JP6182300B2 - 標的核酸の検出方法 - Google Patents

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Description

本明細書は、標的核酸を検出する技術に関する。
従来、生物個体の遺伝子解析や、生体試料におけるウイルスや細菌等の存在を調べるための方法として、核酸配列を網羅的に検出し、同定し、さらに定量する方法が提案されている。こうした解析等においては、予め標的となる核酸配列に関連付けられたプローブなどを準備しておき、このプローブ等と生体試料から核酸増幅法により増幅したＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションを利用し、プローブないしＤＮＡ断片に結合させておいた標識物質で標的核酸を検出等することが通常である。
例えば、核酸増幅法により増幅したＤＮＡ断片の両端に特定の物質が結合できるような塩基配列を含むようにプライマーを設計し、こうした特定物質を利用してＤＮＡ断片を検出する方法が記載されている（特許文献１）。
また、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に特化したアレイが開発されている（例えば特許文献２、３、非特許文献１）。この方法では、人工的な塩基配列を有する検出用プローブを予め準備しておき、当該人工的塩基配列に結合する塩基配列を有するようなＤＮＡ断片を増幅可能に試料調製工程が設計されている。また、これらのプローブは、ハイブリダイズ温度を３７℃程度で、最も特異性が高まるようにプローブの塩基配列が設計されている。
国際公開第ＷＯ２００９／０３４８４２号 特開２００６−２１１９８２号公報 特開２００６−１０１８４４号公報
Analytical Biochemistry, 364、1(2007）, 78-85
上記特許文献１に記載の方法では、増幅ＤＮＡ断片の特定物質結合部位（特定物質が結合可能な特定塩基配列）を、特定物質が認識して当該特定塩基配列に結合する。しかしながら、増幅ＤＮＡ断片は、その特定塩基配列においてもその相補鎖と二重鎖を形成しており、特定物質と相互作用しやすい一本鎖状態ではない。したがって、特定物質が特定塩基配列を認識する効率はそれほど高くなく、特定物質が結合した二重鎖断片を濃縮する必要がある。
また、上記特許文献２、３及び非特許文献１に記載の方法では、ラベリング工程において、片方のプライマー濃度を相対的に高くして増幅を行う（アシメトリックＰＣＲともいう。）などして、意図的にアレイ上のプローブと反応する側のＤＮＡ鎖を選択的に増幅するようにして、反応性を向上させている。しかしながら、こうした非対照的なＰＣＲでは、増幅効率自体が低下する傾向があった。このため、ハイブリダイズ温度を低下させたり、あるいは塩濃度を高めるといった方策が考えられるが、一方で非特異的なハイブリダイゼーションが発生するおそれもある。
さらに、一般的なプローブハイブリダイゼーションにおいて、試料として用いられるＤＮＡ増幅断片はやはり二重鎖であり、プローブとのハイブリダイゼーションを効率的に行うためには、熱変性やアルカリ変性を行って一本鎖とすることが一般的である。しかしながら、変性した増幅断片は、徐々に二重鎖に戻り、ハイブリダイゼーション効率が低下するおそれがある。一方、これを抑制するには、ハイブリダイゼーション時間や温度などの条件の最適化が必要になる場合もある。
以上の現状に鑑み、本明細書は、従来のプローブハイブリダイゼーションにおける試料ＤＮＡ断片における問題を解決して、効率的なプローブハイブリダイゼーションを実現できる標的核酸の検出方法を提供する。
本発明者らは、プローブハイブリダイゼーションに適用する際のプローブとのハイブリダイゼーションについて種々検討した結果、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制しつつ効率的なハイブリダイゼーション実現するための好適な検出用プローブをより容易に提供して標的核酸を検出できることを見出した。
また、本発明者らは、ハイブリダイゼーション効率や感度の向上の観点から核酸増幅法の修飾について検討した。種々の検討の結果、核酸増幅に用いるプライマーの一部にポリメラーゼ反応の進行を抑制又は停止可能な部位を導入しておくことで、ハイブリダイゼーション効率が高く、検出感度を向上させることができるという知見を得た。また、熱変性を不要として短時間で高感度なハイブリダイゼーションが可能であるという知見を得た。本明細書は、これらの知見に基づいて以下の手段を提供する。
本明細書は、１又は２以上の標的核酸を検出する方法を開示する。この方法は、前記１又は２以上の標的核酸のそれぞれ予め関連付けられ前記標的核酸を検出するための検出用配列を含む１又は２以上の検出用プローブと前記標的核酸の増幅断片とをハイブリダイズ可能に接触させるハイブリダイゼーション工程、を備えることができる。前記検出用プローブは、水素結合数が９以上１２５以下の検出用配列を含むことができる。前記検出用プローブの前記検出用配列の水素結合数は、好ましくは１５以上であり、より好ましくは１７以上である。また、好ましくは、５５以下である。
この方法は、前記ハイブリダイゼーション工程に先立って、さらに、前記１又は２以上の標的核酸のそれぞれ予め関連付けられた前記検出用プローブに相補的なタグ配列と前記１又は２以上の標的核酸中の各第１の塩基配列を識別する第１の識別配列とを含み、前記タグ配列と前記第１の認識配列との間に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有する１又は２以上の第１のプライマーと、前記標的核酸中の各第２の塩基配列を識別する第２の識別配列を含む１又は２以上の第２のプライマーと、を用いて、核酸増幅反応を実施する増幅工程、を備えることができる。
また、前記ハイブリダイゼーション工程は、前記複数の検出用プローブを備える前記固相体に対して前記増幅断片を含む液体を移動相として供給し前記固相体に対して前記移動相を展開することを含む工程であってもよい。
本明細書は、１又は２以上の標的核酸を検出するために用いるプローブセットを提供する。このプローブセットは、それぞれ異なる所定の塩基配列を有する複数の検出用プローブを含み、前記複数の検出用配列の水素結合数は、９以上１２５以下とすることができる。
本明細書は、上記プローブセットが保持された固相体を提供し、また、上記プローブセットを含む標的核酸の検出キットも提供する。
本発明の検出方法における増幅工程の一例の概要を模式的に示す図である。 本発明の検出方法における増幅工程の他の一例の概要を模式的に示す図である。 本発明の検出方法のフローの一例を示す図である。 本発明の検出方法のフローの他の一例を示す図である。 本発明の検出方法のフローの他の一例を示す図である。 実施例におけるゲノムＤＮＡの増幅結果を示す図である。 実施例で得られた検出結果を示す図である。 実施例で得られた検出結果を示す図である。 実施例３のメンブレンアレイにおけるプローブの配置を示す図である。 メンブレンアレイ上での検出結果を示す図である。ある。 実施例４のメンブレンアレイにおけるプローブの配置の一例を示す図である。 ４５種の検出用プローブと標的オリゴヌクレオチドとの非特異的ハイブリダイゼーションを示す図である。 検出用プローブと標的オリゴヌクレオチドとの一致配列の水素結合数と非特異的ハイブリダイゼーションとの関係を示す第１の図である。 検出用プローブと標的オリゴヌクレオチドとの一致配列の水素結合数と非特異的ハイブリダイゼーションとの関係を示す第２の図である。 検出用プローブと標的オリゴヌクレオチドとの一致配列の水素結合数と非特異的ハイブリダイゼーションとの関係を示す第３の図である。 検出用プローブと標的オリゴヌクレオチドとの一致配列の水素結合数と非特異的ハイブリダイゼーションとの関係を示す第４の図である。 検出用プローブと標的オリゴヌクレオチドとの一致配列の水素結合数と非特異的ハイブリダイゼーションとの関係を示す第５の図である。 検出用プローブと標的オリゴヌクレオチドとの一致配列の水素結合数と非特異的ハイブリダイゼーションとの関係を示す第６の図である。 検出用プローブと標的オリゴヌクレオチドとの一致配列の水素結合数と発色の有無との関係を示す図である。 検出用プローブと標的オリゴヌクレオチドとの一致配列の水素結合数と発色程度との関係を示す図である。
本明細書は、標的核酸の検出方法等に関する。本明細書の標的核酸の検出方法の１つは、標的核酸に予め関連付けられた検出用プローブの検出用配列の水素結合数が９以上１２５以下の範囲である検出用プローブと標的核酸又はその核酸増幅産物とハイブリダイゼーションする工程を備えることができる。このような水素結合数の検出用配列とすることで、ハイブリダイゼーションにおける非特異的反応を抑制して標的核酸を検出できる。また、低コストでかつ容易に検出用プローブを設計し、製造できる。検出用配列の水素結合数は、その塩基配列および塩基長に基づいて算出できる。アデニンまたはチミンの水素結合数を２とし、グアニンまたはシトシンの水素結合数を３として、検出用配列中のアデニンまたはチミンの塩基数、グアニンまたはシトシンの塩基数とそれぞれ乗じることで、検出用配列の水素結合数が算出される。なお、算出に際しては、アデニンまたはチミンと、グアニンまたはシトシンの存在比が５０％であると仮定し、配列の塩基長に２．５を乗じることによって、水素結合数を計算した。
本明細書の標的核酸を検出方法の他の１つは、以下の第１のプライマーと第２のプライマーとを用いることを特徴としている。本発明の検出方法における増幅工程の一例を図１Ａ及び図１Ｂに示す。
図１Ａに示すように、第１のプライマーは、標的核酸に予め関連付けられた検出用プローブに相補的なタグ配列などの第１の任意の塩基配列と標的核酸中の第１の塩基配列を識別する第１の識別配列とを含み、第１の任意の塩基配列と第１の認識配列との間に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有しており、
第２のプライマーは、標的核酸中の第２の塩基配列を識別する第２の識別配列を含んでいる。
連結部位は、ＤＮＡポリメラーゼの反応を抑制又は停止させる。すなわち、当該連結部位は、天然塩基等を含まないなどの理由により、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の鋳型とはなりえない。このため、図１Ａに示すように、第１のプライマーによって増幅されたＤＮＡ一本鎖が鋳型鎖となって、さらに第２のプライマーによって増幅されるとき、第２のプライマーからのＤＮＡ伸長反応は、当該連結部位に対合する部位より３’側において抑制又は停止される。このため、増幅工程により得られる増幅断片（ＤＮＡ二重鎖断片）は、結果として、一方の端部に第１の任意の塩基配列を突出する一本鎖として備えるとともに塩基の対合による二重鎖部分を備えたものとなると推論される。
また、図１Ｂには、第２のプライマーが、第２の任意の塩基配列をさらに有し、当該第２の任意の塩基配列と第２の識別配列との間に前記連結部位を有する場合の増幅工程を示す。図１Ｂに示すように、図１Ａで示した第１のプライマーと同様、第２のプライマーによって増幅されたＤＮＡ一本鎖が鋳型鎖となって、さらに第１のプライマーによって増幅されるとき、第１のプライマーからのＤＮＡ伸長反応は、当該連結部位に対合する部位より３’側において抑制又は停止される。このため、増幅工程により得られる増幅断片（ＤＮＡ二重鎖断片）は、結果として、一方の端部にタグ配列を突出した一本鎖として備え、他方の端部に任意の塩基配列を突出した一本鎖として備えるとともに、塩基の対合による二重鎖部分を備えたものとなると推論される。
以上のことは、第１の任意の塩基配列を、標的核酸に予め関連付けられた検出用プローブに相補的なタグ配列としたプライマーセットを用いて、標的核酸を含む試料に対してＤＮＡポリメラーゼによる増幅工程を実施することで得られる増幅断片を、そのまま変性することなく、検出用プローブとハイブリダイゼーションさせるとき、極めて高感度にかつ迅速に標的核酸を検出できることでも支持されている。図１Ａ及び図１Ｂに示すように、得られたＤＮＡ二重鎖断片が、標的核酸中の第１の塩基配列及び第２の塩基配列において二重鎖部分を形成し、端部にタグ配列を一本鎖として有するＤＮＡ二重鎖断片となっているため、この一本鎖で効率的にプローブとハイブリダイゼーションしていると考えられる。ハイブリダイゼーション効率が上昇することにより感度は向上する。
本発明の検出方法によれば、以下の少なくとも一つの効果を実現できる。
（１）ハイブリダイゼーションの効率化（迅速化）
（２）ラベリングの効率化
（３）検出感度の高度化
（４）工程の簡略化（迅速化）−特に二重鎖を一本鎖とする変性工程の省略による
こうした連結部位を含んで塩基配列を有するオリゴヌクレオチド誘導体は、それ自体プライマー等の核酸増幅剤として有用である。また、こうしたプライマーを用いる核酸増幅方法、得られたＤＮＡ二重鎖断片及び当該断片を含むハイブリダイゼーション用組成物も、それぞれその形態に応じた少なくとも一つの効果を発揮することができる。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
なお、本明細書において「核酸」とは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡを含む全てのＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ−オリゴ核酸などの人工合成核酸を含む。また、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。また、本明細書において「標的核酸」とは、任意の配列を有する任意の核酸である。典型的には、体質、遺伝病、癌などの特定疾患についての発症、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択などのヒトや非ヒト動物における遺伝子上の指標となる塩基配列を有する可能性のある核酸が挙げられる。指標としては、ＳＮＰなどの多型や先天的又は後天的変異が挙げられる。また、病原菌やウイルスなどの微生物由来の核酸なども標的核酸に含まれる。
標的核酸は、後述する試料又はその核酸画分をそのまま用いることもできるが、好ましくは、ＰＣＲによる増幅反応、より好ましくはマルチプレックスＰＣＲによる増幅反応により、複数の標的核酸が増幅された増幅産物を用いることが好ましい。
本明細書において「試料」とは、標的核酸を含む可能性のある試料をいう。試料としては、細胞、組織、血液、尿、唾液等が含まれ、核酸を含む任意の試料を用いることができる。こうした各種の試料からの核酸を含む画分は当業者であれば適宜従来技術を参照して取得することができる。
本明細書において「標的配列」とは、検出対象の標的核酸に特徴的な１又は２以上の塩基からなる配列をいう。例えば、標的核酸同士のホモロジーの低い部分配列であってもよいし、試料に含まれる可能性のある他の核酸に相補性もしくは相同性の低い配列であってもよい。標的配列は、標的核酸に特徴的な配列であってもよい。こうした標的配列は、人工的に配列を変更したものであってもよい。
以下では、本明細書の開示の代表的かつ非限定的な具体例について、図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本明細書の開示の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本明細書の開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに開示は、さらに改善された標的核酸の検出方法等を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本明細書の開示を実施する際に必須のものではなく、特に本明細書の開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本明細書の開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
［標的核酸を検出する方法］
本明細書に開示される検出方法は、特定の水素結合数の範囲の検出用配列の検出用プローブと標的核酸又はその増幅断片とをハイブリダイズ可能に接触させるハイブリダイゼーション工程を備えている。
ここでいうハイブリダイゼーション工程は、従来公知の核酸における塩基対合によって増幅断片と検出用プローブとを複合化する工程であって、検出用プローブ及び増幅断片ともに、公知の全ての形態が包含される。また、ハイブリダイゼーション自体も、後述する浸漬型ハイブリダイゼーションのほか展開型ハイブリダイゼーションも包含される。
一方、標的核酸に対して核酸増幅を実施する工程及びハイブリダイゼーション工程については、特に、以下の形態を採用することができる。すなわち、第１のプライマーと、第２のプライマーと、を用いて、前記試料の核酸増幅を実施する工程と、前記増幅実施工程で得られた増幅断片と検出用プローブとを前記タグ配列によりハイブリダイズ可能に接触させるハイブリダイゼーション工程と、前記固相体上の前記増幅断片と前記検出用プローブとのハイブリダイズ産物を検出する検出工程と、を採用できる。
なお、本明細書に開示の検出方法は、１種又は２種以上の標的核酸を適用対象とし、より詳細には、これらの標的核酸中の特徴的な配列に関する標的配列を検出対象とする。
以下、主として一種の標的核酸について、特定の第１のプライマーと第２のプライマーとを用いて増幅断片を得て、検出用プローブとハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイズ産物を検出する一連の工程を説明する。なお以下の説明において、検出用プローブに関する実施態様は、第１及び第２のプライマーを用いない通常の核酸増幅を行いハイブリダイゼーションを実施する場合にも適用される。また、以下の説明における各種実施態様は、複数又は多数の標的核酸を同時に検出する場合にも適用される。
（固相体の準備工程）
本明細書に開示される検出方法（以下、単に本検出方法という。）は、図２Ａに示すように、固相体を準備する工程を備えることができる。こうした固相体は、検出方法の実施に先立って予め準備していてもよいし、商業的に入手してもよいし、検出方法の実施毎に調製してもよい。
図２Ａに示すように、固相体は、それぞれ異なる固有の塩基配列である検出用配列を備える複数の検出用プローブを担体上に備えることができる。このような固相体を準備することで、プローブの設計、合成、アレイの作製、ハイブリダイゼーション条件についての検討を回避することができる。
図２Ａに固相体の一例を示す。検出用プローブは、それぞれプロービングのための固有の塩基配列である検出用配列を有している。このような検出用配列は、標的核酸に特徴的な配列、すなわち標的配列に特異的なハイブリダイゼーションが可能な塩基配列とすることができる。通常、標的配列と完全に相補的な塩基配列とすることができる。一方、検出用配列を、標的配列に無関係に設定することができる。標的配列と無関係に設定することで、検出用プローブの検出用配列を、複数の検出用プローブ間での非特異的結合を抑制又は回避できるように、かつ、ハイブリダイゼーションに好適な温度及び時間等のハイブリダイゼーション条件を考慮して設定することができる。また、標的核酸の種類にかかわらず、いつも同じ検出用プローブを用いることができるようになる。
検出用配列の長さは、特に限定しないが、一般的には、２０塩基長以上５０塩基長以下であることが好ましい。この範囲であると、各検出用配列の特異性を確保しつつハイブリダイゼーション効率も確保できるからである。これを検出用配列の水素結合数に換算すると、５５以上１２５以下となる。例えば、こうした塩基長の検出用配列は、後述する配列番号１〜１００及びその相補配列から選択される各２３塩基長の塩基配列を２つ組み合わせた４６塩基長の配列や、当該組み合わせた塩基配列に対して適宜塩基を付加、欠失などすることにより得ることができる。これによって、水素結合数を調整することもできる。より好ましくは、２０塩基長以上２５塩基長以下（水素結合数に換算すると、５５以上６３以下）である。例えば、こうした塩基長の検出用配列は、配列番号１〜１００の各２３塩基長の塩基配列及びその相補配列又はこれらの塩基配列に対して適宜塩基を付加、欠失などすることにより得ることができる。なお、第１のプライマーにおけるタグ配列は、検出用配列と対合する塩基配列であるため、タグ配列の塩基長は、検出用配列と同様、２０塩基長以上５０塩基長以下（水素結合数に換算すると、５５以上１２５以下）であることが好ましく、より好ましくは、２０塩基長以上２５塩基長以下（水素結合数に換算すると、５５以上６３以下）である。
こうした検出用プローブの検出用配列としては、例えば、配列番号１〜配列番号１００に記載の塩基配列又はこの塩基配列に相補的な塩基配列を用いることができる。これらの塩基配列は全て同一塩基長（２３塩基長）であり、融解温度（Ｔｍ）が４０℃以上８０℃以下、好ましくは５０℃以上７０℃以下であって、同一条件でのハイブリダイズにおいて均質なハイブリダイズ結果が得ることができるようになっている。なお、上述したように、これらの塩基配列群から選択される２種を組み合わせることもできる。さらに、こうした配列に対して、特異性を失わない範囲で塩基長を付加、欠失、置換等することができる。同時に用いる検出用プローブのための検出用配列は、配列番号１〜１００で表される塩基配列（群）か、あるいはこれらに相補的な塩基配列（群）のいずれかの群から選択されることが好ましい。
検出用プローブの検出用配列は、このような候補となる塩基配列又はその相補配列から適宜選択して用いることができるが、なかでも、以下の表に示す塩基配列又はその相補配列から選択される１種又は２種以上の塩基配列をそれぞれ検出用配列として有する１種又は２種以上のプローブのみからなるプローブセット、あるいは以下の全ての塩基配列又はその相補配列をそれぞれ検出用配列として有するプローブのみからなるプローブセットを用いることが好ましい。こうした塩基配列を検出用配列として選択することで、短時間のハイブリダイゼーションが可能であり、ハイブリダイゼーションの一層の迅速性を実現できる。
このような検出用プローブにおける検出用配列は、正規直交化配列ともいい、たとえば乱数から得られた所定塩基長のＤＮＡ配列に対して連続一致長、Nearest-Neighbor法による融解温度予測、ハミング距離、二次構造予測の計算を行うことにより設計される。正規直交化配列は、核酸の塩基配列であって、その融解温度が均一であるもの、即ち融解温度が一定範囲内に揃うように設計された配列であって、核酸自身が分子内（intramolecular）で構造化して、相補的な配列とのハイブリッド形成を阻害することのない配列であり、尚且つこれに相補的な塩基配列以外とは安定したハイブリッドを形成しない塩基配列を意味する。１つの正規直交化配列群に含まれる配列は、所望の組み合わせ以外の配列間および自己配列内において反応が生じ難いか、または反応が生じない。また、正規直交化配列は、ＰＣＲにおいて増幅させると、たとえば上述のクロスハイブリダイズのような問題に影響されずに、当該正規直交化配列を有する核酸の初期量に応じた量の核酸が定量的に増幅される性質を有している。上記のような正規直交化配列は、H.Yoshida and A.Suyama,“Solution to 3-SAT by breadth first search”,DIMACS Vl.54, 9-20(2000)および特願２００３−１０８１２６に詳細が記載されている。これらの文献に記載の方法を使用して正規直交化配列を設計することができる。
検出用配列の設計（塩基配列や塩基長）は、ハイブリダイゼーション形態（ハイブリダイゼーション液に固相体を浸漬して行う浸漬型ハイブリダイゼーションかあるいはハイブリダイゼーション液に固相体の一部を浸漬して一定方向にハイブリダイゼーション液を移動相として展開させて行う展開型ハイブリダイゼーション）やハイブリダイゼーション条件（温度や塩濃度等）に応じて変更することができる。検出用配列の塩基配列や塩基長を変更することによって、検出用配列の水素結合数を変更できる。
ここで、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制できる検出用プローブとして好ましい検出用配列について説明する。こうした検出用配列は、浸漬型ハイブリダイゼーションにも適用できるが、特に、ハイブリダイゼーション形態として、展開型ハイブリダイゼーションのようにハイブリダイゼーション液が、固相体上、すなわち、検出用プローブ上を一定方向に移動（展開）する形態を採用する場合において、好ましい、核酸クロマトグラフィー等の展開型ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション液である移動相の移動（展開）に伴って特異的な移動相の移動に逆らってハイブリダイゼーションが生じる点、一般的に従来の浸漬型ハイブリダイゼーションよりも低い温度でハイブリダイゼーションを行う点、及びハイブリダイゼーション後に十分な洗浄が行われにくい点において、意図しない非特異的ハイブリダイゼーションが生じる可能性が高いと考えられる。このためこうした非特異的ハイブリダイゼーションを抑制できる検出用配列の設計及び製造を効率的に行う必要がある。
こうした検出用配列のためには、以下に示す配列設計を適用することができる。
検出用プローブの検出用配列の水素結合数は、９以上であることが好ましい。検出用配列の水素結合数が８以下であると、ハイブリダイゼーションによって標的配列を捕捉する捕捉力を発揮する検出用配列を設計することが相当困難であるが、検出用配列の水素結合数が９以上であれば、ハイブリダイズ産物を十分に検出できる程度の捕捉力を確保する検出用配列を設計できる。なお、水素結合数を、従来（少なくとも５０程度）よりも少数であることにより、プローブ製造コストを低減できるほか、検出用配列の設計が容易であり、検出用配列を長く設定することによって発生する多種類の検出用配列についての評価実験を排除できる。
検出用配列の水素結合数は、より好ましくは１５以上である。１５以上であると、さらに標的配列を捕捉できる検出用配列を設計するのが容易になる。また、１７以上であると、高いハイブリダイゼーション効率（強いシグナルを取得できる）の検出用配列の設計が一層容易になる。
また、検出用配列の水素結合数は、１２５以下とすることが好ましいが、より好ましくは６３以下とする。さらに、５９未満とすることができる。既述の人工的塩基配列の水素結合数は５９であるが、それよりも少なくても、特に、展開型ハイブリダイゼーションにおいて十分である。さらに、好ましくは、５５以下である。より好ましくは５５未満である。検出用配列は、増幅断片におけるタグ配列の長さに対応しており、タグ配列の水素結合数を５５以下ないし５５未満に制限することで、核酸増幅工程への影響を抑制できる。
なお、こうした検出用プローブが適用される浸漬型又は展開型ハイブリダイゼーションにおいては、そのハイブリダイゼーション条件は、５℃以上４０℃以下であることが好ましい。特に、展開型ハイブリダイゼーションは、室温で簡易にできることにより有利であるからである。より好ましくは、ハイブリダイゼーション温度は、１５℃以上３０℃以下である。
また、こうした展開型ハイブリダイゼーションにおいては、ハイブリダイズ産物の検出を、後述する標識プローブで行うことが好ましい。標識用プローブは、視認可能な標識物質と増幅断片の有する標識用配列に相補的な塩基配列とを備えていることが好ましい。こうした標識用プローブによれば、簡易な検出が可能であるからである。さらに、標識物質は、着色された粒子であることがより好ましい。こうした標識プローブを用いることで、目視でもより明瞭にハイブリダイズ産物を検出できるようになるからである。なお、標識プローブにおける種々の実施形態は後段で詳述する。
検出用プローブは、担体に固定化されている。担体としては、固相担体を用いることができる。例えば、担体はプラスチックであってもよいし、ガラスであってもよく、材質は特に限定されない。また、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン等の多孔質体であってもよい。この種の多孔質担体は、特に、展開型ハイブリダイゼーションにより、固相担体に固定化した検出用プローブと増幅断片とをハイブリダイゼーションさせるのに好適である。
なお、担体の形状は図１に示すように平板状であってもよいが、ビーズ状であってもよく、形状は特に限定されない。固相体は、好ましくは、担体が固相平板状であり、複数の検出用プローブが一定の配列で固定されたアレイ（特にマイクロアレイ）である。アレイは、多数個の検出用プロー４を固定でき、同時に網羅的に各種の標的核酸を検出するのに都合がよい。また、固相体は、担体上に複数個の区画されたアレイ領域を備えていてもよい。これらの複数のアレイ領域は、それぞれ同一の組み合わせからなる検出用プローブのセットが固定化されていてもよいし、それぞれ別の組み合わせからなる検出用プローブのセットが固定化されていてもよい。複数のアレイ領域に異なる組み合わせの検出用プローブのセットが固定化されていれば、個々のアレイ領域を、異なる遺伝子における標的核酸の検出のために割り当てることができる。
担体の形状は、ハイブリダイゼーションの形態を考慮して設定することもできる。例えば、浸漬型ハイブリダイゼーションの場合であって、検査や研究用に汎用されているエッペンドルフチューブ（商標）のようなマイクロチューブ内でハイブリダイゼーションを実施する場合には、当該チューブ内に収容したハイブリダイゼーション溶液に担体のアレイ領域が浸漬されるサイズ及び形状であることが好ましい。こうした担体のサイズは、典型的には、平面積が１５０ｍｍ２以下、アスペクト比が１．５以上２０以下で、厚みは０．０１ｍｍ以上０．３ｍｍ以下とすることができる。
また、ハイブリダイゼーションを、アフィニティークロマトグラフィーの原理を用いて多孔質体である固相担体に固定化した検出用プローブとの間で実施する展開型ハイブリダイゼーションの形態では、少なくとも、検査や研究用に汎用されているエッペンドルフチューブ（商標）のようなマイクロチューブに供給されるハイブリダイゼーション溶液に対して担体の端部が浸漬可能なサイズ（幅方向）及び形状を備えていることが好ましい。好ましくは、この種のチューブの底部近傍から上端までに収容可能な部位を備える長尺体である。
検出用プローブの固定化形態は特に限定されない。検出用プローブは、その３’末端が担体に結合されていてもよいし、５’末端が結合されていてもよい。共有結合性であってもよいし非共有結合性であってもよい。検出用プローブは、従来公知の各種の方法で担体の表面に固定化することができる。例えば、検出用プローブを含む溶液の微小液滴を吐出する方法で、担体に所定の平面形態を描くように供給する。そして、必要に応じて加熱等することで乾燥することで検出用プローブを固定化する。さらに、例えば、検出用プローブの固相担体への固定化のために、検出用プローブにアミノ基等を付加してもよいし、アルブミンなどのタンパク質を連結して担体への固着性を高めることもできる。また、加熱処理やＵＶ照射などの各種放射線照射により固着性を高めることもできる。
また、検出用プローブは、担体の表面に対しては適当なリンカー配列を備えていてもよい。リンカー配列は、好ましくは検出用プローブ間において同一塩基長で同一配列（すなわち、同一の水素結合数）とする。
検出用プローブは、ハイブリダイゼーションの形態に応じて所定のパターンで固相担体に供給される。浸漬型ハイブリダイゼーションでは、典型的には個々の検出用プローブに対応するドットが配列されたパターンとなる。また、展開型ハイブリダイゼーションでは、典型的には個々の検出用プローブに対応するドット状又はストリーム状（帯状体）等が展開方向に沿う１又は２以上の展開位置に配列されたパターンとなる。
（増幅工程）
図２Ａに示すように、増幅工程は、第１のプライマーと第２のプライマーとを用いて実施する。核酸増幅工程における核酸増幅法は、ＰＣＲを始めとするＤＮＡポリメラーゼ反応を用いてＤＮＡを増幅して二重鎖ＤＮＡ断片を取得する各種の公知の方法が挙げられる。
（第１のプライマー）
第１のプライマーは、標的核酸に予め関連付けられた検出用プローブに相補的なタグ配列と標的核酸中の第１の塩基配列を識別する第１の識別配列とを含んでいる。これらの塩基配列の長さ等は特に限定されず、標的核酸の標的配列の内容に応じて適宜決定される。
（第１の識別配列）
第１の識別配列は、核酸増幅により、標的核酸を増幅するための配列であり、標的核酸中の標的配列の一部を構成する第１の塩基配列と特異的にハイブリダイズできる。第１の識別配列は、第１の塩基配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的（特異的）に設定される。
（タグ配列）
タグ配列は、タグ配列は、増幅断片が検出用プローブとハイブリダイゼーションを可能とするための配列であり、標的核酸を検出するものであるため、標的核酸毎に検出用プローブの検出用配列にハイブリダイズ可能に設定される。典型的には、検出用配列に相補的な塩基配列となっている。したがって、一つの標的核酸は、一つの検出用プローブに対応付けられることになる。タグ配列の水素結合数は、既に説明したように、好ましくは検出用プローブの検出用配列の水素結合数に一致し、好ましくは、５５以上１２５以下であり、より好ましくは、５５以上６３以下である。
また、検出用配列におけるのと同様の観点から、タグ配列の水素結合数は、９以上１２５以下であることが好ましい。また、より好ましくは、６３以下である。さらに好ましくは５５以下である。また、別の観点からも水素結合数は５５以下であることが好ましい。タグ配列が短くなることにより、増幅断片におけるタグ配列の長さが一般的なＰＣＲプライマーの水素結合数（５０）と同等かあるいはそれ以下であると、非特異的増幅の低減に寄与する。すなわち、プライマーのタグ配列の水素結合数を制限することで、核酸増幅工程への影響を抑制できる。
標的核酸中の第１の塩基配列と第２の塩基配列とは、標的核酸に対してどのような構成となっていてもよい。例えば、ＤＮＡ上の変異を検出する場合、いずれか一方の塩基配列にのみ１又は２以上の塩基の変異部位が含まれるようにしてもよいし、双方に変異部位が含まれるようにしてもよい。なお、第１のプライマーは、こうしたタグ配列及び第１の識別配列を有しており、こうした塩基配列を構成する天然塩基あるいはこれに相同な人工塩基を有するとともに、天然核酸との間で塩基対合を可能とする骨格を有している。典型的には天然塩基を有するＤＮＡなどのオリゴヌクレオチド又はその誘導体である。
（連結部位）
タグ配列を有するプライマーの一部と第１の識別配列を有するプライマーの他の一部とは直接連結されることはなく、これらの間には連結部位を有している。連結部位は、鋳型鎖に含まれたとき、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な部位である。ＤＮＡポリメラーゼ反応は、鋳型となる核酸（ないし塩基）がないとそれ以上ＤＮＡ鎖を伸長しないとされている。このため、本発明の連結部位は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長時の鋳型となりえない構造を有している。すなわち、本連結部位は、天然塩基又は天然塩基と対合する天然塩基の誘導体（天然塩基等）を含まない。こうした天然塩基等を含まないことで、前記鋳型となることを回避して、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸長を抑制又は回避できる。したがって、本連結部位は、天然塩基等を有しないない単なる骨格鎖だけであってもよい。すなわち、糖−リン酸骨格や、他の公知の人工オリゴヌクレオチドに適用される骨格であってもよい。なお、ＤＮＡポリメラーゼは、各種公知のＤＮＡポリメラーゼが包含される。典型的には、各種ＰＣＲなどの核酸増幅法に用いられるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
また、本連結部位は、リン酸ジエステル結合を介してヌクレオチドに隣接される、元素数が２以上４０以下である一重鎖構造を含む鎖状の連結基であってもよい。元素数が１以下では、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止が不完全になりやすく、元素数が４０を超えると、ヌクレオチドの溶解性が低下するおそれがあるからである。ＤＮＡポリメラーゼ反応の抑制又は停止の効果を考慮すると、鎖状の連結基の元素は、２以上３６以下であることが好ましく、より好ましくは３以上１６以下である。
本連結部位が、一重結合を含むのは、連結部位における回転を容易にするためであり、一重結合は、炭素−炭素一重結合、炭素−酸素一重結合、炭素−窒素一重結合、Ｓ−Ｓ一重結合などが挙げられる。本連結部位は、こうした一重結合を主体とすることが好ましい。また、本連結部位は、一重結合を含む限り一部に芳香環あるいはシクロアルカンを含んでいてもよい。
本連結部位としては、元素数が２以上４０以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を含むことが好ましい。こうした鎖状の連結構造は、構造的に簡易であるほか、連結部位としての導入も容易である。
こうした連結部位としては、例えば、以下の式（１）で表される連結部位が挙げられる。
５’−Ｏ−ＣmＨ2m−Ｏ−３’ 式（１）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｍは２以上４０以下の整数を表す。）、
式（１）においてｍは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（１）中のＨの置換基は、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。アルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１〜８であることが好ましく、より好ましくは１〜４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。
また、他の連結部位としては、以下の式（２）で表される連結部位が挙げられる。
５’−（ＯＣnＨ2n）l−ｖ３’ 式（２）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、ｌは、２以上の整数であって、（ｎ＋１）×ｌは４０以下となる整数を表す。）
式（２）において（ｎ＋１）×ｌは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（２）中のＨの置換基は、式（１）中の置換基と同様の態様が適用される。
本連結部位としては、例えば、以下の鎖状部位が挙げられる。
さらに、本連結部位としては、例えば、以下の鎖状部位が挙げられる。
第１のプライマーは、第１の識別配列及びタグ配列を有しており、こうした塩基配列を構成する天然塩基あるいはこれに相同な人工塩基を有するとともに、天然核酸との間で塩基対合を可能とする骨格を主体として有している。典型的にはオリゴヌクレオチド又はその誘導体である。
第１のプライマーにおいては、その５’側からタグ配列、連結部位及び第１の識別配列の順でこれらを有していることが好ましい。こうした構成とすることで、こうしたプライマーによって増幅されたＤＮＡ鎖が鋳型鎖となって増幅されるとき、鋳型鎖中の第１のプライマー由来の連結部位よりも５’側、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるＤＮＡ鎖においてより先の３’側では伸長反応が停止されるか抑制される。この結果、鋳型鎖中の第１のプライマー由来の連結部位の３’側に隣接するヌクレオチドの塩基又はその近傍の塩基に対合する塩基を５’末端とし、第１のプライマー中のタグ配列の相補鎖を有しない増幅断片が得られることとなる（図１Ａ及び図１Ｂ、図２Ａ〜図２Ｃ参照）。
なお、連結部位近傍、すなわち、連結部位の３’側及び５’側には、タグ配列や第１の識別配列とは無関係の配列を含めることもできる。第１のプライマーが鋳型鎖となったとき、連結部位の存在のために、伸長鎖におけるタグ配列や第１の識別配列に対して意図しないＤＮＡ伸長反応の進行や停止の影響を低減又は回避できるからである。
（第２のプライマー）
図２Ａに示すように、第２のプライマーは、標的核酸中の第２の塩基配列を識別する第２の識別配列を含んでいる。これらの塩基配列の長さ等は特に限定されず、標的核酸の標的配列の内容に応じて適宜決定される。
（第２の識別配列）
第２の識別配列は、核酸増幅により、第１のプライマーとともに標的核酸を増幅するための配列であり、標的核酸中の標的配列の他の一部を構成する第２の塩基配列と特異的にハイブリダイズできる。第２の識別配列は、第２の塩基配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的（特異的）に設定される。
（標識物質結合領域）
図２Ａに示すように、標識物質結合領域は、予め標識物質を備えることができる。標識物質は、固相上で検出用プローブに結合したＤＮＡ二重鎖断片を検出するためのものである。標識物質としては従来公知のものを適宜選択して用いることができる。それ自体励起されると蛍光シグナルを発する蛍光物質などの各種色素であってもよいし、さらに酵素反応や抗原抗体反応により第２成分と組み合わせて各種シグナルを発する物質であってもよい。典型的には、Ｃｙ３、Alexa555、Ｃｙ５、Alexa647等の蛍光標識物質を用いることができる。また、ビオチンとストレプトアビジンＨＰＲとを組み合わせのほか、ＤＩＧ等を用いて基質による処理等による発色による検出を用いてもよい。標識物質結合領域は、標識物質を、第２の塩基配列に対して直接あるいは適当なリンカーを介して公知の方法により連結して備えている。
また、第２のプライマーは、図２Ｂに示すように、標識物質結合領域が、標識物質を結合可能に構成されていてもよい。すなわち、所定の塩基配列を有しており、標識物質を有するとともに標識結合配列を識別する塩基配列を有する標識プローブが結合可能であってもよい。こうした標識プローブは後述するハイブリダイゼーション工程や検出工程において固相体上の検出用プローブとハイブリダイゼーションしたＤＮＡ二重鎖断片に供給されて、これを標識することができる。
例えば、標識プローブは、以下の構成を採用することができる。標識物質としては、目視で視認可能であることが好ましい。すなわち、直接それ自体が、他の成分を必要としないで目視で視認可能なシグナルを生成することができる物質であることが好ましい。こうした物質としては、典型的には、各種の顔料や染料などの各種の着色剤が挙げられる。また、これに準ずる、金、銀などの貴金属ほか、銅などの各種金属又は合金、あるいは当該金属を含む有機化合物（錯体化合物であってもよい）が挙げられる。また、着色剤に準ずる、マイカ等の無機化合物が挙げられる。
標識物質としては、より具体的には、各種染料、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン及びエクリオンを包含する化学発光物質が挙げられる。また、こうした標識物質でラベルされているラテックス粒子などの粒子が挙げられる。さらに、金コロイド若しくはゾル又は銀コロイド若しくはゾルを包含するコロイド若しくはゾル等が挙げられる。
標識物質は、その一部に粒子を備えていてもよい又はそれ自体が粒子状であってもよい。この粒子は、通常、２０ｎｍ以上２０μｍ以下であり、典型的には、４０ｎｍ〜１０μｍ、好ましくは０．１〜１０μｍ、特に好ましくは０．１〜５μｍ、さらに好ましくは０．１５〜２μｍの平均粒子径を有している。好ましい微粒子は、水溶液に懸濁でき、そして水不溶性ポリマー材料の粒子である。特に好ましいものは、ラテックス粒子、例えばポリエチレン、ポリスチレン、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、ポリビニルアセテート−アクリレート、ポリビニルピロリドン又は塩化ビニル−アクリレートが挙げられる。それらの表面上に活性基、例えばカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を有するラテックス粒子である。
こうした標識物質及び標識物質でラベルした粒子は、商業的に入手できるほか、標識物質の製造及び標識を粒子にラベルする方法も公知であり、当業者であれば適宜公知技術を利用して取得することができる。さらに、こうした標識物質又は標識物質でラベル化された粒子とＤＮＡ等のオリゴヌクレオチドとの結合もアミノ基等の官能基を介して適宜可能であり、それ自体は当該分野において周知である。
さらに、第２のプライマーは、図２Ｃに示すように、標識物質結合領域を備えていなくてもよい。すなわち、増幅工程において、標識物質を備えるヌクレオシド誘導体三リン酸を含むヌクレオシド三リン酸を用いて核酸増幅を実施することで、増幅断片のＤＮＡ伸長部位に標識物質が導入され標識された増幅断片を得ることができるからである。
第２のプライマーは、第２の識別配列のほか、必要に応じて標識物質結合領域を有しており、第２の識別配列の塩基配列を構成する天然塩基あるいはこれに相同な人工塩基を有するとともに、天然核酸との間で塩基対合を可能とする骨格を有している。典型的にはオリゴヌクレオチド又はその誘導体である。
（連結部位）
標識物質結合領域を備えるとき、標識物質結合領域と第２の識別配列とは、直接連結されていてもよいが、これらの間には連結部位を有していることが好ましい。特に、図２Ｂに示すように、標識物質結合領域が標識プローブと相互作用してこれを結合する塩基配列を有しているときにおいて好ましい。連結部位は、既に第１のプライマーにおいて説明したとおりである。
第２のプライマーにおいては、その５’側から、標識物質結合領域、連結部位及び第２の識別配列の順でこれらを有していることが好ましい。こうした構成とすることで、第２のプライマーによって増幅されたＤＮＡ鎖が鋳型鎖となって、第１のプライマーによって増幅されるとき、鋳型鎖中の第２のプライマーに由来する連結部位よりも５’側、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される新たなＤＮＡ鎖においてはより先の３’側では伸長反応が停止されるか抑制される。この結果、鋳型鎖中の第２のプライマー由来の連結部位の３’側に隣接するヌクレオチドの塩基又はその近傍の塩基に対合する塩基を５’末端とし、第２のプライマー中の標識結合領域（の塩基配列）の相補鎖を有しないＤＮＡ増幅断片が得られることとなる（図１Ｂ、図２Ｂ参照）。
なお、連結部位近傍、すなわち、連結部位の３’側及び５’側には、標識物質結合領域や第２の識別配列とは無関係の配列を含めることもできる。第２のプライマーが鋳型鎖となったとき、連結部位の存在のために、伸長鎖における標識物質結合領域や第２の識別配列に対して意図しないＤＮＡ伸長反応の進行や停止の影響を低減又は回避できるからである。
こうしたプライマーは、通常のオリゴヌクレオチド合成法にしたがって合成することができる。例えば、連結部位については、アルキレン鎖を有するホフォスホアミダイト試薬を用いて合成することができる。こうした試薬自体は、公知であり、例えば、GlenResearch社等から入手することができる。例えば、以下の試薬が挙げられる。なお、以下の式においてＤＭＴは、水酸基保護基として典型的なジメトキシトリチル基を表すが、他の公知の水酸基保護基であってもよい。また、以下の式においてＰＡは、ホスホアミダイト基を表す。
核酸増幅は、これらのプライマーを用いて実施する。核酸増幅法は既に説明したように各種公知の方法を適用できるが、典型的にはＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ等の各種ＰＣＲである。核酸増幅工程を実施するにあたっての、溶液組成、温度制御等については、当業者であれば適宜設定することができる。
すでに説明したように、たとえば、５’側からタグ配列、連結部位及び第１の識別配列の順でこれらを有する第１のプライマーと、５’側から、標識物質結合領域、連結部位及び第２の識別配列の順でこれらを有する第２のプライマーと、を用いて標的核酸を含む可能性のある試料に対してＰＣＲを実施すると、図１Ｂの各（ａ）〜（ｃ）に示すように、ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ伸長反応により、第１のプライマー及び第２のプライマーに由来して当該プライマーを含む鋳型鎖が形成される。
そして、これらの鋳型鎖がそれぞれ由来するプライマーとは異なる第２のプライマー及び第１のプライマーによって再びＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応が実施される。このとき、図１Ｂの各（ｄ）及び（ｅ）に示すように、第２のプライマーから始まり第１のプライマーを含む鋳型鎖に対するＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ伸長反応は、鋳型鎖中の第１のプライマー由来の連結部位より５’側、すなわち、伸長鎖では連結部位よりも３’側ではＤＮＡの伸長が抑制又は停止される。
また、図１Ｂの（ｄ）及び（ｅ）に示すように、第１のプライマーから始まり第２のプライマーを含む鋳型鎖に対するＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ伸長反応は、鋳型鎖中の第２のプライマー由来の連結部位より５’側、すなわち、伸長鎖では連結部位よりも３’側ではＤＮＡの伸長が抑制又は停止される。
こうした結果、得られる増幅断片は、図２Ｂに示すように、５’末端にそれぞれ突出する一本鎖のタグ配列と標識物質結合領域とを備え、第１の識別配列と第２の識別配列においては二重鎖を備えるＤＮＡ二重鎖断片となる。すなわち、このＤＮＡに重鎖断片にあっては、一方のＤＮＡ鎖の５’側では、タグ配列が突出して一本鎖となり、他方のＤＮＡ鎖の５’側では、標識物質結合領域が突出している。
なお、用いる第２のプライマーが図２Ａに示すように、予め標識物質が結合した標識物質結合領域を有する場合には、図２Ａに示すように、標識物質を一方のＤＮＡ鎖の５’末端に有し、一方のＤＮＡ鎖の５’側にタグ配列を突出して有し、第１及び第２の識別配列においては二重鎖を備えるＤＮＡ二重鎖断片となる。
また、図２Ｃに示すように、標識物質をＤＮＡ鎖伸長部位に有し、一方のＤＮＡ鎖の５’側にタグ配列を突出して有し、第１及び第２の識別配列においては二重鎖を備えるＤＮＡ二重鎖断片となる。
（ハイブリダイゼーション工程）
次に、図２Ａ〜図２Ｃに示すように、ハイブリダイゼーション工程を実施する。ハイブリダイゼーション工程は、増幅工程で得られた増幅断片と検出用プローブとをタグ配列によりハイブリダイズ可能に接触させる工程である。ハイブリダイゼーション工程によれば、図２Ａ〜図２Ｃに示すように、増幅工程で得られたＤＮＡ二重鎖断片のタグ配列と、固相体上の検出用プローブの検出用配列と一定条件下において特異的にハイブリダイズ部可能な程度に相補的であるとき、これらはハイブリダイズし固相体上の所定の検出用プローブにおいて二重鎖を形成する。ハイブリダイゼーション工程後において、適宜洗浄工程をさらに含んでいてもよい。
ハイブリダイゼーション工程には、増幅工程において特異的に増幅された標的核酸に対応するＤＮＡ二重鎖断片が供給される。この断片は、予め関連付けられた検出用プローブに特異的なタグ配列を、一本鎖として突出して有している。このため、増幅工程後、熱変性等の変性工程によって一本鎖としなくても、検出用プローブと容易に反応できる。したがって、ハイブリダイゼーション効率が高いものとなっており、結果として感度も向上しかつ安定化させることができる。感度は、第１のプライマーにおいて連結部位を備えることで、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上向上する。また、ハイブリダイゼーションの迅速性も向上されている。第１のプライマーにおいて連結部位を備えることで、ハイブリダイゼーション時間は、１０分の１程度にまで短縮されることがわかっている。
また、図２Ａに示すように、ハイブリダイゼーション工程に供給されるＤＮＡ二重鎖断片が標識物質結合領域を有し直接標識物質を備えているときには、特別なラベリング工程を実施しなくてよい。図２Ｃに示すように、ＤＮＡ二重鎖断片が増幅工程により標識物質を付与されている場合も同様である。さらに、図２Ｂに示すように、標識物質結合領域が標識プローブを結合する塩基配列を含んでいるときには、この塩基配列部分は、一本鎖としてタグ配列と反対側の５’側に突出している。このため、効率的に標識プローブとハイブリダイズし、迅速かつ容易に、しかも感度よい標識が可能となっている。したがって、特別なラベリング工程は不要であり、標識プローブは、ハイブリダイゼーション工程においてＤＮＡ二重鎖断と同時に固相体に供給するか、あるいは、ＤＮＡ二重鎖断片の固相体への供給に前後して供給してもよい（すなわち、ハイブリダイゼーション前でもハイブリダイゼーション後であってもよい。）。
ＤＮＡ二重鎖断片は、そのタグ配列に基づき特定の検出用プローブにしかハイブリダイズしない。検出用プローブの検出用配列とタグ配列とは、高度に選択的に設計されておりミスハイブリダイズが高度に抑制されているため、ハイブリダイゼーション工程においては検出用プローブに対して非特異的に二重鎖断片がハイブリダイズすることが高度に抑制される。
なお、ハイブリダイゼーション工程は、図２に例示される固相体全体にハイブリダイゼーション溶液を供給して実施する浸漬型ハイブリダイゼーションの形態に限定されないで、展開型ハイブリダイゼーションの形態であってもよい。
（検出工程）
検出工程は、前記固相体上の前記増幅断片と前記検出用プローブとのハイブリダイズ産物を検出する工程である。
検出工程は、ハイブリダイズ後の固相体上のハイブリダイズ産物が保持する標識物質に基づく標的核酸についてのシグナル強度情報を取得し、ハイブリダイズ産物を検出する工程である。シグナル強度情報取得の取得には、標識物質由来の標識シグナルを検出することができる。標的核酸と予め関連付けられた検出用プローブの固相体上における位置は予め取得されているため、標識シグナルを検出することで標的核酸の有無や比率を検知することができる。
シグナル強度情報取得には、用いた固相体の形態や標識物質の種類に応じて、従来公知の手法を適宜選択して採用すればよい。典型的には、固相体からハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチド等を洗浄操作等によって除去した後、付加した標識物質の蛍光シグナルをアレイスキャナ等により検出したり、標識物質に対して化学発光反応を実施したりすることができる。担体にビーズを用いた場合には、フローサイトメーターによる検出方法が挙げられる。
本検出工程では、標識物質のシグナル強度情報に基づいて、試料中の標的核酸の有無や比率等を検出することができる。本方法によれば、複数の標的核酸を同時に検出する場合であっても、確実に検出対象たる標的配列を検出することができる。本方法では、増幅工程で取得したＤＮＡ二重鎖断片が、効率的なハイブリダイゼーションや効率的なラベリングに適しているため、効率的に高感度な検出が可能であるとともに、煩雑な変性工程を省略できるようになっている。
本検出方法は、マルチプレックスＰＣＲで試料から複数の標的核酸に対応する増幅断片を増幅して、これらを一挙に固相体上で検出することが好ましい。すなわち、複数の標的核酸に予め関連付けた複数の検出用プローブで検出可能に、第１のプライマーと第２のプライマーとからなる複数のセットを用いて核酸増幅を実施し、増幅工程で得られた複数の増幅断片と固相体上の複数の検出用プローブとをハイブリダイズ可能に接触させ、固相体上の複数の増幅断片と複数の検出用プローブとのハイブリダイズ産物を検出するようにすることが好ましい。
（核酸増幅剤）
本発明の核酸増幅剤は、図１Ａに第１のプライマー等として示すように、５’側から第１の任意の塩基配列と増幅しようとする核酸中の第１の塩基配列を識別する第１の識別配列とを含み、前記第１の塩基配列と前記第１の識別配列との間に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有するオリゴヌクレオチド誘導体を含んでいる。本核酸増幅剤がこうした連結部位を含むことで、本核酸増幅剤を少なくとも一つのプライマー等として核酸増幅法で用いる場合であって、増幅反応で得られた核酸増幅剤を含むDNA鎖が鋳型鎖となるとき、当該連結部位は、伸長鎖におけるＤＮＡポリメラーゼ反応の抑制又は停止ポイントとして作用し、連結部位以降は、鋳型鎖として機能しなくなる。この結果、連結部位以降の鋳型鎖に相補的な伸長鎖が形成されないことになる。この結果得られるＤＮＡ二重鎖断片は、図１Ａに示すように、一方の５’側に第１の任意の塩基配列の一本鎖を有するＤＮＡ二重鎖となる。
図１Ｂに示すように、他方のプライマーである第２のプライマーを、第１のプライマーと同様に、５’側から第２の任意の塩基配列と増幅しようとする核酸中の第２の塩基配列を識別する第２の識別配列とを含み、前記第２の塩基配列と前記第２の識別配列との間に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有するオリゴヌクレオチド誘導体とすることもできる。こうすることで、図１Ｂに示すように、各５’側に第１の任意の塩基配列の一本鎖と第２の任意の塩基配列の一本鎖を有するＤＮＡ二重鎖となる。
こうした突出一本鎖を有するＤＮＡ二重鎖は、ハイブリダイゼーション用のほか、各種用途に用いられる。核酸増幅剤は、典型的には各種核酸増幅法におけるプライマーとして用いることができる。
第１の任意の塩基配列及び／又は第２の任意の塩基配列は、本発明におけるタグ配列であってもよいし、標識が結合された又は標識プローブとハイブリダイズ可能な塩基配列であってもよい。第１の任意の塩基配列がこのように標識に関連付けられていると、標的核酸を増幅すると同時にラベリングも可能となる。
本核酸増幅剤における連結部位には、本検出方法において既に説明した連結部位の各種実施態様を適用できる。また、本核酸増幅部位の第１の任意の塩基配列及び第１の識別配列には、本検出方法において既に説明した第１のプライマー及び第２のプライマーにおける、タグ配列及び第１の識別配列並びに標識物質結合領域及び第２の識別配列の各種実施態様を適用できる。すなわち、本核酸増幅剤は、第１のプライマーや第２のプライマーをその一実施態様としている。
なお、本発明によれば、こうした核酸増幅剤を１種又は２種以上含むキットも提供される。当該キットには、上記した第１のプライマーや第２のプライマーを用いて得られるＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションさせるための固相体を含んでいてもよい。
本発明によれば、本検出方法において得られるＤＮＡ二重鎖断片、すなわち、少なくとも一方の鎖の５’側に一本鎖部分を有し、塩基対合による二重鎖部分を有するＤＮＡ二重鎖断片であって、少なくとも一方のＤＮＡ鎖は、前記一本鎖部分と前記二重鎖結合部分との間にＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有し、前記一本鎖部分が、検出用プローブ中の塩基配列に相補的なタグ配列を有する、ＤＮＡ二重鎖断片も提供される。さらに、他方の鎖の５’側にも一本鎖部分を有し、この一本鎖部分に標識が連結されているＤＮＡ二重鎖断片も提供される。さらにこうしたＤＮＡ二重鎖断片は、プローブハイブリダイゼーションに好適であるため、これらを含むプローブハイブリダイゼーション用組成物も提供される。この方法で用いる。
さらに、本発明によれば、試料中の標的核酸を増幅する方法も提供される。すなわち、第１の任意の塩基配列と前記標的核酸中の第１の塩基配列を識別する第１の識別配列とを含み、前記第１の任意の塩基配列と前記第１の認識配列との間に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有する第１のプライマーを少なくとも用いて、前記試料の核酸増幅を実施する工程を、備える、方法も提供される。この方法によって得られる増幅断片は、図１Ａに示すように、少なくとも一方の鎖の５’側に突出した第１の任意の塩基配列の一本鎖を有するＤＮＡ二重鎖断片となっている。さらに、この増幅方法においては、他のプライマーとして、第２の任意の塩基配列と前記標的核酸中の第２の塩基配列を識別する第２の識別配列とを含み、前記第１の任意の塩基配列と前記第１の認識配列との間に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有する第２のプライマーを用いることもできる。この場合には、図１Ｂに示すように、両方の鎖の５’側に突出した第１の任意の塩基配列の一本鎖を有するＤＮＡ二重鎖断片を得ることができる。第１のプライマーにおいては、その第１の任意の塩基配列には、標識物質を備えていてもよいし、標識プローブと結合可能な塩基配列を有していてもよい。第２のプライマーについても、同様である。
本増幅方法においても、第１のプライマー及び第２のプライマー並びに連結部位に関して、既に説明した本検出方法の各種態様を適用できる。
本増幅方法は、また、少なくとも一方のＤＮＡ鎖の５’側に一本鎖を備えるＤＮＡ二重鎖断片の生産方法としても提供される。さらに、本増幅方法は、標的核酸のラベリング方法としても実施できる。さらに、こうしたラベリング工程を備える、標的核酸の検出方法としても実施できる。すなわち、特開２００８−３０６９４１号公報、特開２００９−２４号公報並びに非特許文献１に開示されるＳＮＰ等の検出方法における標識工程に替えて本増幅工程（標識工程）を用いることで、その後の変性工程を省略するとともに、効率的かつ高感度なハイブリダイゼーションを実施することができる。
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。
以下の実施例では、本発明の検出方法による標的核酸の検出を次の手順で行った。以下、これらの順序に従って説明する。
（１）ＤＮＡマイクロアレイの作製
（２）標的核酸とプライマーの調製と増幅
（３）ハイブリダイズ
（４）スキャナーを用いた検出
（１）ＤＮＡマイクロアレイの作製
プラスチック板に、３’末端をアミノ基で修飾した合成オリゴＤＮＡ（株式会社日本遺伝子研究所製）を溶かした水溶液を検出用プローブとして、日本ガイシ株式会社にてＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標である）スポッターを用いてスポットした。使用した合成オリゴＤＮＡ配列は、配列番号１〜１００から高速ハイブリダイゼーションが可能な以下の３３種を選択した。
スポットの後、８０℃、１時間のベークを行った。さらに、以下に記載した手順で、合成オリゴＤＮＡの固定化を行った。すなわち、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで１５分洗浄後、９５℃の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで５分洗浄し、その後、滅菌水で洗浄（１０回上下振とう）を３回繰り返した。その後、遠心（１０００ｒｐｍ×３分）により脱水した。
（２）標的核酸の増幅
増幅に使用したゲノムＤＮＡは、ヒト由来とし、ヒトゲノム中の６つの標的核酸（（１）〜（６））に特異的な以下の表に示すプライマーＰ１−１〜Ｐ１−６（日本遺伝子研究所製）、Ｐ２−１〜Ｐ２−６（日本遺伝子研究所製）及びＰ３−１〜Ｐ３−６（日本遺伝子研究所製）を準備した。なお、各系列は以下の構成（５’から３’として表示）とした。なお、Ｐ３系のプライマーのプロピレン基部分は、以下の式に示すGlenResearch社のホスホアミダイト試薬であるSpacer PhophoamiditeＣ３を用いて通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成された。
Ｐ１系のプライマー：Ｆ，Ｒ：ヒトＤＮＡ中の特定の標的核酸（１）〜（６）に対する塩基配列を含む
Ｐ２系のプライマー：
Ｆ：標識プローブの結合配列（タグ配列）＋Ｐ１系の各標的核酸に対する塩基配列
Ｒ：合成オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列と同一の塩基配列からなるタグ配列＋Ｐ１系の各標的核酸に対する塩基配列
（なお、Ｐ２系プライマーを用い場合には、このタグ配列と相補的な塩基配列の相補鎖も増幅されるため、当該相補鎖がプローブとハイブリダイズし、増幅断片を検出できる。）
Ｐ３系プライマー：
Ｆ：標識プローブの結合配列＋連結部位Ｘ（プロピレン鎖）＋Ｐ１系の各標的核酸に対する塩基配列
Ｒ：合成オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列と相補的な塩基配列からなるタグ配列＋連結部位Ｘ（プロピレン鎖）＋Ｐ１系の各標的核酸に対する塩基配列
次に、ゲノムＤＮＡをこれらのプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、ＱＩＡＧＥＮ社のmultiplex PCR master mix を使用した。サーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System9700を使用した。
まず、以下に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。
（試薬調製）
ｄＨ２Ｏ ４．０μｌ
２×multiplex PCR master mix ５．０μｌ
プライマー混合物（各５００ｎＭ） ０．５μｌ
ゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ） ０．５μｌ
合計 １０．０μｌ
次に、増幅用試薬をサーマルサイクルプレートに移し、サーマルサイクル反応（９５℃で１５分後；９５℃で３０秒、８０℃で１秒、６４℃で６分を４０サイクル、その後１０℃に下げる）を行った。そして、増幅したサンプルはＱＩＡＧＥＮ社のMinElute PCR Purification Kitにて精製を行った後、アガロース電気泳動により意図した長さで増幅していることを確認した。結果を図３に示す。図３の上段には、電気泳動結果を示し、その下段には、蛍光強度から算出した増幅量を示す。
（３）ハイブリダイズ
（２）で得た増幅サンプルをマイクロアレイ上に固定した検出用プローブとハイブリダイズするために、以下のHybri controlとHybri solutionを調製し、これからハイブリダイズ用の試薬を調製した。PrimerMixには、標識用プローブ（蛍光修飾したオリゴヌクレオチドでありＰ２系及びＰ３系プライマーのＦの５’側に結合する。）（２５μＭ）を含んでいる。なお、Hybri controlに使用したAlexa555−ｒＤ１_１００は、Ｄ１_１００の対応する配列に相補な配列の５´末端をAlexa555で標識したものを用いた。
（Hybri control）
Alexa555−ｒＤ１＿１００（１００ｎＭ） １０μｌ
ＴＥ（ｐＨ８．０） ３９０μｌ
合計 ４００μｌ
（Hybri solution）
２０×ＳＳＣ ２．０ｍｌ
１０％ＳＤＳ ０．８ｍｌ
１００％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ １２．０ｍｌ
１００ｍＭ ＥＤＴＡ ０．８ｍｌ
ｍｉｌｌｉＱ ２４．４ｍｌ
合計 ４０．０ｍｌ
（ハイブリダイズ用の試薬）
Hybri control １．５μｌ
Primer Mix １．０μｌ
Hybri solution ９．０μｌ
小計 １０．５μｌ
増幅サンプル ３．０μｌ
合計 １８．０μｌ
調製したハイブリダイズ用試薬（標識サンプル溶液）を、変性等のために加熱することなく、各９μｌずつ、マイクロアレイのスポットエリアにかけて、乾燥防止のためコンフォート／プラス用サーモブロックスライド（エッペンドルフ社）を使用し、３７℃で３０分間静置することによってハイブリダイズ反応を行った。
（洗浄）
ハイブリダイズ後、以下の組成の洗浄液を満たしたガラス染色バットに、ハイブリダイズ反応終了後のマイクロアレイ基板を浸漬し、５分間上下振とうし、滅菌水を入れたガラス染色バットにマイクロアレイ基板を移し、１分間上下振とうし、２０００ｒｐｍで１分間遠心乾燥し、マイクロアレイ基板表面に残った水分を除去した。
（洗浄液の組成）
ｍｉｌｌｉＱ １８８．０ｍｌ
２０×ＳＳＣ １０．０ｍｌ
１０％ＳＤＳ ２．０ｍｌ
合計 ２００．０ｍｌ
（４）スキャナーを用いた検出
Appleied Precision社ArrayWoRxを使用して適宜、露光時間を調節し、蛍光画像を取得した。プラスチック基板についての結果を、図４及び図５に示す。
まず、図３の上段に示すように、タグ配列の有無にかかわらず、ゲノムＤＮＡ中の意図した標的核酸を増幅できることがわかった。また、図３の下段の表に示すように、タグ配列を識別配列に直接連結しても、プロピレン基を含む連結部位を介して連結してもその増幅量に大きな変化がないことがわかった。
また、図４及び図５に示すように、Ｐ２系プライマー（タグ配列＋識別配列）とＰ３系プライマー（タグ配列＋連結部位＋識別配列）を用いた場合とでは、明らかに、Ｐ３系プライマーを用いて増幅して得られたＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーション結果において、個々のタグ配列にかかわらず、おおよそ一定の強い蛍光を観察できた。これに対して、Ｐ２系プライマーを用いたときのハイブリダイゼーション結果においては、タグ配列にかかわらずいずれもほとんど蛍光を観察できなかった。
さらに、サンプル濃度を１０倍希釈して得られたハイブリダイゼーション結果においては、Ｐ３系プライマーを用いた場合は、依然として蛍光を観察することができた。以上説明したプラスチック基板におけるのと同様の結果を、ガラス基板についても確認できた。
以上のことから、Ｐ３系プライマーを用いることで、少なくとも検出感度が１０倍以上向上することがわかった。以上の実施例では、増幅したサンプルの変性工程を行わずにアレイに適用したこと、及び図３に示すように、増幅サンプルの合成量がＰ２系プライマーによるものとほぼ同量である。以上のことからすると、Ｐ３系プライマーを用いることで高効率にハイブリダイゼーションし、かつラベル効率の良好な二重鎖断片が得られたことがわかる。
本実施例では、実施例１の（１）ＤＮＡマイクロアレイの作製において、基板として、プラスチック基板に替えてガラス基板（東洋鋼板社製geneslide）を用い、検出用プローブの塩基配列として以下の表に示す３３種を選択し、（３）ハイブリダイズにおいて、ハイブリダイズ試薬として以下の組成の試薬を用いた以外は、実施例１の（１）ＤＮＡマイクロアレイの作製、（２）標的核酸とプライマーの調製と増幅、（３）ハイブリダイズ及び（４）スキャナーを用いた検出と同様に操作して、標的核酸を検出した。結果は、実施例１と同様に、変性工程を実施しなくても、Ｐ２系プライマー（タグ配列＋識別配列）に比べてＰ３系プライマー（タグ配列＋連結部位Ｘ＋識別配列）を用いた場合に、明らかに１０倍以上の強い強度のハイブリダイゼーションシグナルを得ることができた。
（ハイブリダイズ試薬の組成）
Hybri control １．５μｌ
Primer Mix ３．５μｌ
Hybri solution ９．０μｌ
小計 １４．０μｌ
増幅サンプル ４．０μｌ
合計 １８．０μｌ
本実施例では、以下の方法で標的核酸を検出した。
（１）メンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイの作製
メルクミリポア製Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ メンブレンシート（６０ｍｍ ｘ ６００ｍｍ）に以下の表に示す塩基配列からなるキャプチャーＤＮＡプローブ溶液を、特開２００３−７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、スポットした。使用した合成オリゴＤＮＡ配列は、文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85）のSupplementary Table1記載のD1_1からD1_100の100種のうち以下の表７に示す４種の配列をプローブとして使用した。なお、プローブとしては、オリゴヌクレオチドの３‘末端をアミノ基で修飾した配列を使用した。
図６に示す配置でストリーム状のラインでアレイ化した。なお、図６に示すアレイでは、プローブの固定化領域を明示するために、プローブ固定化溶液を染料で着色してストリーム状にスポットした。また、図６に示すアレイでは、ハイブリダイズ産物を検出するプローブ固定化領域を想定しやすいように、顔料を含む液体をプローブ固定化領域に近接してストリーム状（帯状）にスポットした。
プローブのスポットの後、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ社のＵＶ照射装置(ＸＬ−１５００ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ)を用いて、２００〜５００ｍＪ／ｃｍ2程度の紫外線光の照射を行って固定化した。
（２）サンプル遺伝子の増幅
増幅に使用したゲノムＤＮＡとしてはヒト由来のものを使用し、以下の表８及び表９に示すＰ２系プライマー及びＰ３系のプライマーをそれぞれ使用した。また、実施例１と同様に、ゲノムＤＮＡに対してこれらのプライマーを用いて増幅反応を実施し、ＱＩＡＧＥＮ社のMinElute PCR Purification Kitにて精製を行った後、アガロース電気泳動により意図した長さで増幅していることを確認した。
（３）メンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを用いた検出
（２）にて増幅したサンプルを用いてメンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイへの反応及びその検出手順は以下の通りとした。展開液及びラテックス液についてはエーエムアール株式会社製を使用した。ラテックス液は、青色系の着色剤を含有するポリスチレン系のラテックスビーズに各Ｆプライマーの標識プローブ結合配列に相補的な配列のオリゴＤＮＡを固定したものを１００ｎＭの濃度になるように展開液で希釈して用いた。なお、オリゴＤＮＡのビーズへの固定化は、オリゴＤＮＡの５’末端をアミノ基で修飾したオリゴＤＮＡとラテックス表面のカルボキシル基との間で共有結合を形成して行った。展開液には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用した。
（ハイブリダイズサンプル組成）
展開液 ３５．０μｌ
ラテックス液 ５．０μｌ
サンプル １０．０μｌ
ｔｏｔａｌ ５０．０μｌ
（ハイブリダイズ）
上記ハイブリダイズサンプル各５０μｌを変性等のために加熱することなく０．２ｍｌチューブに加えて、メンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを差込んでクロマトグラフィーによる展開型ハイブリダイゼーションを開始した。サンプル液は約２０分間ですべて吸い上がり反応は完了した。反応終了後、メンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを風乾した。
（検出判定）
メンブレンタイプＤＮＡアレイの乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図７に示す。図７に示すように、Ｐ２系プライマーを用いる従来法では、発色を確認できなかったのに対し、Ｐ３系プライマーを用いる方法では、濃い発色を確認できた。以上のことから、Ｐ３系プライマーを用いることで、ハイブリダイゼーション形態にかかわらず、ハイブリダイゼーション検出感度が向上することがわかった。また、Ｐ３系プライマーを用いることで熱変性することなく、ハイブリダイゼーションが可能であることもわかった。
本実施例では、以下の方法で標的核酸を検出した。
（１） クロマト用メンブレンへの検出用プローブのスポット及び固定
ミリポア製ニトロセルロースメンブレンに、文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85）のSupplementary Table 1記載の配列の３’末端側をアミノ基で修飾した配列の合成オリゴＤＮＡ水溶液（株式会社日本遺伝子研究所製のものを日本ガイシ株式会社にて調製）を検出用プローブとし、日本ガイシ株式会社にてGENESHOT（登録商標）スポッターを用いてスポットした（図８）。今回使用した合成検出用プローブは、文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85）のSupplementary Table1記載のＤ１_１からＤ１_１００の１００種のうち任意の５１種の配列の３’末端側をアミノ基で修飾したものである（表１０）。スポットの後、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ社のＵＶ照射装置（ＸＬ−１５００ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）を用いて、２００〜５００ｍＪ／ｃｍ２程度の紫外線光の照射を行った。
（２）検出用プローブが固定されたクロマト用メンブレンを用いた検出
検出用プローブが固定されたクロマト用メンブレンを用いた標的配列を有するオリゴヌクレオチドＤＮＡの検出手順は以下の通りとした。尚、今回の検出に使用したオリゴヌクレオチドＤＮＡ配列は表１１の通りである。具体的には文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85）のSupplementary Table1記載の配列から任意に選んだ配列の３’末端側にSupplementary Table1記載のＥＤ−１配列を付加した配列の標的オリゴヌクレオチドＤＮＡである。
標的オリゴヌクレオチドＤＮＡの各配列（５１種類）につき以下の組成の反応液（展開液）を調製した。
（展開液の組成）
標的オリゴヌクレオチドＤＮＡ水溶液 ５μｌ
ラテックス液 ５μｌ
ＰＢＳ ３５μｌ
合計 ４５μｌ
なお、標的オリゴヌクレオチドＤＮＡ溶液の濃度は、１μＭとした。また、ラテックス液は、青色系の着色剤を含有するポリスチレン系のラテックスビーズにＥＤ−１配列に相補な配列のＤＮＡを固定したもの（５’アミノ基修飾のＥＤ−１相補配列合成ＤＮＡとラテックス１００μＭの濃度となるようにＰＢＳを添加して調製した。
０．２ｍｌ用のＰＣＲチューブに５１種類の反応液をそれぞれ加え、常温においてクロマトメンブレンシートの下端を挿入して展開型ハイブリダイゼーションを開始した。反応開始から１０分程度反応させた後、目視による反応箇所の確認及び画像を撮影した。
５１種類の標的オリゴヌクレオチドＤＮＡの各々と、検出用プローブとのハイブリダイゼーション結果を図９に示す。この図において縦列には、検出用プローブの番号を示し、横列には標的オリゴヌクレオチドＤＮＡの番号を示す。図中において、反応すべき組み合わせのセルを太枠で囲んで、発色ランクＤとして示した。標的オリゴヌクレオチドＤＮＡと検出用プローブとの組合せによっては非特異反応する結果も確認できたため、それぞれの検出強度を４段階に分けて、高度の非特異反応を発色ランクＣとし、セルをダークグレーで示した。中度の非特異反応を発色ランクＢとして、ハッチングで示した。低度の非特異反応を発色ランクＡとし、セルを薄いグレーで示した。発色なしの場合は、発色ランクＥとし、セルを白色で示した。
図９の結果を基に、非特異反応が見られないプローブの組合せを選定して、そのプローブセットでクロマト用メンブレンシートへの固定核酸プローブに使用した。すなわち、検出用プローブとして用いても、標的オリゴヌクレオチドＤＮＡとして用いても、互いに非特異的ハイブリダイゼーションが生じない検出用プローブを選択できる。
一方、検出用プローブと標的オリゴヌクレオチドＤＮＡのそれぞれの相同配列に着目し、ある検出用プローブと標的オリゴヌクレオチドＤＮＡとの間の一致する塩基配列の水素結合数と非特異反応との関係について評価した。結果を図１０〜図１５に示す。
図１０〜図１５においては、検出用プローブと標的オリゴヌクレオチドとが交差する欄の左側には一致する塩基配列の水素結合数を示し、右側には発色ランク（図９に同じ）を示す。図１０〜図１５の結果から、検出用プローブと標的オリゴヌクレオチドＤＮＡとの間の一致する塩基配列の水素結合数と発色ランクがＢ，Ｃ，Ｄとなる組合せ数を算出し、水素結合数ごとに発色ランクがＢ，Ｃ，Ｄとなる組み合わせ（すなわち、発色が良好に観察される）割合でグラフ化を行った。結果を表１２および図１６に示す。
表１２および図１６に示すように、水素結合数が８以下では発色は大半で観察されなかったのに対し、水素結合数が９の場合には、一部で発色が観察され、水素結合数の増大に伴い、発色する割合及び強度が増大した。さらに水素結合数が１５以上の場合では半分程度の配列で発色が観察されるようになり、１７以上ですべての配列で発色が観察される結果となった。
以上のことから、少なくともプローブ配列の水素結合数が９以上あれば標的配列を捕捉しうることが可能であることがわかった。また、より好ましくは水素結合数が１５あれば設計された配列の大半で標的配列を捕捉しうることがわかった。一層好ましくは水素結合数が１７あれば設計配列のほぼすべてでターゲットサンプルを捕捉しうることが示唆された。
また、表１３および図１７に示すように、発色する組み合わせ内の発色程度の内訳（レベル２〜４：それぞれ発色ランクＡ〜Ｄに対応）からは、水素結合数が１５のとき、発色程度の強い（発色レベル３以上）組み合わせが多く出現し、さらに、水素結合数が１７のとき、その傾向が顕著であることがわかった。また、水素結合数が５５あれば、全体が発色レベル４（発色ランクＤ）となることがわかった。
配列番号１〜１００：プローブ
配列番号１０１〜１３６：プライマー

Claims (8)

  1. ２以上の標的核酸を検出する方法であって、
    前記２以上の標的核酸のそれぞれ予め関連付けられ前記標的核酸を検出するための２以上の検出用配列を含む２以上の検出用プローブと前記標的核酸の増幅産物とをハイブリダイズ可能に接触させるハイブリダイゼーション工程と、
    前記ハイブリダイゼーション工程に先立って、
    前記２以上の標的核酸のそれぞれ予め関連付けられた前記検出用プローブに相補的なタグ配列と前記２以上の標的核酸中の各第１の塩基配列を識別する第１の識別配列とを含み、前記タグ配列と前記第１の識別配列との間に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有する１又は２以上の第１のプライマーと、前記標的核酸中の各第２の塩基配列を識別する第２の識別配列を含む１又は２以上の第２のプライマーと、を用いて、核酸増幅反応を実施する増幅工程と、
    を備え、
    前記検出用配列の少なくとも１つと前記タグ配列の少なくとも１つとの間の水素結合数は、連続して１５以上１７以下である、方法。
  2. 前記増幅産物は、二本鎖の一方にのみ二本鎖から突出した一本鎖部分を有し、当該一本鎖部分に前記タグ配列を備える標的核酸の増幅産物である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記連結部位は、天然塩基又は天然塩基と対合する天然塩基の誘導体を含まない、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記連結部位は、リン酸ジエステル結合を介して前記プライマー中のヌクレオチドに隣接される、元素数が２以上４０以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記連結部位は、以下のいずれかの式で表される、請求項４に記載の方法。
    ５’−Ｏ−ＣmＨ2m−Ｏ−３’ 式（１）
    （式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｍは２以上４０以下の整数を表す。）、
    又は、
    ５’−（ＯＣnＨ2n）l−Ｏ−３’ 式（２）
    （式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、ｌは、２以上の整数であって、（ｎ＋１）×ｌは４０以下となる整数を表す。）
  6. １又は２以上の標的核酸を検出するために用いるプローブセットであって、
    それぞれ異なる１又は２以上の検出用配列を有する複数の検出用プローブと、前記検出用プローブに相補的なタグ配列と、前記１又は２以上の標的核酸中の各第１の塩基配列を識別する第１の識別配列とを含み、
    前記タグ配列と前記第１の識別配列との間に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有する１又は２以上の第１のプライマーと、前記標的核酸中の各第２の塩基配列を識別する第２の識別配列を含む１又は２以上の第２のプライマーとを含み、
    前記検出用配列の少なくとも１つと前記タグ配列の少なくとも１つとの間の水素結合数は、連続して１５以上１７以下である、プローブセット。
  7. １又は２以上の標的核酸を検出するためのキットであって、
    それぞれ異なる１又は２以上の検出用配列を有する複数の検出用プローブと、前記検出用プローブに相補的なタグ配列と、前記１又は２以上の標的核酸中の各第１の塩基配列を識別する第１の識別配列とを含み、
    前記タグ配列と前記第１の識別配列との間に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有する１又は２以上の第１のプライマーと、前記標的核酸中の各第２の塩基配列を識別する第２の識別配列を含む１又は２以上の第２のプライマーとを含み、
    前記検出用配列の少なくとも１つと前記タグ配列の少なくとも１つとの間の水素結合数は、連続して１５以上１７以下である、プローブセットと、
    前記プローブセットが保持された固相体と、
    を備える、キット。
  8. 前記固相体は、展開型ハイブリダイゼーション用である、請求項７に記載のキット。
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