み、上流プローブ依存的な５’ヌクレアーゼ活性によって切断される。 ＳＯに対する上流オリゴヌクレオチドとして上流プライマーを使用するＰＣＥ−ＳＣアッセイのまた他の一実現例を図式的に示す。ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含み、上流プライマー依存的な５’ヌクレアーゼ活性によって切断される。 ＳＯに対する上流オリゴヌクレオチドとして上流プライマーを使用するＰＣＥ−ＳＣアッセイのまた他の一実現例を図式的に示す。レポーター分子及びクエンチャー分子で標識されたＳＯは、伸長鎖に非相補的な配列を含む５’タギング部位を含む。 固相でのＰＣＥ−ＳＣアッセイの追加の実現例を図式的に示す。単一標識で標識されたＳＯはそれの３’末端を通じて固相基質上に固定化される。ＳＯは５’ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ又は切断酵素によって切断される。 ＰＯに対する上流プライマーを使用するＰＣＥ−ＳＣアッセイを通じてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子を検出した結果である。ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含み、５’ヌクレアーゼによって切断される。 ＰＯに対する上流プライマー及びＳＯに対する上流オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＥ−ＳＣアッセイを通じてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子を検出した結果である。ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む。 ＰＴＯに対する上流プライマーを使用せずにＰＣＥ−ＳＣアッセイを通じてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子を検出した結果である。ＳＯに対する上流オリゴヌクレオチドが使用される。ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む。 ＰＴＯに対する上流及び下流プライマー対を使用するＰＣＥ−ＳＣアッセイを通じてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子を検出した結果である。ＳＯに対する上流オリゴヌクレオチドが使用される。ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む。

本発明は、ＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の切断と伸長及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断反応を含むプローブハイブリダイゼーションによって発生する連続的なイベントを用い、よって、本発明は、「ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ： ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイ」と命名される。

本発明のＰＣＥ−ＳＣアッセイをそれぞれのステップ別に詳細に説明すれば、次のとおりである：

ステップ （ａ）：ターゲット核酸配列と上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及びＰＴＯとのハイブリダイゼーション
本発明によれば、まず、ターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイゼーションさせる。

本明細書において使用される用語「ターゲット核酸」、「ターゲット核酸配列」又は「ターゲット配列」とは、検出しようとする核酸配列を意味し、ハイブリダイゼーション、アニーリング又は増幅条件下でプライマー又はプローブとアニーリング又はハイブリダイゼーションされる。

本明細書において使用される用語「プローブ（ｐｒｏｂｅ）」は、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な部位又は部位等を含む一本鎖の核酸分子である。

本明細書において使用される用語「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」とは、オリゴヌクレオチドを意味するものであって、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件、すなわち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在、そして好適な温度とｐＨの条件で合成の開始点として作用することができる。

特定の実現例において、プローブ及びプライマーは、一本鎖のデオキシリボヌクレオチド分子である。本発明において用いられるプローブ又はプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（すなわち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含むことができる。また、プローブ又はプライマーは、リボヌクレオチドも含むことができる。

プライマーは重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングさせることができる程度に十分長くなければならない。プライマーの好適な長さは、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）を含んだ複数の要素によって決定される。本明細書において使用される用語「アニーリング」又は「プライミング」とは、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチド又は核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、上記並置は、ポリメラーゼがヌクレオチドを重合させて鋳型核酸又はそれの一部分に相補的な核酸分子を形成させる。

本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」とは、相補的な一本鎖の核酸が二本鎖の核酸を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションは、２本の核酸鎖間の相補性が完全な場合（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）に起こるか、又は一部のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても起こることができる。ハイブリダイゼーションに必要な相補性の程度は、ハイブリダイゼーションの条件によって変わることができ、特に温度によって調節されることができる。

上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯとターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションは、最適化の手順によって通常決定される好適なハイブリダイゼーション条件下で行われることができる。温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーション及び洗浄回数、緩衝液の成分及びこれらのｐＨ及びイオン強度のような条件は、オリゴヌクレオチド（上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ）の長さ及びＧＣ量及びターゲットヌクレオチド配列を含んだ多様な因子によって変わり得る。例えば、相対的に短いオリゴヌクレオチドを用いる場合、低い厳しい条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を選択することが好ましい。ハイブリダイゼーションのための詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋなど，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）； 及びＭ．Ｌ．Ｍ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ．（１９９９）から確認することができる。

用語「アニーリング」と「ハイブリダイゼーション」とは違いがなく、本明細書において混用される。

上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯは、ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む。本明細書において使用される用語「相補的」とは、所定のアニーリング又は厳しい条件の下でプライマー又はプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイゼーションする程度に十分に相補的であることを意味し、「実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」及び「完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」であることをいずれも包括する意味を有し、例えば、完全に相補的であることを意味する。

ＰＴＯの５’タギング部位は、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む。ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のテンプレーティング部位はＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含む。本明細書において使用される用語「非相補的」とは、所定のアニーリング条件又は厳しい条件の下でプライマー又はプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイゼーションされない程度に十分に非相補的であることを意味し、「実質的に非相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」及び「完全に非相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」であることをいずれも包括する意味を有し、例えば、完全に非相補的であることを意味する。

例えば、ＰＴＯの５’タギング部位を言及しながら使用される用語「非相補的」とは、所定のアニーリング条件又は厳しい条件の下で上記５’タギング部位がターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイゼーションされない程度に十分に非相補的であることを意味し、「実質的に非相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」及び「完全に非相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」であることをいずれも包括する意味を有し、例えば、完全に非相補的であることを意味する。

本明細書において使用される用語「プロービングアンドタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）」とは、（ｉ）プローブとしての役割をする３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション後に切断されてＰＴＯから放出され、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を持つ５’タギング部位を含むオリゴヌクレオチドを意味する。上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位は、必ず５’→３’の順序で位置する。図１にＰＴＯを図示的に示す。

一実現例において、３’ターゲッティング部位はターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、５’タギング部位はターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされない厳しい条件の下でステップ（ａ）のハイブリダイゼーションが行われる。

ＰＴＯは特定の長さを要求しない。例えば、ＰＴＯは、１５〜１５０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、２０〜１５０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、３０〜１５０ヌクレオチド、３０〜１００ヌクレオチド、３０〜８０ヌクレオチド、３０〜６０ヌクレオチド、３０〜５０ヌクレオチド、３５〜１００ヌクレオチド、３５〜８０ヌクレオチド、３５〜６０ヌクレオチド、又は３５〜５０ヌクレオチドの長さを持つことができる。ＰＴＯの３’ターゲッティング部位はターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションされる限り、いずれの長さであってもよい。例えば、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜８０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜５０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド又は２０〜３０ヌクレオチドの長さを持つことができる。５’タギング部位は、ＣＴＯのテンプレーティング部位に特異的にハイブリダイゼーションされた後に伸長される限り、いずれの長さであってもよい。例えば、ＰＴＯの５’タギング部位は、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、１５〜５０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド又は１５〜２０ヌクレオチドの長さを持つことができる。

ＰＴＯの３’末端は３’−ＯＨターミナル（ｔｅｒｍｉｎａｌ）を持つこともできる。特定の実現例において、ＰＴＯの３’末端は「ブロッキング」されてそれの伸長が防止される。

ブロッキングは、従来の方法によって達成されることができる。例えば、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にビオチン、標識、リン酸基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート又はアルカンジオール残基のような化学的部分（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して行うことができる。または、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか又はジデオキシヌクレオチドのように３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを用いて行うことができる。

または、ＰＴＯはヘアピン構造を持つようにデザインされることができる。

上記ＰＴＯの５’タギング部位とターゲット核酸配列との非ハイブリダイゼーションとは、特定のハイブリダイゼーション条件下でそれら間で安定した二本鎖が形成されないことを意味する。本発明の一実現例によれば、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションに関与しない上記ＰＴＯの５’タギング部位は一本鎖を形成する。

上流オリゴヌクレオチドは、ＰＴＯの上流に位置する。

また、ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされた上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。

上流オリゴヌクレオチドによるＰＴＯ切断の誘導は、２つの方式で達成されることができる：（ｉ）上流オリゴヌクレオチド伸長独立的な切断の誘導；及び（ｉｉ）上流オリゴヌクレオチド伸長依存的な切断の誘導。

上流オリゴヌクレオチドが５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によって上記ＰＴＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＴＯに近接して位置する場合、上流オリゴヌクレオチドに結合した上記酵素は伸長反応がなくてもＰＴＯを切断する。一方、上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯから離隔している場合、ポリメラーゼ活性を持つ酵素（例えば、鋳型依存的なポリメラーゼ）は、上流オリゴヌクレオチド（例えば、上流プライマー）の伸長を促進させ、伸長産物に結合された５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素はＰＴＯを切断する。

したがって、上流オリゴヌクレオチドは２つの方式でＰＴＯに対して相対的に位置することができる。上流オリゴヌクレオチドは、伸長独立的な方式でＰＴＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＴＯに近接した位置に位置することができる。または、上流オリゴヌクレオチドは、伸長依存的な方式でＰＴＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＴＯから離隔した位置に位置することができる。

本明細書において地点（ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）又は位置（ｌｏｃａｔｉｏｎｓ）を言及しながら使用される用語「近接（ａｄｊａｃｅｎｔ）」とは、上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’ターゲッティング部位のすぐ近くに位置して切れ目（ｎｉｃｋ）を形成することを意味する。また、上記用語は、上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’ターゲッティング部位から１〜３０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド又は１〜１５ヌクレオチド離隔して位置することを意味する。

本明細書において地点又は位置を言及しながら使用される用語「離隔（ｄｉｓｔａｎｔ）」とは、伸長反応が起こるのに十分な程度のある位置又は場所を含む。

本発明の一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチドは、伸長依存的な方式でＰＴＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＴＯから離隔して位置することができる。

本発明の一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチドは、上流プライマー又は上流プローブである。上流プライマーは伸長独立的な切断の誘導又は伸長依存的な切断に適しており、上流プローブは伸長独立的な切断の誘導に適している。

または、上流オリゴヌクレオチドは、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’の一部と部分的に重なる配列（ｐａｒｔｉａｌ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を持つことができる。特定の実現例において、重なる配列は１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチド、又は１〜３ヌクレオチドの長さである。上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’の一部と部分的に重なる配列（ｐａｒｔｉａｌ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を持つ場合、ステップ（ｂ）の切断反応で３’ターゲッティング部位は５’タギング部位とともに部分的に切断される。また、重なる配列は３’ターゲッティング部位のうち所望の特定位置が切断されるようにする。

本発明の一実現例によれば、上流プライマーはそれの伸長鎖を通じて５’ヌクレアーゼ活性を持つ上記酵素による上記ＰＴＯの切断を誘導する。

上流オリゴヌクレオチドがターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯの切断を誘導して、ＰＴＯの５’タギング部位又はＰＴＯの５’タギング部位の一部を含む断片が放出される限り、上流オリゴヌクレオチドによる切断反応に係る従来の技術は、本発明に適用されることができる。例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号、第７，３８１，５３２号及び米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号は本発明に応用することができる。

本発明の一実現例によれば、上記方法は、下流プライマーの存在下で行う。下流プライマーは、ＰＴＯにハイブリダイゼーションされるターゲット核酸配列を追加で生成させ、ターゲット検出の敏感度を向上する。

本発明の一実現例によれば、上流プライマー及び下流プライマーを使用する場合、上記プライマーの伸長のために鋳型依存的な核酸ポリメラーゼをさらに使用する。

本発明の一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチド（上流プライマー又は上流プローブ）、下流プライマー及び／又はＰＴＯの５’タギング部位は、本発明者によって開発された二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する。ＤＰＯ構造を有するオリゴヌクレオチドは、従来のプライマー及びプローブに比べてかなり改善したターゲット特異度を示す（参照 ＷＯ ２００６／０９５９８１； Ｃｈｕｎなど， Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ１９ ｇｅｎｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３５：６ｅ４０（２００７））。

本発明の好ましい一実現例によれば、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は、本発明者によって開発された変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する。変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造は、従来のプローブに比べてかなり改善したターゲット特異性を示す（参照 ＷＯ ２０１１／０２８０４１）。

ステップ（ｂ）：ＰＴＯ切断からの断片の放出
次に、ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に上記ステップ（ａ）の結果物を接触させる。上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされた上記ＰＴＯは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ上記酵素によって切断されて、上記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出する。

本明細書において使用される用語「ＰＴＯの切断のための条件」とは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によってターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯの切断が発生するのに十分な条件、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度、緩衝液、オリゴヌクレオチドの長さ及び配列、そして酵素を意味する。例えば、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素としてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが用いられる場合、ＰＴＯの切断のための条件はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２及び温度を含む。

ＰＴＯがターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされる場合、それの３’ターゲッティング部位はハイブリダイゼーションに関与するが、５’タギング部位はターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされずに一本鎖を形成する（参照：図２）。このように、一本鎖及び二本鎖の構造をいずれも含むオリゴヌクレオチドは、当業界に知られている多様な技術によって５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素を用いて切断されることができる。

ＰＴＯの切断位置は、上流オリゴヌクレオチド（上流プローブ又は上流プライマー）の種類、上流オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション位置及び切断条件によって多様になる（参照 米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号及び第７，３８１，５３２号又は米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号）。

本発明は、ＰＴＯの切断反応のために多数の従来の技術を用いることができ、５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出する。

総合すれば、ステップ（ｂ）の切断反応で三つの切断位置があり得る。第一の切断位置は、ＰＴＯのハイブリダイゼーション部位（３’ターゲッティング部位）と非ハイブリダイゼーション部位（５’タギング部位）との結合位置（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）である。第二の切断位置は、ＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から３’の方向に一部ヌクレオチド離隔した位置である。第二の切断位置は、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置することができる。第三の切断位置は、ＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から５’の方向に一部ヌクレオチド離隔した位置である。

本発明の一実現例によれば、上流プライマーが伸長されながら５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的なポリメラーゼによってＰＴＯの切断か開始される位置は、ＰＴＯ及びターゲット核酸配列間の二本鎖が開始される地点又はその開始地点から１〜３ヌクレオチド離隔した位置である。

したがって、本明細書において５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によるＰＴＯの切断を言及しながら使用される用語「ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片」は、（ｉ）５’タギング部位、（ｉｉ）５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部、及び（ｉｉｉ）５’タギング部位の一部を含む意味で使用される。また、本明細書において用語「ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片」は、「ＰＴＯ断片」と表現される。

一実現例によれば、ＰＴＯは５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による切断に対して耐性を持つ１つのブロッカーを含むブロッカー部位を持ち、上記ブロッカー部位は初期切断位置及び／又は連続的な切断を調節するのに用いられる。

一実現例によれば、ＰＴＯはブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）として５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による切断に対して耐性を持つ少なくとも１個のヌクレオチドを含むブロッカー部位を持つ。

例えば、ＰＴＯのハイブリダイゼーション部位（３’ターゲッティング部位）と非ハイブリダイゼーション部位（５’タギング部位）との結合位置（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）で切断を誘導するために、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はブロッカーでブロッキングされることができる。

ブロッカー部位に含まれるブロッカーの個数は制限されず、１〜１０、２〜１０、３〜８又は３〜６のブロッカーを含む。プローブに存在するブロッカーは連続的又は不連続的な方式で存在することができ、好ましくは連続的な方式である。ブロッカーとしてのヌクレオチド、すなわち５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を持つ骨格を含むヌクレオチドは、当業界に知られているいずれのものも含む。例えば、上記ヌクレオチドは、多様なホスホロチオエート結合、ホスホネート結合、ホスホロアミダート結合及び２’−炭水化物修飾を含む。本発明の一実現例によれば、５’→３’エキソヌクレアーゼに対して耐性を持つ骨格を含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホトリエステル結合、アリールホスホトリステル結合、アルキルホスホネート結合、アリールホスホネート結合、ハイドロゲンホスホネート結合、アルキルホスホロアミダート結合、アリールホスホロアミダート結合、ホスホロセレナート結合、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、２’−Ｏ−アリル修飾、２’−Ｏ−ブチル修飾、α−アノメリックオリゴデオキシヌクレオチド及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）修飾である。

一実現例によれば、ブロッカーとしてヌクレオチドはＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｌｃｅｉｃ ａｃｉｄ）を含む。

本明細書においてＰＴＯの５’タギング部位の一部、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部及びＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部のように、ＰＴＯ又はＣＴＯを言及しながら使用される用語「一部（ｐａｒｔ）」とは、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０又は１〜５ヌクレオチドで構成されたヌクレオチド配列を意味し、好ましくは１、２、３又は４ヌクレオチドである。

一実現例によれば、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素は５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼ又はＦＥＮヌクレアーゼであり、好ましくは５’ヌクレアーゼ活性を持つ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ又はＦＥＮヌクレアーゼである。

本発明に好適な５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼは、多様なバクテリア種から得た熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これはＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ， Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ， Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ， Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。特定の実現例において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼである。

または、本発明は、ポリメラーゼ活性が減少するように変形された、５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。

使用されるＦＥＮ（ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）ヌクレアーゼは、５’フラップ特異的なヌクレアーゼ（５’ｆｌａｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅ）である。

本発明に好適なＦＥＮヌクレアーゼは多様なバクテリア種から得たＦＥＮ ヌクレアーゼを含み、これはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ， Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ， Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ， Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ， Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ｂｒｉｅｒｌｙｉ， Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ， Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ， Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ， Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ， Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ， Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｇｎｅｕｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ， Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ 及びＡｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓを含む。

ステップ（ａ）で上流プライマーを用いる場合、ＰＴＯの切断のための条件は上流プライマーの伸長反応を含むことができる。

一実現例によれば、ステップ（ａ）で上流プライマーを用い、上記上流プライマーの伸長のために鋳型依存的なポリメラーゼを用い、上記鋳型依存的なポリメラーゼは５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素と同一の酵素である。

または、ステップ（ａ）で上流プライマーを用い、上記上流プライマーの伸長のために鋳型依存的なポリメラーゼを用い、上記鋳型依存的なポリメラーゼは５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素と異なる酵素である。

ステップ（ｃ）：ＰＴＯから放出された断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーション
ＰＴＯから放出された断片は、ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイゼーションされる。

ＣＴＯは３’→５’の方向に、（ｉ）ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含む。

ＣＴＯは、ＰＴＯから放出された断片の伸長のための鋳型の役割をする。プライマーとしての役割をする上記断片はＣＴＯにハイブリダイゼーションされ、伸長されて二重体を形成する。

テンプレーティング部位がＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的な配列を持つ限り、いずれの配列でも含むことができる。また、テンプレーティング部位がＰＴＯから放出された断片の伸長のための鋳型の役割ができる限り、いずれの配列でも含むことができる。

上述したように、ＰＴＯの５’タギング部位を持つ断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされることができる。５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部を持つ断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされることができる。ＰＴＯの５’タギング部位の一部を持つ断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされることができる。

一方、ＰＴＯの切断位置を予想することでＣＴＯのキャプチャリング部位をデザインすることができる。例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位が５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインする場合、５’タギング部位の一部を持つ断片又は５’タギング部位を持つ断片はキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされることができ、その後、伸長される。５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部を含む断片が放出される場合、上記断片は５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされたＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされることができ、上記断片の３’末端部位にミスマッチヌクレオチドが存在するにもかかわらず、成功的に伸長されることができる。これはプライマーの３’末端が一部のミスマッチヌクレオチド（例えば、１〜３ミスマッチヌクレオチド）を含むにもかかわらず、プライマーが反応条件によって伸長されることができるからだ。

５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部を含む断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部は上記切断された３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なヌクレオチド配列を持つようにデザインすることで、ミスマッチヌクレオチドに係る問題を解決することができる。

一実現例において、切断された３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部のヌクレオチド配列は、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位上の予想される切断位置によって選択されることができる。切断された３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部のヌクレオチド配列は、１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチド又は１〜３ヌクレオチドの長さを持つことができる。

ＣＴＯの３’末端は断片とのハイブリダイゼーションに含まれない追加のヌクレオチドを含むことができる。また、ＣＴＯが上記断片と安定してハイブリダイゼーションされる限り、ＣＴＯのキャプチャリング部位は上記断片の一部（例えば、断片の３’末端部位を含む断片の一部）にのみ相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。

本明細書において使用される用語「５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位」は、上述したようにＣＴＯのキャプチャリング部位の多様なデザイン及び構成を含んで説明する。

ＣＴＯは、ヘアピン構造を持つようにデザインされることができる。

ＣＴＯの長さは多様であってもよい。例えば、ＣＴＯは、７〜１０００ヌクレオチド、７〜５００ヌクレオチド、７〜３００ヌクレオチド、７〜１００ヌクレオチド、７〜８０ヌクレオチド、７〜６０ヌクレオチド、７〜４０ヌクレオチド、１５〜１０００ヌクレオチド、１５〜５００ヌクレオチド、１５〜３００ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、２０〜１０００ヌクレオチド、２０〜５００ヌクレオチド、２０〜３００ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド、３０〜１０００ヌクレオチド、３０〜５００ヌクレオチド、３０〜３００ヌクレオチド、３０〜１００ヌクレオチド、３０〜８０ヌクレオチド、３０〜６０ヌクレオチド又は３０〜４０ヌクレオチドの長さである。ＣＴＯのキャプチャリング部位は、ＰＴＯから放出された断片に特異的にハイブリダイゼーションされる限り、いずれの長さであってもよい。例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５〜１００ヌクレオチド、５〜６０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド又は１５〜２０ヌクレオチドの長さを持つことができる。また、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、ＰＴＯから放出された断片の伸長反応で鋳型の役割ができる限り、いずれの長さであってもよい。例えば、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、１〜９００ヌクレオチド、１〜４００ヌクレオチド、１〜３００ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜８０ヌクレオチド、１〜６０ヌクレオチド、１〜４０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド、２〜９００ヌクレオチド、２〜４００ヌクレオチド、２〜３００ヌクレオチド、２〜１００ヌクレオチド、２〜８０ヌクレオチド、２〜６０ヌクレオチド、２〜４０ヌクレオチド、２〜２０ヌクレオチド、５〜９００ヌクレオチド、５〜４００ヌクレオチド、５〜３００ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜８０ヌクレオチド、５〜６０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、１０〜９００ヌクレオチド、１０〜４００ヌクレオチド、１０〜３００ヌクレオチド、１５〜９００ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド又は１５〜２０ヌクレオチドの長さを持つことができる。

ＣＴＯの３’末端は３’−ＯＨターミナルを持つことができる。特定の実現例において、ＣＴＯの３’末端はそれの伸長が防止されるようにブロッキングされる。ＣＴＯの非伸長ブロッキングは、従来の方法によって達成されることができる。例えば、ブロッキングはＣＴＯの最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にビオチン、標識、リン酸基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート又はアルカンジオール残基のような化学的部分（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して行うことができる。または、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか又はジデオキシヌクレオチドのように３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを用いて行うことができる。

ＰＴＯから放出された断片はＣＴＯとハイブリダイゼーションされ、断片の伸長に適した形態を提供する。また、非切断ＰＴＯがそれの５’タギング部位を通じてＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされても、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位はＣＴＯにハイブリダイゼーションされず、伸長二重体の形成が防止される。

ステップ（ｃ）でのハイブリダイゼーションは、ステップ（ａ）でのハイブリダイゼーションに関する説明を参照して詳細に説明されることができる。

ステップ（ｄ）：断片の伸長
鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及びステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行う。ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた断片は伸長され、ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な伸長配列を含む伸長鎖を形成し、これによって伸長二重体が形成される。一方、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた非切断ＰＴＯは伸長されず、これによって伸長二重体も形成されない。

本明細書において使用される用語「伸長二重体」とは、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた断片が鋳型依存的な核酸ポリメラーゼとＣＴＯのテンプレーティング部位を鋳型として用いて伸長される伸長反応によって形成された二重体を意味する。

本明細書において用語断片を言及しながら使用される用語「伸長鎖（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｔｒａｎｄ）」とは、断片とこれの伸長配列を含む配列を意味する。

本明細書において用語断片を言及しながら使用される用語「伸長配列（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、伸長鎖で断片を除いた新しく伸長された配列のみを意味する。

ステップ（ｄ）で用いられる鋳型依存的な核酸ポリメラーゼはいずれの核酸ポリメラーゼも含まれ、たとえば、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩの「クレノウ」断片、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びバクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを含む。好ましくは、ポリメラーゼは多様なバクテリア種から得ることができる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これはＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ， Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ 及びＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ， Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ， Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ ａｎｄ Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。特に、鋳型依存的な核酸ポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼである。

本発明の一実現例によれば、ステップ（ｂ）で用いられる５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素と、ステップ（ｄ）の鋳型依存的な核酸ポリメラーゼとは同一の酵素である。より好ましくは、ステップ（ｂ）で用いられる５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素、上流プライマーを伸長するための鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及びステップ（ｄ）の鋳型依存的な核酸ポリメラーゼは同一の酵素である。

ステップ（ｅ）：伸長鎖とＳＯとのハイブリダイゼーション
上記伸長反応に続き、上記伸長鎖とＳＯ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせて伸長鎖／ＳＯハイブリッドを生成させる。

上記伸長鎖とハイブリダイゼーションされる上記ＳＯは、上記伸長鎖に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列及び少なくとも１つの標識を含む。

本明細書において用語ＳＯを言及しながら使用される用語「伸長鎖に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列」とは、特定の厳しい条件の下で上記伸長鎖と二本鎖を形成して伸長鎖とともにハイブリッドを形成することができる配列を意味する。

一実現例によれば、上記ＳＯは、それの全体又は一部の配列に上記伸長配列にハイブリダイゼーション可能な配列を含むことができる。

本明細書において用語ＳＯを言及しながら使用される用語「伸長配列にハイブリダイゼーション可能な配列」とは、ＳＯ配列のうち上記伸長配列と二本鎖を形成するのに関与する特定の配列を意味する。

例えば、上記ＳＯは、それの配列全体的に上記伸長配列にハイブリダイゼーション可能な配列を含むことができる。または、上記ステップ（ｅ）で上記ＳＯが上記伸長鎖と二本鎖を形成することができる限り、上記ＳＯの一部位は上記伸長配列に相補的な配列を含むことができ（すなわち、上記部位は上記伸長配列にハイブリダイゼーション可能な配列である）、他の部位は上記ＰＴＯ断片に相補的な配列を含むことができる。

特に、上記ＳＯは、それの配列全体的に上記伸長配列にハイブリダイゼーション可能な配列を含むことができる。

上記伸長鎖で上記ＰＴＯ断片に該当する部位にのみ相補的な配列を含むＳＯが使用される場合、核酸分解酵素に対する切断位置はそれのハイブリダイゼーションによって提供され、非切断ＰＴＯの５’タギング部位とＳＯとのハイブリッドは切断されて非ターゲットシグナルを生成することができる。しかし、上記ＳＯが上記伸長反応で新しく合成された上記伸長配列にハイブリダイゼーション可能な配列を含むようにデザインされる場合、非ターゲットシグナルを排除させることができる。例えば、核酸分解酵素に対する切断位置は、上記ＳＯの少なくとも一位置が上記ＳＯ／伸長鎖ハイブリッドで新しく合成された上記伸長配列にハイブリダイゼーションされるときにのみ提供されるようにデザインされることができる。上記の場合において、上記ＳＯが非切断ＰＴＯにハイブリダイゼーションされる場合、核酸分解酵素に対する切断位置は提供されないこともある。

特定の実現例において、上記ＳＯの配列は非切断ＰＴＯとハイブリッドを形成しないように選択される。例えば、上記ＳＯと非切断ＰＴＯの上記５’タギング部位との間の相補性は、９０％、７０％、５０％、３０％又は２０％以下であってもよく、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成に対するハイブリダイゼーション条件に依存的に変わることができる。

ＳＯの長さはいずれの長さであってもよい。例えば、５〜１００ヌクレオチド、５〜８０ヌクレオチド、５〜６０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド、５〜１０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜８０ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド又は２０〜３０ヌクレオチドの長さを持つことができる。

ＳＯはヘアピン構造を持つことができる。特定の実現例において、ＳＯは伸長されないようにそれの３’末端がブロッキングされている。または、ブロッキングされていない３’−ＯＨ基を持つＳＯは伸長されることができる。

本発明の一実現例において、上記ＳＯはそれの５’方向に上記伸長鎖に非相補的な配列を持つ５’タギング部位を含む５’末端がタギングされたＳＯ（５’−ｔａｇｇｅｄ ＳＯ）である。上記伸長鎖に非相補的な配列を持つ上記部位（５’タギング部位）は、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、１５〜５０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド又は１５〜２０ヌクレオチドの長さを持つことができる。

特定の実現例において、上記ステップ（ｅ）のハイブリダイゼーションは、上記ＳＯの上流に位置した上流オリゴヌクレオチドの存在下で行われる。上記上流オリゴヌクレオチドは上記伸長鎖に相補的な配列を含み、上記ＳＯの上流で上記伸長鎖とハイブリダイゼーションされる。他の一実現例において、上記上流オリゴヌクレオチドは、上流プライマー又は上流プローブである。

上記伸長鎖と上記ＳＯとのハイブリダイゼーションは５’ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ又は制限酵素のような核酸分解酵素に対する切断位置を生成させる。上記ＳＯ上で上記切断位置は、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドが形成されるときにのみ生成される。

一実現例において、上記ステップ（ｅ）で上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成は、５’ヌクレアーゼに対する切断位置を生成させる。上記ＳＯ上で上記切断位置は上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドが形成されるときにのみ生成され、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯは、５’ヌクレアーゼによって５’→３’方向に切断される。

一実現例において、上記ＳＯはＲＮＡ配列を含み、上記ステップ（ｅ）で上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション二重体及びリボヌクレアーゼに対する切断位置を生成させる。

一実現例において、上記ＳＯは上記切断酵素によって認識される配列を含み、上記ステップ（ｅ）で上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成は、上記制限酵素に対する切断位置を生成させる。

特定の実現例において、上記ステップ（ｅ）で上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成は、ＤＮＡ二重体、ＲＮＡ二重体又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション二重体を切断することができる核酸分解酵素に対する切断位置を生成させる。

上記ＰＴＯ断片の上記伸長鎖及び／又は上記ＳＯは、核酸分解酵素に対する切断位置が所望の類型で導入されるようにデザインされることができる。

ＤＮＡ二重体上で作用する核酸分解酵素（例えば、５’ヌクレアーゼ及び制限酵素）に対する切断位置を生成させる場合、それぞれＤＮＡ分子で構成された上記ＰＴＯ断片の伸長鎖及び上記ＳＯが使用される。ＤＮＡ分子で構成された上記ＰＴＯ断片の伸長鎖は、ＤＮＡ分子で構成された上記ＳＯとハイブリダイゼーションされて、ＤＮＡ二重体上で作用する核酸分解酵素（例えば、５’ヌクレアーゼ及び制限酵素）に対する切断位置を生成する。

本発明において制限酵素を使用する場合、上記ＰＴＯ断片の伸長鎖及び上記ＳＯは、上記制限酵素によって認識される配列を含む。上記制限酵素に対する切断位置を持つ上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドは上記制限酵素によって切断されて、切断された断片を生成し、これはターゲット核酸配列の存在を示す。

ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション二重体上で作用する核酸分解酵素（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）に対する切断位置を生成させる場合、特にＤＮＡ分子で構成された上記ＰＴＯ断片の伸長鎖及びＲＮＡ分子で構成された上記ＳＯが使用される。一実現例において、上記ＳＯは１〜１０リボヌクレオチドを含む。

ＤＮＡ分子で構成された上記ＰＴＯ断片の伸長鎖は、ＲＮＡ分子で構成された上記ＳＯとハイブリダイゼーションされて、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション二重体上で作用する核酸分解酵素（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）に対する切断位置を生成する。

一実現例において、本発明の方法は、上記ステップ（ｄ）と（ｅ）との間に変性ステップをさらに含む。

上記伸長鎖と上記ＣＴＯとの伸長二重体の生成は、上記ＳＯと上記伸長鎖との低いハイブリダイゼーション効率の原因になることができる。本発明において上記伸長鎖量の増加は、上記伸長鎖と上記ＳＯとのハイブリダイゼーションだけでなく、連続的な切断反応の発生可能性を増加させることができる。

一実現例によれば、上記ＰＴＯの量は上記ＣＴＯの量より多く（例えば、１．０以上のＣＴＯに対するＰＴＯのモル比）、上記ステップ（ａ）〜（ｆ）は繰り返しサイクルの間に変性過程を含んで繰り返される。このような場合、上記伸長鎖の数は増加するのに対し、上記ＣＴＯの数は一定である。よって、上記ＣＴＯとハイブリダイゼーションされない自由伸長鎖は、上記伸長鎖と上記ＣＴＯとで伸長二重体を形成するようにする条件の下でも存在することができる。上記ＳＯは、上記ＣＴＯに妨げられず上記自由伸長鎖と効果的にハイブリダイゼーションされることができる。

上記ＳＯは、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断反応の発生（すなわち、ターゲット核酸配列の存在）を示すシグナルを提供することができる少なくとも１つの標識で標識される。

ステップ（ｆ）：伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断
上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯは核酸分解酵素を使用して切断されて、上記ＳＯの切断された断片を生成する。本明細書において上記ステップ（ｂ）の切断反応は第１の切断反応と呼び、上記ステップ（ｆ）の切断反応は第２の切断反応と呼ぶ。

上記ステップ（ｅ）のハイブリダイゼーションによって生成された上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドに核酸分解酵素に対する作用位置が生成されるため、上記第２の切断反応が起こることができる。

本発明の一実現例において、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯの切断された断片は一本鎖又は二本鎖であってもよく、上記切断は少なくとも２個の断片を生成することができる。例えば、制限酵素による上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯの切断は二本鎖状態の２つの切断された断片を生成し、上記二本鎖の断片は反応条件によって一本鎖の形態に解離されることができる。５’ヌクレアーゼを用いた切断反応で一本鎖の断片が生成されることができる。

上記第２の切断反応に使用される核酸分解酵素は、当業界に知られているいずれの酵素も含まれることができる。

特定の実現例において、上記第２の切断反応に使用される核酸分解酵素は５’ヌクレアーゼ、制限酵素及びリボヌクレアーゼを含み、特に、熱安定性５’ヌクレアーゼ、制限酵素及びリボヌクレアーゼを含む。

他の実現例において、上記第２の切断反応に使用される核酸分解酵素は、二重体分子上で特異的に作用する核酸分解酵素を含む。

特定の実現例において、上記核酸分解酵素は５’ヌクレアーゼであり、上記ステップ（ｅ）で上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成は上記５’ヌクレアーゼに対する切断位置を生成し、それによって上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯは５’→３’の方向に５’ヌクレアーゼによって切断される。特に、上記５’ヌクレアーゼは、鋳型依存的なＤＮＡポリメラーゼ又は５’ヌクレアーゼ活性を持つＦＥＮヌクレアーゼである。

核酸分解酵素のうち、上記５’ヌクレアーゼは５’→３’方向にＤＮＡ二重体を切断する。特定の実現例において、上記５’ヌクレアーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、５’→３’エンドヌクレアーゼ活性又は両方の活性を持つ。図２及び図５に示すように、上記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされたＰＴＯの切断によって生成されたＰＴＯ断片は上記ＣＴＯとハイブリダイゼーションされ、その後に伸長されて伸長鎖を生成し、上記ＳＯは上記伸長鎖とハイブリダイゼーションされて上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドを生成する。上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯの５’末端部位は５’ヌクレアーゼによって切断されて、ターゲット核酸配列の存在を示す切断された断片を生成する。

５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的なＤＮＡポリメラーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持ち、一部のポリメラーゼでは５’→３’エンドヌクレアーゼ活性も持つ。

５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的なＤＮＡポリメラーゼは、上記ステップ（ｂ）で上流オリゴヌクレオチド依存的な切断反応を誘導することができる（参照：ＵＳＰ ５，２１０，０１５）。また、５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的なＤＮＡポリメラーゼは、上流オリゴヌクレオチド独立的な切断反応を誘導することができる（参照：ｌａｗｙｅｒなど、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １９９３， ２：２７５−２８７ ａｎｄ ＷＯ ２００８／０１１００４）。

本発明の一実現例において、上記５’ヌクレアーゼは５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的なＤＮＡポリメラーゼであり、特に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。上記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、上記ステップ（ｂ）での説明を参照して詳しく説明されることができる。好ましくは、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯ切断のための５’ヌクレアーゼはＴａｑポリメラーゼである。

本発明の一実現例において、上記ステップ（ｂ）の５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素及び上記ステップ（ｆ）の核酸分解酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的なＤＮＡポリメラーゼである。

特定の実現例において、上記５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的なＤＮＡポリメラーゼは、上記ステップ（ｂ）の上流オリゴヌクレオチド独立的な切断反応だけでなく、上記ステップ（ｅ）の上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドを切断する上流オリゴヌクレオチド独立的な切断反応を誘導することができる。

一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的なＤＮＡポリメラーゼによる上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断は、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドに存在する標識の位置又は標識の連結種類によって影響されることができる。特に、標識が上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯの５’末端に連結された場合、上記標識が特にカーボンスペーサーを通じて上記ＳＯの５’末端のリン酸基に連結されると、５’ヌクレアーゼ活性を持つ上記鋳型依存的なＤＮＡポリメラーゼによる上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断はより効果的になることができる。上記標識が上記ＳＯの５’末端塩基に連結されるか、上記カーボンスペーサーが使用されない場合、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断は発生しないこともある。

核酸分解酵素のうち上記切断酵素は、上記ステップ（ｅ）で上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成によって生成される制限酵素に対する切断位置を切断する。上記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされたＰＴＯ切断によって生成された上記ＰＴＯ断片は、上記ＣＴＯ（上記制限酵素によって認識される配列を含む）とハイブリダイゼーションされた後、伸長されて上記ＰＴＯ断片の伸長配列に上記制限酵素の認識配列が導入され、上記制限酵素によって認識される配列を含む上記ＳＯは上記ＰＴＯ断片の伸長鎖とハイブリダイゼーションされて、上記制限酵素に対する切断位置を生成する。上記制限酵素は、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドをエンドヌクレアーゼ的（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）に切断して、上記ターゲット核酸配列の存在を示す上記切断された断片を生成する。

一実現例によれば、上記制限酵素は、二重体の特定配列を特異的に認識して切断する制限酵素であり、特に熱安定性制限酵素である。当業界に公知されている多様な制限酵素が使用されることができる。

一実現例によれば、上記核酸分解酵素はリボヌクレアーゼであり、上記ＳＯはＲＮＡ配列を含み、上記ステップ（ｅ）で上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成は、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重体を形成させて上記リボヌクレアーゼに対する切断位置を生成する。上記リボヌクレアーゼに対する上記切断位置は、上記ステップ（ｆ）でリボヌクレアーゼによって切断されて上記ターゲット核酸配列の存在を示す切断された断片を形成する。

一実現例によれば、本発明で使用されるリボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ Ｈ又はＥｘｏ ＩＩＩである。

ＲＮａｓｅ Ｈは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション二重体のＲＮＡ部位を切断することができるエンドリボヌクレアーゼの１つである。ＲＮａｓｅ Ｈが使用される場合、上記ＳＯはＲＮＡ分子を含むことができる。上記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされるＰＴＯの切断によって生成された上記ＰＴＯ断片は、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされた後に伸長され、上記ＳＯは上記ＰＴＯ断片の伸長鎖とハイブリダイゼーションされる。上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯで上記ＲＮＡ分子はエンドヌクレアーゼ的に切断されて、上記ターゲット核酸配列の存在を示す切断された断片を形成する。

Ｅｘｏ ＩＩＩはＲＮａｓｅ活性を持つものと報告されている（Ｍｏｌ ＣＤなど， Ｎａｔｕｒｅ ３７４（６５２０）：３８１３８６（１９９５））。Ｅｘｏ ＩＩＩが使用される場合、上記ターゲット核酸配列の存在を示す切断された断片は、ＲＮａｓｅ Ｈと同じ方式で形成される。

上記ＳＯがＲＮＡ分子を含む場合、上記ＳＯはＲＮＡ分子を全体又は部分的に含む。

上記ステップ（ｆ）は、上記ＳＯに対する上流オリゴヌクレオチドの存在又は不在下で行われることができる。このような場合、上記ＳＯに対する上流オリゴヌクレオチドは、上流プライマー又は上流プローブである。

特定の実現例において、上記ステップ（ｆ）は、上記ＳＯに対する上流オリゴヌクレオチドの存在下で行われる。

本発明の一実現例において、上記核酸分解酵素は５’ヌクレアーゼであり、上記ステップ（ｆ）は上記ＳＯの上流に位置する上流オリゴヌクレオチドの存在下で行われ、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯは、上記上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖に依存的な５’ヌクレアーゼの核酸分解活性によって切断される。

特定の実現例において、上記核酸分解酵素は熱安定性核酸分解酵素である。

図２及び図６は、上記ＳＯに対する上流オリゴヌクレオチドの不在下で行われる本発明の特定の実現例を図式的に示し、図３〜５は、上記ＳＯに対する上流オリゴヌクレオチドの存在下で行われる本発明の特定の実現例を示す。

一実現例によれば、上記鋳型依存的なＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性による上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの上流オリゴヌクレオチド独立的な切断は、上記鋳型依存的なＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性による上流オリゴヌクレオチド依存的な切断より低い切断効率を持つことができる。

上記ＳＯに対する上流オリゴヌクレオチドの細部内容は、ステップ（ａ）で上記ＰＴＯに対する上流オリゴヌクレオシドの内容を参照して記述されることができる。

一実現例において、リボヌクレアーゼ又は制限酵素が核酸分解酵素として使用される場合、上記ＳＯに対する上流オリゴヌクレオチド（特に、上流プライマー）が使用されることができる。このような場合、５’ヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼは、単に上記上流プライマーの伸長のために使用されることができる。

本発明の一実現例において、上記ＳＯは、５’方向に上記伸長鎖に非相補的な配列を含む５’タギング部位を含む。このような場合、上記ＳＯは５’→３’の方向に、（ｉ）上記伸長鎖に非相補的な配列を含む５’タギング部位、及び（ｉｉ）上記伸長鎖に非相補的な配列を含む３’ハイブリダイゼーション部位を含む。

上記ＳＯの５’タギング部位が上記ＣＴＯ（例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位）に相補的なヌクレオチド配列を含む場合、５’ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ又は制限酵素による上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯ切断は、上記ＳＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出し、上記ＳＯから放出された上記断片は、上記ＣＴＯとハイブリダイゼーションされて伸長されることができる。よって、伸長鎖は追加で生成される。

本発明の一実現例において、核酸分解酵素（特に、制限酵素）による上記伸長鎖の生成及び切断は別途の容器で行われる。

ステップ（ｇ）：ターゲット核酸配列の存在を示す伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断の検出
上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断反応に続き、上記ターゲット核酸配列の存在を分析するために上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断反応の発生を検出する。

一実現例によれば、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断反応発生の検出は、上記ＳＯに連結された標識から提供されるシグナルを測定することで行う。

本発明で採択されたシグナリングシステムは、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断とシグナル生成とを直接関連付けたことに特徴がある。一実現例によれば、本発明で使用されたシグナリングシステムは、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断時にシグナルを変化させる。ターゲット核酸配列が存在し、ＰＴＯが切断される場合にのみ上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断が発生するため、本発明は、上記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを提供する。要求に応じて、本発明はリアルタイム方式で行うことができる。

シグナル発生と上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断とを直接関連付けるために、本発明は、上記ＳＯに連結された少なくとも１つの標識を用いてシグナルを提供する。

特定の実現例において、本発明で使用する上記標識システムは相互作用的な二重標識又は単一標識である。

（ｉ） 相互作用的な二重標識
相互作用的な標識システムは、ドナー分子及びアクセプター分子間でエネルギーが非放射性（ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｉｖｅｌｙ）で伝達されるシグナル発生システムである。相互作用的な標識システムの代表的な例として、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（ドナー分子）及びクエンチャー分子（アクセプター分子）を含む。ＦＲＥＴで、エネルギー供与体は蛍光性であるが、エネルギー受容体は蛍光性又は非蛍光性であってもよい。相互作用的な標識システムの他の形態において、エネルギー供与体は非蛍光性、例えば発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は蛍光性である。相互作用的な標識システムのまた他の形態において、エネルギー供与体は発光性（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）、例えば、生物発光性、化学発光性又は電気化学発光性であり、受容体は蛍光性である。ドナー分子及びアクセプター分子は、本発明においてそれぞれレポーター分子及びクエンチャー分子と説明されることができる。

本発明の一実現例によれば、伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断発生（すなわち、ターゲット核酸配列の存在）を示すシグナルは相互作用的な標識システムによって発生され、特にＦＲＥＴ標識システム（すなわち、相互作用的な二重標識システム）によって発生される。

一実現例によれば、上記ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識を持ち、上記核酸分解酵素に対する切断位置は上記ＳＯに連結された上記レポーター分子と上記クエンチャー分子との間に位置し、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの上記ＳＯの切断は、上記レポーター分子と上記クエンチャー分子とを互いに分離させ、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯに対する切断反応の発生は、上記標識からのシグナルを測定することで検出する。

特定の実現例において、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの生成の前に上記クエンチャー分子は上記レポーター分子からシグナルをクエンチングできる位置に位置する。

本発明において上記相互作用的な標識システムは、液相及び固相で用いられる。

上記相互作用的な標識システムが用いられる場合、上記ステップ（ｅ）で生成される切断位置は、５’ヌクレアーゼ、制限酵素又はリボヌクレアーゼに対する切断位置である。

本発明において相互作用的な二重標識の原理は、図２ないし５に図式的に示す。ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされたＰＴＯからＰＴＯ断片が放出された後、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされ伸長されて、ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な伸長配列を含む伸長鎖を形成する。上記ＳＯは上記伸長鎖とハイブリダイゼーションされ、核酸分解酵素によって切断される。このとき、上記ＳＯに連結されたレポーター分子とクエンチャー分子とは互いに分離され、クエンチャー分子によるクエンチングが防止されてシグナル変化（例えば、レポーター分子からシグナル増加）が誘導され、最終的に検出可能なシグナルを提供する。

上記ＳＯ上で二重標識は、上記伸長鎖とＳＯとのハイブリダイゼーション時に、クエンチングしない（ｕｎｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）位置に位置されることができる。連続的な切断反応によって上記ＳＯ上で上記レポーターとクエンチャーとを互いに分離することは、クエンチングを完全に軽減させることができる。その後、上記標識された断片からシグナルを測定して上記切断反応の発生を検出する。

上記ターゲット核酸配列の不在時に、上記ＰＴＯは切断されず、上記切断されていないＰＴＯは伸長されないが、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされる。このような場合、上記非ハイブリダイゼーションＳＯに連結された上記レポーター分子とクエンチャー分子とは互いに隣接して、上記クエンチャー分子が上記レポーター分子からのシグナルをクエンチングできるようにする。

上記ターゲット核酸配列は、上述した原理によって検出されることができる。

上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成の前に、上記クエンチャー分子は上記レポーター分子からシグナルをクエンチングできる位置に位置する。特定の実現例において、上記レポーター分子とクエンチャー分子とは、上記ＳＯの長さによって互いに隣接して位置するか、ランダムコイル及びヘアピン構造のようなＳＯの形態的構造の形成によって互いに隣接して位置する。

上記核酸分解酵素（例えば、５’ヌクレアーゼ）は、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯの５’末端部位を切断して上記レポーター分子を放出することができ、それによって上記レポーター分子からシグナル変化を誘導する。上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断発生は、上記ターゲット核酸配列の存在決定のための蛍光シグナルを測定することで検出することができる。

上記クエンチャー分子が蛍光である場合、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断発生は、上記蛍光クエンチャーからシグナルを測定することで検出することができる。

一実現例によれば、上記レポーター分子及びクエンチャー分子のうち少なくとも１つは上記ＳＯの５’末端に連結されている。特定の実現例において、上記レポーター分子及びクエンチャー分子のうち１つは上記ＳＯの５’末端に連結されており、他の１つは３’末端に連結されている。

一実現例によれば、上記ＳＯ上で上記レポーター分子及びクエンチャー分子のうち１つはそれの５’末端又はそれの５’末端から１〜１０ヌクレオチド離隔して位置し、他の１つは上記伸長鎖とＳＯとのハイブリダイゼーションの前には上記レポーター分子からシグナルをクエンチングするように位置する。

一実現例によれば、上記ＳＯ上で上記レポーター分子及びクエンチャー分子のうち１つはそれの３’末端又はそれの３’末端から１〜１０ヌクレオチド離隔して位置し、他の１つは上記伸長鎖とＳＯとのハイブリダイゼーションの前には上記レポーター分子からシグナルをクエンチングするように位置する。

例えば、上記ＳＯ上で上記レポーター分子はそれの５’末端又はそれの５’末端から１〜５ヌクレオチド離隔して位置することができ、上記クエンチャー分子は上記レポーター分子から５〜８０ヌクレオチド離隔して位置することができる。

一実現例によれば、上記相互作用的な二重標識は上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成に先立ってクエンチング現象を維持するのに十分な位置に位置し、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断によってクエンチングしないことを誘導する。

上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断中にリアルタイムシグナル生成を考慮するとき、上記レポーター分子とクエンチャー分子とは互いに８０ヌクレオチド以内、６０ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、２５ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内又は１０ヌクレオチド以内で離隔して位置することができる。一実現例によれば、上記レポーター分子とクエンチャー分子とは少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド又は少なくとも１５ヌクレオチド離隔する。

また、標識（例えば、レポーター分子）を持つ切断された断片が生成されるため、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断発生はより柔軟か便利な条件（例えば、高い厳しい条件又は固相基質上で洗浄後の条件）下で上記切断された断片に連結された標識からシグナルを直接検出することで分析することができる。

一実現例によれば、上記固定化されたＳＯに連結された相互作用的な二重標識のうち１つは、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断後に固相基質上に残る。

一実現例によれば、固相基質上に固定化された上記ＳＯが相互作用的な二重標識を持ち、５’ヌクレアーゼが核酸分解酵素として使用される場合、上記ハイブリッドからＳＯ断片を解離する適当な条件を付与するか上記ＳＯの内部ヌクレオチドに５’ヌクレアーゼ活性に対して耐性（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性又はそれの塩基上に標識を持つヌクレオチドに対して耐性を持つ骨格を含むヌクレオチド）を付与することで、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断後に上記相互作用的な二重標識のうち１つは固相基質上に確実に残っていることができる。

一実現例によれば、５’ヌクレアーゼ活性に対する耐性は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を持つ骨格を含むヌクレオチドによって付与され、上記ヌクレオチドは、多様なホスホロチオエート結合、ホスホネート結合、ホスホロアミダート結合及び２’−炭水化物修飾を含み、特に、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホトリエステル結合、アリールホスホトリステル結合、アルキルホスホネート結合、アリールホスホネート結合、ハイドロゲンホスホネート結合、アルキルホスホロアミダート結合、アリールホスホロアミダート結合、ホスホロセレナート結合、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、２’−Ｏ−アリル修飾、２’−Ｏ−ブチル修飾、α−アノメリックオリゴデオキシヌクレオチド及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）修飾を含む。

上記ＳＯが上記伸長鎖に非相補的な５’タギング部位を含む場合、レポーター又はクエンチャー分子は、上記切断位置を考慮して上記５’タギング部位に位置することができる。

本発明において有用なレポーター分子及びクエンチャー分子は、当業界に知られているいずれの分子でも含むことができる。その例は次のとおりである： Ｃｙ２^ＴＭ （５０６）， ＹＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１ （５０９）， ＹＯＹＯ^ＴＭ−１ （５０９）， Ｃａｌｃｅｉｎ （５１７）， ＦＩＴＣ （５１８）， ＦｌｕｏｒＸ^ＴＭ （５１９）， Ａｌｅｘａ^ＴＭ （５２０）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０ （５２０）， Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ ５００ （５２２）， Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ ４８８ （５２４）， ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ^ＴＭ （５２５）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ （５２７）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３ （５２９）， Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ （５３１）， Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ （５３３）， ＴＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１ （５３３）， ＴＯＴＯ１ （５３３）， ＪＯＥ （５４８）， ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０ （５５０）， Ｄｉｌ （５６５）， ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ （５６８）， ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８ （５６８）， ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０ （５７０）， Ｃｙ３^ＴＭ （５７０）， Ａｌｅｘａ^ＴＭ ５４６ （５７０）， ＴＲＩＴＣ （５７２）， Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ^ＴＭ （５７５）， Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ （５７５）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ （５７５）， Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ^ＴＭ （５７６）， Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ （５８０）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ （５８０）， ＴＡＭＲＡ （５８２）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ^ＴＭ （５９０）， Ｃｙ３．５^ＴＭ （５９６）， ＲＯＸ （６０８）， Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｒｉｍｓｏｎ^ＴＭ （６１５）， Ａｌｅｘａ^ＴＭ ５９４ （６１５）， Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（６１５）， Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ （６２８）， ＹＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−３ （６３１）， ＹＯＹＯ^ＴＭ−３ （６３１）， Ｒｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ （６４２）， Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ （６４８）， ＴＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−３ （６６０）， ＴＯＴＯ３ （６６０）， ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５） （６６５）， Ｃｙ５^ＴＭ （６７０）， Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ （６７１）， Ｃｙ５．５ （６９４）， ＨＥＸ （５５６）， ＴＥＴ （５３６）， Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｌｕｅ （４４７）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０ （５４４）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０ （５５９）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０ （５９１）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０ （６１０）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５ （６３７）， ＦＡＭ （５２０）， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ （５２０）， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３ （５２０）， Ｐｕｌｓａｒ ６５０ （５６６）， Ｑｕａｓａｒ ５７０ （６６７）， Ｑｕａｓａｒ ６７０ （７０５）及びＱｕａｓａｒ ７０５ （６１０）。カッコの数字はナノメートル単位で表示した発光最大波長である。好ましくは、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ及びフルオレセイン基盤標識を含む。

好適なレポーター−クエンチャー対は多くの文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅ など， ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７１）； Ｗｈｉｔｅ など， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７０）； Ｂｅｒｌｍａｎ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７１）； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｃｏｌｏｒ ＡＮＤ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７６）； Ｂｉｓｈｏｐ， ｅｄｉｔｏｒ， Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ （Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９７２）； Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， １９９２）； Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ （Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９４９）； Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｒ． Ｐ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ６^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇ．， １９９６）； 米国特許第３，９９６，３４５号及び第４，３５１，７６０号。

本発明において、広範囲な波長又は特定波長の蛍光をクエンチングできる非蛍光ブラッククエンチャー分子（又はダーククエンチャー分子）が用いられることができるということは注目に値する。非蛍光ブラッククエンチャー分子の例は、ＢＨＱ及びＤＡＢＣＹＬである。

ＳＯに適用されるＦＲＥＴ標識で、レポーターはＦＲＥＴのドナーを含み、クエンチャーはＦＲＥＴの残りのパートナー（アクセプター）を含む。例えば、フルオレセイン色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｙｅ）はレポーターとして用いられ、ローダミン色素（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｄｙｅ）はクエンチャーとして用いられる。

上記標識は、従来の方法を通じてＳＯに連結されることができる。例えば、炭素原子を含むスペーサー（例えば、３−カーボンスペーサー、６−カーボンスペーサー又は１２−カーボンスペーサー）を通じてＳＯに連結される。

（ｉｉ）単一標識
また、本発明は、ターゲット核酸配列の存在を示す伸長鎖／ＳＯハイブリッドの発生に対するシグナルを提供する単一標識システムを用いて優秀に行われる。

上記単一標識は、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学的標識及び金属標識を含むが、これに限定されるものではない。特に、上記単一標識は蛍光標識を含む。

単一標識がオリゴヌクレオチドに連結されているかそれともオリゴヌクレオチドから放出されるかに依存的に、又は単一標識が無傷（ｉｎｔａｃｔ）のオリゴヌクレオチドに連結されているかそれとも上記オリゴヌクレオチドの断片に連結されているかに依存的に、異なるシグナルを示す単一標識が存在する。このような単一標識が使用される場合、本発明は液相でも伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断と同時に発生するシグナリングシステムを提供することができる。例えば、蛍光テルビウムキレートは、それがオリゴヌクレオチドに連結されているかそれともオリゴヌクレオチドから放出されるかに依存的に異なるシグナルを提供する（Ｎｕｒｍｉなど， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０００， Ｖｏｌ． ２８ Ｎｏ．８ ｅ２８）。他の例としては、上記単一標識が平面偏光による励起を通じて分極化された蛍光を放出する色素である場合、上記単一標識を含む切断された断片はＦＰ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）法を通じて検出することができる。放出された蛍光の分極化程度は、標識に連結された分子の運動によって影響される。通常、運動が速ければ分極化程度は低くなる（Ｌａｔｉｆなど， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １１：４３６−４４０， ２００１）。

特定の実現例において、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断に依存的に異なるシグナルを発生させることができる単一標識は、蛍光テルビウムキレート又は分極化された蛍光を放出する色素である。

上記ＳＯの切断で生成された断片が単一標識を含むようにシグナリングシステムがデザインされた場合、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断発生は上記標識された断片を用いることで効果的に検出することができる。特定の実現例において、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの切断発生は電気泳動上で標識された断片を検出することで便利に分析することができる。

本発明の一実現例において、上記ＳＯは単一標識を持ち、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯ切断は単一標識を持つ断片を生成し、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯ切断の発生は、上記単一標識された断片の放出を検出することで検出する。このような場合、上記ＳＯの切断に先立って上記単一標識から発生したシグナルは、上記ＳＯの切断後に上記単一標識から発生したシグナルと異なっており、上記シグナルの差は上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯ切断の発生を検出できるようにする。

一実現例によれば、上記単一標識は上記ＳＯの５’末端又は３’末端に連結される。

本発明において単一標識を使用する場合、本発明は固定化されたＳＯを使用して固相で効率的に行われる。一実現例によれば、上記ＳＯはそれの５’末端又は３’末端を通じて固相基質上に固定化される。

一実現例によれば、上記ＳＯはそれの５’末端又は３’末端を通じて固相基質の表面上に固定化され、上記ＳＯは単一標識を持ち、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯ切断は単一標識を持つ断片を生成させ、上記断片は固相基質上で放出され、それによってシグナル変化が上記固相基質上で発生して上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯ切断の発生を検出する。

上記ＳＯがそれの３’末端を通じて上記固相基質上に固定化される場合、上記単一標識は上記ＳＯの５’末端に連結され、上記ステップ（ｅ）で生成される上記切断位置は、５’−ヌクレアーゼ、制限酵素又はリボヌクレアーゼに対する切断位置である。

図６に示すように、上記ＰＴＯ断片の伸長鎖はそれの３’末端を通じて固相基質上に固定化されたＳＯとハイブリダイゼーションされて、５’ヌクレアーゼに対する切断位置を生成させる。上記５’ヌクレアーゼは上記切断位置を攻撃することで上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドを切断し、上記ＳＯの５’末端から蛍光レポーター分子を放出させる。ターゲット核酸配列が存在する場合、固定化されたＳＯを含むスポットは蛍光の減少又は消滅を示すのが観察される。ターゲット核酸配列がない場合、固定化されたＳＯを含むスポットで蛍光の減少又は消滅は観察されない。

特に、本発明が単一標識を使用して固相で行われる場合、一般的な蛍光標識を使用することができ、オリゴヌクレオチドに連結されているかそれともオリゴヌクレオチドから放出されるかに依存的に、又は無傷のオリゴヌクレオチドに連結されるかそれとも上記オリゴヌクレオチドの断片に連結されるかに依存的に、異なる強度を持つ蛍光シグナルを提供することができる特定の蛍光標識を必要としない。固相で上記伸長鎖／ＳＯハイブリッド切断の発生に依存的に差を示すシグナルは、固相で単一標識の残留を検出することで分析することができる。このような点で、本発明で単一標識の活用性（ｗｏｒｋａｂｉｌｉｔｙ）は固相で目立つ。

上述したように、シグナルの存在有無又はシグナル変化（シグナル強度の増加又は減少）は、上記第２の切断反応と同時発生的な方式で上記単一標識によって提供されてターゲット核酸配列の存在を検出する。

本発明において有用な単一蛍光標識の例は、上述したようにレポーター及びクエンチャー分子に関する説明を参照して説明することができる。

上記単一標識は、従来の方法によって上記ＳＯに連結されることができる。例えば、上記単一標識は炭素原子を含むスペーサー（例えば、３−カーボンスペーサー、６−カーボンスペーサー又は１２−カーボンスペーサー）を通じてＳＯに連結される。

特定の実現例において、上記ＳＯの単一標識は５’末端又は５’末端から１〜５ヌクレオチド離隔して位置する。または、上記単一標識は、上記ＳＯの３’末端又は３’末端から１〜５ヌクレオチド離隔して位置する。

上記プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＳＯは天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰｓから構成されることができる。または、上記プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＳＯは、修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチド、例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ， 参照 ＰＣＴ出願第ＷＯ ９２／２０７０２号）及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ， 参照 ＰＣＴ出願第ＷＯ ９８／２２４８９号、第ＷＯ ９８／３９３５２号及び第ＷＯ ９９／１４２２６号）を含むことができる。上記ＰＴＯ及びＣＴＯは、デオキシイノシン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール及び５−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含むことができる。用語「ユニバーサル塩基」とは、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基それぞれに対してほとんど区別なく塩基対を形成できることを意味する。

上述したように、ＰＴＯは、ＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から３’方向に離隔した一位置で切断されることができる。上記切断位置は、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置することができる。ＰＴＯ断片がＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部を含む場合、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部にハイブリダイゼーションされるＣＴＯの位置は、ユニバーサル塩基、縮重配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又はそれらの組合わせを含むことができる。例えば、ＰＴＯがＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から３’方向に１つのヌクレオチドだけ離隔した一位置で切断されると、上記ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのためにＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部はユニバーサル塩基を含むことが有利である。仮に、ＰＴＯがＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から３’方向に２個のヌクレオチドだけ離隔した一位置で切断されると、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端は縮重配列を含み、それの３’方向に接したヌクレオチドはユニバーサル塩基を含むのが有利である。このように、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部の多様な位置でＰＴＯの切断が起こる場合、ＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮重配列を用いるのが有用である。また、上流プライマー伸長依存的な切断誘導下で、同一の５’タギング部位を持つＰＴＯを複数のターゲット核酸配列スクリーニングに用いる場合、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部が互いに異なるＰＴＯ断片を生成することができる。このような場合、ユニバーサル塩基及び縮重配列はＣＴＯに有用に使用される。ＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮重配列を用いる戦略は、複数のターゲット核酸配列のスクリーニングのために１つのタイプのＣＴＯ又は最小限のタイプのＣＴＯを使用させる。

一実現例によれば、本発明は繰り返しサイクル（ｒｅｐｅａｔｉｎｇ ｃｙｃｌｅ）の間に変性過程を含んでステップ（ａ）〜（ｇ）の全部又は一部を繰り返し行うことをさらに含む。このような繰り返しによって、ターゲット核酸配列及び／又はターゲットシグナルを増幅させることができる。上記変性は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリオキサール処理、酵素的方法（例、ヘリカーゼ作用）及び結合タンパク質を含む公知の技術を通じて行うことができるが、これに限定されるものではない。例えば、変性は８０〜１０５℃の温度範囲で熱処理して達成されることができる。このような処理を達成するための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋなど， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）に開示されている。

一実現例によれば、上記ステップ（ａ）〜（ｂ）、（ａ）〜（ｄ）、（ａ）〜（ｅ）、（ａ）〜（ｆ）又は（ａ）〜（ｇ）は変性過程を含んで繰り返されることができる。

上記ステップ（ａ）〜（ｆ）の繰り返しが、上記ＳＯの断片生成に関する一例であることは当業者に明確である。例えば、本発明は、ステップ（ａ）〜（ｂ）を繰り返してステップ（ｃ）〜（ｆ）を行って上記ＳＯの断片を生成した後、上記ＳＯ断片の検出を行うことができる。

本発明の一実現例によれば、上記ステップ（ａ）〜（ｇ）は１つの反応容器で行われるか上記ステップ（ａ）〜（ｇ）の一部は別途の反応容器で行われる。例えば、上記ステップ（ａ）〜（ｂ）、（ｃ）〜（ｄ）又は（ｅ）〜（ｆ）は１つの反応容器又は別途の反応容器で行われることができる。例えば、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位とターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションが、ＰＴＯ断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーションよりもっと厳しい条件の下で行われるようにＰＴＯ及びＣＴＯの配列及び反応条件が決定される場合、上記ステップ（ａ）〜（ｂ）は上記ステップ（ｃ）〜（ｇ）を行うことなく繰り返されることができる。上記ステップ（ａ）〜（ｂ）の繰り返し後、ステップ（ｃ）〜（ｇ）を行うことができる。

一実現例によれば、上記ステップ（ａ）〜（ｂ）は、変性過程を含んで繰り返されることができる。

特定ステップの繰り返し、繰り返し過程で変性の介在、特定ステップ（等）の分離実施及び検出時点が、幅広く変化されることができるということは当業者に明確である。

一実現例によれば、上記繰り返しが上記ＰＴＯに対する上流プライマーを使用して変性過程と共に行われる場合、上記繰り返しは下流プライマーの存在下で行われ、特にＰＣＲによって行われる。上記ＰＴＯに対する上流プライマー及び下流プライマーの使用は、ターゲット核酸配列を増幅させることができる。

一実現例によれば、上記繰り返しが上記ＰＴＯに対する上流プローブを使用して変性過程と共に行われる場合、上記繰り返しは下流プライマーの存在下で行われる。

本発明においては検出及び／又は増幅しようとするターゲット核酸配列が、全てのＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を含んである特定の配列又は長さを持つように要求しない。上記ターゲット核酸配列は、一本又は二本鎖であってもよい。

ｍＲＮＡを初期物質として用いる場合、アニーリングステップ実施の以前に逆転写ステップが必須であり、これの詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋなど， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）； 及びＮｏｏｎａｎ， Ｋ． Ｆ． など， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０３６６ （１９８８）に開示されている。逆転写反応のためには、ランダムヘキサマー又はｍＲＮＡにハイブリダイゼーションされるオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが用いられることができる。

検出及び／又は増幅できる上記ターゲット核酸配列はある天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、エプスタイン・バール・ウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸又はウイロイド核酸もいずれも含む。

本発明によって検出されるターゲット核酸配列は、多様な核酸配列、例えば、ゲノム内の配列、人為的に分離されるか断片化された配列及び合成配列（例えば、ｃＤＮＡ配列及びバーコード配列）を含む。例えば、ターゲット核酸配列はＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）のための核酸マーカー配列を含む。ＩＰＣＲはＰＣＲと共に核酸マーカー配列及び抗体間のコンジュゲートを使用し、これはタンパク質を含んだ多様な種類のターゲットを検出するのに広く適用される（Ｓａｎｏなど， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８ ｐｐ：１２０−１２２（１９９２）、米国特許第５，６６５，５３９号、Ｎｉｅｍｅｙｅｒなど、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３ ｐｐ：２０８−２１６（２００５）、米国出願公開番号第２００５／０２３９１０８号及びＹｅなど、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２ ｐｐ：７９６−８００（２０１０））。

また、本発明はヌクレオチド変異の検出に有用である。好ましくは、ターゲット核酸配列はヌクレオチド変異を含む。本明細書において使用される用語「ヌクレオチド変異」とは、連続的なＤＮＡセグメント又は配列が類似するＤＮＡセグメントで特定位置のＤＮＡ配列での全ての単一又は複数のヌクレオチド置換、欠失又は挿入を意味する。このような連続的なＤＮＡセグメントは１つの遺伝子又は１つの染色体のある他の部位を含む。このようなヌクレオチド変異は、突然変異（ｍｕｔａｎｔ）又は多型対立遺伝子変異（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）であってもよい。例えば、本発明によって検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）、欠失、挿入、置換及び転座を含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、病原体の薬剤耐性に係る変異及びがん発生関連の変異を含む。上記使用された用語「ヌクレオチド変異」は核酸配列の特定位置にあるいずれの変異も含む。すなわち、用語「ヌクレオチド変異」は、野生型及び核酸配列の特定位置にあるいずれの突然変異型も含む。

ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異を検出する本発明において、使用されるプライマー又はプローブがターゲット核酸配列の上記ヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つ場合、上記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は本明細書においてマッチングテンプレート（ｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）と記載される。使用されるプライマー又はプローブがターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して非相補的な配列を持つ場合、上記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は本明細書においてミスマッチングテンプレート（ｍｉｓｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）と記載される。

ヌクレオチド変異の検出のために、上流プライマーの３’末端はターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異位置の向かい側に位置するようにデザインすることができる。一実現例によれば、上流プライマーの３’末端はターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つ。ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つ上流プライマーの３’末端はマッチングテンプレートにアニーリングされ伸長されてＰＴＯ切断を誘導する。結果物としてのＰＴＯ断片はＣＴＯにハイブリダイゼーションされて、ターゲットシグナルを提供する。逆に、上流プライマーの３’末端がミスマッチングテンプレートでヌクレオチド変異にミスマッチされる場合、上流プライマーがミスマッチングテンプレートにハイブリダイゼーションされても、伸長反応のためにプライマーの３’末端のアニーリングが必須な条件の下では伸長されず、よってターゲットシグナルが発生されない。

または、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つＰＴＯのハイブリダイゼーションに依存的なＰＴＯ切断を用いることができる。例えば、調節された条件下で、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つＰＴＯは、マッチングテンプレートにハイブリダイゼーションされた後、切断される。結果物としてのＰＴＯ断片はＣＴＯにハイブリダイゼーションされて、ターゲットシグナルを提供する。一方、調節された条件の下で、ＰＴＯはヌクレオチド変異位置に非相補的な配列を持つミスマッチングテンプレートにはハイブリダイゼーションされず、切断されない。このような場合、好ましくはＰＴＯのヌクレオチド変異に対する相補的な配列は、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の中間に位置する。

一実現例によれば、人為的なミスマッチヌクレオチドの使用は、ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの区別可能性を向上する。

または、本発明は、特定のヌクレオチド変異に対するＰＴＯの選択性のために３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置したヌクレオチド変異区別サイトを持つＰＴＯを使用する。上記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は、ヌクレオチド変異検出のためにターゲット核酸配列でヌクレオチド変異に位置し、上記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はターゲット核酸配列でヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つ。

上記ＰＴＯがヌクレオチド変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列（すなわち、マッチテンプレート）とハイブリダイゼーションされると、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はマッチテンプレートと二本鎖を形成する。一方、上記ＰＴＯがヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列（すなわち、ミスマッチテンプレート）とハイブリダイゼーションされると、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はミスマッチテンプレートと二本鎖を形成しない。

本明細書においてＰＴＯに関連して使用される用語「ヌクレオチド変異区別サイト」とは、ターゲット核酸配列でヌクレオチド変異に対するＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部の相補的な配列を意味する。

このように関心のあるヌクレオチド変異に対する区別されるハイブリダイゼーションパターンは、ＰＴＯの初期切断位置での差を提供し、これによって２種のＰＴＯ断片が生成されて、関心のあるヌクレオチド変異の存在有無によってシグナル差が発生するということは注目に値する。

関心のあるヌクレオチド変異の存在下で第１断片は、ＰＴＯとマッチングテンプレートとのハイブリッドの切断によって生成され、関心のあるヌクレオチド変異の不在下で第２断片は、ＰＴＯとミスマッチングテンプレートとのハイブリッドの切断によって生成される。上記第２断片は追加の３’末端部位を含み、これは第２断片を第１断片と異ならせる。

単一ヌクレオチド変異の検出に関する一実現例において、上記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は、ターゲット核酸配列で単一ヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つ。上述したように、マッチテンプレートとハイブリダイゼーションされたＰＴＯの切断は、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端に対して３’方向に隣接した位置で誘導されることができ、例えば、上流プライマー伸長依存的な切断の誘導下でそうである。上記ＰＴＯ断片の３’末端は上記単一ヌクレオチド変異に対して相補的なヌクレオチドを持つ。上記ＰＴＯ断片は上記ヌクレオチド変異に対応する配列を含むキャプチャリング部位を持つＣＴＯとハイブリダイゼーションされ、伸長されて伸長二重体を生成し、ターゲットシグナルを提供する。同一の上記ＰＴＯが単一ヌクレオチド変異を除いてマッチテンプレートと同一の配列を持つミスマッチテンプレートとハイブリダイゼーションすると、上記ＰＴＯの切断は、上記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端から３’方向に２個のヌクレオチド離隔した位置で発生することができる。上記ＰＴＯ断片の３’末端は、上記単一ヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチド以外にも追加で切断されたヌクレオチドを持つ。追加で切断されたヌクレオチドとハイブリダイゼーションされる上記ＣＴＯの位置が、追加で切断されたヌクレオチドに非相補的な配列を持つようにデザインされる場合、上記ＰＴＯ断片の３’末端は上記ＣＴＯとハイブリダイゼーションされず、その結果、調節された条件で上記ＰＴＯ断片は伸長されない。

一実現例によれば、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部にヌクレオチド変異に対する相補的な配列を持つ上記ＰＴＯの切断位置は、マッチテンプレート又はミスマッチテンプレートとのハイブリダイゼーションに依存的に変化し、ハイブリダイゼーションイベントから放出された上記ＰＴＯ断片は、好ましくはそれの３’末端の一部、より好ましくはそれの３’末端に異なる配列を持つ。

一実現例によれば、上記ＰＴＯ断片の３’末端の一部の差を考慮したＣＴＯヌクレオチド配列の選択は、ミスマッチテンプレートからマッチテンプレートを区別できるようにする。

一実現例によれば、２つのうちいずれのＰＴＯ断片の生成も、ＣＴＯ上で伸長反応によって明らかに検出されることができる。

一実現例によれば、上記第２断片がＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされる場合、ＣＴＯが上記第２断片の上記追加の３’末端部位とハイブリダイゼーションされなくて、上記第２断片の伸長が防止されるようにＣＴＯの配列を選択する。

本発明において説明したように、上記第１断片の伸長は上記伸長二重体の切断発生によって検出される。

本発明の一実現例によれば、上記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は、ヌクレオチド変異区別サイトから１〜１０ヌクレオチド（より好ましくは１〜５ヌクレオチド）離隔した位置以内に位置した非塩基対部分（ｎｏｎ−ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を含む。

ＰＴＯが変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされる場合、上記非塩基対部分は３’ターゲッティング部位の５’末端の一部がターゲットヌクレオチド配列と二本鎖を形成することを防止する。

非塩基対部分（例えば、人為的なミスマッチヌクレオチド）の利用は、ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの区別能力を向上する。

本発明の一実現例によれば、ヌクレオチド変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列にＰＴＯがハイブリダイゼーションされる場合、非塩基対部分は５’末端の一部がターゲット核酸配列と二本鎖を形成することを抑制しない。

本発明の一実現例によれば、非塩基対部分は、上記ＰＴＯとマッチテンプレートとのハイブリッドの初期切断位置と、上記ＰＴＯとミスマッチテンプレートとのハイブリッドの初期切断位置との距離を拡大させる。

一実現例によれば、非塩基対部分配列の導入は初期切断位置を調節することができ、特に、上記ＰＴＯとミスマッチテンプレートとのハイブリッドの初期切断位置を調節することができる。

一実現例によれば、非塩基対部分はヌクレオチド変異区別サイトの下流に位置する。

非塩基対部分は、ターゲット核酸配列間で塩基対を形成しないいずれの部分も含む。好ましくは、非塩基対部分は、（ｉ）人為的なミスマッチ塩基、塩基対を形成できないように修飾された非塩基対塩基又はユニバーサル塩基を含むヌクレオチド、（ｉｉ）塩基対を形成できないように修飾された非塩基対ヌクレオチド、又は（ｉｉｉ）非塩基対形成化合物（ｎｏｎ−ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）である。

例えば、非塩基対部分は、アルキレン基、リボフラノシルナフタレン、デオキシリボフラノシルナフタレン、メタリン酸塩、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホトリエステル結合、アリールホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アリールホスホネート結合、ハイドロゲンホスホネート結合、アルキルホスホロアミダート結合及びアリールホスホロアミダート結合を含む。従来のカーボンスペーサーもまた非塩基対部分として用いられる。非塩基対部分としてのユニバーサル塩基はＰＴＯの切断位置を調整するのに有用である。

デオキシイノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール及び５’−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含む塩基対は天然型塩基間の結合力より低い結合力を有し、ユニバーサル塩基は特定のハイブリダイゼーション条件下で非塩基対部分として用いられることができる。

５’末端の一部に導入された非塩基対部分は、好ましくは１〜１０個の部分、より好ましくは１〜５個の部分、さらに好ましくは１〜２個の部分を持つ。５’末端の一部の多数の非塩基対部分は連続的又は不連続的に存在することができる。好ましくは、非塩基対部分は２〜５個の連続的な部分を持つ。

好ましくは、非塩基対部分は非塩基対形成化合物である。

一実現例によれば、ＰＴＯのヌクレオチド変異区別サイト及び非塩基対部分は、３’ターゲッティング部位の５’末端から１０ヌクレオチド（より好ましくは８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、６ヌクレオチド、５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチド又は１ヌクレオチド、さらに好ましくは１ヌクレオチド）離隔した位置以内に位置する。

一実現例によれば、ＰＴＯはブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）として５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による切断に対して耐性を持つ少なくとも１個のヌクレオチドを含むブロッカー部位を持ち、上記ブロッカー部位は初期切断位置を調節するか、１つの位置又は位置等で切断を防止するために位置する。

ヌクレオチド変異の検出効率を改善させるために、本発明はＰＣＲクランピング法で行われることができる。ＰＮＡを使用する代表的なＰＣＲクランピング法は、Ｈｅｎｒｉｋなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：５３３２−５３３６（１９９３）及びＬｕｏなど， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ． ３４， Ｎｏ ２ ｅ１２ （２００６）に開示されている。例えば、ＰＮＡを使用するＰＣＲクランピング技術は変異型（ｍｕｔａｎｔ ｔｙｐｅ）ヌクレオチド変異を持つ核酸配列は増幅するが、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ヌクレオチド変異を持つ核酸配列は増幅しない。ＰＣＲクランピングに続き、ＰＴＯＣＥアッセイを行うと、ヌクレオチド変異をより効果的に検出することができる。特に、ＰＣＲクランピング技術は、特異的なタイプのヌクレオチド変異を持つ核酸配列のみを増幅させるから、ＰＣＲクランピング技術と本発明の方法とを結合すれば、より効果的な方式で少数の変異体（ｍｉｎｏｒｉｔｙ−ｖａｒｉａｎｔ）を検出することができる。

５’末端部位にヌクレオチド変異区別部位を持つプローブがミスマッチテンプレートとハイブリダイゼーションされる場合、これの５’末端部位は特定の条件下で一本鎖を形成することができる。上記プローブはＰＴＯに該当することができる。上記シグナルは本発明のＰＴＯアッセイによって生成されることができる。このような接近は、プローブのヌクレオチド変異区別サイトに非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列の検出に有用である。

一実現例によれば、本発明に用いられるターゲット核酸配列は前増幅された核酸配列である。前増幅された核酸配列の利用は、本発明のターゲット検出の敏感度及び特異性をかなり高く増加させる。

好ましい一実現例によれば、上記方法は、ＰＴＯに対する下流プライマーの存在下で行われる。

少なくとも２種のターゲット核酸配列が同時に検出（マルチプレックス）されるという点で、本発明の利点が一層目立つ。

一実現例によれば、上記方法は、少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のターゲット核酸配列を検出するために行われる。

一実現例によれば、上記方法は、少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のターゲット核酸配列を検出するために行われ；上記上流オリゴヌクレオチドは少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のオリゴヌクレオチドを含み、ＰＴＯは少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のＰＴＯを含み、ＣＴＯは少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のＣＴＯを含み、ＳＯは少なくとも２種（好ましくは少なくとも３種、より好ましくは少なくとも５種）のＳＯを含む。

特定の実現例において、少なくとも２種のターゲット核酸配列が存在する場合、これに対応する少なくとも２種のシグナルが提供される。

少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するための上記方法で、上記ＳＯに対する上流オリゴヌクレオチドが使用される場合、上記上流オリゴヌクレオチドは上記ＳＯに対する少なくとも２種の上流オリゴヌクレオチドを含む。

一実現例によれば、本発明は、上記ＰＴＯに対する少なくとも２種の下流プライマーを使用して行われる。

本発明は液相又は固相で行われることができる。

固相に固定化されたＳＯを用いたターゲット検出
一実現例によれば、本発明は固相で行われ、ＳＯはそれの５’末端又は３’末端を通じて固相基質上に固定化される（参照：図６）。固相では、固相基質上で提供されるターゲットシグナルを測定する。

固相反応のために、ＳＯはそれの５’末端又は３’末端（好ましくは、３’末端）を通じて固相基質の表面に直接又は間接に（好ましくは間接）固定化される。また、ＳＯは共有又は非共有結合方式で固相基質の表面上に固定化されることができる。固定化されたＳＯが固相基質の表面に間接に固定化される場合、適当なリンカーを用いる。本発明において有用なリンカーは、固相基質の表面上のプローブ固定化に用いられるいずれのリンカーも含むことができる。例えば、アミン基を持つアルキル又はアリール化合物、又はチオール基を持つアルキル又はアリール化合物がリンカーとしてＳＯ固定化に用いられることができる。また、ポリ（Ｔ）テール又はポリ（Ａ）テールがリンカーとして使用されることができる。

好ましい一実現例によれば、本発明において用いられる固相基質はマイクロアレイである。本発明の反応環境を提供するマイクロアレイは、当業界に公知されたいずれのものでも含むことができる。本発明の全ての過程、すなわち、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション、切断、伸長、融解及び蛍光検出はマイクロアレイ上で行われる。マイクロアレイ上に固定化されたＣＴＯは、ハイブリダイゼーションアレイ要素（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ ａｒｒａｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）として用いられる。マイクロアレイを作製するための固相基質は、金属（例えば、金、金と銅の合金、アルミニウム）、金属オキシド、ガラス、セラミック、石英、シリコーン、半導体、Ｓｉ／ＳｉＯ_２ウエハ、ゲルマニウム、ヒ化ガリウム、カーボン、カーボンナノチューブ、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリアクリルアミド）、セファロース、アガロース及びコロイドを含むが、これに限定されるものではない。本発明の多数の固定化されたＳＯは、固相基質上の１つのアドレス可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）部位又は複数のアドレス可能な部位に固定化されることができ、固相基質は２〜１，０００，０００個のアドレス可能な部位を含むことができる。フォトリソグラフィー、インクジェット、機械的なマイクロスポッティング及びこれと類似する方法のような従来の作製技術によって、アレイ又は特定応用のためのアレイを生産するために固定化されたＣＴＯが作製（ｆａｂｒｉｃａｔｅ）されることができる。

固相で行う本発明は、固定化されたＳＯ上の標識は物理的に離隔しているから、一種類の標識を用いても多数のターゲット核酸配列を同時に検出することができる。よって、固相で本発明によって検出可能なターゲット核酸配列の数は制限されない。

一実現例によれば、上記ＳＯはそれの３’末端又は５’末端を通じて固相基質の表面上に固定化され、上記ＳＯは単一標識を持ち、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯ切断は単一標識を持つ断片を生成させ、上記断片は固相基質上から放出され、それによってシグナル変化が上記固相基質上で発生して上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯ切断の発生を検出する。

共焦点検出装備（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用する場合、上記固相基質上でのシグナルは、液相で懸濁される標識に影響されることなく検出することができる。

上記固定化されたＳＯを使用する本発明は、ハイブリダイゼーション、切断反応及び増幅のために単一の反応容器で行うことができ、リアルタイム方式でターゲット増幅によるシグナル変化を提供することができる。または、上記固定化されたＳＯの切断反応が個別容器で行われる場合、固相で時間依存的なシグナル変化はリアルタイム方式で検出することができる。

ターゲット核酸配列の増幅を伴う一実現例
本発明は、ターゲット核酸配列を合成することができる上流プライマー及び下流プライマーで構成されたプライマー対を用いてターゲット核酸配列の増幅を同時に共に行った。

本発明のまた他の様態によれば、本発明は、次のステップを含み、ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ： ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイによってＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：

（ａ） 上記ターゲット核酸配列を、上流プライマー及び下流プライマーを含むプライマー対及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記上流プライマー及び上記下流プライマーそれぞれは、上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み；上記ＰＴＯは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；上記３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；上記ＰＴＯは上記上流プライマーと上記下流プライマーとの間に位置し；上記ＰＴＯはそれの３’末端がブロッキングされて伸長が防止され；

（ｂ） 上記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に上記ステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって；上記上流プライマー又はそれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ上記酵素による上記ＰＴＯの切断を誘導して、上記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出し；

（ｃ） 上記ＰＴＯから放出された上記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記ＣＴＯは３’→５’の方向に、（ｉ）上記ＰＴＯの上記５’タギング部位又は上記５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；上記ＰＴＯから放出された上記断片は、上記ＣＴＯの上記キャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされ；

（ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び上記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた上記断片は伸長され、上記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な伸長配列を含む伸長鎖を生成して伸長二重体を形成し；

（ｅ） 上記伸長鎖とＳＯ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションして伸長鎖／ＳＯハイブリッドを形成させるステップであって、上記ＳＯは、上記伸長鎖に相補的な配列及び少なくとも１つの標識を含み；

（ｆ） 核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）を用いて上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの上記ＳＯを切断して、上記ＳＯの切断された断片を生成させるステップ；及び

（ｇ） 上記ステップ（ｆ）で切断反応の発生を検出するステップであって；上記検出は、上記ＳＯに連結された標識から提供されるシグナルを測定して行い、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの上記ＳＯに対する切断反応の発生は、上記ターゲット核酸配列の存在を示す。

本発明の一実現例は、上述された本発明のステップを行うため、これら間で共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

一実現例によれば、上記方法は、繰り返しサイクルの間に変性過程を含んで上記ステップ（ａ）〜（ｇ）を全部又は一部繰り返すステップをさらに含む。反応の繰り返しはターゲット核酸配列の増幅を伴う。特に、上記増幅は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号に開示されたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって行う。

一実現例によれば、上記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために行われる。

ＩＩ． 上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性に基づくＰＣＥ−ＳＣアッセイによるターゲット核酸の検出
本発明の他の一様態によれば、本発明は、次のステップを含み、ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ： ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイによってＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：

（ａ） 上記ターゲット核酸配列をＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記ＰＴＯは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；上記３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；

（ｂ） 上記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に上記ステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって；上記ＰＴＯは上記５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によって切断され、このような上記切断は、上記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出し；

（ｃ） 上記ＰＴＯから放出された上記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記ＣＴＯは３’→５’の方向に、（ｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、上記ＰＴＯから放出された上記断片は、上記ＣＴＯの上記キャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされ；

（ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び上記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた上記断片は伸長され、上記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な伸長配列を含む伸長鎖を生成して伸長二重体を形成し；

（ｅ） 上記伸長鎖とＳＯ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションして伸長鎖／ＳＯハイブリッドを形成させるステップであって、上記ＳＯは、上記伸長鎖に相補的な配列及び少なくとも１つの標識を含み；

（ｆ） 核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）を用いて上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの上記ＳＯを切断して、上記ＳＯの切断された断片を生成させるステップ；及び

（ｇ） 上記ステップ（ｆ）で切断反応の発生を検出するステップであって；上記検出は、上記ＳＯに連結された標識から提供されるシグナルを測定して行い、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの上記ＳＯに対する切断反応の発生は、上記ターゲット核酸配列の存在を示す。

上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性に基づく本発明の方法は、上流オリゴヌクレオチドを使用しないことを除いて上流オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＥ−ＳＣアッセイと同一であるため、これら間で共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

興味深いことに、上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性に基づく本発明の方法は、実際に上流オリゴヌクレオチドを使用しなくてもＰＣＥ−ＳＣアッセイを通じてターゲットシグナルを提供する。

本発明の方法のために、上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性を持つ従来の酵素が使用されることができる。５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的なポリメラーゼのうちいくつかの酵素は、上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性を持つ（たとえば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）。

ターゲット核酸配列の増幅及びＰＴＯの切断効率を考慮するとき、本発明のＰＣＥ−ＳＣアッセイは、好ましくは上流オリゴヌクレオチドを用いて行う。

ターゲット検出のためのキット
本発明のまた他の様態によれば、本発明は、次を含むＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ： ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイによってＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する：

（ａ） プロービングアンドタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）；上記ＰＴＯは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；上記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位はターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされず；

（ｂ） 上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；上記上流オリゴヌクレオチドは、上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ＰＴＯより上流に位置し、上記上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による上記ＰＴＯの切断を誘導して、上記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出し；

（ｃ） キャプチャリングアンドテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）；上記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；上記ＰＴＯから放出された上記断片は、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされて伸長され、上記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖を生成して伸長二重体を形成し；

（ｄ） 少なくとも１つの標識を持つシグナリングオリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＳＯ）；上記ＳＯは上記伸長鎖に相補的な配列を含み；上記ＳＯは、上記伸長鎖とハイブリダイゼーションして伸長鎖／ＳＯハイブリッドを生成し；及び

（ｅ） 核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）；上記核酸分解酵素は、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの上記ＳＯを切断する。

本発明のキットは、上述した本発明の検出方法を行うためのものであって、これら間で共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

本発明の一実現例によれば、上記ＳＯは、上記伸長配列にハイブリダイゼーション可能な配列を含む。

本発明の一実現例によれば、上記核酸分解酵素は５’ヌクレアーゼであり、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成は５’ヌクレアーゼに対する切断位置を生成させ、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの上記ＳＯは、５’→３’の方向に５’ヌクレアーゼによって切断される。

本発明の一実現例によれば、上記核酸分解酵素は５’ヌクレアーゼであり、上記キットは、ＳＯの上流に位置した上流オリゴヌクレオチドをさらに含み、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯは、上記上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖に依存的な５’ヌクレアーゼの核酸分解活性によって切断される。

本発明の一実現例によれば、上記上流オリゴヌクレオチドは、上流プライマー又は上流プローブである。

本発明の一実現例によれば、上記核酸分解酵素はリボヌクレアーゼであり、上記ＳＯはＲＮＡ配列を含み、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション二重体を生成し、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯはリボヌクレアーゼによって切断される。

本発明の一実現例によれば、上記核酸分解酵素は制限酵素であり、上記ＳＯは上記制限酵素によって認識される配列を含み、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯは上記制限酵素によって切断される。

本発明の一実現例によれば、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成は、ＤＮＡ二重体、ＲＮＡ二重体又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション二重体を切断することができる核酸分解酵素に対する切断位置を生成させる。

本発明の一実現例によれば、上記核酸分解酵素は５’ヌクレアーゼであり、上記５’ヌクレアーゼは、５’ヌクレアーゼ活性又はＦＥＮヌクレアーゼを持つ鋳型依存的なＤＮＡポリメラーゼである。

本発明の一実現例によれば、上記ＳＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識を持ち、上記核酸分解酵素に対する切断位置は、上記ＳＯに連結された上記レポーター分子とクエンチャー分子との間に位置し、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯ切断は、上記レポーター分子とクエンチャー分子とを互いに分離させる。

本発明の一実現例によれば、上記ＳＯは単一標識を持ち、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯ切断は上記単一標識を持つ断片を生成させ、上記伸長鎖／ＳＯハイブリッドのＳＯ切断の発生は、上記単一標識された断片の放出を検出することで検出される。

本発明の一実現例によれば、上記単一標識は蛍光標識である。

本発明の一実現例によれば、上記ＳＯは、５’方向に上記伸長鎖に非相補的な配列を含む５’タギング部位を含む。

本発明の一実現例によれば、上記ＳＯに連結された少なくとも１つの標識は、上記ＳＯの５’タギング部位に連結される。

本発明の一実現例によれば、上記ＰＴＯ、ＣＴＯ及び／又はＳＯは、それの３’末端はそれの伸長が防止されるようにブロッキングされる。

本発明の一実現例によれば、上記上流オリゴヌクレオチドは、上流プライマー又は上流プローブである。

本発明の一実現例によれば、上記キットは、上記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされたＰＴＯの切断のために５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素をさらに含む。

本発明の一実現例によれば、上記ＳＯは、それの３’末端又は５’末端を通じて固相基質の表面上に固定化され、上記ＳＯは単一標識を持つ。

本発明の一実現例によれば、上記キットは、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するためのキットであり、上記上流オリゴヌクレオチドは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、上記ＰＴＯは少なくとも２種のＰＴＯを含み、上記ＣＴＯは少なくとも２種のＣＴＯを含み、上記ＳＯは少なくとも２種のＳＯを含む。

本発明の一実現例によれば、上記上流オリゴヌクレオチドは上流プライマーであり、上記キットは、上記上流プライマーの伸長のために鋳型依存的な核酸ポリメラーゼをさらに含む。

本発明の一実現例によれば、上記キットは、下流プライマーをさらに含む。

上述した本発明の全てのキットは、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ補助因子及びデオキシリボヌクレオチド５’−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）を行うのに要求される試薬を選択的に含むことができる。または、上記キットは、さらに、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様な緩衝液及び試薬、及びＤＮＡポリメラーゼ活性を抑制する抗体を含むことができる。上記キットは、さらに、陽性及び陰性対照群反応を行うのに必要な試薬を含むことができる。与えられた反応で使用される試薬の最適量は、当業者によって容易に決定されることができる。上記キットは、一般的に上述した成分が別途の包装又は区画に含まれるように適用される。

以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。

実施例１：ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ； ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイの評価
新規なＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ； ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイを用いてターゲット核酸配列を検出できるかを実験した。

５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは上流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断、ＰＴＯ断片の伸長及びＳＯの切断のために使用した。

ＰＴＯ及びＣＴＯは標識せず、３’末端をカーボンスペーサーでブロッキングした。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドをターゲット鋳型として用いた。ＳＯは５’末端に蛍光レポーター標識分子（ＦＡＭ）を含み、３’末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）を含む。

図２は、本実施例で用いられたＰＣＥ−ＳＣアッセイを図式的に示す。

本実施例で使用された合成鋳型、上流プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＳＯの配列は、次のとおりである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＰＴＯ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）
ＮＧ−ＣＴＯ ５’−ＧＴＣＧＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＣＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＧＣＴＧＴ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）
ＮＧ−ＳＯ ５’−［ＦＡＭ］ＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣ［ＢＨＱ−１］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング部位を示す。）

ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １） ２ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４） ０．５ｐｍｏｌｅ、ＳＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５） ５ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、１．６ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ） １０μＬを含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返した。発生されたシグナルの検出は、毎サイクルごとに変性ステップ（９５℃）で行った。

変性温度（９５℃）での検出は、検出されたシグナルがＳＯ切断によって発生された標識断片から提供されるようにする。

図７に示すように、蛍光シグナルは、鋳型が存在する場合に検出された。鋳型、ＰＴＯ、ＣＴＯ又はＳＯがない場合、シグナルは検出されなかった。

実施例２：上流オリゴヌクレオチド依存的なＳＯ切断を用いたＰＣＥ−ＳＣアッセイの評価
本発明者らは、ＳＯの上流に位置した上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ； ＵＯ）を用いるＰＣＥ−ＳＣアッセイを通じてターゲット核酸配列を検出できるかを追加で実験した。

５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、上流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断、ＰＴＯ断片の伸長、ＵＯの伸長及びＳＯの切断のために使用した。

ＰＴＯ及びＣＴＯは標識せず、３’末端をカーボンスペーサーでブロッキングした。ＮＧ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドをターゲット鋳型として使用した。ＳＯは５’末端に蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を含み、３’末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）を含む。ＵＯはＳＯの上流に位置し、ＵＯの伸長生成物はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によってＳＯの切断を誘導する。

図４は、本実施例で用いられたＰＣＥ−ＳＣアッセイを図式的に示す。

本実施例で使用された合成鋳型、上流プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ、ＳＯ及びＵＯの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＰＴＯ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）
ＮＧ−ＣＴＯ ５’−ＧＴＣＧＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＣＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＧＣＴＧＴ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）
ＮＧ−ＳＯ ５’−［ＦＡＭ］ＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣ［ＢＨＱ−１］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）
ＵＯ ５’−ＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＣＧＣＴＴＣＴＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング部位を示す。）

ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １） ２ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４） ０．５ｐｍｏｌｅ、ＳＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５） ５ｐｍｏｌｅ、ＵＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６） ３ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ， １．６ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ） １０μＬを含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返した。発生されたシグナルの検出は、毎サイクルごとに変性ステップ（９５℃）で行った。変性温度（９５℃）での検出は、検出されたシグナルがＳＯ切断によって発生された標識断片から提供されるようにする。

図８に示すように、蛍光シグナルは、鋳型が存在する場合に検出された。鋳型がない場合、シグナルは検出されなかった。

実施例３：ＰＴＯの上流プライマー独立的な切断を用いたＰＣＥ−ＳＣアッセイの評価
本発明者らは、ＰＴＯの上流に位置した上流プライマーを使用しないＰＣＥ−ＳＣアッセイを通じてターゲット核酸配列を検出できるかを追加で評価した。

５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＴＯの切断、ＰＴＯ断片の伸長、ＵＯの伸長及びＳＯの切断のために使用した。

ＰＴＯ及びＣＴＯは標識せず、３’末端をカーボンスペーサーでブロッキングした。ＮＧ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドをターゲット鋳型として使用した。ＳＯは５’末端に蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を含み、３’末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）を含む。本実施例でＰＴＯは、上記ＰＴＯの上流に位置した上流プライマーの関与なしでＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断される。ＵＯはＳＯの上流に位置し、ＵＯの伸長生成物はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によってＳＯの切断を誘導する。

本実施例で使用された合成鋳型、ＰＴＯ、ＣＴＯ、ＳＯ及びＵＯの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＮＧ−ＰＴＯ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）
ＮＧ−ＣＴＯ ５’−ＧＴＣＧＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＣＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＧＣＴＧＴ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）
ＮＧ−ＳＯ ５’−［ＦＡＭ］ＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣ［ＢＨＱ−１］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）
ＵＯ ５’−ＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＣＧＣＴＴＣＴＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング部位を示す。）

ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １） ２ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４） ０．５ｐｍｏｌｅ、ＳＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５） ５ｐｍｏｌｅ、ＵＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６） ３ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、１．６ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ） １０μＬを含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返した。発生されたシグナルの検出は、毎サイクルごとに変性ステップ（９５℃）で行った。変性温度（９５℃）での検出は、検出されたシグナルがＳＯ切断によって発生された標識断片から提供されるようにする。

図９に示すように、蛍光シグナルは、鋳型が存在する場合に検出された。鋳型がない場合、シグナルは検出されなかった。

実施例４：ＰＣＥ−ＳＣアッセイを用いたターゲット核酸配列の検出
本発明者らは、ＰＣＥ−ＳＣアッセイを用いてターゲット核酸配列を検出できるかを追加で評価した。

５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、上流プライマー及び下流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断、ＰＴＯ断片の伸長、ＵＯの伸長及びＳＯの切断のために使用した。

ＰＴＯ及びＣＴＯは標識せず、３’末端をカーボンスペーサーでブロッキングした。ＮＧ遺伝子のゲノムＤＮＡをターゲット鋳型として使用した。ＳＯは５’末端に蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を含み、３’末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）を含む。ＵＯはＳＯの上流に位置し、ＵＯの伸長生成物はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によってＳＯの切断を誘導する。

本実施例で使用された上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ、ＳＯ及びＵＯの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｆ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＰＴＯ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）
ＮＧ−ＣＴＯ ５’−ＧＴＣＧＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＣＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＧＣＴＧＴ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）
ＮＧ−ＳＯ ５’−［ＦＡＭ］ＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣ［ＢＨＱ−１］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）
ＵＯ ５’−ＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＣＧＣＴＴＣＴＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング部位を示す。）

ＮＧのゲノムＤＮＡ １００ｐｇ、上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） １０ｐｍｏｌｅ、下流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４） ０．５ｐｍｏｌｅ、ＳＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５） ５ｐｍｏｌｅ、ＵＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６） ３ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、１．６ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ） １０μＬを含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒及び７２℃で３０秒の過程を４０回繰り返した。発生されたシグナルの検出は、毎サイクルごとに変性ステップ（９５℃）で行った。変性温度（９５℃）での検出は、検出されたシグナルがＳＯ切断によって発生された標識断片から提供されるようにする。

図１０に示すように、蛍光シグナルは、鋳型が存在する場合に検出された。鋳型がない場合、シグナルは検出されなかった。

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実現例に過ぎず、本発明の範囲がこれに制限されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれの等価物によって定義されると言える。

Claims (20)

1. 次のステップを含むＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ： ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイによって液相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法：
   （ａ） 前記ターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及びプロービングアンドタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；前記上流オリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；前記３’ターゲッティング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、前記５’タギング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；前記上流オリゴヌクレオチドは前記ＰＴＯより上流に位置し；
   （ｂ） 前記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に前記ステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって、前記上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ前記酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、前記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出し；
   （ｃ） 前記ＰＴＯから放出された前記断片とキャプチャリングアンドテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、前記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）前記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位それぞれに非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；前記ＰＴＯから放出された断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；
   （ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び前記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた前記断片は伸長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成されて伸長二重体を形成し、
   （ｅ） 前記伸長鎖とシグナリングオリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＳＯ）とをハイブリダイゼーションして伸長鎖／ＳＯハイブリッドを形成させるステップであって、前記ＳＯは、前記伸長鎖に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列及び少なくとも１つの標識を含み；前記ＳＯは、前記伸長配列にハイブリダイゼーション可能な配列を含み；
   （ｆ） 核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）を用いて前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの前記ＳＯを切断して、前記ＳＯの切断された断片を生成させるステップ；及び
   （ｇ） 前記ステップ（ｆ）で前記切断反応の発生を検出するステップであって；前記検出は、液相で前記ＳＯに連結された標識から提供されるシグナルを測定して行い、前記ＣＴＯ及び前記ＳＯは固相基質上に固定化されておらず、前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの前記ＳＯに対する切断反応の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
2. 前記核酸分解酵素は５’ヌクレアーゼであり、前記ステップ（ｅ）で前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成は５’ヌクレアーゼに対する切断位置を生成し、前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの前記ＳＯは、５’ヌクレアーゼによって５’→３’の方向に切断されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記核酸分解酵素は５’ヌクレアーゼであり、前記ステップ（ｆ）は、前記ＳＯの上流に位置した上流オリゴヌクレオチドの存在下で行われ、前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの前記ＳＯは、前記上流オリゴヌクレオチド又はこれの伸長鎖に依存的な前記５’ヌクレアーゼの核酸分解活性によって切断されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記核酸分解酵素はリボヌクレアーゼであり、前記ＳＯはＲＮＡ配列を含み、前記ステップ（ｅ）で前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重体を生成し、前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの前記ＳＯは、前記リボヌクレアーゼによって切断されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記核酸分解酵素は制限酵素であり、前記ＳＯは前記制限酵素によって認識される配列を含み、前記ステップ（ｅ）で前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成は前記制限酵素に対する切断位置を生成し、前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの前記ＳＯは、前記制限酵素によって切断されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記ステップ（ｅ）で前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの形成は、ＤＮＡ二重体、ＲＮＡ二重体又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重体を切断することができる核酸分解酵素に対する切断位置を生成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記ステップ（ｆ）で前記核酸分解酵素は５’ヌクレアーゼであり、前記５’ヌクレアーゼは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的なＤＮＡポリメラーゼ又はＦＥＮヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 前記ＳＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識を持ち、前記核酸分解酵素に対する前記切断位置は、前記ＳＯに連結された前記レポーター分子と前記クエンチャー分子との間に位置し、前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの前記ＳＯの切断は、前記レポーター分子と前記クエンチャー分子とを互いに分離させ、前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの前記ＳＯに対する切断反応の発生は、前記標識からのシグナルを測定することで検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 前記ＳＯは単一標識を持ち、前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの前記ＳＯ切断は単一標識を持つ断片を生成し、前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの前記ＳＯ切断の発生は、前記単一標識された断片の放出を検出することで検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 前記ＳＯは、それの５’方向に前記伸長鎖に非相補的な配列を含む５’タギング部位を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの前記ＳＯ切断は、前記ＳＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出し、前記ＳＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯとのハイブリダイゼーション及び伸長が可能であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＰＴＯ、ＣＴＯ及び／又はＳＯは、伸長されないようにそれの３’末端がブロッキングされていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
13. 前記方法は、前記ステップ（ａ）〜（ｇ）の全体又は一部を変性を含んで繰り返すことをさらに行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
14. 前記ステップ（ａ）〜（ｇ）は１つの反応容器で行うか又は前記ステップ（ａ）〜（ｇ）のうち一部は別途の反応容器で行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
15. 前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために行われ；前記上流オリゴヌクレオチドは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＴＯは少なくとも２種のＰＴＯを含み、前記ＣＴＯは少なくとも２種のＣＴＯを含み、前記ＳＯは少なくとも２種のＳＯを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
16. 前記ターゲット核酸配列はヌクレオチド変異を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
17. 前記方法は、下流プライマーの存在下で行うことを特徴とする請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
18. 次のステップを含むＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ： ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイによって液相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法：
    （ａ） 前記ターゲット核酸配列を上流プライマー及び下流プライマーを含むプライマー対及びプロービングアンドタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；前記上流プライマー及び下流プライマーはそれぞれ前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；前記３’ターゲッティング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、前記５’タギング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；前記ＰＴＯは前記上流プライマーと前記下流プライマーとの間に位置し；前記ＰＴＯは伸長されないようにそれの３’末端がブロッキングされており；
    （ｂ） 前記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に前記ステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって、前記上流プライマー又はそれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ前記酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、前記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出し；
    （ｃ） 前記ＰＴＯから放出された前記断片とキャプチャリングアンドテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、前記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）前記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；前記ＰＴＯから放出された断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；
    （ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び前記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた前記断片は伸長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な伸長配列を含む伸長鎖を生成して伸長二重体を形成し；
    （ｅ） 前記伸長鎖とシグナリングオリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＳＯ）とをハイブリダイゼーションして伸長鎖／ＳＯハイブリッドを形成させるステップであって、前記ＳＯは、前記伸長鎖に相補的な配列及び少なくとも１つの標識を含み；前記ＳＯは、前記伸長配列にハイブリダイゼーション可能な配列を含み；
    （ｆ） 核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）を用いて伸長鎖／ＳＯハイブリッドの前記ＳＯを切断して、前記ＳＯの切断された断片を生成させるステップ；及び
    （ｇ） 前記ステップ（ｆ）で切断反応の発生を検出するステップであって；前記検出は、液相で前記ＳＯに連結された標識から提供されるシグナルを測定して行い、前記ＣＴＯ及び前記ＳＯは固相基質上に固定化されておらず；前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの前記ＳＯに対する切断反応の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
19. 前記方法は、前記ステップ（ａ）〜（ｇ）の全体又は一部を変性を含んで繰り返すことをさらに行うことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. 請求項１から１９のいずれかに記載の方法の実施における使用のためのキットであって、次を含むＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ： ＰＣＥ−ＳＣ）アッセイによってＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキット：
    （ａ） プロービングアンドタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）；前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；前記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、前記５’タギング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；
    （ｂ） 上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；前記上流オリゴヌクレオチドは前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み；前記上流オリゴヌクレオチドは前記ＰＴＯより上流に位置し、前記上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、前記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出し；
    （ｃ） キャプチャリングアンドテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）；前記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）前記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされて伸長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖を生成して伸長二重体を形成し；前記ＣＴＯは固相基質上に固定化されておらず；
    （ｄ） 少なくとも１つの標識を持つシグナリングオリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＳＯ）；前記ＳＯは前記伸長鎖に相補的な配列を含み；前記ＳＯは前記伸長鎖とハイブリダイゼーションして伸長鎖／ＳＯハイブリッドを生成し；前記ＳＯは、前記伸長配列にハイブリダイゼーション可能な配列を含み；前記ＳＯは固相基質上に固定化されておらず；及び
    （ｅ） 核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）；前記核酸分解酵素は前記伸長鎖／ＳＯハイブリッドの前記ＳＯを切断する。