JP6097076B2 - 対象外の表現型が除外された、分化多能性幹細胞の子孫 - Google Patents

対象外の表現型が除外された、分化多能性幹細胞の子孫 Download PDF

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Description

本発明は、幹細胞生物学の分野に関する。
優先権
本出願は、２００９年６月２５日に提出された仮特許出願第６１／２２０，４１８号に対する優先権を主張する。
多能性幹細胞は、培養で、適切な増殖条件下で増殖すると共に、３つの主要な胚葉すべて：内胚葉、中胚葉、および外胚葉を代表する、系列が限られた細胞型に分化する能力を有する（米国特許第５，８４３，７８０号；第６，２００，８０６号；第７，０２９，９１３号；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６；Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２００７）Ｃｅｌｌ １３１（５）：８６１；Ｙｕら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：５８５８）。特定の系列が限られた細胞型についての適切な増殖条件の決定は、研究および治療上の応用で使用されるその細胞型の無限の供給を事実上もたらすであろう。
霊長動物多能性幹（ｐＰＳ）細胞を、乏突起膠細胞、神経細胞、心筋細胞、造血細胞、膵島細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞を含む、様々な、目標とする細胞型に分化させるためのプロトコールが、記載されてきた（たとえば米国特許第７，２８５，４１５号；第６，８３３，２６９号；第７，４２５，４４８号；第７，４５２，７１８号；第７，０３３，８３１号；第７，３２６，５７２号；第６，４５８，５８９号；第６，５０６，５７４号；第７，２５６，０４２号；第７，４７３，５５５号；米国特許出願公開第２００５／０１５８８５５号；第２００４／０２２４４０３号；第２００５／０２８２２７２号；第２００５／０２８２２７４号；第２００６／０１４８０７７号；米国特許出願第１２／４１２，１８３号；ＰＣＴ公開ＷＯ ０７／１４９１８２；ＷＯ ０５／０９７９８０；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら（２００１）Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １７２：３８３；Ｃｈａｄｗｉｃｋら（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０２：９０６；Ｋｉｅｒｓｔａｄら（２００５）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２５：４６９４）；Ｌａｆｌａｍｍｅら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５：１０１５ Ｊｉａｎｇら（２００７）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５：１９４０を参照されたい。
目的の表現型細胞へのｐＰＳ細胞の分化は、目標とする表現型および様々な対象外の（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ）表現型を含む細胞の混合集団の産生をもたらすかもしれない。未分化胚性幹細胞の多能性潜在能力を保持するある種の対象外の表現型は、対象に投与された場合、奇形腫を形成するかもしれない。たとえばＴｈｏｍｓｏｎ １９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５を参照されたい。他の対象外の表現型は、単に、目標とする表現型の細胞の数を減らし、それによって細胞調製物の全体的な有効性を低下させることによって、目的の表現型の有効性に干渉するかもしれない。したがって、ｐＰＳ細胞の目標とする分化子孫を含む細胞の集団において見つけられる、対象外の表現型を有する細胞の数を低下させる必要性がある。治療上の、診断の、および／または研究の応用において使用するための、対象外の表現型の最小限の数の細胞を有する、ｐＰＳ細胞の分化子孫の集団がさらに必要とされる。本明細書において記載される本発明の様々な実施形態は、同様に、これらの必要性および他の必要性を満たす。
いくつかの実施形態では、本発明は、対象外の表現型の細胞型が本質的にない、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む細胞の集団を提供する。ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、肝細胞、造血細胞、軟骨細胞、および骨芽細胞から選ばれる、目的の表現型を含んでいてもよい。対象外の表現型の細胞の一例は、上皮系列細胞、つまり、１つまたは複数の以下のマーカー：サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）などのような、上皮細胞と関連する１つまたは複数のマーカーを発現する細胞である。これらの細胞は、げっ歯動物などのような対象に植え込まれた場合、集まって塊になった上皮構造を形成し得るかもしれない。対象外の表現型の細胞型が本質的にない細胞集団は、１つまたは複数の以下のマーカー：デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）、サイトケラチンなどのような上皮細胞と関連するマーカーについてスクリーニングすることによって得られてもよい。たとえば、これらのマーカーの任意の１つまたは複数の抗体が、使用されてもよい。
他の実施形態では、本発明は、対象外の表現型の細胞が本質的にない、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む細胞の集団を得るための方法であって、ａ）ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む細胞の集団を得るステップと、ｂ）上皮細胞に結合する１つまたは複数のリガンドとａ）の細胞集団を接触させるステップと、ｃ）ｂ）のリガンドが結合した細胞を除去し、それによって、対象外の表現型の細胞が本質的にない細胞の集団を得るステップとを含む方法が提供される。リガンドが結合した細胞を除去するステップは、リガンドが結合した細胞を細胞集団の残りから物理的に分離することを含んでいてもよい。リガンドが結合した細胞を除去するステップはまた、リガンドが結合した細胞を死滅させることを含んでいてもよい。たとえば、細胞に結合したリガンドに結合する毒素などのような作用物質が使用されてもよい。一実施形態では、リガンドは、抗体であってもよく、補体は、細胞を溶解し、したがって細胞の集団からそれを除去する作用物質として使用されてもよい。
ある他の実施形態では、本発明は、霊長動物多能性幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、細胞の混合集団を提供する。細胞の混合集団は、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させることによって濃縮された、目標とする表現型の細胞集団を含み、したがって、対象外の表現型の細胞の数を低下させていない、細胞の混合集団と比較した場合に、治療上のまたは研究の産物として使用するための、細胞のより適した集団を提供してもよい。細胞の目標とする集団の濃縮は、対象外の表現型の細胞と関連する特異的なマーカー、たとえば、上皮細胞によって発現される１つまたは複数のマーカーを発現する細胞の数を低下させることによって達成される。対象外の表現型の除去は、集団を含む他の細胞から対象外の表現型を物理的に分離することを含んでいてもよい。対象外の表現型の除去はまた、リガンドが結合した細胞を死滅させるために、対象外の表現型を化学的に処理すること、たとえば、対象外の表現型の細胞に結合したリガンドに特異的に結合する化学薬品を含んでいてもよい。
驚いたことに、上皮系列の対象外の表現型の細胞と関連する少なくとも１つまたは複数のマーカーの発現は、未分化細胞と関連する少なくとも１つまたは複数のマーカー、たとえばＴＲＡ−１−６０の発現と部分的に重なる。したがって、上皮系列の対象外の表現型と関連するマーカーを発現する細胞を除外することによって、未分化細胞の数または混合集団内の未分化細胞によって発現される少なくとも１つのマーカー（ＴＲＡ−１−６０など）を発現する細胞の数もまた、低下させてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）対象外の表現型の細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合した対象外の表現型の細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含むｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）対象外の表現型の細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合した対象外の表現型の細胞を、リガンドが結合した対象外の表現型細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
ある実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）上皮細胞によって発現される１つまたは複数のマーカーに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）細胞の混合集団の残りからａ）のリガンドが結合した細胞を分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含むｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）上皮細胞によって発現される１つまたは複数のマーカーに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ａ）のリガンドが結合した細胞を、ａ）のリガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含むｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）上皮細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させ、未分化ｐＰＳ細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含むｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）上皮細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させ、未分化ｐＰＳ細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ａ）のリガンドが結合した細胞を、ａ）のリガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含むｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ａ）のリガンドが結合した細胞を、ａ）のリガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）未分化ｐＰＳ細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｃ）ａ、ｂ）、またはａ）およびｂ）のリガンドが結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＴＲＡ−１６０に特異的に結合するリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｃ）リガンドが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＴＲＡ−１６０に特異的に結合するリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｃ）ａ、ｂ）、またはａ）およびｂ）のリガンドが結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
ある他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における上皮細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）上皮細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合した上皮細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から上皮細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
ある他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における上皮細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）上皮細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ａ）の細胞を、ａ）のリガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から上皮細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における上皮細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数の分子と特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合した上皮細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から上皮細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における上皮細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数の分子と特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合した上皮細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から上皮細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥｐＣＡＭが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥｐＣＡＭが結合した細胞を、ＥｐＣＡＭが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチン分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）サイトケラチンが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチン分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）サイトケラチンが結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）デスモコリン３分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）デスモコリン３が結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）デスモコリン３分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）デスモコリン３が結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）デスモグレイン２分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）デスモグレイン２が結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）デスモグレイン２分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）デスモグレイン２が結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）Ｅ−カドヘリン分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）Ｅ−カドヘリンが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）Ｅ−カドヘリン分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）Ｅ−カドヘリンが結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ４９ｆ分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ４９ｆが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ４９ｆ分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ４９ｆが結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥＭＡ分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥＭＡが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥＭＡ分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥＭＡが結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）Ｅ−ｃａｄ分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）Ｅ−ｃａｄが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）Ｅ−ｃａｄ分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）Ｅ−ｃａｄが結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ３２１分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ３２１が結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ３２１分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ３２１が結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ６６分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ６６が結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ６６分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ６６が結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ１０分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ１０が結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ１０分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ１０が結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ１０５分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ１０５が結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ１０５分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ１０５が結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団からサイトケラチン発現細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥｐＣＡＭが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団からサイトケラチン細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、サイトケラチン発現細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
ある他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドおよび未分化細胞上に発現されるマーカーに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥｐＣＡＭのリガンドに結合した細胞および未分化細胞上に発現されたマーカーのリガンドに結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドおよび未分化細胞上に発現されるマーカーに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥｐＣＡＭについてのリガンドに結合した細胞および／または未分化細胞上に発現されたマーカーのリガンドに結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドおよびＴＲＡ−１−６０に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥｐＣＡＭのリガンドに結合した細胞およびＴＲＡ−１−６０のリガンドに結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドおよびＴＲＡ−１−６０に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥｐＣＡＭについてのリガンドに結合した細胞および／またはＴＲＡ−１−６０のリガンドに結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
ある他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数の分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドならびに未分化細胞上に発現されるマーカーに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数の分子に結合した細胞ならびに未分化細胞上に発現されるマーカーのリガンドに結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数の分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドならびに未分化細胞上に発現されるマーカーに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数の分子に特異的に結合した１つまたは複数のリガンドに結合した細胞ならびに／または未分化細胞上に発現されるマーカーのリガンドに結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数の分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数の分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ａ）のリガンドに結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥｐＣＡＭが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥｐＣＡＭが結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチンに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂサイトケラチンが結合した細胞を）細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチンに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）サイトケラチンが結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）デスモコリン３に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）デスモコリン３が結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）デスモコリン３に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）デスモコリン３が結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）デスモグレイン２に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）デスモグレイン２が結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）デスモグレイン２に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）デスモグレイン２が結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）Ｅ−カドヘリンに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）Ｅ−カドヘリンが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）Ｅ−カドヘリンに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）Ｅ−カドヘリンが結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ４９ｆに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ４９ｆが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ４９ｆに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ４９ｆが結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥＭＡに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥＭＡが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥＭＡに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥＭＡが結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）Ｅ−ｃａｄに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）Ｅ−ｃａｄが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）Ｅ−ｃａｄに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）Ｅ−ｃａｄが結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ３２１に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ３２１が結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ３２１に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ３２１が結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ６６に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ６６が結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ６６に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ６６が結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ１０に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ１０が結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ１０に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ１０が結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ１０５に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ１０５が結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＣＤ１０５に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＣＤ１０５が結合した細胞を、リガンドが結合した細胞を死滅させる化学薬品と接触させ、それによって、細胞の混合集団から、上皮の塊を形成する細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、上皮の塊を形成する細胞を含む、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における未分化細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）未分化細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合した未分化細胞を細胞の混合集団の残りから除去し、それによって、細胞の混合集団から未分化細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＴＲＡ−１−６０に特異的に結合するＩｇＧなどのような抗体を含んでいてもよい。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、未分化細胞によって発現される１つまたは複数の分子を発現する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）上皮細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ａ）のリガンドが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから除去し、それによって、細胞の混合集団から未分化細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、未分化細胞によって発現される１つまたは複数の分子を発現する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合したＥｐＣＡＭ細胞を細胞の混合集団の残りから除去し、それによって、細胞の混合集団から未分化細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、未分化細胞によって発現される１つまたは複数の分子を発現する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドおよびＴＲＡ−１−６０に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから除去し、それによって、細胞の混合集団から未分化細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、未分化細胞によって発現される１つまたは複数の分子を発現する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチンに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合したサイトケラチン細胞を細胞の混合集団の残りから除去し、それによって、細胞の混合集団から未分化細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞の混合集団における、未分化細胞によって発現される１つまたは複数の分子を発現する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）サイトケラチンに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドおよびＴＲＡ−１−６０に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから除去し、それによって、細胞の混合集団から未分化細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、上皮細胞上に見つけられる分子を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、上皮細胞上に見つけられる分子を発現する少なくとも１つの細胞および未分化幹細胞上に見つけられる分子を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数の分子を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、ＥｐＣＡＭを発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、サイトケラチンを発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、デスモコリン３を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、デスモグレイン２を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、Ｅ−カドヘリンを発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、ＣＤ４９ｆを発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、ＥＭＡを発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、Ｅ−ｃａｄを発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、ＣＤ３２１を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、ＣＤ１６６を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、ＣＤ１０５を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数の分子を発現する少なくとも１つの細胞ならびに未分化霊長動物多能性細胞上に見つけられるマーカーを発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、ＥｐＣＡＭを発現する少なくとも１つの細胞および未分化霊長動物多能性細胞上に見つけられるマーカーを発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、サイトケラチンを発現する少なくとも１つの細胞および未分化霊長動物多能性幹細胞上に見つけられるマーカーを発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、ＥｐＣＡＭを発現する少なくとも１つの細胞およびＴＲＡ−１−６０を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、サイトケラチンを発現する少なくとも１つの細胞およびＴＲＡ−１−６０を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型を有する細胞を含む、細胞の集団を対象に移植するための方法であって、ａ）目標とする表現型を含む、対象外の表現型を有する少なくとも１つの細胞が除外されている細胞の集団を得るステップと、ｂ）ａ）からの細胞の集団を対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞療法を必要とする対象を治療するための方法であって、ａ）目標とする表現型を有する細胞を含む、対象外の表現型を有する少なくとも１つの細胞が除外されている細胞の集団を得るステップと、ｂ）ａ）からの細胞の集団を対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、目標とする表現型を有する細胞を含む細胞療法を必要とする対象を治療するための細胞の集団の使用であって、細胞の集団は、対象外の表現型を有する少なくとも１つの細胞が除外されている、使用を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型を有する細胞を含む、細胞の集団を対象に移植するための方法であって、ａ）目標とする表現型を有する細胞を含む、上皮細胞マーカーを発現する少なくとも１つの細胞が除外されている細胞の集団を得るステップと、ｂ）ａ）からの細胞の集団を対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、細胞療法を必要とする対象を治療するための方法であって、ａ）目標とする表現型を有する細胞を含む、上皮細胞マーカーを発現する少なくとも１つの細胞が除外されている細胞の集団を得るステップと、ｂ）ａ）からの細胞の集団を対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、目標とする表現型を有する細胞を含む細胞療法を必要とする対象を治療するための細胞の集団の使用であって、細胞の集団は、上皮細胞マーカーを発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、使用を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ａ）上皮細胞上に発現される１つまたは複数の分子に対するリガンドと、ｂ）未分化細胞上に発現される１つまたは複数の分子に対するリガンドと、ｃ）１つまたは複数の容器とを含む、細胞の混合集団から対象外の表現型を有する細胞を除外するためのキットであって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、キットを提供する。
他の実施形態では、本発明は、ａ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、上皮膜抗原（ＥＭＡ）、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数の分子に対するリガンドと、ｂ）未分化細胞上に発現される１つまたは複数の分子に対するリガンドと、ｃ）１つまたは複数の容器とを含む、細胞の混合集団から対象外の表現型を有する細胞を除外するためのキットであって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、キットを提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、ＥｐＣＡＭに対するリガンドと、ＴＲＡ−１−６０に対するリガンドと、１つまたは複数との容器を含む、細胞の混合集団から対象外の表現型を有する細胞を除外するためのキットであって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、キットを提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、サイトケラチンに対するリガンドと、ＴＲＡ−１−６０に対するリガンドと、１つまたは複数の容器とを含む、細胞の混合集団から対象外の表現型を有する細胞を除外するためのキットであって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、キットを提供する。
他の実施形態では、本発明は、ａ）サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）から選ばれる１つまたは複数の分子に対するリガンドと、ｂ）１つまたは複数の容器とを含む、細胞の混合集団から対象外の表現型を有する細胞を除外するためのキットであって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、キットを提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、ＩｇＧアイソタイプを有する、ＴＲＡ１−６０に特異的に結合する抗体を提供する。
ｈＥＳ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した乏突起膠細胞前駆細胞を投与した、わずかな割合のラットにおいて存在する集まって塊になった上皮構造が、上皮様の形態を有することを示す顕微鏡写真を示す図である。 パンサイトケラチン抗体ＡＥ１／ＡＥ３が、ヒト組織アレイにおいて見つけられる様々な組織型を標識し（左側のパネル）、また、未分化ｈＥＳ細胞をマウスに筋肉内注射することによって形成されたマウス奇形腫をも標識する（右側のパネル）ことを示す一連の顕微鏡写真を示す図である。 Ｂｅｒ−ＥＰ４（ＥｐＣＡＭ）抗体が、ヒト組織アレイにおいて見つけられる様々な組織型を標識し（左側のパネル）、また、未分化ｈＥＳ細胞をマウスに筋肉内注射することによって形成されたマウス奇形腫をも標識する（右側のパネル）ことを示す顕微鏡写真を示す図である。 パンサイトケラチン抗体ＡＥ１／ＡＥ３でいくつかの場合において陽性に標識された、ｈＥＳ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した乏突起膠細胞前駆細胞の調製物を投与した３匹のラットから得られた、集まって塊になった上皮構造を示す、一連の顕微鏡写真を示す図である。上部のパネル倍率は、２４×である。下部のパネル倍率は、４００×である。 Ｂｅｒ−ＥＰ４ ＥｐＣＡＭ抗体でいくつかの場合において標識された、ｈＥＳ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した乏突起膠細胞前駆細胞の調製物を投与した１匹のラットから得られた、集まって塊になった上皮構造を示す、一連の顕微鏡写真を示す図である。 Ｂｅｒ−ＥＰ４ ＥｐＣＡＭ抗体およびパンサイトケラチン抗体ＡＥ１／ＡＥ３の両方でいくつかの場合において標識された、ｈＥＳ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した乏突起膠細胞前駆細胞の調製物を投与した１匹のラットから得られた、集まって塊になった上皮構造を示す、一連の顕微鏡写真を示す図である。 Ｂｅｒ−ＥＰ４（ＥｐＣＡＭ）抗体ではなくパンサイトケラチン抗体ＡＥ１／ＡＥ３でいくつかの場合において標識された、ｈＥＳ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した乏突起膠細胞前駆細胞の調製物を投与した１匹のラットから得られた、集まって塊になった上皮構造を示す、一連の顕微鏡写真を示す図である。 細胞が、パンサイトケラチン抗体ＡＥ１／ＡＥ３またはＢｅｒ−ＥＰ４（ＥｐＣＡＭ）抗体のどちらでも標識されなかった、ｈＥＳ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した乏突起膠細胞前駆細胞の調製物を投与した１匹のラットから得られた、集まって塊になった上皮構造を示す、一連の顕微鏡写真を示す図である。 フローサイトメトリーによって得られたデータを示す図である。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した乏突起膠細胞前駆細胞の異なる２つのロットを、ＥｐＣａｍ、パンサイトケラチン、およびＴＲＡ−１−６０について標識した。 フローサイトメトリーによって得られたデータを示す図である。ＥｐＣＡＭを発現しない細胞（ＨＥＫ ２９３）にＥｐＣＡＭ＋細胞を加えて、混合集団を生成した。次いで、混合集団は、ＥｐＣＡＭ特異的抗体にコンジュゲートされた磁気ビーズを使用する分離にかけた。結果として生じる画分は、ＥｐＣＡＭ特異的抗体、その後に標識二次抗体（Ａ６４７）またはアイソタイプコントロール、その後に同じ二次抗体のいずれかを使用して、フローサイトメトリーによって分析した。 フローサイトメトリーによって得られたデータを示す図である。ｈＥＳ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した乏突起膠細胞前駆細胞の単一のロットは、磁気ビーズにコンジュゲートされたＥｐＣＡＭ特異的抗体を使用してＥｐＣＡＭ陽性細胞を除外した。結果として生じる細胞画分は、それぞれに対して特異的な抗体を使用してＴＲＡ−１−６０およびパンサイトケラチンについて標識した。ＴＲＡ−１−６０標識細胞は、二次抗体を用いて同様に染色した。
定義
量または値を指すために本明細書において使用される「約」は、明示される量または値の＋または−５％を意味する。
本明細書において使用される「心筋細胞」は、成熟した心筋細胞（若年もしくは成体の霊長動物のいずれかから単離された、心筋細胞の機能的な能力を持つ細胞）ならびに／または心筋細胞前駆体（心筋細胞上に、それにおいて、もしくはそれによって発現される１つもしくは複数のマーカーを発現しおよび／または心筋細胞と関連する１つもしくは複数の形態学的特質を有し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象に植え込まれた場合に成熟した心筋細胞に分化するかもしれない細胞）を含む。
本明細書において使用される「細胞培養物」は、ある期間にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させた複数の細胞を指す。細胞培養物は、複数のｐＰＳ細胞または単一のｐＰＳ細胞から生じてもよく、１）細胞培養物が培養の一生にわたって受ける継代または分裂の数および２）培養の一生にわたる、培養物内の１つまたは複数の細胞に対する表現型におけるあらゆる変化に関係なく、生じる細胞（複数可）の子孫をすべて含んでいてもよい。したがって、本明細書において使用されるように、細胞培養は、少なくとも１つのｐＰＳ細胞の１つまたは複数の適した容器への初めの接種から始まり、最初の初代の最後に生存する子孫が採取されるまたは死滅すると終わる。最初の初代細胞の子孫の、１つまたは複数のさらなる培養容器への接種もまた、最初の細胞培養の一部であると考えられる。
本明細書において使用される「軟骨細胞」は、成熟した軟骨細胞（若年もしくは成体の霊長動物のいずれかから単離された、軟骨細胞の機能的な能力を持つ細胞）ならびに／または軟骨細胞前駆体（軟骨細胞上に、それにおいて、もしくはそれによって発現される１つもしくは複数のマーカーを発現しおよび／または軟骨細胞と関連する１つもしくは複数の形態学的特質を有し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象に植え込まれた場合に成熟した軟骨細胞に分化するかもしれない細胞）を含む。
本明細書において使用される「集まって塊になった上皮構造」は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む細胞の混合集団において見つけられる上皮系列の対象外の表現型の細胞が、対象に植え込まれた場合に形成するかもしれない構造を指す。これらの構造は、上皮細胞の形態を有し、以下に記載される上皮細胞において発現される少なくとも１つの分子のマーカーを発現する。いくつかの実例では、構造は、嚢または小胞の形態を有していてもよい。
本明細書において使用される「サイトケラチン」は、上皮組織の細胞質内の細胞骨格において見つけられる中間径フィラメントケラチンを指す。２つの型のサイトケラチンがある：酸性型Ｉサイトケラチンおよび塩基性または中性型ＩＩサイトケラチン。サイトケラチンは、普通、Ｉ型サイトケラチンおよびＩＩ型サイトケラチンを含むペアで見つけられる。塩基性または中性サイトケラチンであるＩＩ型サイトケラチンは、亜型ＣＫ１、ＣＫ２、ＣＫ３、ＣＫ４、ＣＫ５、ＣＫ６ａ、ＣＫ６ｂ、ＣＫ６ｃ、ＣＫ７、およびＣＫ８０を含む。酸性サイトケラチンであるＩ型サイトケラチンは、亜型ＣＫ９、ＣＫ１０、ＣＫ１２、ＣＫ１３、ＣＫ１４、ＣＫ１５、ＣＫ１６、ＣＫ１７、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＣＫ２０、ＣＫ２３、およびＣＫ２４を含む。サイトケラチンタンパク質はすべて、非α−ヘリカルＮおよびＣ末端ドメインと共に中央のα−ヘリックスリッチドメイン（同じ型のサイトケラチンの中で５０〜９０％の配列同一性および異なる型のサイトケラチンの間で約３０％の配列同一性を有する）を含有する。
本明細書において使用される「除外された」は、細胞の混合集団内に含有される対象外の表現型が、ヒトの手によって開始された作用の結果として、集団内の他の表現型の細胞型と比較して数が減少する作用を指す。対象外の表現型が、たとえば、対象外の表現型の細胞を免疫沈降することによって、集団中の他の細胞から物理的に分離される方法が含まれる。対象外の表現型の細胞が集団の残りから化学的に除去される、たとえば、対象外の表現型の細胞が、毒素、補体、およびその他同種のものなどのような化学薬品により、特異的に標的とされる方法もまた含まれる。したがって、対象外の表現型を有する１つまたは複数の細胞を除外した細胞集団は、除外されたと考えられる。典型的に、除外は、ヒトの手によって開始される作用の前および後に、対象外の表現型を有する細胞の数を比較することによって測定され、それによって、ヒトの手によって開始される作用の結果としての、対象外の表現型を有する細胞集団の相対数におけるあらゆる減少は、除外と考えられる。細胞の混合集団からの対象外の表現型の除外は、細胞の混合集団内の目的の細胞集団の濃縮をもたらしてもよい。
本明細書において使用される「デスモコリン３」は、カドヘリンスーパーファミリーのデスモコリンサブファミリーのメンバーであるカルシウム依存性糖タンパク質である上皮細胞マーカーを指す。デスモグレインと共にこれらのデスモソームファミリーメンバーは、主として上皮細胞中に見つけられ、ここで、それらは、デスモソーム細胞間結合の接着性タンパク質を構成し、細胞接着およびデスモソーム形成に必要とされる。デスモソームファミリーメンバーは、第１８染色体上に２つのクラスターで配置され、組み合わせて６５０ｋｂ未満を占める。選択的スプライシングは、別個のアイソフォームをコードする２つの転写変異体をもたらす。
本明細書において使用される「デスモグレイン２」は、上皮細胞マーカーを指す。デスモグレイン２は、脊椎動物上皮細胞におけるデスモソームのカルシウム結合膜貫通糖タンパク質の構成成分である。デスモソームは、上皮、心筋、およびある種の他の細胞型の間の細胞間結合である。現在、３つのデスモグレインサブファミリーメンバーが同定されており、すべて、カドヘリン細胞接着分子スーパーファミリーのメンバーである。これらのデスモグレイン遺伝子ファミリーメンバーは、第１８染色体上にクラスターで位置する。この第２のファミリーメンバーは、結腸、結腸癌、および他の単純で重層の上皮由来の細胞において発現される。
本明細書において使用される「Ｅ−カドヘリン」（ＣＤ３２４）は、細胞表面上に発現される上皮細胞マーカーを指す。それは、５つの細胞外カドヘリンリピート、膜貫通領域、および高度に保存された細胞質側末端から構成されるカルシウム依存性細胞間接着糖タンパク質である。この遺伝子における突然変異は、胃癌、乳癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、および卵巣癌と関連する。機能の損失は、増殖、浸潤、および／または転移を増加させることによって、癌の進行の一因となると考えられる。このタンパク質の外部ドメインは、哺乳動物細胞への細菌の接着を媒介し、細胞質ドメインは、内部移行に必要とされる。
本明細書において使用される「濃縮された」は、それによって細胞の混合集団内に含有される目的の表現型が、集団内の他の表現型の細胞型と比較して数が増加する、ヒトの手によって開始される作用を指す。典型的に、濃縮は、ヒトの手によって開始される作用の前および後に、目的の表現型の細胞の数を比較することによって測定され、それによって、ヒトの手によって開始される作用の結果としての、目標とする細胞集団の相対数におけるあらゆる増加は、濃縮と考えられる。
本明細書において使用される「胚様体」は、懸濁培養液または凝集物中で非特異的な方法で霊長動物多能性幹細胞を分化させる場合、現われる未分化細胞、分化細胞、および部分的に分化した細胞を含む不均質の塊を指す。
本明細書において使用されるように、「胚性幹細胞」（ＥＳ）は、１）３つの胚葉への細胞の実質的な分化の前の、胚盤胞に由来するまたは２）その代わりに、樹立細胞株から得られる多能性幹細胞を指す。他に明示的に指定のない限り、用語は、ＥＳ細胞の表現型の特質を有する一次組織および樹立株ならびに多能性表現型を有するそのような株の子孫を含む。ＥＳ細胞は、ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳ）であってもよい。プロトタイプ「ヒト胚性幹細胞」（ｈＥＳ細胞）は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８；米国特許第６，２００，８０６号）によって記載されており、ＵＫ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）などのような多くの樹立幹細胞バンクのいずれか１つから得られてもよい。
本明細書において使用される「ＥｐＣＡＭ」は、上皮細胞接着分子である上皮細胞マーカーを指す。それは、上皮細胞およびほとんどすべての癌上に発現されるパン上皮分化抗原である。
本明細書において使用される「上皮細胞」は、ａ）うろこ状（薄い扁平）；ｂ）立方状（立方体様）；ｃ）円柱状（丈が高い）、ｄ）多列（細胞はすべて基底膜に達し、いくつかは表面までずっと及ぶが他のものは及ばない；ｅ）移行性（たとえば膀胱で見つけられる）、細胞は、いくつかの条件下でうろこ状に見え、他の条件下で丸く見えるかもしれず、上皮細胞と関連する少なくとも１つのマーカーを発現する、から選ばれる形態を有する細胞を指す。例示的な上皮マーカーは、ＥｐＣＡＭ；サイトケラチン；デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）を含む。
本明細書において使用される「対象外の表現型」は、望ましくない、細胞の混合集団内に含有される１つまたは複数の細胞型を指す。したがって、目的の表現型の細胞集団を含む細胞の混合集団において、目的の集団と異なる表現型を有するあらゆる細胞は、対象外と考えられてもよい。対象外の表現型の細胞は、除外のために標的とされてもよい。対象外の表現型の細胞の一例は、対象に投与された場合に集まって塊になった上皮構造を形成する潜在能力を有し、上皮細胞によって発現される１つまたは複数のマーカーを発現する細胞である。
本明細書において使用される「造血細胞」は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋リンパ球の両方を含むＴリンパ球、好中球、好塩基球、好酸球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、血小板、赤血球、ならびに肥満細胞などのような成熟した造血細胞（若年もしくは成体の霊長動物のいずれかから単離された、造血細胞の機能的な能力を持つ細胞）ならびに／または造血前駆体（造血細胞上に、それにおいて、もしくはそれによって発現される１つもしくは複数のマーカーを発現しおよび／または造血細胞と関連する１つもしくは複数の形態学的特質を有し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象に植え込まれた場合に成熟した造血細胞に分化するかもしれない細胞）を含む。
本明細書において使用される「肝細胞」は、成熟した肝細胞（若年もしくは成体の霊長動物のいずれかから単離された、肝細胞の機能的な能力を持つ細胞）ならびに／または肝細胞前駆体（肝細胞上に、それにおいて、もしくはそれによって発現される１つもしくは複数のマーカーを発現しおよび／または肝細胞と関連する１つもしくは複数の形態学的特質を有し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象に植え込まれた場合に成熟した肝細胞に分化するかもしれない細胞）を含む。
本明細書において使用される「島細胞」または「膵島細胞」は、成熟した島細胞（若年もしくは成体の霊長動物のいずれかから単離された、島細胞の機能的な能力を持つ細胞）ならびに／または島細胞前駆体（島細胞上に、それにおいて、もしくはそれによって発現される１つもしくは複数のマーカーを発現しおよび／または島細胞と関連する１つもしくは複数の形態学的特質を有し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ ｖｉｖｏで、すなわち対象に植え込まれた場合に成熟した島細胞に分化するかもしれない細胞）を含む。
本明細書において使用されるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫は、ｐＰＳ細胞の培養物にまたは既に１つもしくは複数の特異的な経路に沿って分化し始めたｐＰＳ細胞の培養物にヒトの手によって追加される１つまたは複数の増殖因子、サイトカイン、モルフォゲン、またはその他同種のものの追加によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｐＰＳ細胞から分化した細胞を指す。ｐＰＳを分化させるのに有用であってもよいさらなる適した作用物質は、マイクロＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ならびにＩＤＥ１、ＩＤＥ２、−（−）インドラクタム、およびスタウプリミドなどのような小分子を含む（Ｂｏｒｏｗｉｃｋら（２００９）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：３４８；Ｃｈｅｎら（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ４：２５８；Ｚｈｕ（２００９）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：４１６を参照されたい）。単に胚様体を形成することによってまたは１つもしくは複数の増殖因子、サイトカイン、モルフォゲン、もしくはその他同種のものを追加することなく、単に、ｐＰＳ細胞の培養物を、それらを含有する容器において過成長させることによって得られる偶発的または自発的な分化事象が定義から除かれる（市販で入手可能な細胞培養培地または市販で入手可能な血清産物もしくは血清置換産物において見つけられるかもしれないものを除く）。しかしながら、胚様体から分化した細胞は、定義に含まれる、ただし、１つまたは複数の増殖因子、サイトカイン、モルフォゲン、またはその他同種のものが、目的の表現型を得るための特定の経路に沿って分化を容易にするために、培養物に追加されることを条件とする。
本明細書において使用される「リガンド」は、第２の分子と特異的に相互作用して、化学結合を形成する第１の分子を指す。典型的に、結合は、イオン相互作用、水素結合、またはファンデルワールス力によって媒介される相互作用などのような非共有結合となるであろう。リガンドペア（つまり、上記に言及される第１および第２の分子）の例は、エピトープおよびそのエピトープに特異的に結合する抗体ならびに酵素に特異的に結合する基質を含む。２つの分子の間の解離定数（Ｋｄ）は、リガンドおよびその特異的な結合パートナーの間の親和性の１つの基準である。特異的な相互作用は、比較的小さなＫｄによって典型的に特徴付けられる。非常に高度な親和性（非常に小さなＫｄ）により互いに結合するリガンドペアの例は、ビオチン／アビジンである。対照的に、２つの分子の間の非特異的な結合は、電荷および疎水性に基づく化学結合の形成を含んでいてもよいが、特異的な結合と異なり、相互作用は、２つの分子の厳密な構造に基づくものではない。
本明細書において使用される「細胞の混合集団」は、１つを超える表現型から構成される細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物を指す。
本明細書において使用される「乏突起膠細胞」は、成熟した乏突起膠細胞（若年もしくは成体の霊長動物のいずれかから単離された、乏突起膠細胞の機能的な能力を持つ細胞）ならびに／または乏突起膠細胞前駆体（乏突起膠細胞上に、それにおいて、もしくはそれによって発現される１つもしくは複数のマーカーを発現しおよび／または乏突起膠細胞と関連する１つもしくは複数の形態学的特質を有し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象に植え込まれた場合に成熟した乏突起膠細胞に分化するかもしれない細胞）を含む。
本明細書において使用される「骨芽細胞」は、成熟した骨芽細胞（若年もしくは成体の霊長動物のいずれかから単離された、骨芽細胞の機能的な能力を持つ細胞）ならびに／または骨芽細胞前駆体（骨芽細胞上に、それにおいて、もしくはそれによって発現される１つもしくは複数のマーカーを発現しおよび／または骨芽細胞と関連する１つもしくは複数の形態学的特質を有し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象に植え込まれた場合に成熟した骨芽細胞に分化するかもしれない細胞）を含む。
本明細書において使用される「パンサイトケラチン」は、少なくとも１つのまたは複数のサイトケラチンファミリーメンバー上にまたはそれにおいて発現されるエピトープに結合する抗体または抗体の混合物を指す。
本明細書において使用されるように、「霊長動物多能性幹細胞」（ｐＰＳ）は、任意の供給源に由来してもよく、適切な条件下で、３つの胚葉のすべて（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の誘導体である異なる細胞型の霊長動物子孫を産生することができる細胞を指す。ｐＰＳ細胞は、８〜１２週齢のＳＣＩＤマウスにおいて奇形腫を形成する能力および／または組織培養において３つの胚葉すべての同定可能な細胞を形成する能力を有していてもよい。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞（たとえばＴｈｏｍｓｏｎら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５を参照されたい）およびヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞（たとえばＳｈａｍｂｌｏｔｔら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６を参照されたい）を含む様々な型の胚細胞；アカゲザル幹細胞（たとえばＴｈｏｍｓｏｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７８４４を参照されたい）、マーモセット幹細胞（たとえば（１９９６）ＴｈｏｍｓｏｎらＢｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４を参照されたい）などのような他の霊長動物からの胚性幹細胞、核移植技術によって生成された幹細胞（米国特許出願公開第２００２／００４６４１０号）、ならびに誘発多能性幹細胞（たとえばＹｕら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：５８５８）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２００７）Ｃｅｌｌ １３１（５）：８６１を参照されたい）が霊長動物多能性幹細胞の定義に含まれる。ｐＰＳ細胞は、細胞系として樹立され、したがって、ｐＰＳ細胞の継続的な供給源を提供してもよい。本明細書において記載される本発明の実施形態のいずれも、ｐＰＳ細胞の１つまたは複数の以下のサブ分類：ヒト胚性幹細胞、ヒト胚性生殖細胞、アカゲザル幹細胞、マーモセット幹細胞、核移植幹細胞、および／または誘発多能性幹細胞をｐＰＳ細胞と置換することによって実施されてもよいことが企図される。
本明細書において使用される「目的の表現型」または「目標とする表現型」は、ｐＰＳ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した望ましい細胞型を指す。
本明細書において使用されるように、「未分化霊長動物多能性幹細胞」は、集団における実質的な割合の霊長動物多能性幹細胞およびそれらの誘導体が未分化細胞の形態学的特質を示し、３つの胚葉：内胚葉、中胚葉、および外胚葉のそれぞれから少なくとも１つの細胞型を生じる性能を維持する細胞培養物を指す。集団内の未分化細胞のコロニーは、部分的に分化した近隣の細胞に囲まれてもよいことが理解される。
本明細書において使用される治療する、治療、治療することは、以下のいずれかを意味する：疾患または状態の重症度の低下；疾患過程の期間の低下；疾患または状態と関連する１つまたは複数の症状の回復；必ずしも疾患または状態を治癒するわけではないが、疾患または状態を有する対象への有益な効果の提供、疾患または状態と関連する１つまたは複数の症状の予防。
本発明は、対象外の表現型が、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む細胞培養物において時に存在するかもしれないという発見に、少なくとも部分的に関する。典型的に、これらの対象外の表現型は、まれであり、低レベルで存在する。対象外の表現型は、たとえば、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫が対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏで増えることによって現われるかもしれない。対象外の表現型の細胞の一例は、対象に植え込まれた場合に集まって塊になった上皮構造に発達する性能を有する細胞である。対象に植え込まれた場合に集まって塊になった上皮構造に発達する性能を有する細胞は、典型的に、上皮細胞によって発現される１つまたは複数のマーカーを発現してもよい。
ある種の対象外の表現型の細胞は、ＥｐＣＡＭ、デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、ＣＤ１０５（エンドグリン）、サイトケラチン、およびその他同種のものなどのような上皮細胞マーカーの存在によって同定されてもよいことが発見された。対象外の表現型の細胞の細胞表面上に発現される上皮マーカーは、対象外の表現型の細胞の存在を同定し、除外のためにこれらの細胞を標的とする両方のために、適したマーカーを提供する。ＥｐＣＡＭは、そのようなマーカーの例である。ＥｐＣａｍは、単独でまたは以下に記載される１つもしくは複数のマーカーと組み合わせて除外のために標的とされてもよい。したがって、ＥｐＣＡＭは、ＴＲＡ−１６０などのような未分化細胞上に見つけられるマーカーと共に除外のために標的とされてもよい。他の例は、１つまたは複数の以下のマーカーを含む：デスモコリン３；デスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン、ＣＤ４９ｆ、ＥＭＡ、Ｅ−ｃａｄ、ＣＤ３２１（Ｊａｍ１）、ＣＤ１０、ＣＤ６６、およびＣＤ１０５（エンドグリン）。したがって、以下に記載されるマーカーは、対象外の表現型を有する細胞を含むまたはたとえば対象に植え込まれた場合に、対象外の表現型を有する細胞に発達するかもしれない細胞を含む細胞の混合集団からの除去／除外のためにこれらの細胞を標的とするのに使用されてもよい。
驚いたことに、これらの上皮マーカーを発現する細胞のある種の亜母集団もまた、ＴＲＡ−１−６０などのような、未分化ｐＰＳ細胞上に見つけられるマーカーを発現することもまた発見された。したがって、適したリガンドを有する上皮細胞マーカーを発現する細胞のターゲティングは、集団における対象外の表現型の細胞の数を減少させるだけではなく、それはまた、多能性幹細胞を含むかもしれない細胞培養物中の未分化ｐＰＳ細胞と関連するマーカーを発現する細胞の数を最小限にすることを容易にしてもよい。
細胞の混合集団から対象外の表現型細胞を低下させるための方法
ある実施形態では、本発明は、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、対象外の表現型を有する細胞に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップおよび次いで、集団から対象外の表現型の細胞を分離するステップを含む方法を提供する。細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含んでいてもよい。
混合性の細胞集団は、適したバッファー中でリガンドと接触させてもよい。適したバッファーは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または細胞の混合集団の生存を容易にする任意の市販で入手可能な細胞培養培地を含んでいてもよい。典型的に、バッファーは、等張バッファーであり、約６．８〜約７．７、約６．９〜約７．６；約７．０〜約７．５の範囲のｐＨを有するであろう。いくつかの実施形態では、バッファーのｐＨは、生理的ｐＨとなるであろう。
方法は、マイクロウェルプレートの単一のウェルから得られる試料サイズ〜スケールアップバイオリアクターから得られる試料の範囲の、広範囲の試料容量にわたって適応可能である。混合性の細胞集団を接触させるのに適した容量は、約５０μＬ〜約１０，０００リットルの範囲とすることができる。いくつかの実施形態では、細胞の混合物を接触させるのに適した容量は、約１００μＬ、約２００μＬ、約５００μＬ、約１ｍＬ、約１０ｍＬ、約５０ｍＬ、約１００ｍＬ、約１リットル、約１０リットル、約５０リットル、約１００リットル、約１０００リットル、約２０００リットル、約５０００リットル、約８，０００リットル、約１０，０００リットル以上である。
混合性の細胞集団を含む細胞数に対するリガンドの任意の適した比が使用されてもよい。たとえば、細胞数に対するリガンドの適した比は、約１：１；約１０：１；約１００：１；約１０００：１；約１０，０００：１；約１０５：１；約１０６：１；約１０７：１；約１０８：１；約１０９：１；約１０１０：１であってもよい。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ビーズなどのような固体担体に連結されてもよい。複数のリガンド連結ビーズは、細胞の混合集団中に存在する対象外の表現型の細胞の数を低下させるために使用されてもよい。たとえば、ビーズの適した数は、細胞当たり約１つのビーズ；細胞当たり約５つのビーズ；細胞当たり約１０のビーズ；細胞当たり約１５のビーズ；細胞当たり約２０のビーズ；細胞当たり約２５のビーズ；細胞当たり約３０のビーズ；細胞当たり約３５のビーズ；細胞当たり約４０のビーズ；細胞当たり約４５のビーズ；細胞当たり約５０のビーズ；細胞当たり約６０のビーズ；細胞当たり約７０のビーズ；細胞当たり約８０のビーズ；細胞当たり約９０のビーズ；細胞当たり約１００のビーズの範囲であってもよい。さらにはそれぞれのビーズに少なくとも１０のリガンド；少なくとも１００のリガンド；少なくとも１０００のリガンド；少なくとも１０，０００のリガンド；少なくとも１０５のリガンド；少なくとも１０６のリガンド；少なくとも１０７のリガンド；少なくとも１０８のリガンド；少なくとも１０９のリガンド；少なくとも１０１０のリガンド；少なくとも１０２０のリガンド；少なくとも１０３０のリガンド、少なくとも１０４０のリガンド、少なくとも１０５０のリガンドが連結されてもよい。
典型的に、本発明の方法は、リガンドの結合パートナーを発現する対象外の表現型の細胞へのリガンドの結合を容易にするためにリガンドおよび混合性の細胞集団を同時にインキュベートするステップを含む。リガンドおよび混合性の細胞集団は、約３℃〜約４０℃の範囲の温度でインキュベートされてもよい。いくつかの実施形態では、リガンドおよび混合性の細胞集団は、約４℃、約２０℃、約３７℃でインキュベートされてもよい。リガンドおよび細胞の混合集団をインキュベートするための時間の適した長さは、約１分間〜約６０分間、約５分間〜約５０分間、約１０分間〜約４０分間の範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、リガンドおよび混合性の細胞集団は、約１０分間、約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約６０分間インキュベートされてもよい。リガンドと混合性の細胞集団を接触させた後、細胞は、非特異的に結合したリガンドを洗浄するために適したバッファーを用いて１回または複数回、洗浄されてもよい。適したバッファーは、ＰＢＳ、任意の市販で入手可能な等張バッファー、または培地を含む。
リガンドが結合した細胞の分離は、混合物を分離するための当技術分野において既知の任意の方法によって達成されてもよい。たとえば、リガンドは、以下に記載されるように検出可能な物質を用いてタグをつけられてもよく、分離は、蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用して細胞選別によって達成されてもよい。他の例として、リガンドは、以下に記載されるように固体担体に連結されてもよい。リガンドが結合した細胞は、重力によって沈殿させてもよい。その代わりに、外部の力は、リガンドが結合した細胞が、細胞の混合集団を含む他の細胞から分離するように、リガンドが結合した細胞に加えられてもよい。たとえば、リガンドは、磁気ビーズなどのような磁化した固体担体に連結されてもよく、リガンドが結合した細胞を含む混合性の細胞集団は、リガンドが結合した細胞が、細胞の混合集団を含む他の細胞から分離するように、磁場に曝露されてもよい。
他の実施形態では、細胞は、対象外の表現型と考えられる細胞によって発現される分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと接触させてもよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、細胞と接触させる前に、化学薬品とコンジュゲートされてもよい。他の実施形態では、リガンドは、最初に細胞に結合させ、次いで、化学薬品と接触させてもよい。したがって、リガンドが結合した細胞は、リガンドが結合した細胞に結合する化学薬品、たとえばリガンドに特異的に結合する作用物質を用いて標的とされてもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の介在するリガンドが、使用されてもよい。したがって、第１のリガンドは、細胞に結合してもよい。第２のリガンドは、第１のリガンドに結合してもよい、などであってもよい。化学薬品は、細胞に結合したリガンドのいずれかに結合してもよい。作用物質は、毒素であってもよく、それによって、リガンドが結合した細胞へのその結合は、細胞を死滅させてもよい。適した毒素の例は、ジフテリア毒素、破傷風毒素、およびその他同種のものを含む。作用物質は、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質であってもよい。リガンドが免疫グロブリンである一実施形態では、化学薬品は、補体であってもよい。
分離が実行される場合、対象外の表現型の細胞は、リガンドからの除去または溶出によって採取されてもよい。対象外の表現型の細胞の溶出は、結合した細胞を含有するバッファーのｐＨおよび結合した細胞を含有するバッファーの塩濃度などのような１つまたは複数の結合条件を改変することによって達成されてもよい。
リガンド
対象外の表現型を有する細胞によって発現されるマーカーに特異的に結合する任意の適したリガンドが、使用されてもよい。リガンドは、タンパク質または完全長タンパク質のペプチド断片から構成されてもよい。適したタンパク質は、対象外の表現型の細胞の表面上に発現された分子に特異的に結合するタンパク質またはペプチドを含むであろうが、いくつかの実施形態では、リガンドは、細胞内の標的に結合してもよい。リガンドはまた、核酸、糖、脂質、糖タンパク質、もしくはレクチンまたはこれらのいずれかの組み合わせまたはタンパク質もしくはペプチドおよびこれらのいずれかの組み合わせから構成されてもよい。したがって、特異的な結合ペアを含む任意のリガンドは、それが、対象外の表現型を含む細胞によって発現される分子に特異的に結合し、目的の表現型の細胞に結合しない限り、使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のリガンドが、使用されてもよい。したがって、第１のリガンドは、対象外の表現型の細胞によって発現されるマーカーに直接結合してもよく、次いで、第２のリガンドは、第１のリガンドに結合してもよい。第２または任意の続くリガンドに結合するさらなるリガンドもまた企図される。第２の（または続く）リガンドは、当技術分野において既知の任意の方法、たとえばＦＡＣＳによる細胞選別；固体担体に結合したリガンドの沈殿；磁気基質に結合したリガンドの磁気分離；固体担体に連結されたリガンドに対するカラムクロマトグラフイーによる、第１のリガンドに結合した細胞の分離を容易にするタグを含んでいてもよい。もちろん、範囲外の表現型の（ｅｘｔｒａ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ）細胞によって発現される複数の分子は、それぞれ別個のリガンドと結合させてもよく、それぞれのそれらのリガンドは、さらには、１つまたは複数のさらなるリガンドと接触させてもよい。
いくつかの実施形態では、リガンドは、抗体であってもよい。本明細書において使用される抗体は、免疫グロブリンまたはその部分を含み、供給源、産生の方法、および他の特質に関係なく抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。用語は、たとえばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、およびＣＤＲ移植抗体ならびに２つの重鎖および２つの軽鎖から構成される分子を含む。抗体の部分は、なお抗原に結合することができる任意の断片、たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖを含むことができる。いくつかの実施形態では、抗体は、対象外の表現型の細胞上に見つけられるエピトープに特異的に結合する可変領域および固体担体または第２のリガンドへの結合を容易にするために、Ｆｃ領域の少なくとも１つの部分を含んでいてもよい。抗体は、以下に記載されるように固体担体に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、固体担体は、ビーズであってもよい。特定の実施形態では、ビーズは、磁化されてもよい。
ある実施形態では、適したリガンドは、上皮細胞または上皮系列細胞の表面上に発現されるエピトープに対する抗体であってもよい。エピトープは、上皮細胞の表面上に発現されるタンパク質、炭水化物、糖、および／または脂質から構成されてもよい。適したエピトープは、１つまたは複数の以下の分子を発現する細胞上に見つけられてもよい：ＥｐＣＡＭ；デスモコリン、たとえばデスモコリン３；デスモグレイン、たとえばデスモグレイン２；Ｅ−カドヘリン。したがって、ＥｐＣＡＭ、デスモコリン、たとえばデスモコリン３、デスモグレイン、たとえばデスモグレイン２、Ｅ−カドヘリンに結合する抗体は、以下に記載される方法を実施するのに適したリガンドであってもよい。これらの抗体は、単独でまたは１つもしくは複数のさらなるリガンドと組み合わせて使用されてもよい。さらなるリガンドは、上皮細胞によって特異的に発現される分子に特異的に結合するリガンドを含んでいてもよい。その代わりに、リガンドは、未分化ｐＰＳ細胞によって発現される１つまたは複数の分子に結合するリガンドと組み合わせられてもよい。たとえば、未分化細胞上に見つけられるエピトープに結合する抗体は、上皮細胞上に見つけられる１つまたは複数のマーカーを発現する細胞に結合するリガンドと組み合わせて使用されてもよい。したがって、混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法において使用されてもよい、適した抗体の例は、上皮細胞によって発現される１つまたは複数のマーカーに結合するリガンドに加えて、ＴＲＡ−１−６０；ＴＲＡ−１−８１；ＳＳＥＡ３；ＳＳＥＡ４；（Ｔｈｏｍｓｏｎ １９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５を参照されたい）、Ｃｒｉｐｔｏ、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）受容体、およびポドカリキシン様タンパク質（米国特許出願第１０／３８８，５７８号を参照されたい）に対する抗体を含んでいてもよい。
リガンドは、結合した細胞の同定および／または単離を容易にするために、検出可能な物質と共有結合でまたは非共有結合でカップルされてもよいまたは連結されてもよい。検出可能な物質は、リガンドに付着した場合に、このリガンドの存在の認識を可能にする任意の化合物を含んでいてもよい。化合物はたとえば、放射性分子、蛍光性分子、ハプテン、キャリヤー、酵素、ビオチンなどのような介在分子、または色素を含むことができる。検出可能な物質は、たとえば化学発光材料または生物発光材料であってもよい。リガンドはまた、細胞死、細胞溶解などを誘発する任意の分子などのような毒素と連結されてもよい。
ある実施形態では、リガンドは、固体担体にカップルされてもよいまたは連結されてもよい。固体担体は、ビーズ、ゲル、モノリス（ｍｏｎｏｌｉｔｈ）、または膜を含んでいてもよい。固体担体は、対象のリガンドに連結することができる任意の材料を含んでいてもよい（たとえばポリスチレン、セファロース、セファデックス）。固体担体は、ポリアクリル、ビニルポリマー、アクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、およびポリオレフィンなどのような任意の合成有機ポリマーを含んでいてもよい。固体担体はまた、炭水化物ポリマー、たとえばアガロース、セルロース、ヒアルロン酸、キチン、アシルゲラン（ａｃｙｌ ｇｅｌｌａｎ）、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルキチン、ポリ（ラクチド−コ−エチレングリコール）を含んでいてもよい。固体担体は、たとえばニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、またはカルボキシル化ポリビニリデンを含んでいてもよい（米国特許第６，０３７，１２４号）。固体担体は、ポリビニルベンジルジメチルヒドロキシエチル塩化アンモニウム、ポリビニルベンジルベンゾイルアミノエチルジメチル塩化アンモニウム、ポリビニルベンジルトリブチル塩化アンモニウム、ポリビニルベンジルトリヘキシル塩化アンモニウムおよびポリビニルベンジルトリブチル塩化アンモニウムのコポリマー、ポリビニルベンジルジメチル塩化アンモニウムおよびポリビニルアミノエチルジメチル塩化アンモニウムのコポリマーを用いてコーティングされてもよい（米国特許第５，３３６，５９６号）。固体担体は、シリカ、ジルコニア、たとえば炭素クラッドジルコニア（ｃａｒｂｏｎ ｃｌａｄ ｚｉｒｃｏｎｉａ）（米国特許第５，１８２，０１６号）、チタニア、セリア、アルミナ、マンガン、マグネシア（つまり酸化マグネシウム）、酸化カルシウム、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）などのような無機酸化物を含んでいてもよい。固体担体はまた、デキストラン−アクリルアミドを含むが、これらに限定されない前述の担体のいくつかの組み合わせを含んでいてもよい。固体担体は、たとえば、アルブミン、カゼイン、およびその他同種のものなどのような１つまたは複数のブロックタンパク質を用いてそれをコーティングすることによって、非特異的な相互作用を最小限にするように調製されてもよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、固体担体および検出可能な物質の両方に連結されてもよい。
いくつかの実施形態では、リガンドは、固体担体へのリガンドの共有結合を容易にする条件下で、適した濃度のリガンドおよびビーズを混合することによって、ビーズなどのような固体担体に連結されてもよい。リガンドおよびビーズの適した濃度は、約０．１ｍｇリガンド／ｍＬビーズ〜約２０ｍｇリガンド／ｍＬビーズ；約０．５ｍｇリガンド／ｍＬビーズ〜約１０ｍｇリガンド／ｍＬビーズ；約１．０ｍｇリガンド／ｍＬビーズ〜約５ｍｇリガンド／ｍＬビーズの範囲である。いくつかの実施形態では、約１ｍｇリガンド／ｍＬビーズが、使用されてもよい。他の実施形態では、約２ｍｇリガンド／ｍＬビーズが、使用されてもよい。いくつかの実施形態では、約３ｍｇリガンド／ｍＬビーズが、使用されてもよい。他の実施形態では、約４ｍｇリガンド／ｍＬビーズが、使用されてもよい。他の実施形態では、約５ｍｇリガンド／ｍＬビーズが、使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、抗体は、ＥＨＳエステルの形成などのような既知のコンジュゲーション化学を使用して、ビーズに直接連結されてもよい。他の実施形態では、抗体の特異的な結合パートナーは、ビーズに直接連結されてもよく、抗体は、さらには、特異的な結合パートナーに結合し、したがって、それをビーズに連結してもよい。特異的な結合パートナーは、その特異的なエピトープに結合しない抗体の領域、たとえば抗体の非可変領域に結合してもよい。適した領域は、抗体のＦｃ領域を含んでいてもよい。抗体のＦｃ領域に結合する結合パートナーの例は、プロテインＡおよびプロテインＧを含む。その代わりに、抗体は、ビオチンなどのような他の分子にコンジュゲートし、次いで、ストレプトアビジンとコンジュゲートしたビーズにカップルされてもよい。
特定の一実施形態では、リガンドは、たとえば、磁気ビーズなどのようなビーズに共有結合された、ＥｐＣＡＭに対する抗体である。抗体は、ビーズに直接連結されてもよいまたは先の段落において記載されるように、プロテインＡ、プロテインＧ、ビオチン、ストレプトアビジンなどのような介在分子によって間接的に連結されてもよい。その代わりに、短いリンカーは、ビーズに抗体を固着させるように果たし、それによって抗体の結合到達性を増強してもよい。リンカーは、たとえば、１つまたは複数のアミノ酸から構成されてもよい。
他の特定の実施形態では、リガンドは、たとえば、磁気ビーズなどのようなビーズに、共有結合された、ＴＲＡ−１−６０に対する抗体であってもよい。抗体は、ビーズに直接連結されてもよいまたは先の段落において記載されるように、プロテインＡ、プロテインＧ、ビオチン、ストレプトアビジンなどのような介在分子によって間接的に連結されてもよい。その代わりに、短いリンカーは、ビーズに抗体を固着させるように果たし、それによって抗体の結合到達性を増強してもよい。リンカーは、たとえば、１つまたは複数のアミノ酸から構成されてもよい。ＴＲＡ−１−６０に対する抗体は、いくつかの実施形態では、ＩｇＧアイソタイプを有していてもよい。他の実施形態では、ＴＲＡ−１−６０に対する抗体は、ＩｇＭアイソタイプを有していてもよい。
いくつかの実施形態では、上皮細胞によって発現されるマーカーに対する１つまたは複数の抗体の組み合わせは、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞を除外するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、上皮細胞によって発現されるマーカーに対する１つまたは複数の抗体は、未分化細胞によって発現されるマーカーに対する１つまたは複数の抗体と組み合わせられてもよい。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに対する１つまたは複数の抗体およびＴＲＡ−１−６０に対する１つまたは複数の抗体の組み合わせは、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞を除外するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、使用される抗体はすべて、ＩｇＧアイソタイプを有していてもよい。他の実施形態では、抗体のうちの少なくとも１つは、ＩｇＧアイソタイプを有していてもよい。さらに他の実施形態では、抗体のうちの少なくとも１つは、ＩｇＭアイソタイプを有していてもよい。
細胞集団
ある実施形態では、本発明は、目標とする表現型について濃縮された、細胞の混合集団を提供する。細胞の混合集団は、細胞の混合集団から対象外の表現型を有する少なくとも１つの細胞を排除することによって、目標とする細胞型について濃縮されてもよい。
１．対象外の表現型
いくつかの実施形態では、対象外の表現型の細胞は、たとえば、上皮形態を有する細胞、上皮細胞においてまたは上に発現される少なくとも１つのマーカーを発現する細胞、対象に植え込まれた場合に集まって塊になった上皮構造を形成することができる細胞、未分化多能性細胞、未分化細胞の形態を有する細胞、未分化細胞においてまたは上に発現される少なくとも１つのマーカーを発現する細胞を含んでいてもよい。未分化細胞においてまたはその上に発現されるマーカーの例は、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１；ＳＳＥＡ３；ＳＳＥＡ４；Ｏｃｔ４を含む。上皮細胞においてまたは上に発現されるマーカーの例は、ＥｐＣＡＭおよびサイトケラチンを含む。上皮細胞上に発現される他の適したマーカーは、デスモコリン、デスモグレイン、およびＥ−カドヘリンを含んでいてもよい。これらの細胞は、げっ歯動物などのような対象に植え込まれた場合に上皮塊を形成する性能を有していてもよい。
２．目標とする表現型
目標とする表現型の細胞は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫であってもよく、以下のいずれかを含んでいてもよい：乏突起膠細胞、ニューロンおよびアストロサイトなどのような神経細胞、心筋細胞、造血細胞、膵島細胞、肝細胞、骨芽細胞、ならびに軟骨細胞。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、成熟した心筋細胞、成熟した乏突起膠細胞などのような成熟した目的の細胞であってもよい。他の実施形態では、目標とする細胞型は、心筋細胞前駆体、乏突起膠細胞前駆体、神経細胞前駆体、島細胞前駆体、造血細胞前駆体、肝細胞前駆体、骨芽細胞前駆体、軟骨前駆体などのような前駆体細胞であってもよい。前駆体細胞は、対応する成熟細胞型によって発現される１つもしくは複数のマーカーを発現してもよいおよび／または対応する成熟細胞型上に見つけられる１つもしくは複数の形態学的特徴を有していてもよいおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて対応する成熟細胞型に分化する能力を有していてもよい。目標とする細胞型は、以下の細胞型のうちの１つの上に、において、またはによって発現される１つまたは複数のマーカーを発現する細胞を含んでいてもよい：乏突起膠細胞、神経細胞心筋細胞、造血細胞、膵島細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞（適したマーカーの例は、続く段落において提供される）。マーカーは、当技術分野において既知の任意の方法を使用して検出されてもよく、たとえば、免疫細胞化学、免疫組織化学的検査、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、またはｑＰＣＲは、目的の細胞上に、において、またはによって発現される１つまたは複数のマーカーを検出するために使用されてもよい。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｐＰＳ細胞を乏突起膠細胞に分化させるための方法は、その全体が参照によってこれによって組み込まれる米国特許第７，２８５，４１５号において記載されている。乏突起膠細胞は、たとえば、ｐＰＳ細胞を増殖因子、甲状腺ホルモン受容体に対するリガンド、およびレチノイン酸受容体に対するリガンドと接触させることによって、ｐＰＳ細胞の集団からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させてもよい。乏突起膠細胞上に、において、またはによって発現されるマーカーは、ＮＧ２、マクロファージおよび乏突起膠細胞前駆体によって発現される硫酸コンドロイチンプロテオグリカン；ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、コミットした乏突起膠細胞についてのマーカー；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、成熟ミエリンのマーカー；微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ−２）、ＣＮＳ細胞についてのマーカー；ミエリンプロテオリピドタンパク質、乏突起膠細胞および膠細胞前駆体上に発現されるミエリンの構成成分；Ｏ４抗体によって決定されるエピトープ、乏突起膠細胞、アストロサイト、およびそれらの前駆体についてのマーカー；Ａ２Ｂ５、２型アストロサイト、膠細胞前駆体、および乏突起膠細胞前駆体上に発現されるエピトープ；乏突起膠細胞およびそれらのプロセスを染色し、脊髄および小脳の両方における有髄軸索と一致する、ＲＩＰ抗体によって認識されるエピトープを含む。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて神経細胞にｐＰＳ細胞を分化させるための方法は、記載されている。たとえば、すべて、それらの全体が参照によって組み込まれる米国特許第６，８３３，２６９号；米国特許出願公開第２００５／００９５７０７号；第２００５／０１５８８５５号を参照されたい。神経細胞は、たとえば、ｐＰＳ細胞を、ノギンおよび／もしくはフォリスタチンと接触させることによって；ｐＰＳ細胞をＴＧＦβアンタゴニストと接触させることによって、または胚様体（ＥＢ）を形成し、１０μＭレチノイン酸を有する懸濁液中でＥＢを培養し、次いで、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）を補足した限定培地に細胞を平板培養することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＳ細胞の集団から分化させてもよい。神経細胞上に、において、またはによって発現されるマーカーは、ＮＣＡＭ、Ａ２Ｂ５、βチューブリンＩＩＩ、および微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）を含む。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて心筋細胞にｐＰＳを分化させるための方法は、記載されている。たとえば、すべて、それらの全体が参照によって組み込まれる米国特許第７，４５２，７１８号；第７，４２５，４４８号；米国特許出願公開第２００５／００５４０９２号；第２００７／００１００１２号を参照されたい。ｐＰＳ細胞は、ｐＰＳ細胞を心筋細胞に分化させるために、アクチビン、その後に骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）と接触させてもよい。心筋細胞上に、において、またはによって発現されるマーカーは、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、横紋筋収縮の調節のためにカルシウム感受性分子スイッチを提供するトロポニン複合体のサブユニット；心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）；Ｎｋｘ２．５、発達中の心臓において存続する、初期の胚発生の間に心臓中胚葉において発現される心臓転写因子；心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、発達中の心臓および胎児の心筋細胞において発現されるが、成人においてダウンレギュレートされるホルモンを含む。他の適したマーカーは、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、特に心臓特異的なβ鎖；タイチン、トロポミオシン、α筋節アクチニン、およびデスミン；ＧＡＴＡ−４、心臓中胚葉において高度に発現され、発達中の心臓において存続する転写因子を含む。さらに他の適したマーカーは、ＭＥＦ ２Ａ、ＭＥＦ ２Ｂ、ＭＥＦ ２Ｃ、ＭＥＦ ２Ｄ；心臓細胞の間の接着を媒介するＮ−カドヘリン；心筋細胞の間でギャップジャンクションを形成するコネキシン４３；β１アドレノセプター（β１ ＡＲ）；心筋梗塞の後に血清において上昇するクレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ ＭＢ）およびミオグロビン；α心臓アクチンを含む。
ｐＰＳ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて造血細胞に分化させるための方法は、記載されている。たとえば、すべて、それらの全体が参照によってこれによって組み込まれる米国特許第７，２４７，４８０号；米国特許出願第１２／４１２，４８０号、および米国特許出願公開第２００５／０２８２２７２号を参照されたい。例として、ｐＰＳ細胞は、ｐＰＳ細胞を未成熟樹状細胞に分化させるために、ＢＭＰ−４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などのような複数のサイトカインとｐＰＳ細胞を接触させることによって、樹状細胞に分化させてもよい。次いで、未成熟樹状細胞は、成熟樹状細胞を生成するために、成熟反応混液、たとえばＧＭ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン１−β（ＩＬ−１β）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）と接触させてもよい。造血細胞において、上に、またはによって発現されるマーカーは、ＣＤ３４、ＣＤ５９、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０、ＣＤ３８、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７、ＣＤ１３、ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）、およびＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６４、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ 、ＣＤ８３、ＣＣＲ７、ＣＤ２０５、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ１１９、ＣＤ７４、ＣＤ７１、ＣＤ７５、ＣＤ５１、ＣＤ５６、ＣＤ６５、ＣＤ１０、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４４、ベータグロビン、ならびにミオグロビンを含む。
ｐＰＳ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて島細胞に分化させるための方法は、記載されている。たとえば、両方とも、それらの全体が参照によって組み込まれる米国特許第７，０３３，８３１号および米国特許出願第１２／３０３，８９５号を参照されたい。例として、ｐＰＳ細胞は、最初に、ｐＰＳ細胞を、アクチビンおよび酪酸ナトリウム、その後、ノギン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、およびニコチン酸アミドと接触させることによって島細胞に分化させてもよい。島細胞（島細胞前駆体を含む）において、上に、またはによって発現されるマーカーは、インスリン、ｃ−ペプチド、Ｈｌｘｂ９、Ｐｄｘ１、ニューロゲニン３、Ｐａｘ４、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｉｓｌ１、Ｎｋｘ２．２、およびＮｋｘ６．１；膵臓ポリペプチド、島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、Ｉｓｌｅｔ１、Ｂｅｔａ２／ＮｅｕｒｏＤ、ＨＮＦ４ａを含む。最終的な内胚葉細胞、Ｓｏｘ１７およびＨＮＦ３βを発現する特定の島前駆体細胞もまた、含まれる。
ｐＰＳ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて肝細胞に分化させるための方法は、記載されている。たとえば、すべて、それらの全体が参照によって組み込まれる米国特許第６，４５８，５８９号；第６，５０６，５７４号；第７，２５６，０４２号；第７，４７３，５５５号；および米国特許出願号１２／３０３，１０４号を参照されたい。たとえば、ｐＰＳ細胞は、ｐＰＳ細胞を、ＤＭＳＯおよびブチレート、その後、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、およびブチレートと接触させることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて肝細胞に分化させてもよい。肝細胞において、上に、またはによって発現されるマーカーは、α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、アルブミン；アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ−１またはＡＳＧＲ−２アイソタイプのいずれか）；Ｃｋ８、Ｃｋ１８、Ｃｋ１９、シトクロムｐ４５０、ＣＹＰ１Ａ１／２ｄ、ＣＹＰ２Ａ６ ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ３−５、グルコース−６−ホスファターゼ；ＨＮＦ−４α、α−フェトプロテイン、ａｐｏＥ、グルコキナーゼ、インスリン様増殖因子１および２受容体、インスリン受容体、レプチン、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＩ、ａｐｏＢ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＣＩＩ、アルドラーゼＢ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、Ｌ形脂肪酸結合タンパク質、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、およびＮＡＤＰＨ−Ｃｃを含む。
ｐＰＳ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて骨芽細胞に分化させるための方法は、記載されている。たとえば、参照によってその全体が組み込まれる米国特許出願第２００５／０２８２７４号を参照されたい。たとえば、ｐＰＳ細胞は、ｐＰＳ細胞を、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ヒトＴＧＦ−β受容体に対するリガンド、またはビタミンＤ受容体に対するリガンドと接触させることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて骨芽細胞に分化させてもよい。細胞も、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−ホスフェート、ならびにカルシウムおよびホスフェートの供給源と接触させてもよい。骨芽細胞において、上に、またはによって発現されるマーカーは、オステオカルシン、オステオネクチン、１型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、ＢＭＰ受容体、ＰＴＨ受容体、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ）、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）、ＣＤ２９、ＣＤ４４、およびＧＡＴＡ４を含む。
ｐＰＳ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて軟骨細胞に分化させるための方法は、記載されている。たとえば米国特許出願第２００６／０１４８０７７号を参照されたい。たとえば、ｐＰＳ細胞は、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ヘッジホッグタンパク質（ＨＨ）、Ｌ‐アスコルビン酸、および副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）とｐＰＳ細胞を接触させることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて軟骨細胞に分化させてもよい。細胞は、微量（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）で分化プロセスの間に培養物中に維持されてもよい。軟骨細胞において、上に、またはによって発現されるマーカーは、ＩＩ型コラーゲンまたはアグレカンを含む。
濃縮された細胞集団
上記に議論されるように、本発明は、目的の表現型について濃縮された細胞集団を提供する。細胞集団は、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させることによって濃縮されてもよい。対象外の表現型の細胞は、以下に議論されるように、上皮細胞によって発現される１つまたは複数のマーカーを発現してもよい。対象外の表現型の細胞は、上皮細胞の形態を有していてもよい。対象外の表現型の細胞は、対象に植え込まれた場合に集まって塊になった上皮構造を形成する能力を有していてもよい。対象外の表現型の細胞は、未分化ｐＰＳ細胞であってもよい。対象外の表現型の細胞は、ｐＰＳ細胞によって発現される１つまたは複数のマーカー、たとえばＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４を発現する細胞であってもよい。対象外の表現型の細胞は、この段落において記載される１つまたは複数の対象外の表現型の細胞の組み合わせを含んでいてもよい。したがって、ある実施形態では、本発明は、目標とする表現型を含む細胞の濃縮された集団であって、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の対象外の表現型の細胞は、目的の細胞表現型を含む細胞集団から除去される、細胞の濃縮された集団を提供する。
他の実施形態では、本発明は、目標とする表現型を含む混合性の細胞集団であって、対象外の表現型を有する少なくとも１つの細胞は、混合集団から除去され、目的の表現型は、対象外の表現型を有する少なくとも１つの細胞が除去された後に、集団において、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の細胞を含む、混合性の細胞集団を提供する。目標とする細胞型は、乏突起膠細胞、神経細胞、心筋細胞、造血細胞、膵島細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞からまたは乏突起膠細胞、神経細胞、心筋細胞、造血細胞、膵島細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる細胞上に、において、もしくはによって発現される１つもしくは複数のマーカーを発現する細胞から選ばれてもよい。
キット
ある実施形態では、本発明は、細胞の混合集団から対象外の表現型を有する細胞を除外するためのキットであって、細胞の混合集団は、目標とする表現型の細胞および対象外の表現型の細胞を含む、キットを提供する。両方の細胞型は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ子孫であってもよい。たとえば、目標とする表現型の細胞は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫から構成されてもよいが、対象外の表現型の細胞は、ｐＰＳ細胞の分化子孫、ｐＰＳ細胞の未分化子孫、または両方の組み合わせを含んでいてもよい。キットは、対象外の表現型を含む細胞によって発現される１つまたは複数の分子に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドを含んでいてもよい。１つまたは複数のリガンドは、１つまたは複数の容器中で提供されてもよい。リガンドは、水性バッファー、たとえば等張バッファー、ＰＢＳ、またはその他同種のものなどのような溶液中で提供されてもよい。その代わりに、１つまたは複数のリガンドは、凍結乾燥形態で提供されてもよい。キットは、凍結乾燥リガンドを還元するための説明書を含んでいてもよい。キットは、リガンドと細胞の混合集団を接触させるための説明書を含んでいてもよい。説明書は、対象外の表現型を除外するために使用するための、適した濃度のリガンドを含んでいてもよい。任意選択で、キットは、１つまたは複数のコントロール、たとえば、提供される１つまたは複数のリガンドに結合するであろうポジティブコントロール細胞型および１つまたは複数の提供されるリガンドに結合しないであろうネガティブコントロール細胞型を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、キット中に提供されるリガンドは、抗体であってもよい。リガンドは、対象外の表現型を含む細胞によって発現される分子に結合する抗体であってもよい。適した抗体の例は、ＴＲＡ−１−６０抗体、ＥｐＣＡＭ抗体、パンサイトケラチン抗体などのようなサイトケラチン抗体、ＴＲＡ−１−８１に対する抗体、ＳＳＥＡ３に対する抗体、およびＳＳＥＡ４に対する抗体を含む。抗体は、任意のアイソタイプ、たとえばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤであってもよい。一実施形態では、抗体は、ＥｐＣＡＭに結合するＩｇＧであってもよい。一実施形態では、抗体は、サイトケラチンに結合するＩｇＧであってもよい。一実施形態では、複数のサイトケラチン上の異なるエピトープに結合する複数のＩｇＧ抗体が、使用されてもよい。一実施形態では、抗体は、ＴＲＡ−１−６０に結合するＩｇＭであってもよい。一実施形態では、抗体は、ＴＲＡ−１−６０に結合するＩｇＧであってもよい。一実施形態では、異なる抗体の組み合わせ、たとえば、この段落において記載される複数のタイプの抗体が、使用されてもよい。したがって、単一の抗原（しかし異なるエピトープ）に向けられる複数の抗体が、使用されてもよい。複数の抗原に向けられる複数の抗体が、使用されてもよい。
キットは、リガンドに対する固体担体を含んでいてもよい。固体担体は、以下に詳細に記載される。リガンドは、単一の容器中で固体担体に既に連結されて提供されてもよい。その代わりに、キットは、互いに連結されていない抗体および固体担体を提供してもよい。固体担体およびリガンドは、したがって、別々の容器中で提供されてもよい。キットは、リガンドを固体担体に連結するための説明書および１つまたは複数の試薬を提供してもよい。
キットは、キット中に提供される１つまたは複数のリガンドに連結されてもよい１つまたは複数の検出可能な物質をさらに含んでいてもよい。検出可能な物質は、以下に詳細に記載される。１つまたは複数の検出可能な物質は、それぞれ、１つまたは複数の検出可能な物質を１つまたは複数のリガンドに連結するための説明書と共に、１つまたは複数の別々の容器中で提供されてもよい。
キットは、細胞の混合集団からの、リガンドが結合した対象外の表現型の細胞の分離を容易にするために、細胞の混合集団が、固体担体に結合したリガンドと接触した後に、細胞の混合集団に外部の力を加えるための手段を提供してもよい。外部の力は、磁場であってもよい。
一実施形態では、キットは、ＥｐＣＡＭに対する抗体、サイトケラチンに対する抗体、たとえばパンサイトケラチン、デスモコリンに対する抗体、デスモグレインに対する抗体、およびＥ−カドヘリンに対する抗体、ならびに／またはＴＲＡ−１−６０に対する抗体から選ばれる１つまたは複数の抗体を含んでいてもよい。１つまたは複数の抗体は、磁気ビーズにコンジュゲートされてもよい。キットは、抗体に結合した対象外の表現型の細胞の除去を容易にするのに適した磁場発生源をさらに含んでいてもよい。キットは、１つまたは複数の抗体および磁場の供給源を保持するために１つまたは複数の容器を含んでいてもよい。キットは、任意選択で、洗浄溶液および／またはバッファーならびに抗体および磁場を使用するための説明書を含んでいてもよい。
濃縮された細胞集団の使用
本発明は、目的の表現型について濃縮された多数の細胞を産生するための方法を提供する。目的の表現型は、乏突起膠細胞、神経細胞、心筋細胞、造血細胞、島細胞、肝細胞、軟骨細胞、および骨芽細胞を含む。これらの細胞集団は、多くの重要な研究、開発、および商業目的に使用することができる。提供される集団が目的の表現型について濃縮されるので、それらは、そのように濃縮されていない細胞集団と比較した場合、以下に記載される使用のすべてに、より適しているであろう。
スクリーニング
本発明の濃縮された目的の細胞集団は、因子（溶媒、小分子薬剤、ペプチド、オリゴヌクレオチドなど）またはそのような細胞およびそれらの様々な子孫の特質に影響を与える環境条件（培養条件もしくは操作など）についてスクリーニングするために、市販で使用することができる。特質は、細胞の表現型のまたは機能的な形質を含んでいてもよい。
本発明の他のスクリーニングの応用は、濃縮された目的の細胞集団に対するそれらの効果についての医薬化合物の試験に関する。スクリーニングは、化合物が、細胞に対して薬理学的効果を有するように設計されているのでまたは他に効果を有するように設計された化合物が、目的の表現型の細胞に対して意図しない副作用を有するかもしれないので行われてもよい。他のスクリーニングの応用は、発癌性または他の毒性作用について化合物をスクリーニングすることを含むことができる。スクリーニングは、目的の化合物が目的の細胞に対して有益なまたは有害な効果を有するかどうかを決定するために、本発明の前駆体細胞または最終的に分化した細胞／成熟細胞を使用して、行うことができる。以下に記載される、濃縮された目的の集団の使用は、より正確なスクリーニング結果を提供するであろう。
読者は、標準の教科書Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７を一般に参照する。候補医薬化合物の活性の評価は、一般に、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、候補化合物と本発明の濃縮された目的の細胞を組み合わせることを含む。研究者は、化合物に起因する形態、以下に記載されるマーカー表現型、または細胞の機能的な活性におけるあらゆる変化を決定し（未処理の細胞または不活性化合物を用いて処理された細胞と比較して）、次いで、化合物の効果を観察された変化と関連させる。
細胞毒性は、細胞生存率、生存、形態、ならびにある種のマーカーおよび受容体の発現に対する効果によって、第１の実例において決定することができる。染色体ＤＮＡに対する薬剤の効果は、ＤＮＡ合成または修復を測定することによって決定することができる。特に、細胞周期の不定期の時間のまたは細胞複製に必要とされるレベルを超える［３Ｈ］−チミジンまたはＢｒｄＵの組み込みは、薬剤効果と一致している。望ましくない効果はまた、中期スプレッド（ｍｅｔａｐｈａｓｅ ｓｐｒｅａｄ）によって決定される、異常な率の姉妹染色分体交換を含むこともできる。読者は、さらなる詳細について、Ａ．Ｖｉｃｋｅｒｓ（ｐｐ ３７５−４１０ ｉｎ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７）を参照されたい。
効果が観察される場合、化合物の濃度は、半有効量（ＥＤ５０）を決定するために、量を決めることができる。
動物試験
本発明はまた、代謝機能における先天異常、疾患状態の影響、または著しい外傷の結果などのような任意の認められる必要性のための、組織維持または組織機能の修復を増強するための、本発明の濃縮された目的の細胞の使用を提供する。
治療上の投与に対する細胞組成物の適合性を決定するために、濃縮された目的の細胞は、最初に、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、霊長動物、または他の哺乳動物などのような適した動物モデルにおいて試験することができる。あるレベルで、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生存し、かつそれらの表現型を維持するそれらの能力について評価される。細胞組成物は、免疫不全動物（ヌードマウスまたは化学的にもしくは照射によって免疫不全にされた動物など）に投与されてもよい。組織は、再生の期間の後に採取され、多能性幹由来細胞がなお存在するかどうかに関して評価される。当技術分野において既知の機能試験が、実行されてもよい。
細胞生存は、検出可能な標識（緑色蛍光タンパク質もしくはβ−ガラクトシダーゼなど）を発現する；あらかじめ標識した（たとえばＢｒｄＵもしくは［３Ｈ］チミジンを用いて）細胞を投与することによってまたは恒常的細胞マーカーの続く検出によって（たとえば、ヒト特異的抗体を使用して）モニターされてもよい。投与された細胞の存在および表現型は、ヒト特異的抗体を使用する免疫組織化学的検査もしくはＥＬＩＳＡによってまたは公開される配列データに従って、増幅をヒトポリヌクレオチドに特異的になるようにするプライマーおよびハイブリダイゼーション条件を使用するＲＴ−ＰＣＲ分析によって評価することができる。
一実施形態では、濃縮された目的の細胞集団は、集まって塊になった上皮構造の形成について試験するために動物に投与されてもよい。動物は、マウスまたはラットなどのようなげっ歯動物であってもよい。濃縮された細胞は、適した期間、たとえば約１〜１２か月間、動物に投与されてもよい。動物は、犠牲死させてもよく、濃縮された細胞集団を受ける組織は、上皮形態および／または上皮細胞上に見つけられる１つもしくは複数のマーカーについての標識および／または未分化ｐＰＳ細胞上に見つけられる１つもしくは複数のマーカーを有する霊長動物細胞についてスクリーニングするために、組織学的検査もしくはＩＣＣまたはその両方にかけられてもよい。
他の実施形態では、本発明の濃縮された目的の細胞は、特定の疾患について既知の動物モデルを使用して機能的に試験されてもよい。たとえば、目的の細胞型が心筋細胞である場合、心疾患および梗塞についてのいくつかのモデルのうちの１つを使用することができる。心臓は、前部の左心室壁の表面に接するように、あらかじめ冷却したアルミニウム棒を置くことによって凍結傷害を与えることができる（Ｍｕｒｒｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２２０９、１９９６；Ｒｅｉｎｅｃｋｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００：１９３、１９９９；米国特許第６，０９９，８３２号；Ｒｅｉｎｅｃｋｅら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．、Ｅｐｕｂ Ｍａｒ ２００４）。より大型の動物では、凍結傷害は、約２０分間、左心室の前壁の上に液体Ｎ中で冷却した３０〜５０ｍｍの銅盤プローブを置くことによって引き起こすことができる（Ｃｈｉｕら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６０：１２、１９９５）。梗塞は、左冠動脈主幹をライゲーションすることによって（Ｌｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１９９１、１９９７）または徐々に膨張して、動脈を閉塞するアメロイド狭窄デバイスを使用することによって、誘発することができる。傷害部位は、本発明の細胞調製物を用いて治療され、心臓組織は、損傷部位における細胞の存在について組織学的検査によって検査される。心臓機能は、左室拡張末期圧、最大圧、血圧上昇速度、および血圧減衰速度などのようなパラメーターを決定することによってモニターすることができる。
目的の細胞が乏突起膠細胞である場合、慢性脱髄の領域は、成体のラット脊髄後柱において誘発されてもよい（Ｋｅｉｒｓｔｅａｄら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：７５２９、１９９９）。脊髄は、鉛シールディングを使用して、Ｔ９を中心において２ｃｍの距離にわたって４０ＧのＸ線照射に曝露されてもよく、これにより、曝露した細胞のＤＮＡに切れ目を導入し、したがって、分裂している細胞の死滅を引き起こす。これに、Ｔ９での、２日後の、臭化エチジウムの直接的な髄腔内注射が続く。臭化エチジウムは、それに曝露された細胞を死滅させて、脊髄後柱の部位の約６０％を通して、生存可能な乏突起膠細胞およびアストロサイトがない慢性脱髄の無細胞の領域を与える、ＤＮＡインターキレート剤（ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｃｈｅｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）である。
３日後に、動物は、脱髄の部位への乏突起膠細胞系列細胞の濃縮された集団の移植を受ける。任意選択で、細胞は、前もって４８時間、培養液に追加されたブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いてあらかじめ標識することができる。第１の実例では、細胞は、μＬ当たり約６０，０００細胞の密度に濃縮された約３０の前駆体の塊として調製することができる。１μＬの細胞は、約１０分間の期間にわたって、外径約８０ｕｍの引っ張ったガラスマイクロピペットまたは注射器針を使用して、傷害部位に投与される。約２〜４週間後、組織試料は、樹脂切片またはクライオスタット切片を作って、１ｍｍの横断ブロックにするために調製される。
冠状面からの切片は、トルイジンブルーを用いて染色し、全般的な病態、再有髄化の証拠、および細胞形態について分析した。損傷領域が無細胞であるので、移植の後に存在する細胞は、投与された細胞に由来する。クライオスタット切片は、ＧＦＡＰ（アストロサイト）、ＣＮＰ（乏突起膠細胞）、ＲＩＰ（乏突起膠細胞）、またはＮｅｕＮ（ニューロン）などのような関連する細胞型のマーカーについて染色することができる。超薄切片もまた、ミエリン層板の数および細胞の超微細構造について電子顕微鏡によって分析することができる。脱髄の部位の全体にわたる移植細胞の再分布および成熟有髄化細胞への分化を決定することができる。２５％、５０％、または７５％のレベルでの脱髄軸索の割合としての再有髄化は、生物学的有効性の増加の証拠である。
濃縮された目的の細胞は、挫傷傷害および背側の片側切断を含むＳＣＩについてモデルにおいて試験することができる。挫傷傷害については、脊髄は、適した脊髄挫傷傷害デバイスを使用して、２３ミリ秒にわたって約０．９ｍｍ（中程度の傷害）、移動させる。片側切断傷害については、脊髄の背側の半分は、定位マニピュレーターを使用し、鋭いメスの刃を用いて切断される。両方の手順の後に適した術後ケアを続ける。植え込まれた細胞の移動を促進し、ミエリン関連成長阻害物質を除去するために、脊髄はまた、任意選択で脱髄されてもよい（Ｋｅｉｒｓｔｅａｄら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．１５１：３０３、１９９８）。２ｍｍの穴を、脊椎管の中心に、軸索傷害の部位に対して尾側に作る。曝露した脊髄に、リン酸緩衝生理食塩水中３３％モルモット補体（Ｈａｒｌａｎ ＳｅｒａＬａｂ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）と１：２の希釈の約４μＬポリクローナル抗ＧａｌＣ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を注射する。
動物は、引っ張ったガラスマイクロピペットまたは注射器針を通して、傷害の約２４時間後に、濃縮された目的の表現型乏突起膠細胞系列細胞を移植する。その代わりに、慢性傷害モデルは、１〜３か月の間、傷害の後に治療を保留することによって作製することができる。細胞を用いる治療の後に、機能的反応はビデオテープによって記録することができ、臨床的改善の証拠について定期的にモニターすることができる。たとえば、地上の移動力は、関節運動、体重支持、肢協調、および他の特徴に基づいて、ＢＢＢスケール、２１点スケールを使用して定量することができる。
ヒトにおける治療上の使用
適切な試験の後に、本発明の濃縮された目的の細胞は、そのような治療を必要とするヒト患者または他の対象において組織再構成または組織再生に使用することができる。細胞は、それらが意図される組織部位に移植させるまたは移動し、かつ機能的に欠損した部位を再構成するまたは再生することを可能にする方法で投与される。したがって、心筋細胞を含む、濃縮された目的の細胞集団は、心臓に投与されてもよい。乏突起膠細胞を含む、濃縮された目的の細胞集団は、脊髄に投与されてもよい。肝細胞を含む、濃縮された目的の細胞集団は、肝臓に投与されてもよい。造血細胞を含む、濃縮された目的の細胞集団は、静脈内に投与されてもよい。島細胞を含む細胞の濃縮された集団は、腎臓または膵臓の近くに投与されてもよい。その代わりに、島細胞を含む細胞の濃縮された集団は、自己免疫応答から細胞を保護する移植可能なデバイスにおいて皮下投与されてもよい。軟骨細胞を含む細胞の濃縮された集団は、軟骨が欠損したまたは軟骨修復を必要とする関節に投与されてもよい。骨芽細胞の濃縮された集団は、破損した骨に投与されてもよい。
細胞の集団の投与は、当技術分野において既知の任意の方法によって達成されてもよい。たとえば、細胞は、細胞の移植を必要とする器官または組織に外科的に直接投与されてもよい。その代わりに、非侵入性の手順が、細胞を対象に投与するために使用されてもよい。非侵入性の送達方法の例は、細胞療法を必要とする器官または組織に細胞を送達するための注射器および／またはカテーテルの使用を含む。
本発明の濃縮された目的の細胞の異型移植を受ける患者は、移植細胞の免疫拒絶を低下させるように治療されてもよい。企図される方法は、タクロリムス、シクロスポリンＡのような従来の免疫抑制剤の投与（Ｄｕｎｎら、Ｄｒｕｇｓ ６１：１９５７、２００１）または多能性幹由来細胞のマッチした集団を使用して免疫耐性を誘発すること（ＷＯ０２／４４３４３；米国特許第６，２８０，７１８号；ＷＯ ０３／０５０２５１）を含む。その代わりに、抗炎症剤（プレドニソンなど）および免疫抑制剤の組み合わせが使用されてもよい。
本発明の濃縮された目的の細胞は、ヒト投与のために十分に無菌の条件下で調製された等張賦形剤を含む医薬組成物の形態で供給することができる。移植に際しての細胞死の危険性を低下させるために、細胞は、投与の前に、熱ショックによって処理されてもよいまたは約２４時間、約０．５Ｕ／ｍＬエリトロポイエチンと共に培養されてもよい。
医薬品製剤における一般的な原理については、読者は、Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、ｂｙ Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ ＆ Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９６およびＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ、Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ ＆ Ｐ．Ｌａｗ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、２０００を参照されたい。細胞賦形剤および組成物の任意の付随するエレメントの選択は、投与に使用されるルートおよびデバイスに合わせて適しているであろう。組成物はまた、濃縮された目的の細胞の移植または機能的な動員を容易にする１つまたは複数の他の成分を含んでいてもよいまたはが伴っていてもよい。適した成分は、目的の表現型に依存して変動するであろうが、目的の細胞型の接着を支持するもしくは促進するまたは植え込まれた組織の血管新生を促進するマトリックスタンパク質を含んでいてもよい。
本発明はまた、製造、分配、または使用の間のいかなる時も存在する細胞のセットまたは組み合わせを含む試薬系を含む。細胞セットは、本開示に記載され、例証されるが、未分化霊長動物多能性幹細胞または多くの場合同じゲノムを共有する他の分化細胞型と組み合わせたある種の分化多能性幹由来細胞に限定されない２つ以上の細胞集団の任意の組み合わせを含む。セット中の細胞型はそれぞれ、一緒にまたは同じ機能の別々の容器中にまたは異なる場所で、同じもしくは異なる時間に、同じ団体もしくはビジネス関係を共有する異なる団体のコントロール下でパッケージされてもよい。
本発明の医薬組成物は、任意選択で、心臓筋肉の疾患状態もしくは異常を改善するための心筋細胞系列細胞機能の再構成または傷害脊髄の再有髄化などのような所望の目的のために、書面の説明書と共に、適した容器中にパッケージされてもよい。
本発明の濃縮された目的の細胞は、他の系列からの細胞において優先的に発現されるｃＤＮＡが比較的混入していないｃＤＮＡライブラリーを調製するために使用することができる。たとえば、濃縮された目的の細胞は、５分間、１０００ｒｐｍでの遠心分離によって収集され、次いで、ｍＲＮＡが調製され、逆転写される。濃縮された目的の細胞の発現パターンは、一般にＦｒｉｔｚら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：３１６、２０００によって概説されるマイクロアレイ分析によって他の細胞型と比較されてもよい。そのようなライブラリーは、それらが由来する未分化ｐＰＳ細胞と比較して、目的の細胞における遺伝子発現の研究に特に十分に適しているであろう。これらの細胞が本質的に同一のゲノムを共有するので、たとえばサブトラクティブハイブリダイゼーションを使用する遺伝子発現の比較は、バックグラウンドノイズをほとんどまたは全く伴うことなく、成すことができる。細胞集団内の対象外の表現型の細胞の数を低下させることにより、細胞の２つの集団、たとえば、分化した目的の子孫および分化した目的の細胞を生じる親ｐＰＳ細胞系における遺伝子発現を比較する際に、シグナル対ノイズ比の改善がもたらされるであろう。
本発明の分化細胞は、濃縮された目的の細胞のマーカーに特異的な抗体を調製するために使用することができる。ポリクローナル抗体は、免疫原性の形態をした本発明の細胞を脊椎動物に注射することによって調製することができる。モノクローナル抗体の産生は、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、米国特許第４，４９１，６３２号、第４，４７２，５００号、および第４，４４４，８８７号、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ７３Ｂ：３（１９８１）のような標準の参考文献において記載されている。
霊長動物多能性幹細胞
本発明は、ｐＰＳ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した目的の細胞を濃縮するための方法を提供する。ｐＰＳ細胞は、任意の霊長動物多能性細胞を含む。多能性細胞は、適切な増殖条件下で、３つの主要な胚葉：中胚葉、内胚葉、および外胚葉のそれぞれから少なくとも１つの細胞型を形成することができるであろう。ｐＰＳ細胞は、前期胚、胚性、もしくは胎児組織または成熟した分化細胞から生じてもよい。典型的に、ｐＰＳ細胞は、悪性の供給源に由来しない。ｐＰＳ細胞は、免疫不全マウス、たとえばＳＣＩＤマウスに植え込まれた場合、奇形腫を形成するであろう。ｐＰＳ細胞は、樹立細胞株から得られてもよい。樹立細胞株は、ＷｉＣｅｌｌおよびＵＫ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋなどのような公的な細胞バンクから入手可能である。
顕微鏡下で、ｐＰＳ細胞は、認識が不十分な細胞結合と共に、高度な核／細胞質比、顕著な核小体、および密度の高いコロニー形成を伴って現われる。ｐＰＳ細胞は、典型的に、段階特異的な胚抗原（ＳＳＥＡ）３および４ならびにＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１と呼ばれる抗体を使用して検出可能なマーカーを発現する。未分化ヒト胚性幹細胞はまた、典型的に、ＲＴ−ＰＣＲによって検出されるように、転写因子Ｏｃｔ−３／４、Ｃｒｉｐｔｏ、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）受容体、ポドカリキシン様タンパク質、（ＰＯＤＸＬ）ｎａｎｏｇ、およびテロメラーゼリバーストランスクリプターゼ、たとえばｈＴＥＲＴ（米国特許出願公開第２００３／０２２４４１１ Ａ１号）をも発現する。
本発明の実施形態のいずれかにおいて使用されてもよいｐＰＳ細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）などのような胚性幹細胞を含むが、これらに限定されない。本発明において使用される胚性幹細胞は、胚性幹細胞系から選ばれてもよい。Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、またはＨ１４（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５）；ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．、Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅから）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏから）；Ｉ ３、Ｉ ３．２、Ｉ ３．３、Ｉ ４、Ｉ ６、Ｉ ６．２、Ｊ ３、Ｊ ３．２（Ｔｅｃｈｎｉｏｎ−Ｉｓｒａｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈａｉｆａ、Ｉｓｒａｅｌで誘導）；ＵＣＳＦ−１およびＵＣＳＦ−２（Ｇｅｎｂａｃｅｖら（２００５）Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．８３（５）：１５１７）；系ＨＵＥＳ １−１７（Ｃｏｗａｎら（２００４）ＮＥＪＭ ３５０（１３）：１３５３）；ならびに系ＡＣＴ−１４（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａら（２００５）Ｌａｎｃｅｔ，３６５（９４７１）：１６３６）を含むが、これらに限定されない多くの胚性幹細胞系が樹立されている。
他の霊長動物多能性幹細胞型は、ＷＯ ０１／５１６１０において記載される原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞およびヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６）を含むが、これらに限定されない。
本発明の実施形態のいずれかにおいて使用するのに適したｐＰＳ細胞はまた、誘発霊長動物多能性幹（ｉＰＳ）細胞をも含む。ｉＰＳ細胞は、たとえば、それらがｐＰＳ細胞の表現型を獲得するように、１つまたは複数の適切なベクターを用いるトランスフェクションによって遺伝的に修飾された細胞を指す（Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２００７）Ｃｅｌｌ １３１（５）：８６１；Ｙｕら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７）。その代わりに、ｉＰＳ細胞は、それらが、胚盤胞由来多能性幹細胞と関連する表現型および形態学的形質を有するように、細胞が再プログラムするように誘発するタンパク質反応混液とそれらを接触させることによって、成体の細胞を再プログラムすることによって得られてもよい。Ｋｉｍら（２００９）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４（６）：４７２を参照されたい。これらの再プログラム細胞によって獲得される表現型の形質は、胚盤胞から単離される多能性幹細胞に似ている形態ならびにｐＰＳ細胞において見つけられる表面抗原の発現、遺伝子発現、およびテロメラーゼ活性を含む。ｉＰＳ細胞は、主要な胚葉：外胚葉、内胚葉、および中胚葉のそれぞれから少なくとも１つの細胞型に分化する能力を有していてもよい。ｉＰＳ細胞もまた、免疫不全マウス、たとえばＳＣＩＤマウスに注射された場合、奇形腫を形成するかもしれない。（Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２００７）Ｃｅｌｌ １３１（５）：８６１；Ｙｕら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７）。
霊長動物多能性幹細胞についての培養条件
ある実施形態では、本発明において使用されるｐＰＳ細胞は、フィーダーなしの方法で誘導されてもよい（たとえばＫｌｉｍａｎｓｋａｙａら（２００５）Ｌａｎｃｅｔ ３６５（９４７１）：１６３６を参照されたい）。ある実施形態では、ｐＰＳは、無血清の環境において使用に先立って培養されてもよい。
ｐＰＳ細胞は、様々な基質、培地、および他の補体ならびに当技術分野において既知の因子を使用して培養されてもよい。いくつかの実施形態では、適した基質は、以下の１つまたは複数を含むマトリックスから構成されてもよい：ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン。いくつかの実施形態では、マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）として市販で入手可能なマウスＥＨＳ肉腫からの基底膜の可溶性抽出物を含んでいてもよい。他の実施形態では、マトリックスは、ヒト、ヒト化、マウス起源の１つまたは複数の単離マトリックスタンパク質、たとえばＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含んでいてもよい。さらに他の実施形態では、適した基質は、１つまたは複数のアクリレートなどのような１つまたは複数のポリマーから構成されてもよい。ポリマーは、細胞外マトリックスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで見つけられるタンパク質に由来する１つまたは複数のタンパク質またはペプチド断片を含んでいてもよい。特定の実施形態では、基質は、１つまたは複数のアクリレートおよびコンジュゲートビトロネクチンペプチドから構成される（たとえば米国特許出願公開第２００９／０１９１６３３号；米国特許出願公開第２００９／０１９１６２６号；米国特許出願公開第２００９／０２０３０６５号を参照されたい）。ｐＰＳ細胞は、分化を阻害しながら増殖を促進する培養条件を使用して、培養で継続的に増殖させることができる。
例示的な培地は、８０％ＤＭＥＭ（Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏなど）、２０％の限定ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）または血清代替品（米国特許出願公開第２００２／００７６７４７ Ａ１号、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールを用いて作製されてもよい。他の適した培地は、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）などのような無血清限定培地を含む。本発明のある実施形態において使用されてもよい他の市販で入手可能な培地製剤は、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；ｍＴｅＳＲ（商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＣＡ）；ｈＴｅＳＲ（商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＣＡ）、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、およびＣｅｌｌｇｒｏ（商標）ＤＣ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を含む。
ある実施形態では、ｐＰＳ細胞は、追加のフィーダー細胞を伴うことなく未分化の状態で維持されてもよい（たとえば（２００４）Ｒｏｓｌｅｒら、Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍ．２２９：２５９を参照されたい）。フィーダーなしの培養物は、分化を伴わない細胞の増殖を促進する因子を含有する培養液によって典型的に支持される（たとえば米国特許第６，８００，４８０号を参照されたい）。ある実施形態では、そのような因子を含有する条件培地が使用されてもよい。条件培地は、そのような因子を分泌する細胞を有する培地を培養することによって得られてもよい。適した細胞は、照射（約４，０００ｒａｄ）一次マウス胚性線維芽細胞、テロメライズした（ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅｄ）マウス線維芽細胞、またはｐＰＳ細胞に由来する線維芽細胞様細胞を含む（米国特許第６，６４２，０４８号）。培地は、２０％血清代替品および４ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを補足したＫＯ ＤＭＥＭなどのような無血清培地中でフィーダーを平板培養することによって調整することができる。１〜２日間調整した培地は、さらにｂＦＧＦを補足されてもよく、１〜２日間ｐＰＳ細胞培養を支持するのに使用されてもよい（たとえばＷＯ ０１／５１６１６；Ｘｕら（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：９７１を参照されたい）。
その代わりに、未分化の形態で細胞の増殖を促進する、追加因子（線維芽細胞増殖因子またはホルスコリンのような）を補足した新鮮なまたは非条件培地を使用することができる。例示的なのは、４０〜８０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、および任意選択でＳＣＦ（１５ｎｇ／ｍＬ）またはＦｌｔ３リガンド（７５ｎｇ／ｍＬ）を含有するＸ−ＶＩＶＯＴＭ（商標）１０（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）またはＱＢＳＦ（商標）−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）のような基本培地である（たとえばＸｕら（２００５）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３（３）：３１５を参照されたい）。これらの培地製剤は、他の系において２〜３倍の速度で細胞増殖を支持するという利点を有する（たとえばＷＯ ０３／０２０９２０を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ｈＥＳ細胞などのようなｐＰＳ細胞は、ｂＦＧＦおよびＴＧＦβを含む培地において培養されてもよい。ｂＦＧＦの適した濃度は、約８０ｎｇ／ｍｌを含む。ＴＧＦβの適した濃度は、約０．５ｎｇ／ｍｌを含む。
いくつかの実施形態では、霊長動物多能性幹細胞は、＞１５，０００細胞ｃｍ−２（最適には９０，０００ｃｍ−２〜１７０，０００ｃｍ−２）で平板培養されてもよい。典型的に、細胞が完全に分散する前に、酵素による消化は停止されてもよい（たとえばコラゲナーゼＩＶで約５分間）。次いで、約１０〜約２，０００細胞の一群は、さらなる分散を伴うことなく適した基質上で直接平板培養されてもよい。その代わりに、細胞は、ＰＢＳ中０．５ｍＭ ＥＤＴＡの溶液中で約５分間、細胞をインキュベートすることによってまたは細いピペットもしくは細胞スクレーパーを用いてこすり取ることまたは単離によってなどのように、プレートから単純に機械的に所望の細胞を分離することによって、プレートがコンフルエンスに達する前に酵素なしで採取されてもよい。培養容器から洗浄した後に、細胞は、さらなる分散を伴うことなく新しい培養物に平板培養されてもよい。さらなる実例では、フィーダーの非存在下において培養されたコンフルエントなヒト胚性幹細胞は、３７℃で５〜１５分間、０．０５％（重量／用量）トリプシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および０．０５ｍＭ ＥＤＴＡの溶液と共にインキュベートすることによってプレートから取り出されてもよい。プレート中の残りの細胞は、取り出されてもよく、細胞は、粉砕され、単一の細胞および小さな塊を含む懸濁液にされてもよく、次いで、生存を促進し、かつ分化を制限するために５０，０００〜２００，０００細胞ｃｍ−２の密度で平板培養されてもよい。
ある実施形態では、ｐＰＳ細胞は、フィーダー細胞、典型的に胚性または胎児組織に由来する線維芽細胞の層上で培養されてもよい（Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５）。ある実施形態では、それらのフィーダー細胞は、ヒトまたはマウス供給源に由来してもよい。ヒトフィーダー細胞は、様々なヒト組織から単離するまたは線維芽細胞へのヒトの胚性幹細胞の分化によって誘導することができる（たとえばＷＯ ０１／５１６１６を参照されたい）。ある実施形態では、使用されてもよいヒトフィーダー細胞は、胎盤線維芽細胞（たとえばＧｅｎｂａｃｅｖら（２００５）Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．８３（５）：１５１７を参照されたい）、ファロピウス管上皮細胞（たとえばＲｉｃｈａｒｄｓら（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：９３３を参照されたい）、包皮線維芽細胞（たとえばＡｍｉｔら（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６８：２１５０を参照されたい）、子宮の子宮内膜細胞（たとえばＬｅｅら（２００５）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．７２（１）：４２を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。
本発明の実施において、細胞を培養するのに使用されてもよい様々な固体表面がある。それらの固体表面は、６ウェル、２４ウェル、９６ウェル、または１４４ウェルプレートなどのような、標準の市販で入手可能な細胞培養プレートを含むが、これらに限定されない。他の固体表面は、マイクロキャリヤーおよびディスクを含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、マイクロキャリヤーは、細胞の付着のために、撹拌タンクバイオリアクターにおいて使用されてもよい。ある実施形態では、マイクロキャリヤーは、ビーズである。それらのビーズは、細胞付着を増すために正電荷群を有するＣｙｔｏｄｅｘデキストランマイクロキャリヤービーズ、細胞付着のためのゼラチン／コラーゲンコーティングビーズ、および細胞の付着のために異なる多孔度を有するマクロ多孔性マイクロキャリヤービーズなどのような様々な形態で手に入る。Ｃｙｔｏｄｅｘデキストラン、ゼラチンコーティング、およびマクロ多孔性マイクロキャリヤービーズは、市販で入手可能である（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯまたはＳｏｌｏｈｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）。ある実施形態では、ビーズは、３５０〜５００ｃｍ２の面積を有し、サイズが９０〜２００μｍである。ビーズは、これらに限定されないが、ガラスまたはプラスチックなどのような様々な材料から構成されてもよい。ディスクは、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ，Ｉｎｃ．（Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）などのような会社によって販売されている。ある実施形態では、ディスクは、ポリエステル／ポリプロピレンディスクであるＦｉｂｒａ−ｃｅｌディスクである。１グラムのこれらのディスクは、１２００ｃｍ２の表面積を提供する。
ｐＰＳ細胞を成長させるのに適した固体表面は、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ｍｅｌｉｎｅｘ、またはｔｈｅｒｍａｎｏｘなどのようなガラスまたはプラスチックを含むが、これらに限定されない様々な物質から作製されてもよい。本発明のある実施形態では、固体表面は、形状が立体的であってもよい。例示的な立体的な固体表面は、たとえばＵＳ２００５／００３１５９８において記載されている。
ある実施形態では、細胞は、本発明の方法の間、単一細胞で浮遊している。単一細胞の浮遊は、振盪機フラスコ、撹拌フラスコ、または発酵槽における培養を含むが、これらに限定されない様々な方法で実行されてもよい。使用されてもよい発酵槽は、Ｃｅｌｌｉｇｅｎ Ｐｌｕｓ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ，Ｉｎｃ．、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）およびＳＴＲまたはＳｔｉｒｒｅｄ−Ｔａｎｋ Ｒｅａｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、バイオリアクターは、培地で継続的に満たされてもよいまたは流加モードで使用されてもよい。他の適したバイオリアクターは、Ｗａｖｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒバッグ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含む。バイオリアクターは、２．２リットル、５リットル、７．５リットル、１４リットル、または２０リットル、１００リットル、１００リットル、１０，０００リットル以上を含むが、これらに限定されない異なるサイズで手に入る。
一般的な技術
本発明の実施において有用な一般的な技術のさらなる詳細については、従事者は、細胞生物学、組織培養、発生学、発生生物学、免疫学、神経生物学、内分泌内科学、心臓学、およびその他同種のものにおける標準の教科書および概説を参照することができる。
組織および細胞培養物ならびに胚性幹細胞に関して、読者は、当技術分野において入手可能な多数の刊行物、たとえばＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．１９８７）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓｅｒｍａｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００、１９９３）；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．１０：３１、１９９８；およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００）のいずれかを参照することを望んでもよい。
ｐＰＳ細胞の樹立株に由来する場合、本発明の細胞集団および単離細胞は、それらが由来する株と同じゲノムを有するとして特徴付けることができる。これは、染色体ＤＮＡが、ｐＰＳ細胞および分化子孫細胞の間でＲＦＬＰまたはＳＮＰ分析によって本質的に同一となるであろうということを意味する（細胞がヒトの手によって遺伝的に操作されていないことを仮定する）。ゲノムにおける比較的微細な変化が、たとえば非コード領域において、ある期間にわたって起こってもよいが、しかしながら、全体として、遺伝的同一性は、親細胞株およびあらゆる子孫、たとえば分化子孫の間で実質的に維持されるであろうということが企図される。典型的に、遺伝的同一性のレベルは一卵性双生児の間で観察される遺伝的同一性に類似するであろう。
分化した細胞の遺伝的改変
本発明の細胞は、分化の前または後の細胞の遺伝子操作によって１つまたは複数の遺伝的改変を含有するように作製することができる（米国特許出願公開第２００２／０１６８７６６ Ａ１号）。たとえば、いくつかの実施形態では、細胞は、それらが制限された発生系列細胞または最終分化細胞に進む前にまたは後に、テロメラーゼリバーストランスクリプターゼを発現するように細胞を遺伝的に改変することによって、それらの複製潜在能力を増加させるように処理することができる（米国特許出願公開第２００３／００２２３６７ Ａ１号）。
本発明の細胞はまた、特異的な治療上の機能を調整するのに関与するまたは投与の部位に治療用遺伝子を送達するようにそれらの能力を増強するために改変することもできる。ベクターは、すべての細胞型において活性であるまたは分化細胞型において特異的に活性であるプロモーターに作動可能に連結された所望の遺伝子についての既知のコード配列を使用して設計される。その代わりに、プロモーターは、遺伝的改変の定期の発現を可能にする誘発性プロモーターであってもよい。たとえば、細胞は、心臓機能を調整するサイトカインを発現するように遺伝的に操作されてもよい。
本発明のさらなる態様
本発明のさらなる態様は、以下を含む。
１．細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）対象外の表現型の細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合した対象外の表現型の細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含むｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法。
２．対象外の表現型の細胞は、上皮細胞である、１の方法。
３．上皮細胞は、サイトケラチンを発現する、２の方法。
４．上皮細胞は、ＥｐＣＡＭを発現する、２の方法。
５．ＥｐＣＡＭを発現する１つまたは複数の細胞はまた、ＴＲＡ−１−６０をも発現する、４の方法。
６．リガンドは、抗体である、１の方法。
７．抗体は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する、６の方法。
８．リガンドは、固体担体に結合している、１の方法。
９．固体担体は、ビーズである、８の方法。
１０．ビーズは、磁気ビーズである、９の方法。
１１．リガンドが結合した対象外の表現型の細胞の、細胞の混合集団の残りからの分離は、細胞の混合集団に外部の力を加えることによって実行される、請求項１の方法。
１２．外部の力は、磁場によって提供される、１１の方法。
１３．細胞の混合集団は、目標とする表現型を含む、１の方法。
１４．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、１３の方法。
１５．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、１４の方法。
１６．目標とする表現型は、心筋細胞である、１４の方法。
１７．細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）上皮細胞によって発現される１つまたは複数のマーカーに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ａ）のリガンドが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、対象外の表現型の細胞を含むｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法。
１８．上皮細胞によって発現されるマーカーは、サイトケラチンである、１７の方法。
１９．上皮細胞によって発現されるマーカーは、ＥｐＣＡＭである、１７の方法。
２０．ＥｐＣＡＭを発現する細胞はまた、ＴＲＡ−１−６０をも発現する、１９の方法。
２１．リガンドは、抗体である、１７の方法。
２２．抗体は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する、２１の方法。
２３．リガンドは、固体担体に結合している、１７の方法。
２４．固体担体は、ビーズである、１７の方法。
２５．ビーズは、磁気ビーズである、２４の方法。
２６．リガンドが結合した対象外の表現型の細胞の、細胞の混合集団の残りからの分離は、細胞の混合集団に外部の力を加えることによって実行される、１７の方法。
２７．外部の力は、磁場によって提供される、２６の方法。
２８．細胞の混合集団は、目標とする表現型を含む、１７の方法。
２９．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、２８の方法。
３０．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、２８の方法。
３１．目標とする表現型は、心筋細胞である、２８の方法。
３２．細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）上皮細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させ、未分化ｐＰＳ細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法。
３３．上皮細胞によって発現されるマーカーは、サイトケラチンである、３２の方法。
３４．上皮細胞によって発現されるマーカーは、ＥｐＣＡＭである、３２の方法。
３５．ＥｐＣＡＭを発現する細胞はまた、ＴＲＡ−１−６０をも発現する、３４の方法。
３６．リガンドは、抗体である、３２の方法。
３７．抗体は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する、３６の方法。
３８．リガンドは、固体担体に結合している、３６の方法。
３９．固体担体は、ビーズである、３８の方法。
４０．ビーズは、磁気ビーズである、３９の方法。
４１．リガンドが結合した対象外の表現型の細胞の、細胞の混合集団の残りからの分離は、細胞の混合集団に外部の力を加えることによって実行される、３２の方法。
４２．外部の力は、磁場によって提供される、４１の方法。
４３．細胞の混合集団は、目標とする表現型を含む、３２の方法。
４４．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、４３の方法。
４５．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、４３の方法。
４６．目標とする表現型は、心筋細胞である、４３の方法。
４７．未分化ｐＰＳ細胞に結合するリガンドは、抗体である、３２の方法。
４８．抗体は、ＴＲＡ−１−６０に結合する、４７の方法。
４９．ＴＲＡ−１−６０に結合する抗体は、ＩｇＧである、４８の方法。
５０．ＴＲＡ−１−６０に結合する抗体は、ＩｇＭである、４８の方法
５１．対象外の表現型の細胞に結合するリガンドは、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する抗体であり、未分化ｐＰＳ細胞に結合するリガンドは、ＴＲＡ−１−６０に結合する抗体である、３２の方法。
５２．ＥｐＣＡＭに結合する抗体は、磁気ビーズに連結され、ＴＲＡ−１−６０に結合する抗体は、磁気ビーズに連結される、５１の方法。
５３．細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥｐＣＡＭが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法。
５４．ＥｐＣＡＭに結合するリガンドは、抗体である、５３の方法。
５５．ＥｐＣＡＭ抗体は、固体担体に連結される、５４の方法。
５６．固体担体は、ビーズである、５５の方法。
５７．ビーズは、磁気ビーズである、５６の方法。
５８．リガンドが結合した対象外の表現型の細胞の、細胞の混合集団の残りからの分離は、細胞の混合集団に外部の力を加えることによって実行される、５３の方法。
５９．外部の力は、磁場によって提供される、５８の方法。
６０．細胞の混合集団は、目標とする表現型を含む、５３の方法。
６１．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、６０の方法。
６２．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、４３の方法。
６３．目標とする表現型は、心筋細胞である、４３の方法。
６４．細胞の混合集団における対象外の表現型の細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドおよびＴＲＡ−１−６０に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥｐＣＡＭについてのリガンドに結合した細胞およびＴＲＡ−１−６０のリガンドに結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から対象外の表現型の細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法。
６５．ＥｐＣＡＭに結合するリガンドは、抗体である、６４の方法。
６６．ＥｐＣＡＭに結合するリガンドは、固体担体に連結される、６４の方法。
６７．固体担体は、ビーズである、６６の方法。
６８．ビーズは、磁気ビーズである、６７の方法。
６９．ＴＲＡ−１−６０に結合するリガンドは、抗体である、６４の方法。
７０．抗体は、ＩｇＧである、６９の方法。
７１．抗体は、ＩｇＭである、６９の方法。
７２．ＴＲＡ−１−６０に結合するリガンドは、固体担体に連結される、６４の方法。
７３．固体担体は、ビーズである、７２の方法。
７４．ビーズは、磁気ビーズである、７３の方法。
７５．リガンドが結合した対象外の表現型の細胞の、細胞の混合集団の残りからの分離は、細胞の混合集団に外部の力を加えることによって実行される、６４の方法。
７６．外部の力は、磁場によって提供される、７５の方法。
７７．細胞の混合集団は、目標とする表現型を含む、６４の方法。
７８．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、７７の方法。
７９．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、７７の方法。
８０．目標とする表現型は、心筋細胞である、７７の方法。
８１．細胞の混合集団における集まって塊になった上皮形成細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ＥｐＣＡＭが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から、集まって塊になった上皮形成細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法。
８２．ＥｐＣＡＭに結合するリガンドは、抗体である、８１の方法。
８３．ＥｐＣＡＭ抗体は、固体担体に連結される、８２の方法。
８４．固体担体は、ビーズである、８３の方法。
８５．ビーズは、磁気ビーズである、８４の方法。
８６．リガンドが結合した対象外の表現型の細胞の、細胞の混合集団の残りからの分離は、細胞の混合集団に外部の力を加えることによって実行される、８１の方法。
８７．外部の力は、磁場によって提供される、８１の方法。
８８．細胞の混合集団は、目標とする表現型を含む、８８の方法。
８９．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、８８の方法。
９０．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、８８の方法。
９１．目標とする表現型は、心筋細胞である、８８の方法。
９２．細胞の混合集団における、未分化細胞によって発現される１つまたは複数の分子を発現する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）上皮細胞に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）ａ）のリガンドが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から未分化細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法。
９３．リガンドは、抗体である、９２の方法。
９４．抗体は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する、９２の方法。
９５．抗体は、サイトケラチンに特異的に結合する、９２の方法。
９６．抗体は、固体担体に結合している、９２の方法。
９７．固体担体は、ビーズである、９６の方法。
９８．ビーズは、磁気ビーズである、９７の方法。
９９．リガンドが結合した対象外の表現型の細胞の、細胞の混合集団の残りからの分離は、細胞の混合集団に外部の力を加えることによって実行される、９２の方法。
１００．外部の力は、磁場によって提供される、９９の方法。
１０１．細胞の混合集団は、目標とする表現型を含む、９２の方法。
１０２．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、１０１の方法。
１０３．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、１０１の方法。
１０４．目標とする表現型は、心筋細胞である、１０１の方法。
１０５．未分化細胞によって発現される分子は、ＴＲＡ−１−６０である、９２の方法。
１０６．細胞の混合集団における、未分化細胞によって発現される１つまたは複数の分子を発現する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合したＥｐＣＡＭ細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から未分化細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法。
１０７．未分化細胞によって発現される分子は、ＴＲＡ−１−６０である、１０６の方法。
１０８．ＥｐＣＡＭに結合するリガンドは、抗体である、１０６の方法。
１０９．ＥｐＣＡＭ抗体は、固体担体に連結される、１０８の方法。
１１０．固体担体は、ビーズである、１０８の方法。
１１１．ビーズは、磁気ビーズである、１１０の方法。
１１２．リガンドが結合した対象外の表現型の細胞の、細胞の混合集団の残りからの分離は、細胞の混合集団に外部の力を加えることによって実行される、１０６の方法。
１１３．外部の力は、磁場によって提供される、１１２の方法。
１１４．細胞の混合集団は、目標とする表現型を含む、１０６の方法。
１１５．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、１１４の方法。
１１６．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、１１４の方法。
１１７．目標とする表現型は、心筋細胞である、１１４の方法。
１１８．細胞の混合集団における、未分化細胞によって発現される１つまたは複数の分子を発現する細胞の数を低下させるための方法であって、ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドおよびＴＲＡ−１−６０に特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団を接触させるステップと、ｂ）リガンドが結合した細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団から未分化細胞の数を低下させるステップとを含み、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、方法。
１１９．ＥｐＣＡＭに結合するリガンドは、抗体である、１１８の方法。
１２０．ＥｐＣＡＭに結合するリガンドは、固体担体に連結される、１１９の方法。
１２１．固体担体は、ビーズである、１２０の方法。
１２２．ビーズは、磁気ビーズである、１２１の方法。
１２３．ＴＲＡ−１−６０に結合するリガンドは、抗体である、１１８の方法。
１２４．抗体は、ＩｇＧである、１１８の方法。
１２５．抗体は、ＩｇＭである、１１８の方法。
１２６．ＴＲＡ−１−６０に結合するリガンドは、固体担体に連結される、１１８の方法。
１２７．固体担体は、ビーズである、１２６の方法。
１２８．ビーズは、磁気ビーズである、１２７の方法。
１２９．リガンドが結合した対象外の表現型の細胞の、細胞の混合集団の残りからの分離は、細胞の混合集団に外部の力を加えることによって実行される、１１８の方法。
１３０．外部の力は、磁場によって提供される、１２９の方法。
１３１．細胞の混合集団は、目標とする表現型を含む、１１８の方法。
１３２．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、１３１の方法。
１３３．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、１３１の方法。
１３４．目標とする表現型は、心筋細胞である、１３１の方法。
１３５．対象外の表現型の細胞が本質的にない、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む細胞の集団を得るための方法であって、ａ）ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む細胞の集団を得るステップと、ｂ）上皮細胞に結合する１つまたは複数のリガンドとａ）の細胞集団を接触させるステップと、ｃ）ｂ）のリガンドが結合した細胞を除去し、それによって、対象外の表現型の細胞が本質的にない細胞の集団を得るステップとを含む、方法。
１３６．上皮細胞に結合するリガンドは、ＥｐＣＡＭである、１３５の方法。
１３７．ＥｐＣＡＭに結合するリガンドは、抗体である、１３５の方法。
１３８．ＥｐＣＡＭに結合するリガンドは、固体担体に連結される、１３５の方法。
１３９．固体担体は、ビーズである、１３８の方法。
１４０．ビーズは、磁気ビーズである、１３９の方法。
１４１．リガンドが結合した対象外の表現型の細胞の、細胞の混合集団の残りからの除去は、細胞の混合集団に外部の力を加えることによって実行される、１３５の方法。
１４２．外部の力は、磁場によって提供される、１４１の方法。
１４３．細胞の混合集団は、目標とする表現型を含む、１３５の方法。
１４４．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、１４３の方法。
１４５．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、１４３の方法。
１４５．目標とする表現型は、心筋細胞である、１４３の方法。
１４６．目標とする表現型について濃縮された細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、上皮細胞上に見つけられる分子を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団。
１４７．上皮細胞上に見つけられる分子を発現する少なくとも１つの細胞は、ＥｐＣＡＭを発現する、１４６の細胞の混合集団。
１４８．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、１４３の細胞の混合集団。
１４９．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、１４６の細胞の混合集団。
１５０．目標とする表現型は、心筋細胞である、１４６の細胞の混合集団。
１５１．目標とする表現型について濃縮された細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、上皮細胞上に見つけられる分子を発現する少なくとも１つの細胞および未分化多能性幹細胞上に見つけられる分子を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団。
１５２．上皮細胞上に見つけられる分子を発現する少なくとも１つの細胞は、ＥｐＣＡＭを発現する、１５１の細胞の混合集団。
１５３．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、１５１の細胞の混合集団。
１５４．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、１５１の細胞の混合集団。
１５５．目標とする表現型は、心筋細胞である、１５１の細胞の混合集団。
１５６．未分化細胞上に見つけられる分子を発現する少なくとも１つの細胞は、ＴＲＡ−１−６０を発現する、１５１の細胞の混合集団。
１５７．目標とする表現型について濃縮された細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、ＥｐＣＡＭを発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団。
１５８．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、１５７の細胞の混合集団。
１５９．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、１５７の細胞の混合集団。
１６０．目標とする表現型は、心筋細胞である、１５７の細胞の混合集団。
１６１．目標とする表現型について濃縮された細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、サイトケラチンを発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団。
１６２．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、１６１の細胞の混合集団。
１６３．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、１６１の細胞の混合集団。
１６４．目標とする表現型は、心筋細胞である、１６１の細胞の混合集団。
１６５．サイトケラチンを発現する少なくとも１つの細胞はまた、ＥｐＣＡＭをも発現する、１６１の細胞の混合集団。
１６６．目標とする表現型について濃縮された細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、サイトケラチンを発現する少なくとも１つの細胞および未分化細胞上に見つけられる分子を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団。
１６５．サイトケラチンを発現する少なくとも１つの細胞はまた、ＥｐＣＡＭをも発現する、１６６の細胞の混合集団。
１６７．未分化細胞上に見つけられる分子を発現する少なくとも１つの細胞は、ＴＲＡ−１−６０を発現する、１６６の細胞の混合集団。
１６８．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、１６６の細胞の混合集団。
１６９．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、１６６の細胞の混合集団。
１７０．目標とする表現型は、心筋細胞である、請求項１６６の細胞の混合集団。
１７１．目標とする表現型について濃縮された細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、ＥｐＣＡＭを発現する少なくとも１つの細胞およびＴＲＡ−１−６０を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団。
１７２．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、１７１の細胞の混合集団。
１７３．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、１７１の細胞の混合集団。
１７４．目標とする表現型は、心筋細胞である、１７１の細胞の混合集団。
１７５．目標とする表現型について濃縮された細胞の混合集団であって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含み、細胞の混合集団は、サイトケラチンを発現する少なくとも１つの細胞およびＴＲＡ−１−６０を発現する少なくとも１つの細胞が除外されている、細胞の混合集団。
１７６．サイトケラチンを発現する少なくとも１つの細胞はまた、ＥｐＣＡＭをも発現する、１７５の細胞の混合集団。
１７７．目標とする表現型は、乏突起膠細胞、心筋細胞、島細胞、造血細胞、肝細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞から選ばれる、１７５の細胞の混合集団。
１７８．目標とする表現型は、乏突起膠細胞である、１７５の細胞の混合集団。
１７９．目標とする表現型は、心筋細胞である、１７５の細胞の混合集団。
１８１．細胞の混合集団から対象外の表現型を有する細胞を除外するためのキットであって、ａ）上皮細胞上に発現される１つまたは複数の分子に対するリガンドと、ｂ）未分化細胞上に発現される１つまたは複数の分子に対するリガンドと、ｃ）１つまたは複数の容器とを含み、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、キット。
１８２．ＥｐＣＡＭに対するリガンドと、ＴＲＡ−１−６０に対するリガンドと、１つまたは複数の容器とを含む、細胞の混合集団から対象外の表現型を有する細胞を除外するためのキットであって、細胞の混合集団は、ｐＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化子孫を含む、キット。
以下の実施例では、ヒト胚細胞（ｈＥＳ）の細胞を利用する実験はすべて、樹立された公的に入手可能なｈＥＳ細胞系を使用して実行した。
実施例１：上皮細胞マーカーは、霊長動物多能性幹細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した乏突起膠細胞における対象外の表現型と関連する。
全ＲＮＡは、ヒト胚性幹細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した乏突起膠細胞前駆細胞から、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）を使用して、メーカーの指示に従って抽出した。それぞれ７．５×１０６乏突起膠細胞前駆細胞を含有するバイアルを使用した。これらのバイアルは、ｉｎ ｖｉｖｏで多くの、集まって塊になった上皮構造（ＣＥＳ）を生成した３つのロットおよびｉｎ ｖｉｖｏで低いレベルのＣＥＳを有した３つのロットから作り出された。ＲＮＡの完全性は、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して確認し、使用される試料はすべて、９．８を超えるＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を有した。３‘ ＩＶＴ Ｅｘｐｒｅｓｓキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）は、このＲＮＡからｃＤＮＡを生成するためにメーカーの指示に従って使用した。マイクロアレイ分析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３＋２．０ ゲノムアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用し、これらのｃＤＮＡ試料を用い、メーカーの指示に従って実行した。このアレイは、５４，０００以上のプローブセットを含有する包括的なヒトゲノム発現アレイである。高および低ＣＥＳロットのこれらの群の間で２倍よりも大きな発現の差異を有する遺伝子を、さらに検査した。表１は、上皮細胞マーカーの発現の増加が、ＧＲＮＯＰＣ１のロットにおけるＣＥＳの発現の増加と関連することを示す。
実施例２：ラット脊髄における上皮構造の同定
ｈＥＳ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したヒト乏突起膠細胞前駆細胞を投与したラットは、まれに、集まって塊になった上皮構造を発達させた。図１は、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した、集まって塊になった上皮構造を示す。構造は、形態に基づいて上皮細胞と同定された。
これらの集まって塊になった上皮構造をさらに特徴付けるために、パンサイトケラチンに対する抗体またはＥｐＣＡＭに対する抗体を使用して免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を実行した。パンサイトケラチン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）は、２つの抗体の混合物とした：抗ＡＥ１および抗ＡＥ３。ＡＥ１抗体は、ケラチンＣＫ１０、ＣＫ１４、ＣＫ１５、およびＣＫ１６ならびにケラチンＣＫ１９を認識する。ＡＥ３抗体は、ケラチンＣＫ１、ＣＫ２、ＣＫ３、ＣＫ４、ＣＫ５、およびＣＫ６ならびにケラチンＣＫ７およびＣＫ８を認識する。ケラチンＣＫ１０は、うろこ状のケラチン状になった皮膚およびいくつかの腸細胞において発現される。ケラチンＣＫ１９は、分泌上皮、ほとんどの腺、多列上皮、分泌腸上皮、および気道上皮において発現される。ケラチンＣＫ８は、典型的に、ケラチンＣＫ１８と同時発現され、ほとんどの腺、分泌腸上皮、およびほとんどの分泌上皮において見つけられる。
使用したＥｐＣＡＭ抗体は、Ｂｅｒ−Ｅｐ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とした。ＥｐＣＡＭは、ほとんどの上皮組織細胞および上皮系列細胞の側底膜で発現される。それは、扁平上皮において発現されない。それは、細胞増殖と関連して一時的に発現されるかもしれない。
切片は、上皮細胞を標識するためにパンサイトケラチン抗血清と共に（ＩＨＣ）を使用して検査した。スライドは、キシレンおよび減少性の連続エタノール系列を使用して脱パラフィンした。抗原回収前処理は、３７℃での３０分間のＤＰＢＳ中４％ペプシンとのスライドのインキュベート、その後に続く外界温度までの冷却から成った。スライドは、ＤＰＢＳ中ですすぎ、外界温度で、１時間、ブロックバッファー（ＤＰＢＳ中０．３％ トリトンＸ−１００、１０％正常ヤギ血清、１％ウシ血清アルブミン、３％ＨＯ）と共にインキュベートし、外界温度で、２４時間、１：４００に希釈した、パンサイトケラチンに対して産生される一次抗血清（カタログ＃ｍＡＢ ３４１２、クローンＡＥ１／ＡＥ３）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）とのインキュベーションを続けた。切片は、洗浄し、外界温度で、１時間、１：５００に希釈したビオチン化二次抗体（カタログ＃ＢＡ−１０００）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と共にインキュベートし、洗浄し、外界温度で、１時間、ＤＰＢＳ中で１：１０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートした。Ｎｉ−ＤＡＢ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、ＨＲＰの視覚化のために使用した。スライドは、増加性の連続的エタノール系列を通して脱水し、キシレン中で脱脂し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（商標）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈａｍｐｔｏｎ、ＮＨ）を用いてカバーガラスをかけた。スライドは光学顕微鏡下で検査した。
切片は、上皮細胞を標識するためにＥｐＣＡＭ抗血清と共にＩＨＣを使用して検査した。スライドは、キシレンおよび減少性の連続エタノール系列を使用して脱パラフィンした。抗原回収前処理は、３７℃での３０分間のＤＰＢＳ中４％ペプシンとのスライドのインキュベート、その後に続く外界温度までの冷却から成った。スライドは、ＤＰＢＳ中ですすぎ、外界温度で、１時間、ブロックバッファー（ＤＰＢＳ中０．３％ トリトンＸ−１００、１０％正常ヤギ血清、１％ウシ血清アルブミン、３％ＨＯ）と共にインキュベートし、外界温度で、２４時間、１：１００に希釈した、ＥｐＣＡＭに対して産生される一次抗血清（Ｂｅｒ−ＥＰ４；カタログ＃ｍＡＢ ８４、クローン；Ｄａｋｏ；Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）とのインキュベーションを続けた。切片は、洗浄し、外界温度で、１時間、１：５００に希釈したビオチン化二次抗体（カタログ＃ＢＡ−１０００）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と共にインキュベートし、洗浄し、外界温度で、１時間、ＤＰＢＳ中で１：１０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートした。Ｎｉ−ＤＡＢ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、ＨＲＰの視覚化のために使用した。スライドは、増加性の連続的エタノール系列を通して脱水し、キシレン中で脱脂し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（商標）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈａｍｐｔｏｎ、ＮＨ）を用いてカバーガラスをかけた。スライドは光学顕微鏡下で検査した。
図２は、ヒト組織アレイ（肝臓、小腸、脾臓、胃、結腸、および皮膚の細胞を含有する）がすべてパンサイトケラチンについて標識されたことを示す。図２の右側は、マウス筋肉内の奇形腫（ＳＫＩＤ／ｂｇマウスにおいて）もまた、パンサイトケラチンについて標識されたことを示す。図３は、ＥｐＣＡＭ抗体についての類似する結果を示す。
図４は、３匹の別個の動物における集まって塊になった上皮構造がパンサイトケラチンについて陽性に標識されたことを示す。示す倍率は、２４×（上部のパネル）および４００×（下部のパネル）である。図５は、ＥｐＣＡＭ抗体を用いて標識された１匹の動物における集まって塊になった上皮構造を示す。示す倍率は、２４×（上部の左パネル）および４００×（下部のパネル）である。図６は、１匹の動物における集まって塊になった上皮構造がパンサイトケラチンおよびＥｐＣａｍの両方について標識されたことを示す。示す倍率は、２４×（上部のパネル）および４００×（下部のパネル）である。図７は、１匹の動物における集まって塊になった上皮構造がＥｐＣＡＭではなくパンサイトケラチンについて標識されたことを示す。示す倍率は、２４×（上部のパネル）および４００×（下部のパネル）である。図８は、１匹の動物における集まって塊になった上皮構造がパンサイトケラチンまたはＥｐＣＡＭについて標識されなかったことを示す。示す倍率は、２４×（上部のパネル）および４００×（下部のパネル）である。
実施例３：乏突起膠細胞を含む細胞の混合性集団の特徴付け
ｈＥＳ細胞は、上記および米国特許第７，２８５，４１５号に記載されるように、乏突起膠細胞および乏突起膠細胞前駆体に分化した。別々の２つのロット（Ｍ０７Ｄ１Ａおよび２００８−０５Ａ−ｍｓ）を生成した。両方の調製物における細胞は、以下の上皮マーカーについての抗体を用いて細胞を標識することによってフローサイトメトリーによって特徴付けた：ＡＬｅｘａ ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートしたＥｐＣＡＭ（クローンＢＥＲ−Ｅｐ４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および霊長動物未分化多能性幹細胞と関連するマーカー：ＴＲＡ−１−６０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。ＴＲＡ−１−６０について使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とコンジュゲートした抗マウスＩｇＭ Ａ４８８とした。
手短かに言えば、５×１０５細胞は、１００μＬの容量で反応当たりに標識した。一次抗体については、標識当たり５００ｎｇを使用した。細胞は、１５分間、氷上でインキュベートし、次いで、染色バッファー（０．５％ヒト血清アルブミンＰＢＳ）を用いて２時間洗浄した。二次抗体は、１：４００に希釈し、１５分間、氷上で標識した。細胞は、染色バッファーを用いて２時間洗浄し、次いで、ヨウ化プロピジウム染色バッファー（５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムの最終濃度に向けて、２ｍｌの染色バッファーに１０μＬの１．０ｍｇ／ｍｌストックのヨウ化プロピジウムを追加することによって調製した）中に再懸濁した。細胞は、細胞ストレーナと共にＦＡＣＳチューブを使用してろ過した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）。細胞は、ヨウ化プロピジウム対前方散乱について、次いで、前方散乱対側方散乱光についてさらにゲーティングした。これらのゲート内で、２０，０００の事象が収集された。結果は、図９に示され、わずかな割合の集団がパンサイトケラチン（両方のロット）およびＥｐＣＡＭ（左のパネル）を発現したことを示す。ＥｐＣＡＭを発現するほとんどの細胞はまた、パンサイトケラチンについても標識された。二重陽性細胞は明らかにはっきりとわかる。
実施例４：ＥｐＣＡＭ抗体は、細胞の混合集団からＥｐＣＡＭ＋細胞を除去するのに成功する。
この実験では、１０％ＥｐＣＡＭ＋である混合性集団を作製するために、ＥｐＣＡＭ陰性細胞系（ヒト胚性腎臓２９３細胞）にＥｐＣＡＭ陽性細胞系（ヒト腺癌株ＳＷ４８０）を加えた。細胞は、磁気Ｄｙｎａｌビーズ（ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈ Ｂｅａｄ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にコンジュゲートしたＢＥＲ−Ｅｐ４ ＥｐＣＡＭ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて標識し、細胞は、下記のプロトコールに従ってＤｙｎａｌ ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して分離した。
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、バイアル中に再懸濁した。５０μＬ／２ｅ７細胞のＤｙｎａｂｅａｄｓを１５ｍＬチューブに移入した。同じ容量または少なくとも１ｍＬのバッファー１（ＰＢＳ／０．１％ヒト血清アルブミン）をチューブに追加し、混合した。チューブは、１分間、磁石中に置き、上清を廃棄した。チューブを磁石から取り出し、洗浄した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓの初めの容量と同じ容量のバッファー１中に再懸濁した。
試料２ｅ７／ｍＬ細胞を調製するために、冷バッファー２（ＰＢＳ／０．１％ヒト血清アルブミン／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。ＥｐＣＡＭ＋細胞について濃縮するために、５０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓを１ｍＬの調製試料に追加し、次いで、緩やかな回転に設定したＭＡＣＳｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において２〜８℃で３０分間インキュベートした。チューブは、２分間、磁石中に置いた。ＥｐＣＡＭ除外細胞を含有する上清は、氷上で保存した。
ＥｐＣＡＭ＋ビーズ結合細胞は、あらかじめ熱した（３７℃）バッファー３（ＲＰＭＩ／０．１％ ＨＳＡ／１ｍＭ ＣａＣＬ／４ｍＭ ＭｇＣｌ）（洗浄当たり５ｍＬ）中で３×洗浄し、磁石中に置いた。洗浄物はすべて、単一チューブ中にプールした。細胞は、２００μＬ（２ｅ７細胞当たり）のあらかじめ熱した（３７℃）バッファー３中に再懸濁した。ビーズからＥｐＣＡＭ＋細胞を放出するために、４ｕＬの放出バッファー（ＤＮＡｓｅ）（キット中に提供される）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）をチューブに追加した。チューブは、緩やかな回転に設定したＭＡＣＳｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において室温で１５分間インキュベートした。チューブの内容物は、１ｍＬピペットを用いて勢いよく少なくとも５〜１０回ピペットで移し、次いで、２分間、磁石中に置いた。放出された細胞を有する上清は、ＲＰＭＩ培地であらかじめコーティングした１５ｍＬチューブ中に移入した。試料をプールした。ビーズは、バッファー３（２００μＬ）中に再懸濁し、ビーズはもう一度勢いよくピペットで移し、２分間、磁石に戻した。上清は、非結合ＥｐＣＡＭ＋細胞を含有した。
細胞画分は、実施例３に記載されるプロトコールを使用して、ＥｐＣＡＭについて標識した。ＥｐＣＡＭ抗体についてのアイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ１）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用した。結果は、図１０に示す。データは、細胞の混合集団からＥｐＣＡＭ＋細胞を除外するのに成功したことを実証した（図９下、３番目および４番目のパネルを参照されたい）。ＥｐＣＡＭ陰性細胞の回収効率は、９３％であると計算された。ＥｐＣＡＭ陽性細胞の回収効率は、９％であると計算された。
実施例５：ＥｐＣＡＭ＋細胞の除外は、パンサイトケラチン＋細胞およびＴＲＡ−１−６０細胞を同時に除外する。
この実験では、抗ＥｐＣＡＭ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）をバイアル中に再懸濁し、目的のＥｐＣＡＭ発現細胞当たり２５のビーズを、１５ｍＬチューブに移入した（目的の集団の５％であることを仮定−５％は、集団におけるＥｐＣＡＭ＋細胞の数の推定値に選んだ。５％は、ｈＥＳ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した乏突起膠細胞前駆体の前の集団において見られた上限よりも高い）。同じ容量または少なくとも１ｍＬのバッファー１（ＰＢＳ／０．１％ヒト血清アルブミン）を、使用に先立ってビーズを洗浄するためにチューブに追加し、混合した。チューブは、１分間、磁石中に置き、上清を廃棄した。チューブを磁石から取り出し、洗浄した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓの初めの容量と同じ容量のバッファー１中に再懸濁した。
試料２ｅ７／ｍＬ細胞（ｈＥＳ細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した乏突起膠細胞前駆細胞を含む細胞の混合集団）を調製するために、冷バッファー２（ＰＢＳ／０．１％ヒト血清アルブミン／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。ＥｐＣＡＭ＋細胞を除外するために、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを調製試料に追加し、次いで、緩やかな回転に設定したＭＡＣＳｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において２〜８℃で３０分間インキュベートした。チューブは、２分間、磁石中に置いた。ＥｐＣＡＭ除外細胞を含有する上清は、氷上で保存した。
細胞画分は、実施例３に記載されるプロトコールを使用して、ＥｐＣＡＭ、ＴＲＡ−１−６０、およびＰＣＫについて標識した。抗体についてのアイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＭ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用した。結果は、図１１に示す。データは、細胞の混合集団からＥｐＣＡＭ＋細胞を除外するのに成功したことを実証した（図１１下、３番目および４番目のパネルを参照されたい）。ＥｐＣＡＭ陰性細胞の回収効率は、９６％であると計算された。さらに、ＥｐＣＡＭの除外は、ＴＲＡ−１−６０＋細胞集団およびＰＣＫ＋細胞集団の両方のパーセンテージを低下させた。
実施例６：ＥｐＣＡＭ／ＴＲＡ１−６０除外ヒト乏突起膠細胞前駆細胞は、ラット脊髄においてより少数の上皮構造を形成した。
この実験は、動物モデルとしてラットを使用し、ｉｎ ｖｉｖｏでの集まって塊になった上皮形成に対する対象外の表現型の除外の効果を調査した。集まって塊になった上皮構造において高度であることが期待されるヒト乏突起膠細胞前駆体のロットをこの研究のために特に選んだ。胸部の高さに脊髄挫傷傷害を有するラットの２群は、ＥｐＣＡＭ＋／ＴＲＡ １−６０＋細胞を除外したまたはしていないヒト乏突起膠細胞前駆細胞の脊髄内注射を受けた。６か月後に、動物は、潅流し、脊髄を除去し、縦断面で薄片に切った。傷害の部位に対して約１ｃｍ頭側および１ｃｍ尾側にわたる脊髄組織は、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色し、集まって塊になった上皮構造について検査した。結果は、表２に示す。
本発明の多くの修飾および変形は、当業者らに明らかであるように、その精神および範囲から逸脱することなく成すことができる。本明細書において記載される特定の実施形態は、例のみのために提示され、決して限定を意味するものではない。本明細書および実施例は、例示的なものとして考えられるのみであり、本発明の正確な範囲および精神は、以下の請求項によって示される。

Claims (8)

  1. 乏突起膠細胞前駆細胞とＥｐＣＡＭ及びＴＲＡ−１−６０を共に発現する対象外の細胞とを含むｈＥＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した子孫を含む細胞の混合集団におけるＥｐＣＡＭ及びＴＲＡ−１−６０を共に発現する対象外の細胞の数を低下させることによりヒトの乏突起膠細胞前駆細胞のより純粋な集団を製造する方法であって、
    ａ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは複数のリガンドと細胞の混合集団とを接触させるステップと、
    ｂ）リガンドが結合した対象外の細胞を細胞の混合集団の残りから分離し、それによって、細胞の混合集団における対象外の細胞の数を低下させるステップとを含むことにより、
    乏突起膠細胞前駆細胞のより純粋な集団を製造する方法。
  2. リガンドが抗体である、請求項１に記載の方法。
  3. 抗体がＥｐＣＡＭに特異的に結合する、請求項２に記載の方法。
  4. リガンドが固体担体に結合している、請求項１に記載の方法。
  5. 固体担体がビーズである、請求項４に記載の方法。
  6. ビーズが磁気ビーズである、請求項５に記載の方法。
  7. リガンドが結合した対象外の細胞の、細胞の混合集団の残りからの分離が、細胞の混合集団に外部の力を加えることによって実行される、請求項１に記載の方法。
  8. 外部の力が磁場によって提供される、請求項７に記載の方法。
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