JP6182525B2 - ｉＦＲＥＴ用探針及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、ｉＦＲＥＴ（固有の蛍光共鳴エネルギー転移、intrinsic Fluorescence Resonance Energy Transfer）用探針及びその用途に関するものである。具体的に、本発明は、新規なｉＦＲＥＴ用探針、ｉＦＲＥＴ用探針の製造方法、ｉＦＲＥＴ用探針を用いて、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子を検索する方法及びｉＦＲＥＴ用探針を介して標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法に関するものである。

生命科学と関連した多くの分野で様々な物質が生体内又は生体外で生体物質を分析するための探針又はレポーターとして活用されている。このような探針又はレポーターシステムは、大きく、特定基質自体又は基質が酵素反応により分解又は変形して、現れる着色、発色、発光を測定する方法と、蛍光や着色能を有した物質自体を観察することに分けられる。

前者の方法は、目的とするタンパク質に融合された形態でタンパク質の発現量、プロモーターの強度測定、組換え菌体の選別などの細胞内観察だけでなく、ウエスタン・ノーザンブロッテイング、ＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay）等の細胞外観察にも活用されている。代表的な例として、アルカリ（性）ホスファターゼ（alkaline phosphatase）、ペルオキシダーゼ（peroxidase）、キサンチンオキシダーゼ（xanthineoxidase）などの酵素と、基質としてルミノール（luminol）、ルシゲニン（lucigenin）、アクリジニウムエステル（acridiniumester）、ビオチン（biotin）、フルオレセイン（fluorescein）、ジゴキシゲニン（dioxigenin）などの化合物が利用されている。

しかし、これらが細胞内で発現される場合、生体内代謝経路を撹乱し、成長をしたり、アポトーシスを誘導する等の危険性が存在するという短所を有する。また、前記酵素の触媒特性に起因する問題だけでなく、用いられる基質の低い安定性は、実験誤差の主要な原因となり、これらの大部分が生物素材でない化学合成物であるため、細胞に有害となる可能性があり、生体内で持続的な観察が難しいという短所もある。したがって、前述した探針又はレポーターの大部分は生体内よりは生体外探針に主に利用されている。

したがって、前記問題を改善するために、タンパク質自体が探針として作用するレポーターに関する研究が活発に進められてきた。タンパク質自体が探針である代表的な例としては蛍光タンパク質が挙げられる。これは、特定波長の光を受けて吸収し、活性化された蛍光団が低いエネルギーを有する正常状態に戻る過程で放出されるエネルギーが光の形で現れるという特性を有する。代表的な例としては、クラゲ（jellyfish）であるオワンクラゲに由来する緑色蛍光を発する緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)と、野生型イソギンチャクモドキ(Ｄｉｓｃｏｃｏｓｏｍａ)種から由来のＤｓＲｅｄ（Discosoma赤色蛍光タンパク質）を挙げることができる。

前記蛍光タンパク質は基質や補因子なしでタンパク質自体が蛍光を発するため、前者の場合のように代謝攪乱及び細胞生理学的因子に対する干渉が少なく、前者の酵素が活用される多くのの探針分野とそれ以外の分野、すなわち、酵素及び基質が持つ短所により適用することが難しい分野における活用が可能である。特に、タンパク質が特定波長の光により生成される固有の波長を有する蛍光を通して細胞や生物体を破壊することなく正常な生理機能を保持する、生きている状態で、特定タンパク質の移動と活性経路、細胞分裂及び分化過程などのように細胞内部で起こる複雑な変化を直接モニターリングすることにおいて、現存するいかなる方法よりも優れた要素として認められている。また、蛍光タンパク質は、βバレル（β-barrel）構造内部に蛍光団がある堅固な３次構造を有している。前記構造により物理化学的に非常に安定しており、優れた光安定性を有し、広い範囲のｐＨ、温度区間、変性剤や有機溶媒などが存在する環境でも適用が可能であり、反復的な実験でも再現性が保持でき、従来の探針に比べて、安定した実験結果を得ることができる長所がある。また、タンパク質工学技術を活用し、野生型蛍光タンパク質と異なる波長の光を放出するように改良された赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)、黄色蛍光タンパク質(ＹＦＰ)、青緑色蛍光タンパク質(ＣＦＰ)、青色蛍光タンパク質(ＢＦＰ)などを組み合わせて活用する場合には、複数の現象を同時に観察でき、異なる波長の光を放出する蛍光タンパク質が隣接したり融合された形態で発現された時、起こるＦＲＥＴ現象を活用して、試料内の特定物質の存在有無の探索、タンパク質間の相互作用の観察などの研究目的に多様に活用できる長所を有する。

しかし、前記ＧＰＦ、ＹＦＰ及びＣＦＰの場合、照射する光の波長が似ていることから単一波長の光を利用して様々な波長の蛍光を同時に測定できる長所があるが、放出される光の波長度がＧＦＰと類似しており、同時に使用する場合、それぞれの蛍光を測定するために、高価な装置を必要とする欠点がある。また、ＧＦＰ骨格を有したあらゆるタンパク質の場合、蛍光団を構成する時間（maturation time）が必要であり、発現時点からの観察が難しいという欠点と構造形成に酸素が必要とされるので、無酸素（anoxic）環境での活用が難しいという短所、酸化過程で生産される活性酸素（ＲＯＳ）が生体物質（脂肪酸、アミノ酸、タンパク質、核酸）に対する潜在的な毒性を有するという問題から活用範囲が大幅に制限されている。

一方、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ；Fluorescence Resonance Energy Transfer）とは、短波長蛍光タンパク質（shorter wavelength dye）であるエネルギー供与体（donor）が、外部からエネルギーを吸収すると、供与体の励起エネルギーが光エネルギーとして放出される代わりに、所定の距離内に位置した（＜１０ｎｍ）長波長蛍光タンパク質（longer wavelength excitation dye）であるエネルギー受容体（acceptor）に無発光で（radiationless）伝達され、受容体の長波長蛍光のみが放出される現象をいう。非特許文献１では、ＦＲＥＴ原理を利用し、カルモジュリン（calmodulin）とカルモジュリン結合ペプチド（calmodulin-binding peptide）間の相互作用を分析しながら、新しい概念のタンパク質相互作用分析システムを開発した。蛍光タンパク質は互いに異なる固有の波長領域の光を吸収して励起（excitation）され、そのエネルギーが光又は熱として発散されると、基底状態に回復しながら蛍光タンパク質毎に独特の波長帯の光を発散（emission）する。蛍光共鳴エネルギー転移の原理は、互いに異なる２つの蛍光タンパク質が１０〜１００Å内にある場合、短波長蛍光タンパク質が励起した後に放出する光が長波長蛍光タンパク質の励起を誘導し、蛍光を発散する現象である。すなわち、相互作用を調べようとする２つタンパク質の後に互いに異なる２つ蛍光タンパク質をそれぞれ付着させた後、タンパク質相互作用により、２つ蛍光タンパク質が１０〜１００Å以内に近くなった時に起こる蛍光共鳴エネルギー転移現象による蛍光を探知することで、タンパク質の相互作用を分析することができるものである。例えば、４８８ｎｍの波長の光で励起される蛍光タンパク質は、５２０ｎｍの波長帯の蛍光を発散し、これはまた対をなした他の蛍光タンパク質を刺激する波長として作用するようになり、６３０ｎｍの波長帯の蛍光を発散する。したがって、４８８ｎｍで励起し、６３０ｎｍの波長帯の蛍光を探知することで、２つタンパク質の相互作用を分析することができる。このシステムは、生きている細胞内でタンパク質の動的な相互作用の分析が可能であるという長所があるが、２つ蛍光タンパク質の距離非常に近い場合にのみ探知可能であり、微妙な蛍光波長の変化を感知するためには、タンパク質の過量発現が必要とされる場合がある。

前述の問題を解決するために、最近、タンパク質固有の蛍光を利用しようとする研究が活発となり、アミノ酸の中の一つであるトリプトファンをＦＲＥＴに応用できることが報告されおり（非特許文献２）、トリプトファン結合ドメイン及びこれを検出できる蛍光部分を利用してＦＲＥＴを測定する多重結合トリプトファンバイオセンサー技術が知られている（特許文献１）。

しかし、現在まで知られているタンパク質固有の蛍光を用いたＦＲＥＴ技術に用いられる探針は、タンパク質自体と蛍光分子の発光波長が互いに重畳し、不必要な信号が測定され、これにより測定結果の敏感度と特異性が阻害されるという短所がある。

米国公開特許公報 第2008／0311047号 WO2008/115262

Miyawaki et al., Nature, 1997, 388:882-887 Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4562-4588 Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York:Plenum Press, 1999 Patterson et al., Anal. Biochem. 284: 438, 2000 Patterson et al., J. of Cell Sci. 114: 837, 2001 JACS,2000,122,p．87-95 JOC,2005,70,p．717-720 J. Med. Chem. 2006, 49, 4953-4960

そこで、本発明者らは、従来広範囲に活用されている探針システムが有する根本的な問題を解決しようと持続的な研究を重ねた結果、タンパク質固有の蛍光を利用する新しい蛍光分子を確認し、これらを標的タンパク質結合部位又は前記結合部位を有する分子と結合した探針システムを開発し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、標的タンパク質に特異的な結合部位（bindingsite）又は前記結合部位を有する分子を様々な候補群から取得し、タンパク質の固有の蛍光(intrinsic fluorescence)に対するアクセプター（acceptor）機能を有する蛍光分子と直接又はリンカーを介して連結し、固有の蛍光共鳴エネルギー転移（ｉＦＲＥＴ）用探針を製造する第１ステップと、前記標的タンパク質に第１ステップで製造されたｉＦＲＥＴ用探針を処理する第２ステップと、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長を含む光を照射し、発光するｉＦＲＥＴ用探針を確認する第３ステップとを含み、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子を検索する方法を提供することにある。

本発明の別の目的は、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子を様々な候補群から取得し、タンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する第１蛍光分子と直接又はリンカーを介して連結し、第１のｉＦＲＥＴ用探針を製造する第１ステップと、前記標的タンパク質に第１のｉＦＲＥＴ用探針を処理する第２ステップと、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長を含む光を照射し、発光する第１のｉＦＲＥＴ用探針を確認する第３ステップと、前記第３ステップで発光する第１のｉＦＲＥＴ用探針を構成する、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子をタンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する第２蛍光分子と直接又はリンカーを介して連結し、第２のｉＦＲＥＴ用探針を製造する第４ステップとを含み、ｉＦＲＥＴ用探針を製造する方法を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子と、ｉＦＲＥＴアクセプター機能を有する蛍光分子として下記化学（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）よりなる群から選ばれる分子が直接又はリンカーを介して結合されたｉＦＲＥＴ用探針を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子と、ｉＦＲＥＴアクセプター機能を有する蛍光分子が直接又はリンカーを介して結合されたｉＦＲＥＴ用探針であって、ＦＲＥＴ効率が５０％になる蛍光供与体と蛍光受容体との間の距離であるＲ_０の値が１〜４ｎｍであることを特徴とするｉＦＲＥＴ用探針を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、前記方法で製造された第２のｉＦＲＥＴ用探針又は前述のｉＦＲＥＴ用探針を、標的タンパク質を含有するサンプル内に添加する第１ステップと、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長を含む光を照射し、前記ｉＦＲＥＴ用探針が発光する光を確認又は追跡する第２ステップとを含み、ｉＦＲＥＴにより標的タンパク質をイメージ化する方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、前記製造方法に係る下記式（ＸＸＩＩＩ）、（ＸＸＩＶ）、又は（ＸＸＶＩ）〜（ＸＸＸＩＩ）よりなる群から選ばれる式で表される化合物及びその塩を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、固有の蛍光共鳴エネルギー転移（ｉＦＲＥＴ）用探針を用いた標的タンパク質検出又はイメージ化の方法であって、前記ｉＦＲＥＴ用探針は、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子と、標的タンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する蛍光分子が直接又はリンカーを介して結合されたものであり、前記ｉＦＲＥＴ用探針を標的タンパク質を含有する試料内に導入する第１ステップと、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を交互に第１ステップで製造された試料に照射する第２ステップと、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射し、ｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値とｍｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射し、ｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値とを分析し、第１発光信号値と第２発光信号値とのレシオメトリック法（ratiometric measurement）で第３発光信号値を算出する第３ステップとを含むことを特徴とする方法を提供することである。

本発明に係るｉＦＲＥＴ用探針は、従来のＦＲＥＴ方法と違って、タンパク質内のアミノ酸を蛍光供与体として使用するので、標的タンパク質に人為的な標識（蛍光タンパク質等）が不要であるだけでなく、一つの蛍光物質のみ用いてもよく、タンパク質固有の蛍光と分離された発光波長を有するので、高い特異性と敏感度を有し、様々なタンパク質の量、活性及び機序などをより容易且つ正確に分析することができ、前記標的タンパク質に関連する疾患の診断及び治療剤の開発に利用できる。

式（ＸＸＩＩＩ）の化合物が、ｉＦＲＥＴを発揮する作用機序に対する模式図である。 式（ＸＸＩＶ）の化合物が、ｉＦＲＥＴを発揮する作用機序に対する模式図である。 本発明の蛍光分子、すなわち、式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物等の蛍光特性を示すグラフである。 本発明の蛍光分子、すなわち、式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物等の蛍光特性を示すグラフである。 本発明の蛍光分子、すなわち、式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物等の蛍光特性を示すグラフである。 本発明の蛍光分子、すなわち、式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物等の蛍光特性を示すグラフである。 本発明の蛍光分子、すなわち、式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物等の蛍光特性を示すグラフである。 本発明の蛍光分子、すなわち、式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物等の蛍光特性を示すグラフである。 本発明の蛍光分子、すなわち、式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物等の蛍光特性を示すグラフである。 本発明の蛍光分子、すなわち、式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物等の蛍光特性を示すグラフである。 本発明の蛍光分子、すなわち、式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物等の蛍光特性を示すグラフである。 本発明の蛍光分子、すなわち、式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物等の蛍光特性を示すグラフである。 本発明の蛍光分子、すなわち、式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物等の蛍光特性を示すグラフである。 本発明の蛍光分子、すなわち、式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物等の蛍光特性を示すグラフである。 本発明の蛍光分子、すなわち、式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物等の蛍光特性を示すグラフである。 本発明に係る式（ＸＸＩＩＩ）の化合物を用いたカスパーゼ−３の検出結果を示したグラフである。 化合物ＸＸＩＶの蛍光特性スペクトル結果である。 化合物ＸＸＩＶと熱ショックタンパク質９０(heat shock protein 90、以下ＨＳＰ９０とする)を用いて、ｉＦＲＥＴシグナルを検出した結果を示したグラフである。 式（ＸＸＩＶ）の化合物を用いたＨＳＰ９０の検出結果を示したグラフである。 ＨＳＰ９０と結合するものとして知られているゲルダナマイシンとＰＵ―Ｈ６４を用いた競合アッセイであり、結合競争物質の有無に応じた競争化合物ＸＸＩＶとＨＳＰ９０タンパク質のｉＦＲＥＴシグナル変化を示したグラフである。 本発明に係る式（ＸＸＩＶ）の化合物を用いたＨＳＰ９０の定量分析結果を示したグラフである。 本発明に係る式（ＸＸＩＩＩ）の化合物の質量分析グラフである。 本発明に係る式（ＸＸＶ）の化合物をｉＦＲＥＴ用探針として用いて、ストレプトアビジンを検出した結果を示した図である。 本発明に係る式（ＸＸＶＩ）の化合物をｉＦＲＥＴ用探針として用いて、ストレプトアビジンを検出した結果を示した図である。 本発明に係る式（ＸＸＶＩＩ）の化合物をｉＦＲＥＴ用探針として用いて、ストレプトアビジンを検出した結果を示した図である。 本発明に係る式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物をｉＦＲＥＴ用探針として用いて、ストレプトアビジンを検出した結果を示した図である。

発明の実施のための形態

本発明の第１実施形態は、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子を様々な候補群から取得し、タンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する蛍光分子と直接又はリンカーを介して連結し、固有の蛍光共鳴エネルギー転移（ｉＦＲＥＴ）用探針を製造する第１ステップと、前記標的タンパク質に第１ステップで製造されたｉＦＲＥＴ用探針を処理する第２ステップと、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長を含む光を照射し、発光するｉＦＲＥＴ用探針を確認する第３ステップとを含み、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子を検索する方法を提供する。

本発明で使用される用語「ＦＲＥＴ」とは、互いに異なる発光波長帯の２つ蛍光物質間で発生する非放射性（non-radiative）エネルギー転移現象であり、励起された状態の蛍光供与体の励起準位エネルギーが蛍光アクセプターに伝達され、蛍光受容体から発光（emission）が観察されるか、蛍光供与体の蛍光減少（quenching）が観察される現象を意味する（非特許文献３）。

ＦＲＥＴは、一般に蛍光供与体から放出される波長が蛍光受容体の吸光スペクトルと重なり、光子（photon）の出現なしに発生するため、共鳴エネルギー転移といわれ、これは、蛍光供与体と蛍光受容体との間の長距離双極子相互作用による結果である。ＦＲＥＴのエネルギー転移効率は、蛍光供与体の発光スペクトルと蛍光受容体の吸光スペクトルが重なる範囲と蛍光供与体の量子効率、蛍光供与体と蛍光受容体の転移双極子（transition dipoles）の相対的方向（relative orientation）、そして、蛍光供与体と蛍光受容体との間の距離によって異なる。したがって、ＦＲＥＴのエネルギー転移効率は、蛍光供与体と蛍光受容体との距離と相対的方向により異なって現れるが、フォルスター（Forster）の数式によれば次の通り表現される。

Ｅ＝Ｒ_０ ^６／（Ｒ^６＋Ｒ_０ ^６） （数式１）
（式中、ＥはＦＲＥＴ効率を示し、Ｒは蛍光供与体と蛍光受容体との間の距離であり、蛍光物質に応じて差はあるが、通常２〜９ｎｍ以内と定義される。また、Ｒ_０はＦＲＥＴ効率が５０％になる蛍光供与体と蛍光受容体との間の距離をいい、一般にフォルスター距離（Forster distance）又はフォルスター半径（Forster radius）と呼ばれる。Ｒ_０は下記数式２で表現される。

Ｒ_０＝０．２１１［ｋ^２ｎ^−４Ｑ_ＤＪ（λ）］^１／６（ｉｎÅ） （数式２）
（式中、ｋ^２は方向係数（orientation factor）であって、通常２／３で計算し、蛍光供与体発光と蛍光受容体吸光の相対的方向により、０〜４範囲の値を有する。ｎは媒質の屈折率であって、通常２５℃の水は約１．３３４であり、Ｑｎは蛍光供与体の量子効率である。Ｊ（λ）は、蛍光供与体の発光と蛍光受容体の吸光スペクトル上の重複（overlap）程度であって、Ｍ^−１ｃｍ^−１ｎｍ^４の単位値を有する（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。

本発明で使用される用語「蛍光供与体」とは、タンパク質の固有の蛍光の発揮に関与するアミノ酸である。大部分のタンパク質は、固有の蛍光を発揮するが、この時、芳香族環状構造を有するアミノ酸が関与するものと知られている。その例としては、トリプトファン（Tryptophan）、チロシン（Tyrosine）、フェニルアラニン（Phenylalanine）を挙げることができる。このようなトリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンは、２６０〜３００ｎｍの波長の光により励起され、２９０〜４００ｎｍの波長の光を発光し、その光が４４０ｎｍの波長まで影響を及ぼすものと知られている。

本発明で使用される用語「蛍光アクセプター」及び「蛍光受容体」とは混用され、タンパク質の固有の蛍光により励起され、発光する蛍光分子を意味する。

本発明に係るｉＦＲＥＴ用探針は、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子（以下、「結合分子」と略称する）とｉＦＲＥＴアクセプター機能を有する蛍光分子を含み、前記結合分子と蛍光分子が直接又はリンカーを介して結合されている。

前記結合分子部位は、ｉＦＲＥＴ用探針が標的タンパク質に特異的な結合をするよう誘導する。

本発明で、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子は、２個以上の標的タンパク質に共通して結合する結合部位又は前記結合部位を有する分子も含む。

前記結合分子は、標的タンパク質に特異的に結合する公知化合物であり、本発明に係る結合分子検索方法で標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子が多様な候補群から選別することができる。

本発明に係るタンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する蛍光分子は、前記タンパク質の固有の蛍光を発するアミノ酸であるトリプトファン、チロシン及び／又はフェニルアラニンの発光波長である３００〜４００ｎｍの光により励起されることが好ましく、タンパク質固有の蛍光と分離される波長である４５０ｎｍ以上の発光波長を有することがより好ましい。

一方、ｉＦＲＥＴ用探針が発光する光を確認又は追跡時、ｉＦＲＥＴ用探針が発光する全ての領域の波長帯を測定することができるが、ｉＦＲＥＴ用探針が放出する光の中で、４５０ｎｍ又はそれ以上の長波長の光を測定することが好ましい。細胞或いは組織（tissue）には、２６０〜４００ｎｍの光によって、蛍光を出す細胞自家蛍光（cellular autofluorescence）物質である核酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈやコラーゲン、或いは細胞タンパク質などが存在し、これらが生成する蛍光発光波長が、主に３００〜４５０ｎｍにわたって存在する。したがって、本発明のｉＦＲＥＴ用探針は、細胞イメージ化に使用されるか、細胞抽出物或いは組織染色（tissue staining）に使用される場合、これらの干渉を避けるために、本発明のｉＦＲＥＴ用探針は、発光領域が４５０ｎｍ以上であることが好ましい。

本発明は実験を通じて、タンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する蛍光分子として、下記表１の式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物を確認した（実施例１〜７参照）。

式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される各化合物の誘導体及びその塩は、タンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する蛍光分子として機能する限り、本発明の範疇に属する。

リンカーの例としては、両末端に適切な機能団（−ＮＨ_２、ＣＯ_２Ｈ、−Ｎ_３、−Ｃ≡Ｃ−、等）を有した各種アルキル（−（ＣＨ_２）_ｎ−）、アリール、エチレングリコール（−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ‐；ｎ＝１〜２０）などが挙げられる。前記リンカーは、蛍光物質と炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−窒素結合など可能なあらゆる形態の結合によって連結されてもよい。リンカーは、本発明に係るｉＦＲＥＴ用探針の結合分子が標的タンパク質に結合時、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子が結合部位又は近くで発散される標的タンパク質の固有の蛍光を最大限度でケンチングできるように配向することが好ましい。前記リンカーは、標的タンパク質に結合分子を結合した後、３次元的配向シミュレーションによって適宜デザインされてもよい。

一方、標的タンパク質に、本発明に係るｉＦＲＥＴ用探針を処理する場合、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する光を照射し、発光するｉＦＲＥＴ用探針を確認するために、通常の蛍光物質処理条件を利用でき、好ましくは、水、緩衝溶液、炭素数１〜６の低級アルコール及びこれらの混合物よりなる群から選ばれる溶媒内の、或いはバイオチップや（極）微粒子状、或いは細胞や組織で遂行されてもよい。

標的タンパク質内のアミノ酸を励起するＵＶ領域の光を照射し、発光するｉＦＲＥＴ用探針を確認するために、同日付け出願された本発明者の韓国出願（ｉＦＲＥＴ用探針を用いたタンパク質検出又はイメージ化顕微鏡装置及びそれを用いたタンパク質検出又はイメージング方法）に記載された顕微鏡装置を用いることができるが、通常の蛍光測定法を用いてもよく、例えば蛍光分析装置を使用することができる。蛍光分析装置としては、フィルタ方式及びモノクローム方式の蛍光分光器などがある。前記同日付けの韓国出願は本発明の明細書の一部として統合される。

本発明に係る標的タンパク質に特異的な結合分子検索方法により確認された標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子は、前記標的タンパク質が関与する疾患を予防、改善又は治療するための物質又はその一部として用いられてもよい。

本発明の第２実施形態は、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子を様々な候補群から取得し、タンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する第１蛍光分子と直接又はリンカーを介して連結し、第１のｉＦＲＥＴ用探針を製造する第１ステップと、前記標的タンパク質に第１のｉＦＲＥＴ用探針を処理する第２ステップと、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長を含む光を照射し、発光する第１のｉＦＲＥＴ用探針を確認する第３ステップと、前記第３ステップで発光する第１のｉＦＲＥＴ用探針を構成する、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子をタンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する第２蛍光分子と直接又はリンカーを介して連結し、第２のｉＦＲＥＴ用探針を製造する第４ステップとを含むｉＦＲＥＴ用探針を製造する方法を提供する。

本発明の第２実施形態で、第１ステップ〜第３ステップに対する説明は、本発明の第１実施形態で説明した第１ステップ〜第３ステップと略同じである。

本発明の第２実施形態で、第４ステップは、第３ステップから得られた標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子をタンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する第２蛍光分子と直接又はリンカーを介して連結し、第２のＦＲＥＴ用探針を製造するステップであり、本発明によって標的タンパク質に特異的な結合分子を検索するために用いられた第１のｉＦＲＥＴ用探針の第１蛍光分子及び第２のｉＦＲＥＴ用探針の第２蛍光分子は同一又は異なっていてもよい。

前記標的タンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する第１蛍光分子及び第２蛍光分子は、それぞれ独立して、タンパク質の固有の蛍光を発するアミノ酸であるトリプトファン、チロシン及び／又はフェニルアラニンの発光波長である３００〜４００ｎｍの光により励起されることが好ましく、タンパク質固有の蛍光と分離される波長である４５０ｎｍ以上の発光波長を有することがより好ましい。

前記第１蛍光分子及び第２蛍光分子は、それぞれ独立して、前記表１の式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物のいずれか１つであってもよいが、これに限定されない。

本発明の第３実施形態は、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子と、ｉＦＲＥＴアクセプター機能を有する蛍光分子として前記式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物よりなる群から選ばれる分子とが直接又はリンカーを介して結合されたｉＦＲＥＴ用探針を提供する。

前記本発明のｉＦＲＥＴ用探針は、４５０ｎｍ或いはそれ以上の長波長の光を放出することが好ましい。

本発明の第４実施形態は、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子と、ｉＦＲＥＴアクセプター機能を有する蛍光分子とが直接又はリンカーを介して結合されたｉＦＲＥＴ用探針であって、ＦＲＥＴ効率が５０％になる蛍光供与体と蛍光受容体との間の距離であるＲ_０値が１〜４ｎｍであることを特徴とするｉＦＲＥＴ用探針を提供する。

従来、一般的なＦＲＥＴ対に対するＲ_０値は、約５ｎｍ以上であるのに対して、本発明によるｉＦＲＥＴ探針は、標的タンパク質内のＴｒｐなどの蛍光供与体と１〜４ｎｍのＲ_０値を有するよう考案されていてもよい。したがって、本発明のｉＦＲＥＴ探針は、一般的なＦＲＥＴ探針に比べて、標的タンパク質内の蛍光供与体に近接した時、すなわち、約２ｎｍ内外の距離に位置する時、検出可能であるので、一般的なＦＲＥＴ検出で発生しうる低分子物質の非特異的結合によるノイズ発生可能性を排除することができる。

また、本発明の第５実施形態は、新規化合物として下記式（ＸＸＩＩＩ）、（ＸＸＩＶ）、又は（ＸＸＶＩ）〜（ＸＸＸＩＩ）で表される化合物又はその塩を提供する。

前記式（ＸＸＩＩＩ）、（ＸＸＩＸ）、（ＸＸＸ）、（ＸＸＸＩ）又は（ＸＸＸＩＩ）で表される化合物又はその塩、式（ＸＸＶＩ）、（ＸＸＶＩＩ）又は（ＸＸＶＩＩＩ）で表される化合物又はその塩、及び式（ＸＸＩＶ）で表される化合物又はその塩は、それぞれ、カスパーゼ−３、ストレプトアビジン（Streptavidin）及びＨＳＰ９０（heat shock protein 90）を標的タンパク質とするｉＦＲＥＴ用探針として用いられてもよい。

また、前記式（ＸＸＩＩＩ）、（ＸＸＩＶ）、又は（ＸＸＶＩ）〜（ＸＸＸＩＩ）で表される化合物の誘導体図本発明の範疇に属する。

前記式（ＸＸＩＩＩ）で表される化合物又はその塩；及び式（ＸＸＩＶ）で表される化合物又はその塩は、下記式（Ｉ）の１−ナフチルエチレンジアミンが蛍光分子として用いられ、それぞれ標的タンパク質カスパーゼ−３及びＨＳＰ９０に結合できる結合分子が前記蛍光分子に直接又はリンカーを介して結合されたものであり、カスパーゼ−３及びＨＳＰ９０に特異的なｉＦＲＥＴ用探針として用いられてもよい。

前記式（ＸＸＶＩ）、（ＸＸＶＩＩ）又は（ＸＸＶＩＩＩ）で表される化合物又はその塩は、それぞれ、下記式（ＸＩＩ）

のヒドロキシクマリン酢酸、下記式（ＩＸ）

のヒドロキシクマリンアクリル酸、及び下記式（ＸＸＩ）

のジメチルアミドクマリン酢酸が蛍光分子として用いられ、標的タンパク質であるストレプトアビジンに特異的に結合しうるビオチンが結合分子として前記蛍光分子に直接又はリンカーを介して結合されたものである。したがって、前記式（ＸＸＶＩ）、（ＸＸＶＩＩ）又は（ＸＸＶＩＩＩ）で表される化合物又はその塩は、ストレプトアビジンに特異的なｉＦＲＥＴ用探針として用いられてもよい。

前記式（ＸＸＩＸ）、（ＸＸＸ）、（ＸＸＸＩ）又は（ＸＸＸＩＩ）で表される化合物又はその塩は、前記式（Ｉ）の１−ナフチルエチレンジアミン（（ＸＸＸＩ）及び（ＸＸＸＩＩ））又は式（ＸＩＩ）のヒドロキシクマリン酢酸（（ＸＸＩＸ）及び（ＸＸＸ））が蛍光分子として用いられ、標的タンパク質であるカスパーゼ−３に特異的に結合できるＡｓｐ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−（ケトン）−ＣＦ_３（（ＸＸＩＸ）及び（ＸＸＸＩ））又はＡｓｐ（ＣＯ_２Ｍｅ）−Ｌ−Ｇｌｕ（ＣＯ_２Ｍｅ）−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＣＯ_２Ｍｅ）−（ケトン）−ＣＦ_３（（ＸＸＸ）及びＸ（ＸＸＩＩ））が結合分子として前記蛍光分子に直接又はリンカーを介して結合されたものである。したがって、前記式（ＸＸＩＸ）、（ＸＸＸ）、（ＸＸＸＩ）又は（ＸＸＸＩＩ）で表される化合物又はその塩は、カスパーゼ−３に特異的なｉＦＲＥＴ用探針として用いられてもよい。

一般に、蛍光体の場合、励起（absorbance）波長と発光波長帯が高いほど、すなわち、低いエネルギーで励起が可能であるほど、より低コストの形態の光源を選択することができ、測定装置を経済的に製作することができる。また、細胞の自家蛍光（autofluorescence）と蛍光体の発光波長が互いに重複しないように蛍光体の感度を高めるためには、発光波長が自己波長と互いに重複しない蛍光体の開発が非常に重要である。

前記式（Ｉ）の１−ナフチルエチレンジアミンは、ＬＥＤ（light-emitting diode）に效果的に検出可能であることから蛍光探針として用いられ、励起波長が３４０ｎｍ〜３８０ｎｍであり、発光波長が４００ｎｍ〜６００ｎｍであるので、公知された蛍光体と比較して、発光波長帯が高く、細胞の自家蛍光と分離され測定できる蛍光分子である。

本発明の化合物は、当該技術分野で通常的な方法によってその塩及び溶解性化合物として製造されてもよい。

塩としては、遊離酸（free acid）により形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は、通常の方法、例えば、化合物を過量の酸水溶液に溶解し、この塩をメタノール、エタノール、アセトン又はアセトニトリルのような水混和性有機溶媒を用いて沈殿させ、製造する。同モル量の化合物及び水中の酸又はアルコール（例、グリコールモノメチルエーテル）を加熱し、次いで、前記混合物を蒸発して乾燥するか、又は析出された塩を吸引ろ過することができる。この時、遊離酸としては有機酸と無機酸が用いられ、無機酸としては塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、酒石酸などが用いられ、有機酸としてはメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、プロピオン酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸（glutaric acid）、グルクロン酸（glucuronic acid）、アスパラギン酸、アスコルビン酸、バニリン酸、ヒドロヨード酸などが用いられるが、これに限定されない。

また、塩基を用いて薬学的に許容可能な金属塩を製造することができる。アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解し、非溶解化合物塩をろ過した後、ろ液を蒸発し、乾燥して得る。この時、金属塩としては、特にナトリウム、カリウム又はカルシウム塩を製造することが製薬上適しており、また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩を適当な銀塩（例えば、窒酸銀）と反応させて得る。

前記式（ＸＸＩＩＩ）、（ＸＸＩＶ）、又は（ＸＸＶＩ）〜（ＸＸＸＩＩ）の化合物の塩は、特に言及しない限り、式（ＸＸＩＩＩ）、（ＸＸＩＶ）、又は（ＸＸＶＩ）〜（ＸＸＸＩＩ）の化合物に存在しうる酸性又は塩基性基の塩を含む。例えば、塩としては、ヒドロキシ基のナトリウム、カルシウム及びカリウム塩が含まれ、アミノ基のその他の塩としては、ヒドロクロリド、臭化水素酸塩、硫酸塩、水素硫酸塩、リン酸塩、水素リン酸塩、二水素リン酸塩、アセテート、スクシネート、シトレート、酒石酸塩、ラクテート、マンデレート、メタンスルホネート（メシレート）及びｐ−トルエンスルホネート（トシレート）塩などがあり、当業界で公知の塩の製造方法や製造過程を介して製造されてもよい。

本発明の第６実施形態は、前記本発明の第２実施形態により製造された第２のｉＦＲＥＴ用探針又は前記本発明の第３実施形態又は第４実施形態に係るｉＦＲＥＴ用探針を、標的タンパク質を含有するサンプル内に添加する第１ステップと、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長を含む光を照射し、前記ｉＦＲＥＴ用探針が発光する光を確認又は追跡する第２ステップとを含み、ｉＦＲＥＴにより標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法を提供する。

また、本発明の第７実施形態は、固有の蛍光共鳴エネルギー転移（ｉＦＲＥＴ）用探針を用いた標的タンパク質検出又はイメージ化の方法であって、前記ｉＦＲＥＴ用探針は、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子と、標的タンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する蛍光分子とが直接又はリンカーを介して結合されたものであり、前記ｉＦＲＥＴ用探針を標的タンパク質を含有する試料内に導入する第１ステップと、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を交互に第１ステップで製造された試料に照射する第２ステップと、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射し、ｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射し、ｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値とを分析し、第１発光信号値と第２発光信号値とのレシオメトリック法で第３発光信号値を算出する第３ステップとを含むことを特徴とする方法を提供する。

本発明で使用される用語「試料」又は「サンプル」とは、標的タンパク質を含有するか、又は含有しているものと推定され、分析が行なわれる組成物を意味し、標的タンパク質自体、細胞、血液、尿、水、土壌、空気、食品、廃棄物、動植物組織及び生物体自体のいずれか一つ以上から収集されたものであってもよいが、これに限定されない。試料又はサンプルは、標的タンパク質を含有する水、緩衝溶液、炭素数１〜６の低級アルコール、又はこれらの混合物、バイオチップや（極）微粒子状であってもよい。

本発明の第７実施形態は、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を、標的タンパク質及びこれに結合されたｉＦＲＥＴ用探針を含有する試料に、交互に照射することを特徴とする。

ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光は、標的タンパク質内のアミノ酸を励起しなく、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を直接励起する光である。

本発明の第７実施形態では、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射し、ｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射し、ｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値とのレシオメトリック法で第３発光信号値を算出することができる。

第３発光信号値は、測定試料（例：細胞、検液等）に存在するｉＦＲＥＴ用探針（第２発光信号値）の量に対する標的タンパク質に結合したｉＦＲＥＴ用探針の量（第１発光信号値）の比であり、測定の時間的・空間的変化に関係なく、常時基準値（第２発光信号値）が提供され、標的タンパク質とｉＦＲＥＴ用探針の結合を定量化することを可能にする。また、レシオメトリック法を用いれば、試料に照射される光の量が変わっても補正が可能である。

第３発光信号値は下記数式３によって計算できる。

第３発光信号値＝第１発光信号値÷第２発光信号値 （数式３）

レシオメトリック法により、第２発光信号値を基準値（reference）として用い、第１発光信号値の強度を第３発光信号値に換算することで、ｉＦＲＥＴ用探針の偏在化（localization）による測定誤差を最小化し、鮮明なイメージを得ることができ、標的タンパク質の量と標的タンパク質に対する薬物結合の定量的測定、標的タンパク質の空間的移動追跡などが可能である。

第３発光信号値は、従来のレシオメトリック法ソフトウェアを使用して計算できる。

一方、ｉＦＲＥＴ用探針は、標的タンパク質に特異的な結合分子とｉＦＲＥＴアクセプター機能を有する蛍光分子とが直接又はリンカーを介して結合されたものであり、前記結合分子部位は、ｉＦＲＥＴ用探針が標的タンパク質に特異的な結合をするよう誘導し、ｉＦＲＥＴを介して標的タンパク質の定量が可能にするだけでなく、ｉＦＲＥＴ用探針が標的タンパク質と共に移動するようにし、標的タンパク質の挙動を確認することができるようにする。したがって、本発明の第７実施形態に係る標的タンパク質の検出又はイメージ化の方法において、第１発光信号値、第２発光信号値及び第３発光信号値は、試料の２次元の各地点に対応される２次元的な映像値であってもよい。

本発明の第７実施形態で、第１光の波長範囲は２６０ｎｍ〜３００ｎｍであり、第２光の波長範囲は３００ｎｍ〜４００ｎｍであることが好ましい。

また、本発明の第７実施形態で、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を一定時間の間隔で交互に照射すれば、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射し、ｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値（Ａ１、Ａ２、Ａ３、…）と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射し、ｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、…）からレシオメトリック法により第３発光信号値（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、…）が一定時間の間隔で算出され、蓄積され、経時的変化による標的タンパク質の位置、量又は両者の変化を確認することができる。

これにより、時間の経過による標的タンパク質の細胞内位置と空間的移動、量的変化、活性変化、薬物の結合程度、又は前記した全ての変化を確認することができる。また、経時的標的タンパク質の変化は動映像で算出することができる。

本発明の第６実施形態又は第７実施形態に係る標的タンパク質の検出又はイメージ化の方法により、標的タンパク質の量又は標的タンパク質の活性を測定したり、標的タンパク質の作用機序又は移動経路を追跡することができる。

本発明の第６実施形態又は第７実施形態に係る標的タンパク質の検出又はイメージ化の方法は、標的タンパク質の機能を確認したり、様々な検体から疾患関連標的タンパク質を検出する方法として用い、疾患診断したり、食品、飼料、飲料から微生物或いは微生物由来標的タンパク質を検出する方法として用いることができる。

一方、前記ｉＦＲＥＴ用探針が発光する光を確認又は追跡時、ｉＦＲＥＴ用探針が発光する全ての領域の波長帯を測定することができるが、ｉＦＲＥＴ用探針が放出する光のうち、４５０ｎｍ又はそれ以上の長波長の光を測定することが好ましい。細胞或いは組織には２６０〜４００ｎｍの光により蛍光を出す細胞自家蛍光（cellular autofluorescence）物質の核酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈやコラーゲン、又は細胞タンパク質などが存在し、これらが生成する蛍光発光波長が、主に３００〜４５０ｎｍにわたって存在する。したがって、本発明のｉＦＲＥＴ用探針は、細胞イメージ化に用いられるか、細胞抽出物或いは組織染色に用いられた場合、これらの干渉を避けるために、本発明のｉＦＲＥＴ用探針は、発光領域が４５０ｎｍ以上であることが好ましい。

本発明の第６実施形態又は第７実施形態に係る標的タンパク質検出又はイメージ化の方法は、前記ｉＦＲＥＴ用探針と併用し、特定物質をサンプル内に添加し、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する光を照射し、前記ｉＦＲＥＴ用探針が発光する光を確認又は追跡するステップを更に含み、特定物質の存在有無に応じて、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する光を照射し、前記ｉＦＲＥＴ用探針が発光する光の変化を確認し、標的タンパク質に対して所定の機能を有する特定物質をスクリーニングしたり、前記特定物質の標的タンパク質に対する機能を確認することにも応用できる。

この時、前記方法により確認された特定物質は、標的タンパク質と関連した疾患を予防、治療又は改善するための薬物又は食品添加剤として用いることができる。

本発明の第６実施形態又は第７実施形態に係る標的タンパク質検出又はイメージ化の方法は、蛍光顕微鏡を用いたイメージ化及び迅速蛍光免疫クロマトグラフィーなどの通常の蛍光イメージ化の方法で遂行されてもよいが、自動化ワークステーションにより遂行されることが好ましい。

発明の実施するための最良の形態

以下、本発明を、実施例を参照して更に詳しく説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

＜ｉＦＲＥＴ探針用蛍光分子の製造＞

実施例１：式（ＩＩ）の化合物の製造方法

メチル−３−（メチルアミノ）アクリレート（１）の合成
０℃で、２Ｍメチルアミン−テトラヒドロフラン溶液（１２．８ｍＬ）をメチルプロピオレート（２．８９ｍＬ）とＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液に滴下し、室温で、８時間撹拌した。揮発性溶媒とメチルプロピオレートを減圧留去後、真空乾燥して、２．２ｇ（収率：８１％）の化合物１を製造した。生成物の構造は^１Ｈ―ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): 7.648-7.574(b.s,1H), 6.621-6.568(q,1H), 4.483-4.468(d,1H), 3.654(s,3H), 2.971-2.957(d,2H).

メチル１，４，４−トリメチル−１，４−ジヒドロピリジン−３−カルボキシラート（ＩＩ）の合成
化合物１（２．１ｇ）、３−メチル−２−ブテナール（１．０４ｍＬ）、無水硫酸ナトリウム（３ｇ）、スカンジウムトリフルオロメタンスルホネート（２６７ｍｇ）をジクロロメタン（８０ｍＬ）に懸濁した後、室温で、２４時間撹拌した。溶液を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝３：７）で精製して、４７０ｍｇ（収率：１４％）の化合物ＩＩを製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): 7.031-7.027(d,1H), 5.592-5.568(q,1H), 4.481-4.462(d,1H), 3.657(s,3H), 2.963(s,3H), 1.341(s,6H).

実施例２：式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の化合物の製造方法

ジメチルピリジン−３，５−ジカルボキシラート（２）の合成
ピリジン−３，５−ジカルボン酸（７．９４ｇ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、２０ｇ）及び２．２ｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）をメタノール（１５０ｍＬ）に加えた後、室温で、１０時間撹拌した。溶液を減圧濃縮後、残渣をジクロロメタンで希釈した後、１０％クエン酸水溶液で洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）で乾燥した。溶液を減圧濃縮後、残渣を真空乾燥して、８．２ｇ（収率：８８％）の化合物２を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): 9.418(s,2H), 8.920(s,1H), 4.046(s,3H).

３，５−ビス（メトキシカルボニル）−１−メチルピリジニウム（３）の合成
化合物２（８．１ｇ）のアセトン溶液（４０ｍＬ）にヨードメチル（７．７７ｍＬ）を加えた後、２０時間還流・撹拌した。反応物を室温に冷却し、溶媒を減圧留去後、形成された結晶性目的物をアセトンで３回洗浄した後、真空乾燥して、１３．２ｇ（収率：９５％）の化合物（３）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, DMSO): 9.773(s,2H), 9.119(s,1H), 4.500(s,2H), 4.020(s,6H).

ジメチル １−メチル−１，４−ジヒドロピリジン−３，５−ジカルボキシラート（ＩＩＩ）の合成
０℃、アルゴン気流下で化合物３（１３．２ｇ）水溶液（５０ｍＬ）を炭酸水素ナトリウム（１６．５ｇ）と亜硫酸水素ナトリウム（２０．５ｇ）水溶液（１５０ｍＬ）に滴下した。反応液を室温で、３時間撹拌した後、ジクロロメタンで生成物を抽出した。抽出液を減圧濃縮後、真空乾燥して、６．９２ｇ（収率：８４％）の化合物ＩＩＩを製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): 6.918(s,1H), 3.722(s,6H), 3.191(s,2H), 3.108(s,3H).

５−（メトキシカルボニル）−１−メチル−１，４−ジヒドロピリジン−３−カルボン酸（ＩＶ）の合成
化合物ＩＩＩ（６ｇ）を１Ｎ水酸化リチウム水溶液（４０ｍＬ）、ＴＨＦ溶液（２５０ｍＬ）、メタノール（１５０ｍＬ）に溶かした後、室温で、２４時間撹拌した。反応物を１Ｎ塩酸水溶液で酸性化後、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を水溶液で３回、飽和塩溶液で１回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製して、３．５ｇ（収率：６２．５％）化合物ＩＶを製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.015(s,2H), 3.672(s,3H), 3.105(s,2H), 3.067(s,3H).

実施例３：式（Ｖ）の化合物の製造方法

Ｎ−（３−メチル−２−ブテニリデン）−１−フェニルメタンアミン（４）の合成
ベンジルアミン（５．３ｍＬ）、３−メチル−２−ブテナール（４．５４ｍＬ）、分子篩（３０ｇ）をジクロロメタン（６０ｍＬ）に加えた後、室温で、１２時間撹拌した。分子篩除去後、溶液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）で精製して、３．４ｇ（収率：３８％）の化合物４を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): 8.302-8.261(d,1H), 7.336-7.192(m,5H), 6.089-6.040(d,1H), 4.627(s,2H), 1.918(s,3H), 1.864(s,3H).

メチル １−ベンジル−２，４，４−トリメチル−１，４−ジヒドロピリジン−３−カルボキシレート（Ｖ）の合成
化合物４（１．７３ｇ）、メチル−３−オキソブタノエート（１．０８ｍＬ）、ヨウ化リチウム（１３４ｍｇ）を１，２―ジメトキシエタン（１５ｍＬ）に溶かした後、室温で、２４時間撹拌した。溶液を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ジエチルエーテル：ヘキサン＝１：１）で精製して、２００ｍｇ（収率：７．４％）の化合物Ｖを製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): 7.355-7.330(m,2H), 7.268-7.259(m,1H), 7.213-7.200(d,2H), 5.781-5.768(d,1H), 4.478(s,3H), 4.195-4.159(q,2H), 1.957(s,3H), 1.311-1.274(t,9H).

実施例４：式（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）の化合物の製造方法

ジメチル １−メチル−４−（２−メチル−１−プロペニル）−１，４―ジヒドロピリジン−３，５−ジカルボキシラート（ＶＩ）の合成
化合物１（２ｇ）、３−メチル−２−ブテナール（２．５ｍＬ）、無水硫酸ナトリウム（２５ｇ）、塩化鉄６水和物（２３５ｍｇ）をジクロロメタン（１２０ｍＬ）に懸濁した後、４４時間、還流撹拌した。溶液を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン：ヘキサン＝１：１）で精製して、２６ｍｇ（収率：０．６％）の化合物ＶＩを製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): 7.272(s,2H), 4.891-4.870(d,1H), 4.489-4.472(d,1H), 3.711(s,6H), 3.168(s,3H), 1.827(s,3H), 1.628(s,3H).

５−（メトキシカルボニル）−１−メチル−４−（２−メチル−１−プロペニル）−１，４―ジヒドロピリジン−３−カルボン酸（ＶＩＩ）の合成
化合物ＶＩ（１９ｍｇ）を３Ｎ水酸化リチウム水溶液（０．１２ｍＬ）、ＴＨＦ（０．１ｍＬ）溶液、メタノール（０．１ｍＬ）に溶かした後、室温で、４８時間撹拌した。反応物を１Ｎ塩酸水溶液で酸性化後、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を水溶液で３回、飽和塩溶液で１回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝３：７）で精製して、１２ｍｇ（収率：６７％）の化合物ＶＩＩを製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): 7.121(s,1H), 7.025(s,1H), 4.898-4.880(q,1H), 4.469-4.453(d,1H), 3.673(s,3H), 3.183(s,3H), 1.811(s,3H), 1.629(s,3H).

実施例５：式（ＶＩＩＩ）の化合物の製造方法

ジメチル ４−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−１−メチル−１，４−ジヒドロピリジン−３，５−ジカルボキシラート（ＶＩＩＩ）の合成
２Ｍ メチルアミン−テトラヒドロフラン溶液（０．６２ｍＬ）を２，２−ジメトキシプロパン（３．９ｍＬ）、メタノール（１．３ｍＬ）、メチルプロピオレート（０．８ｍＬ）とスカンジウムトリフルオロメタンスルホネート（７８ｍｇ）に滴下し、１８時間、還流撹拌した。減圧留去後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝２：８）で精製して、２４ｍｇ（収率：２８％）の化合物ＶＩＩＩを製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): 7.120(s,2H), 4.200-4.165(t,1H), 3.793(s,6H), 3.599(s,3H), 3.180(s,3H), 2.467-2.449(d,2H).

実施例６：式（ＩＸ）〜（ＸＩ）の化合物の製造方法

メチル ３−（７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−イル）アクリレート（Ｘ）の合成
ジメチルグルタコネート（５．６３ｍＬ）、２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（５ｇ）、ピペリジン（０．３６ｍＬ）をエタノール（１００ｍＬ）に溶かした後、１６時間、還流撹拌をした。反応物を室温に冷却し、溶媒を減圧留去後、形成された結晶性目的物をエタノールで３回洗浄した後、真空乾燥して、８．０１ｇ（収率：９０％）の化合物Ｘを製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, DMSO): 8.445(s,1H), 7.833-7.806(d,1H), 7.614-7.600(d,1H), 7.124-7.097(d,1H), 6.893-6.881(d,1H), 6.774(s,1H), 3.77(s,3H).

３−（７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−イル）アクリル酸（ＩＸ）の合成
３３％臭化水素−酢酸溶液（１５０ｍＬ）に化合物Ｘ（１６ｇ）を溶かした後、１８時間、還流撹拌した。反応物を室温に冷却し、溶媒を減圧留去後、形成された結晶性目的物を水溶液で３回洗浄した後、真空乾燥して、１３．５ｇ（収率：９０％）の化合物ＩＸを製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, DMSO): 8.413(s,1H), 7.587-7.566(d,1H), 7.486-7.446(d,1H), 6.862-6.860(dd,1H), 6.824-6.784(d,1H), 6.757(s,1H).

ｔｅｒｔ−ブチル ２−アミノエチルカルバメート（５）の合成
エチレンジアミン（４ｍＬ）のジクロロメタン（１４０ｍＬ）に、ジ−tert−ブチルカーボネート(２．２ｇ）のジクロロメタン（２０ｍＬ）を６時間滴下した後、室温で、１８時間撹拌した。溶液を減圧濃縮後、残渣をジクロロメタンで希釈した後、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮後、残渣を真空乾燥して、１．４ｇ（収率：８８％）の化合物５を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): 5.01(br s,1H), 3.20-3.12(m,2H), 2.78(t,2H), 1.43(s,9H), 1.31(s,2H).

ｔｅｒｔ−ブチル ２−（３−（７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−イル）アクリルアミド）エチルカルバメート（ＸＩ）の合成
０℃で、化合物５（４１ｍｇ）、生成物ＩＸ（５０ｍｇ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１９ｍＬ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１ｍＬ）に溶かし、１５分後、ＥＤＣ（５０ｍｇ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、４０ｍｇ）を加えた後、室温で、２０時間撹拌した。減圧濃縮した後、残渣を酢酸エチルで希釈した後、水溶液と１０％クエン酸水溶液で洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮後、残渣を真空乾燥して、７５ｍｇ（収率：９１％）の化合物ＸＩを製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, DMSO): 8.252(s,2H), 7.584-7.563(d,1H), 7.305-7.267(d,1H), 6.847-6.842(d,1H), 6.826-6.820(q,2H,), 6.746(d,1H), 3.208-3.161(q,2H), 3.040-2.994(q,2H), 1.379(s,9H).

実施例７：式（ＸＸ）〜（ＸＸＩＩ）の化合物の製造方法

エチル ２−（７−（ジメチルアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセテート（ＸＸ）の合成
３−（ジメチルアミノ）フェノール（６．８６ｇ）、ジエチル−１，３−アセトンジカルボキシレート（１０ｍＬ）、無水塩化亜鉛（ＺｎＣｌ_２、８．２ｇ）をエタノール（３０ｍＬ）に溶かした後、１２時間、還流撹拌した。反応物と４℃水溶液で形成された結晶性物質をクロロホルムとジエチルエーテルで再結晶した後、真空乾燥して、３．４ｇ（収率：２５％）の化合物ＸＸを製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): 7.415-7.393(d,1H), 6.633-6.604(dd,1H), 6.526-6.517(d,1H), 6.059(s,1H), 4.207-4.153(q,2H), 3.677(s,2H), 3.060(s,6H), 1.268-1.232(t,3H).

２−（７−（ジメチルアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）酢酸（ＸＸＩ）の合成
０℃で、化合物ＸＸ（１ｇ）を２Ｎ水酸化リチウム水溶液（３．６ｍＬ）、ＴＨＦ溶液（４．５ｍＬ）、メタノール（１．５ｍＬ）に溶かした後、室温で、１時間撹拌した。水溶液（６ｍＬ）を加えた後、ジエチルエーテルで３回洗浄した。２Ｎ塩酸溶液で水溶液層を酸性化した後、形成された結晶性物質を真空乾燥して、７６０ｍｇ（収率：８５％）の化合物ＸＸＩを製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, DMSO): 12.798(bs,1H), 7.49-4.456(d,1H), 6.755-6.749(d,1H), 6.571(s,1H), 6.049(s,1H), 3.786(s,2H), 3.022(s,6H).

エチル ２−（７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセテート（ＸＸＩＩ）の合成
３−（ジエチルアミノ）フェノール（１００ｍｇ）、ジエチル−１，３−アセトンジカルボキシレート（０．１２ｍＬ）、無水塩化亜鉛（ＺｎＣｌ_２、９９ｍｇ）をエタノール（５ｍＬ）に溶かした後、１２時間、還流撹拌した。反応物と４℃水溶液において形成された結晶性物質をクロロホルムとジエチルエーテルで再結晶した後、真空乾燥して、１７ｍｇ（収率：９．３％）の化合物ＸＸＩＩを製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): 7.477-7.454(d,1H), 6.806-6.778(dd,1H), 6.670(s,1H), 6.046(s,1H), 4.198-4.180(q,2H), 3.486-3.407(m,4H), 2.379(s,2H), 1.281-1.260(t,3H), 1.226-1.190(t,6H).

＜蛍光分子の蛍光特性実験＞
本発明の蛍光分子、すなわち、式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物の励起波長及び発光波長は表１に記載されており、これらの蛍光特性を示すグラフを図３〜図１５に示した。

実施例８：式（ＸＸＩＩＩ）の化合物製造方法

蛍光分子として式（Ｉ）の化合物（化合物Ｉ）にリンカーを結合し、蛍光体（Ａ）を合成した。

下記のような過程を通して、カスパーゼ活性を抑制するペプチド阻害剤であるＤＥＶＤ−ＣＨＯを蛍光体（Ａ）に結合して、式（ＸＸＩＩＩ）の化合物を製造した。

Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミンジヒドロクロリド（４ｍＭ）と無水コハク酸（４．８ｍＭ）をＤＭＦ上で反応させた。この時、約１２ｍＭのトリエチルアミンを塩基として用いた。反応の終結はＴＬＣを用いて確認した。最終生成物はメタノールを用いて再結晶し、分離した。分離された物質は質量分析した（図２２）。

式（ＸＸＩＩＩ）のＬＣ／ＭＳ：７２８．５（Ｍ）

＜式（ＸＸＩＩＩ）のｉＦＲＥＴ探針を用いたカスパーゼ−３タンパク質の検出及び活性確認＞
式（ＸＸＩＩＩ）とカスパーゼタンパク質を用い、ｉＦＲＥＴシグナルを検出した。カスパーゼ単独で存在する時は、２８０ｎｍの波長で励起した時、約３５０ｎｍの波長で蛍光値を観察することができ、式（ＸＸＩＩＩ）の場合、２８０ｎｍの波長で励起した時、約４４５ｎｍで蛍光値を観察することができた。

図１６の左側図から、式（ＸＸＩＩＩ）（ＤＥＶＤ−Ｄｙｅで表される）と活性形カスパーゼが混合されれば、カスパーゼ或いは式（ＸＸＩＩＩ）が単独で存在する時のグラフとは違って、３５０ｎｍでは減少された蛍光値を、４４５ｎｍでは約３００％以上増加された蛍光値を確認することができた。

一方、右側図は、不活性型カスパーゼと式（ＸＸＩＩＩ）を用い、２８０ｎｍの波長で励起した場合であり、この時は、ｉＦＲＥＴシグナルを観察することができなかった。これはｉＦＲＥＴ現象がカスパーゼと式（ＸＸＩＶ）の選択的結合による現象であることを証明する結果であるといえる。

実施例９：式（ＸＸＩＶ）の化合物の製造方法

エチル ３−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパノエート（６）の合成
アデニン（７ｇ）、ナトリウム（５２ｍｇ）、エチルアクリレート（１６．８ｍＬ）をエタノール（１４０ｍＬ）に加えた後、４時間、還流撹拌した。溶液を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝５０：１→３０：１→１０：１）で精製した。エタノールで再結晶して、８．７９ｇ（収率：７３％）の化合物６を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600MHz, CDCl₃)(I): 8.36(s,1H,H-2), 7.90(s,1H,H-8), 5.60(b.s.,2H,NH2), 4.51-4.49 t,2H,CH2N), 4.15-4.11(q,2H,CH2), 2.94-2.92(t,2H,CH2CO), 1.23-1.21(t,3H,CH3).

５−ブロモ−６−ヨード−ベンゾ［１，３］ジオキソール（９）の合成
５−ブロモ−ベンゾ［１，３］ジオキソール（１．５ｇ）、トリフルオロ酢酸（１．１５ｍＬ）、Ｎ−ヨウ化スクシンイミド（５．０６ｇ）をアセトニトリル（２３ｍＬ）に加えた後、室温で、２６時間撹拌した（暗室条件）。減圧濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン）で精製して、２．１２６ｇ（収率：８８％）の化合物９を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, DMSO)(IA): 7.478(s,1H), 7.363(s,1H), 6.092(s,2H)
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃)(IA): 7.26(s,1H), 7.10(s,1H), 5.99(s,2H)

エチル ３−（６−アミノ−８−ブロモ−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパノエート（７）の合成
化合物６（９．２４２ｇ）を酢酸緩衝液（５４ｍＬ）、メタノール（６ｍＬ）、ジクロロメタン（１５ｍＬ）に加えた後、臭素（２．８６ｍＬ）を１０分間、滴下した。メタノール（１０ｍＬ）で反応物の固体化を観察した後、過量のメタノールを加えた後、１時間撹拌した。減圧濃縮後、残渣をジクロロメタンと少量のメタノール混合溶液で抽出した。有機層をチオ硫酸ナトリウム飽和水溶液で洗浄した後、ジクロロメタンで水溶液層の目的物を抽出した。有機層を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１００：１→５０：１→４０：１）で精製した。減圧濃縮後、結晶性物質を酢酸エチルとヘキサンで洗浄した後、真空乾燥して、９．５１７ｇ（収率：７７％）の化合物７を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, DMSO)(II): 8.19(s,1H,H-2), 7.38(b.s.,2H,NH2), 4.38-4.36(t,2H,CH2N), 4.03-3.99(q,2H,CH2), 2.90-2.88(t,2H,CH2CO), 1.12-1.09(t,3H,CH3).

エチル ３−（６−アミノ−８−メルカプト−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパノエート（８）の合成
化合物７（１ｇ）とチオウレア（１．２１ｇ）をブタノール（２４ｍＬ）に加えた後、５時間、還流撹拌した。反応物を室温に冷却し、溶媒を減圧留去後、形成された結晶性目的物をメタノールで再結晶した。真空乾燥して、０．６６１ｇ（収率：７５％）の化合物８を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, DMSO)(III): 12.35(s,1H,SH), 8.15(s,1H,H-2), 6.85(b.s.,2H,NH2), 4.37-4.34(t,2H,CH2N), 4.03-3.99(q,2H,CH2), 2.81-2.79(t,2H,CH2CO), 1.13-1.10(t,3H,CH3).

エチル ３−（６−アミノ−８−（６−ブロモベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルチオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパノエート（１０）の合成^［２］
化合物８（１．４６７ｇ）、化合物９（２．８１ｇ）、ヨウ化銅（０．１０６７ｇ）、ネロクプロイン水和物（０．１１５６ｇ）、ナトリウムブトキシド（０．６４６ｇ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶かした後、２５時間、１１０℃で撹拌した。減圧濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝２００：１→１００：１→５０：１）で精製した。減圧濃縮後、形成された結晶性目的物をジクロロメタンとヘキサン混合液で洗浄した後、真空乾燥して、１．３８６ｇ（収率：５４％）の化合物１０を製造した。
生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (500 MHz, DMSO)(IV): 8.15(s,1H,H-2), 7.399(b.s.,2H,NH2), 7.35(s,1H,CHBr), 6.82(s,1H,CHS), 6.08(s,2H,OCH2O), 4.44-4.41(t,2H,CH2N), 4.02-3.97(q,4H,CH2O), 2.86-2.82(t,2H,CH2CO), 1.12-1.09(t,3H,CH3).
生成物の構造は¹³C-NMRを通して確認した。
¹³C-NMR (400 MHz, DMSO)(IV): 14.459, 33.88, 40.025, 60.98, 103.29, 111.94, 113.68, 115.57, 120.24, 125.61, 143.86, 148.62, 149.09, 151.45, 153.71, 155.92, 170.85.
LC/MS: 466.3 (M+H,98%)

３−（６−アミノ−８−（６−ブロモベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルチオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロピオン酸（１１）の合成
化合物１０（５４０ｍｇ）をＴＨＦ（１３ｍＬ）、１Ｎ水酸化リチウム水溶液（３２ｍＬ）、メタノール（３２ｍＬ）に溶かした後、室温で、１６時間撹拌した。溶液を減圧濃縮後、残渣を少量の水溶液で希釈した後、１Ｎ塩酸水溶液で酸性化した。形成された結晶性目的物を水溶液で洗浄した後、真空乾燥して、３９７．４ｍｇ（収率：７６％）の化合物１１を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, DMSO)(V): 12.50(b.s,COOH), 8.15(s,1H,H-2), 7.42(bs,2H,NH2), 7.36(s,1H,CHBr), 6.84(s,1H,CHS), 6.09(s,2H,OCH2O), 4.40-4.38(t,2H,CH2N), 2.80-2.77(t,2H,CH2CO).
¹³C-NMR (400 MHz, DMSO)(V): 34.605, 40.48, 103.272, 112.157, 113.666, 115.812, 120.274, 125.628, 144.146, 148.600, 149.120, 151.384, 153.61, 155.859, 172.641.
LC/MS: 438.2 (M+H,98%)

３−（６−アミノ−８−（６−ブロモベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルチオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−Ｎ−（２−（ナフタレン−１−イルアミノ）エチル）プロパンアミド（ＸＸＩＶ）の合成
０℃で、化合物１１（４６ｍｇ）とＮ−（１−ナフチル）エチレンジアミンヒドロクロリド（３０ｍｇ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）、ＴＨＦ（１．６ｍＬ）に溶かした後、撹拌した。ＨＯＢｔ（１９ｍｇ）、ＥＤＣ（２４ｍｇ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０５４）を加えた後、室温で、１２時間撹拌した。溶液を減圧濃縮後、残渣をジクロロメタンで希釈し、水溶液で３回洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝１００：１→５０：１→３０：１）で精製して、４０．３ｍｇ（収率：９２％）の化合物ＸＸＩＶを製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, DMSO)(VI): 8.23-8.21(t,1H,NHCO), 8.15(s,1H,H-2), 8.07-8.05(d,1H,Ar), 7.74-7.73(d,1H,Ar), 7.43-7.364(m,4H,Ar+NH2), 7.33(s,1H,CHBr), 7.28-7.25(t,1H,Ar), 7.10-7.09(d,1H,Ar), 6.83(s,1H,CHS), 6.54-6.52(d,1H,Ar), 6.20-6.18(t,1H,NH), 6.07(s,2H,OCH2O), 4.44-4.42(t,2H,CH2N), 3.35-3.29(m,2H,CH2NH), 3.24-3.21(m.2H,CH2NH), 2.699-2.67(t,2H,CH2CO).
¹³C-NMR (400 MHz, DMSO)(VI): 35.455, 38.327, 40.84, 43.667, 103.24, 103.36, 112.208, 113.644, 115.812, 116.113, 120.303, 122.083, 123.577, 124.647, 125.731, 126.251, 127.482, 128.61, 134.689, 144.271, 144.469, 148.556, 149.069, 151.398, 153.537, 155.823, 170.378.
LC/MS:608.5 (M+H,98%)

参照：
［1］非特許文献６
［2］特許文献２
［3］非特許文献7

＜式（ＸＸＩＶ）のｉＦＲＥＴ探針を用いたＨＳＰ９０タンパク質の検出及び活性の確認＞
合成された化合物（ＸＸＩＶ）の蛍光特性を分析し、図１７に示した。２６０、２８０、３４０、３６０ｎｍで励起した後、生成される蛍光スペクトルを観察した。２８０ｎｍで励起した時より３４０ｎｍで励起した時に、約２倍程度より大きな蛍光値を放出した。

図１８の左側図は、化合物ＸＸＩＶと精製されたＨＳＰ９０タンパク質を用い、ｉＦＲＥＴシグナルを検出した結果である。化合物ＸＸＩＶは、ＤＭＳＯに溶かした後、蒸留水に希釈し、最終濃度２μＭになるように用いた。化合物ＸＸＩＶ単独で存在するか、或いはタンパク質のみ存在する時は、４５０ｎｍ付近で新しく生成される蛍光値を観察できなかった。しかし、ＨＳＰ９０タンパク質と化合物ＸＸＩＶが共に存在する場合にのみ、約４５０ｎｍ付近で新しい蛍光値を観察することができ、これは、ｉＦＲＥＴ現象による結果である。

図１８の右側図は、化合物ＸＸＩＶと精製されたＨＳＰ９０タンパク質、また対照群であるＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用い、ｉＦＲＥＴシグナルを再検証した結果である。化合物ＸＸＩＶは２μＭ、ＨＳＰ９０タンパク質とＢＳＡタンパク質は最終濃度２００ｎＭになるように用いた。この時、用いたバッファーはリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）である。図から分かるように、ｉＦＲＥＴシグナルは、タンパク質に選択的な化合物ＸＸＩＶとＨＳＰ９０タンパク質によって表れる現象であり、化合物ＸＸＩＶとＢＳＡはｉＦＲＥＴシグナルを示さない。

図１９は、ＨＳＰ９０タンパク質とこれと選択的に結合する式（ＸＸＩＶ）を用い、ｉＦＲＥＴシグナルを検出したグラフである。ＨＳＰ９０単独で存在する時は、２８０ｎｍの波長で励起したとき、約３５０ｎｍの波長で蛍光値を観察でき、式（ＸＸＩＶ）（Ｄｙｅで表される）の場合、２８０ｎｍの波長で励起したとき、約４３０ｎｍで蛍光値を観察できなかった。式（ＸＸＩＶ）とＨＳＰ９０タンパク質が混合されると、ＨＳＰ９０タンパク質単独で存在する時、或いは式（ＸＸＩＶ）が単独で存在する時のグラフとは異なり、４３０ｎｍで増加した蛍光値を確認することができた。対照群としては、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いており、ＢＳＡと式（ＸＸＩＶ）が混合された時は、ｉＦＲＥＴシグナルが観察できなかった。これは、ｉＦＲＥＴ現象がＨＳＯＰ９０タンパク質と式（ＸＸＩＶ）の選択的結合による現象であることを証明する結果といえる。

ＨＳＰ９０と式（ＸＸＩＶ）によるｉＦＲＥＴ現象を図１８及び図１９を通して確認した。選択的結合によるｉＦＲＥＴ現象を証明するために、ＨＳＰ９０と結合するものとして知らされたゲルダナマイシンとＰＵ−Ｈ６４を用いて、競合アッセイを実施した。ゲルダナマイシンとＰＵ−Ｈ６４、式（ＸＸＩＶ）はいずれもＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に結合し、これらが共に存在する場合、化合物は互いに競争するようになる。これを利用して、図２０の左側図は、ゲルダナマイシンと式（ＸＸＩＶ）、右側図はＰＵ−Ｈ６４と式（ＸＸＩＶ）を用いて単結合部位に対して競争を誘導し、ｉＦＲＥＴシグナルの減少を誘導した。ＨＳＰ９０タンパク質と式（ＸＸＩＶ）を用いてｉＦＲＥＴシグナルの生成を確認し、競争的阻害剤であるゲルダナマイシン或いはＰＵ−Ｈ６４を濃度別に添加することによって、ｉＦＲＥＴシグナルが減少することを確認した。これは、式（ＸＸＩＶ）がＨＳＰ９０タンパク質のＡＴＰ結合部位に選択的に結合し、ｉＦＲＥＴシグナルを生成するということを証明する結果である。

図２１は、合成された式（ＸＸＩＶ）とＨＳＰ９０タンパク質の結合程度を示す結果である。式（ＸＸＩＶ）の合成に用いられた核心構造は、ＰＵ−Ｈ６４（非特許文献８）であり、この構造がＨＳＰ９０と結合する。本実験に用いられたｉＦＲＥＴ探針は、ＰＵ−Ｈ６４に蛍光母核が導入された構造であり、実際、この探針とＨＳＰ９０タンパク質との間の結合程度を調べるために、酵素動力学的分析を通して解離定数が約１６０ｎＭであることを確認した。ｉＦＲＥＴ探針である式（ＸＸＩＶ）の濃度を一定に固定し、ＨＳＰ９０の濃度は多様に反応し、生成された蛍光値を測定した。この測定値に基づいて解離定数を求めた。ＨＳＰ９０の濃度の逆数と蛍光値の逆数をプロットし、解離定数を求めた。

実施例１０：ストレプトアビジンの特異的な式（ＸＸＶ）〜（ＸＸＶＩＩＩ）のｉＦＲＥＴ用探針の製造

Ｎ−ビオチニル Ｎ'−（１−ナフチル）エチレンジアミン（ＸＸＶ）の合成
Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミンジヒドロクロリド（２５４ｍｇ）、ビオチン（２００ｍｇ）及びトリエチルアミン（０．５８ｍＬ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１０ｍＬ）に溶かし、０℃で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、２３６ｍｇ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、１６６ｍｇ）を加え、室温で、１２時間撹拌した。溶液を減圧濃縮した後、残渣を酢酸エチルで希釈し、蒸留水で洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）で乾燥した。溶液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：１０）で精製して、化合物ＸＸＶ（３８０ｍｇ、収率：８３％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): 8.17(d,1H), 8.05(d,1H) 7.74(d,1H), 7.44-7.36(d,1H), 7.28(t,2H), 7.10(dd,1H), 6.54(d,1H), 6.52(d,1H), 4.23(t,1H), 4.01(dd,1H), 3.39(t,2H), 3.28(m,1H), 3.27(t,2H), 2.74(dd,1H), 2.55(d,1H), 2.11(t,2H), 1.56(m,2H), 1.55(m,2H), 1.27(m,2H).

Ｎ−（７−ヒドロキシクマリン−４−アセチル）−Ｎ'−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（１２）の合成
７−ヒドロキシクマリン−４−酢酸（２ｇ）、Ｎ−Ｂｏｃ−１，２−ジアミノエタン（３ｇ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８ｍＬ）をＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶かし、０℃で、１５分間撹拌した後、ＥＤＣ（２．６ｇ）及びＨＯＢｔ（１．３７ｇ）を加えた後、室温で、更に４時間撹拌した。溶液を減圧濃縮した後、残渣を酢酸エチルで希釈し、１０％クエン酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でそれぞれ洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：１０）で精製して、化合物１２（２．６ｇ、収率：７９％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 7.55-7.52(d,1H), 6.82(d,1H), 6.79(s,1H), 6.23(s,1H), 3.83(s,2H), 3.17-3.11(q,2H), 2.96-2.91(q,2H), 1.51(s,9H).

（７−ヒドロキシクマリン−４−酢酸）−２−アミノエチルアミド（１３）の合成
化合物１２（６０ｍｇ）をＭＣ：ＴＦＡ（３：１、１ｍＬ）に溶かし、室温で、１時間撹拌した。反応物を再び塩化メチレンに溶かした後、減圧蒸留した。同過程を２回繰り返した後、メタノールとジエチルエーテルの組み合わせで再結晶した。結晶性目的物を真空乾燥して、化合物１３（４０ｍｇ、収率：８１％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8.38(t,1H), 7.60(d,1H), 6.81(d,1H), 6.73(s,1H), 3.67(s,2H), 3.30-3.27(q,2H), 2.88-2.84(t,2H).

Ｎ−（７−ヒドロキシクマリン−４−アセチル）−Ｎ'−（ビオチニル）エチレンジアミン（ＸＸＶＩ）の合成
化合物１３（５０ｍｇ）、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（５５ｍｇ）及びＴＥＡ（０．０３６ｍＬ）を０℃で、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶かし、室温で、５時間撹拌した。溶液を減圧濃縮した後、残渣に過量の水を加え、形成された結晶性目的物をろ過して得た後、シリカゲルクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：１０）で再度精製して、化合物ＸＸＶＩ（４０ｍｇ、収率：６３％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8.22(s,1H), 7.82(s,1H), 7.59-7.56 (d,1H), 6.80-6.77(q,1H), 6.71-6.71(d,1H), 6.43-6.37(d,2H), 6.16(s,1H), 4.32(m,1H), 4.12(m,1H), 3.63(s,2H), 3.10(s,5H), 2.84-2.79(dd,1H), 2.59(d,1H), 2.03(t,1H), 1.48-1.28(m,6H).

（Ｅ）−７−ヒドロキシクマリン−３−アクリル酸 ２−アミノエチルアミド（１４）の合成
Ｎ−（（Ｅ）−７−ヒドロキシクマリン−３−アクリル酸）−Ｎ'−ｔｅｒｔ−ブチルエチレンジアミン（７０ｍｇ）をＭＣ：ＴＦＡ（２：１、１ｍＬ）に溶かし、室温で、１時間撹拌した。反応物を再び塩化メチレンに溶かした後、減圧蒸留した。同過程を２回繰り返した後、形成された結晶性目的物を真空乾燥して、化合物１４（６５ｍｇ、収率：９５％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8.45(t,1H), 8.28(s,1H), 7.83(b.s,2H), 7.59-7.57(d,1H), 7.34-7.30(d,1H), 7.09-7.05(d,1H), 6.86-6.83(dd,1H), 6.76(d,1H), 3.42-3.37(q,2H), 2.94-2.89(q,2H).

Ｎ−（（Ｅ）−７−ヒドロキシクマリン−３−アクリル）−Ｎ'−（ビオチニル）エチレンジアミド（ＸＸＶＩＩ）の合成
化合物１４（１００ｍｇ）、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（８９ｍｇ）及びＴＥＡ（０．０６ｍＬ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶かし、室温で、３時間撹拌した。反応物に過量の酢酸エチルを加えて得た沈澱物をろ過後、メタノールとジエチルエーテルの組み合わせで再結晶を試みた。形成された結晶性目的物を真空乾燥して、化合物ＸＸＶＩＩ（５９ｍｇ、収率：４６％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8.28(d,2H), 8.25(s,1H), 7.58-7.63(d,1H), 7.06-7.02(d,1H), 6.88-6.86(d,1H), 6.84-6.82(d,1H), 6.74(s,1H), 6.54(d,1H), 6.52(d,1H), 4.23(t,1H), 4.01(dd,1H), 3.27(t,2H), 3.19(q,2H), 3.02(q,2H), 2.74(dd,1H), 2.55(d,1H), 2.11(t,2H), 1.56(m,2H), 1.55(m,2H), 1.27(m,2H).

Ｎ−（７−ジメチルアミノクマリン−４−アセチル）−Ｎ'−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（１５）の合成
７−ジメチルアミノクマリン−４−酢酸（１００ｍｇ）、Ｎ−Ｂｏｃ−１，２−ジアミノエタン（７１ｍｇ）を０℃で、ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶かし、１５分間撹拌した後、ＥＤＣ（１１６ｍｇ）と４−（ジメチルアミノ）ピリジン（4−（ＤＭＡＰ、6ｍｇ）を加え、室温で、更に１２時間撹拌した。溶液を減圧濃縮後、残渣を酢酸エチルで希釈した後、１０％クエン酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でそれぞれ洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）で乾燥した。溶液を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：２０）で精製して、中間体１５（８７ｍｇ、収率：５５％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): 7.48(d,1H), 6.63(d,1H), 6.61(d,1H), 6.05(s,1H), 4.84(s,1H), 3.62(s,2H), 3.35-3.31(q,2H), 3.23-3.20(q,2H), 3.06(s,6H), 1.41(s,9H).

（７−ジメチルアミノクマリン−４−酢酸）−２−アミノエチルアミド（１６）の合成
化合物１５（８０ｍｇ）をＭＣ：ＴＦＡ（２：１、１ｍＬ）に溶かし、室温で、２時間撹拌した。反応物を再び塩化メチレンに溶かした後、減圧蒸留した。同過程を２回繰り返した後、残渣をメタノールとジエチルエーテルの組み合わせで再結晶した。形成された結晶性目的物を真空乾燥して、化合物１６（５３ｍｇ、収率：６７％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): 7.54(d,1H), 6.75(d,1H), 6.57(s,1H), 6.04(s,1H), 3.73(s,2H), 3.47(t,2H), 3.31(s,6H), 3.05(t,2H).

Ｎ−（（Ｅ）−７−ジメチルアミノクマリン−３−アクリル）−Ｎ'−（ビオチニル）エチレンジアミド（ＸＸＶＩＩＩ）の合成
化合物１６（４０ｍｇ）、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（４１ｍｇ）及びＴＥＡ（０．０３ｍＬ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶かし、室温で、５時間撹拌した。溶液を減圧濃縮した後、残渣に過量の水を加え、形成された結晶性目的物をろ過して得た後、シリカゲルクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：１０）で再度精製して、化合物ＸＸＶＩＩＩ（３０ｍｇ、収率：５２％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8.23(s,1H), 7.83(s,1H), 7.54-7.52(d,1H), 6.74-6.71(q,1H), 6.56-6.55(d,1H), 6.43-6.37(d,2H), 6.00(s,1H), 4.32(m,1H), 4.13(m,1H), 3.56(s,2H), 3.02(s,5H), 2.89(s,6H), 2.84-2.79(dd,1H), 2.59(d,1H), 2.03(t,1H), 1.48-1.28(m,6H).

＜式（ＸＸＶ）〜（ＸＸＶＩＩＩ）のｉＦＲＥＴ探針を用いたストレプトアビジンタンパク質の検出及び活性確認＞
式（ＸＸＶ）〜（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物をｉＦＲＥＴ用探針として用い、ストレプトアビジンを検出した結果を図２３〜２６にそれぞれ示した。
式（ＸＸＶ）の化合物をｉＦＲＥＴ用探針として用いて得た図２３を見ると、探針自体は２８０ｎｍの波長のＵＶ照射により、４３０ｎｍで低い蛍光値を示し（青線）；タンパク質（ストレプトアビジン）は２８０ｎｍの波長のＵＶの照射により、３４０ｎｍで発光する特性を示している（緑線）。ｉＦＲＥＴ用探針と目的タンパク質であるストレプトアビジンを混合した場合、２８０ｎｍの波長のＵＶ照射によって４３０ｎｍで蛍光が大きく増加しているのが観察された（黒線）。前記結果は、本発明で開発された探針は化合物自体としては特定波長のＵＶ照射により、低い蛍光値を有するが、ストレプトアビジンと結合し、ストレプトアビジン内部に存在するエネルギー供与体のトリプトファンに隣接するようになることによって、前記トリプトファンからエネルギーが伝達され、ＦＲＥＴ現象が発生するようになり、これは、本発明の探針が結合感応性点火蛍光探針（binding sensitive turn-on fluorescence probe）であるということを意味する。

式（ＸＸＶＩ）の化合物を蛍光探針として用いて得た図２４を見ると、蛍光探針自体は２８０ｎｍの波長のＵＶ照射により、４６０ｎｍで低い蛍光値を示し（青線）；タンパク質（ストレプトアビジン）は、２８０ｎｍの波長のＵＶの照射により、３４０ｎｍで発光する特性を示している（緑線）。ｉＦＲＥＴ用探針とストレプトアビジンを混合した場合、２８０ｎｍの波長のＵＶ照射により、探針（ＸＸＶ）の発光波長より長波長である４６０ｎｍで蛍光が大きく増加しているのが観察された（黒線）。また、前記発光波長での蛍光増加率が６００％以上であることが確認されたため、効果的なｉＦＲＥＴ信号を生成するということを確認することができた。

式（ＸＸＶＩＩ）の化合物を探針として用いて得た図２５から、放出波長が異なる探針の場合にも探針とストレプトアビジンを混合した時、２８０ｎｍの波長のＵＶ照射によって４８０ｎｍで高い蛍光増加が観察された（黒線）。前記式（ＸＸＶＩＩ）の化合物は従来のｉＦＲＥＴ探針に比べて、長波長での蛍光を放出するので、リアルタイム細胞イメージ化の際に信号対雑音比を最小化し、より鮮明なイメージを提供することができる。

図２６は、合成されたｉＦＲＥＴ用探針リン式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物とストレプトアビジンの結合により生成されるｉＦＲＥＴ信号を示す（図の黒線）。式（ＸＸＶＩＩＩ）を有する探針の標的特異性を観察するために、ＢＳＡに露出させ、ＢＳＡとも結合によってｉＦＲＥＴ信号を生成するかを確認した。しかし、本発明の蛍光探針をＢＳＡと反応させた場合には、ｉＦＲＥＴ信号が観察されなかった（青紫線）。したがって、ビオチンが結合された本発明のｉＦＲＥＴ蛍光探針は、ストレプトアビジンに選択的に結合し、ｉＦＲＥＴ信号を生成することを確認した。

表２には、ビオチンと結合された式（ＸＸＶ）〜（ＸＸＶＩＩＩ）を有する蛍光探針に対する蛍光特性及びＦＲＥＴ効率を示した。

各化合物の量子収率は０．１Ｍ ｐＨ１０．０リン酸緩衝液上で測定した。基準物質としては４−メチル−ウンベリフェロン（ΦＦ＝０．６３）を、ＦＲＥＴ供与体としてはトリプトファン（ΦＦ＝０．１２）を用いて、量子収率を求めた。ＦＲＥＴ伝達効率は、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液上で測定された結果に基づいて算出し、蛍光測定はパーキンエルマー社のＬＳ５５蛍光スペクトル装置を利用した。化合物の各ステップ別の量子収率は表に示し、ＦＲＥＴ効率は合成された化合物により、それぞれ、０．２２５、０．１４１、０．２２及び０．３５９と高いエネルギー伝達効率を示した。ｉＦＲＥＴ蛍光探針とタンパク質との間のフォルスター距離（Foster distance）は、データを通して得られた値から確認することができる。これは、ｉＦＲＥＴ蛍光探針とストレプトアビジンが効果的なｉＦＲＥＴ信号を生成しうる距離内に存在することを意味する。

実施例１１：カスパーゼ−３タンパク質の特異的な式（ＩＸＸＸ）〜（ＸＸＸＩＩ）のｉＦＲＥＴ用探針の製造

２−（３−（ベンジルオキシカルボニル−５−オキソオキサゾリジン−４−イル）酢酸（１７）の合成
Ｎ−Ｃｂｚ−Ｌ−アスパラギン酸（２．１６ｇ）、パラホルムアルデヒド（１．５３ｇ）及びｐ−トルエンスルホン酸（０．１６ｇ）をトルエン（１５０ｍＬ）に溶かした後、ディーン・スターク（Dean-stark）トラップで、２時間、還流撹拌した。反応物を室温に冷却し、溶媒をシリカゲルに加えた。ジエチルエーテルでろ過した後、減圧濃縮して、化合物１７（２．０４ｇ、９０％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): 7.40-7.35(m,5H), 5.45(br,1H), 5.30-5.10(m,3H), 4.38(t,1H), 2.93(d,2H).

ｔｅｒｔ−ブチル−２−（３−（ベンジルオキシカルボニル−５−オキソオキサゾリジン−４−イル）アセテート（１８）の合成
化合物１７（１．８ｇ）、ｔ−ＢｕＯＨ（１．８ｍＬ）、ＥＤＣ（１．５ｇ）及びＤＭＡＰ（０．３５ｇ）を乾燥ＴＨＦ（７０ｍＬ）に溶かした後、５分間撹拌した。反応物にＴＥＡ（０．９ｍＬ）を加えた後、室温で、更に１６時間撹拌にした。溶液を減圧濃縮した後、残渣を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液と５％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：９→１：４）で精製して、化合物１８（１．０１ｇ、収率：４７％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): 7.38-7.34(m,5H), 5.55(br,1H), 5.34(s,1H), 5.22-5.17(q,2H), 4.29(br,1H), 2.96-2.93(d,2H), 1.42(s,9H).

ベンジル ４−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）−５−（トリフルオロメチル）−５−（トリメチルシロキシ）オキサゾリジン−３−カルボキシラート（１９）の合成
化合物１８（０．１ｇ）、フッ化セシウム（０．００６ｇ）及び２Ｍ（トリフルオロメチル）トリメチルシラン（０．１８ｍＬ）を乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）に溶かした後、室温で２時間、超音波処理した。溶液を減圧濃縮した後、残渣を酢酸エチルで希釈し、水溶液で洗浄した。有機層を飽和塩溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１０）で精製して、化合物１９（０．１ｇ、収率：７０％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): 7.38-7.33(m,5H), 5.32-5.17(br,3H), 4.95(s,1H), 4.84(q,1H), 2.46(d,2H), 1.43(s,9H), 0.21(s,9H).

ｔｅｒｔ−ブチル ３−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ）−５，５，５−トリフッ素−４−ヒドロキシペンタノエート（２０）の合成
化合物１９（０．４６ｇ）を溶かしたメタノール（２０ｍＬ）に、水素化ホウ素ナトリウム（０．３６ｇ）をゆっくり滴加した後、室温で、１６時間撹拌した。反応物に水溶液（２０ｍＬ）を加えた後、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を飽和塩溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：５）で精製して、化合物２０（０．２２ｇ、収率：６１％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): 7.36-7.31(m,5H), 5.55(d,1H), 5.13-5.07(q,2H), 4.68(s,1H), 4.65(s,1H), 4.25-4.11(d,2H), 2.70(q,2H), 1.46(s,9H).

ｔｅｒｔ−ブチル ３−アミノ−５,５,５−トリフッ素−４−ヒドロキシヘキサペンタノエート（２１）の合成
化合物２０（０．１７ｍｇ）と１０％Ｐｄ／Ｃ（パラジウム担持活性炭、２３ｍｇ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶かした後、水素気流下で、１２時間撹拌した。反応物をセライト（celite）でろ過した後、減圧濃縮して、化合物２１（０．１ｇ、収率：８１％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): 5.22(bs,2H), 4.26(q,1H), 3.82(q,1H), 2.78(d,2H), 1.31(s,9H).

Ｎ−Ｃｂｚ−アスパラギン酸 ４−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２２）の合成
水（１００ｍＬ）にＬ−アスパラギン酸 ４−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５ｇ）とＮａＨＣＯ_３（４．４３ｇ）を溶かした後、撹拌した。ベンジルクロロホルメート（４．１４ｍＬ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に希釈した溶液を反応物に滴下した後、室温で、１８時間撹拌した。有機溶媒を減圧濃縮して除去した後、水溶液層を酢酸エチルで２回洗浄した。１０％クエン酸水溶液で酸性化した後、酢酸エチルで目的物を抽出した。有機層を飽和塩溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。真空乾燥して、化合物２２（７．２ｇ、収率：８５％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): 7.24-7.34(m,5H), 5.31-5.18(s,3H), 4.58-4.67(m,1H), 2.71(q,2H), 1.46(s,9H).

Ｎ−Ｃｂｚ−アスパラギン酸−Ｎ'−ヒドロキシスクシンイミドエステル−４−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２３）の合成
化合物２２（３ｇ）、ＥＤＣ（１．９５ｇ）及びＮＨＳ（１．１８ｇ）をジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶かした後、室温で、１２時間撹拌した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。メタノールとジエチルエーテルで再結晶した後、真空乾燥して、化合物２３（３ｇ、収率：７７％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): 7.24-7.34(m,5H), 5.33-5.21(s,3H), 4.72(m,1H), 2.94(s,4H), 2.67(q,2H), 1.46(s,9H).

Ｎ−Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−Ｌ−Ｖａｌ（２４）の合成
化合物２３（０．１５ｇ）とアミノ酸ＥＶ（０．１ｇ）を溶かしたジクロロメタン（４０ｍＬ）に、ＴＥＡ（０．１５ｍＬ）をゆっくり滴下した後、室温で、１２時間撹拌した。反応物を１０％クエン酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：１０）で精製して、化合物２４（０．１４ｇ、収率：６６％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d6): 10.52(s,1H), 7.38-7.33(m,5H), 5.33-5.21(s,3H), 4.60(m,1H), 4.33(m,1H), 4.12(m,1H), 2.89(s,1H), 2.73(s,1H), 2.20(m,2H), 2.06(m,1H), 1.99(m,1H), 1.74(m,1H), 1.38(s,9H), 1.35(s,9H), 0.88(q,6H).

Ｎ−Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−（ＯＨ）−ＣＦ_３（２５）の合成
化合物２４（０．１３ｇ）、化合物２１（０．０５ｇ）及びＴＥＡ（０．１５ｍＬ）をジクロロメタン（６ｍＬ）に溶かした後、５分間撹拌した。反応物にＥＤＣ（０．０５ｇ）とＨＯＢｔ（０．０６ｇ）を加えた後、室温で、更に１２時間撹拌した。反応物を１０％クエン酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：１０）で精製して、化合物２５（０．１２ｇ、収率：６７％）を製造した。生成物は質量分析を通して確認した。
LC/MS: 833.4 (M+H).

Ｎ−Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−（ケトン）−ＣＦ_３（２６）の合成
化合物２５（０．２ｇ）とデス−マーティン試薬（０．４５ｇ）をジクロロメタン（１２ｍＬ）に溶かした後、室温で、１２時間撹拌した。沈澱物をセライトでろ過した後、ろ過液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：１０）で精製して、化合物２６（０．１７ｇ、収率：８６％）を製造した。生成物は質量分析を通して確認した。
LC/MS: 831.4 (M+H).

Ｌ−Ａｓｐ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−（ケトン）−ＣＦ_３（２７）の合成
化合物２７（０．０５ｇ）と１０％Ｐｄ／Ｃ（パラジウム担持活性炭、２２ｍｇ）をメタノール（５ｍＬ）に溶かした後、水素気流下で、１２時間撹拌した。反応物をセライトでろ過した後、減圧濃縮して、化合物２７（０．０３ｇ、収率：７１％）を製造した。生成物は質量分析を通し確認した。
LC/MS: 697.4 (M+H).

Ｃｂｚ−３−アミノプロピオン酸、Ｃｂｚ−６−アミノヘキサン酸（２８）の合成
アミノカルボン酸（３−アミノプロパン酸又は６−アミノヘキサン酸、５６ｍｍｏｌ又は３８ｍｍｏｌ）を水（１５ｍＬ）に溶かした後、０℃で、１５分間撹拌した。ＣｂｚＣｌ（１．１ｅｑ）と５Ｎ ＮａＯＨ（１ｅｑ）を反応物にゆっくり滴下し、ｐＨ１０．０を保持した。水溶液層をジエチルエーテルで２回洗浄した後、１Ｎ塩酸で酸性化し、ジクロロメタンで目的物を抽出した。有機層を飽和塩溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。−７０℃で、ジエチルエーテルで再結晶した後、真空乾燥して、化合物２８（ｎ＝３、１０ｇ、収率：７７％／ｎ＝５、７．６ｇ、７５％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃, n=2): 7.34(br,5H), 5.33(br,1H), 5.09(s,2H), 3.46(m,2H), 2.58(t,2H).
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃, n=5): 7.30-7.40(m,5H), 5.09(s,2H), 4.80(br,1H), 3.19(q,2H), 2.34(t,2H), 1.64(q,2H), 1.52(q,2H), 1.37(m,2H).

ｔｅｒｔ−ブチル Ｃｂｚ−３−アミノプロピオネート、ｔｅｒｔ−ブチルＣｂｚ−６−アミノヘキサノエート（２９）の合成
化合物２８（１ｅｑ）とピリジン（１８ｅｑ）をｔｅｒｔ−ブタノールに溶かした後、−１０℃で、１５分間撹拌した。反応物にＰＯＣｌ_３（１．１ｅｑ）をゆっくり滴下した後、室温で、１６時間撹拌した。溶液を減圧濃縮した後、残渣を酢酸エチルで希釈し、水と飽和炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：５０）で精製して、化合物２９（ｎ＝３、１ｇ、収率：６０％／ｎ＝５、１．３５ｇ、５６％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃, n=2): 7.33(m,5H), 5.34(br,1H), 5.10(s,2H), 3.42(q,2H), 2.44(t,2H), 1.44(s,9H).
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃, n=5): 7.30-7.36(m,5H), 5.09(s,2H), 4.78(br,1H), 3.19(q,2H), 2.20(t,2H), 1.65-1.30(m,6H), 1.43(s,9H).

ｔｅｒｔ−ブチル ３−アミノプロピオネート、ｔｅｒｔ−ブチル ６−アミノヘキサノエート（３０）の合成
化合物２９（１ｅｑ）と１０％Ｐｄ／Ｃ（パラジウム担持活性炭、触媒量）をエタノールに溶かした後、水素気流下で、２４時間撹拌した。反応物をセライトでろ過した後、減圧濃縮した。沈澱物を酢酸エチルで希釈した後、再度ろ過し、減圧濃縮した。生成物を真空乾燥して、化合物３０（ｎ＝３、０．３２ｇ、収率：９５％／ｎ＝５、０．５１ｇ、９２％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, n=2): 2.73(t,2H), 2.27(t,2H), 1.93(br,2H), 1.39(s,9H).
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃, n=5): 2.67(t,2H), 2.21(t,2H), 1.65(s,2H), 1.60(m,2H), 1.40-1.50(m,2H), 1.44(s,9H), 1.36(m,2H).

ｔｅｒｔ−ブチル ３−（Ｎ−（７−ヒドロキシクマリン−４−アセチル））プロピオネート、ｔｅｒｔ−ブチル ３−（Ｎ−（７−ジメチルアミノクマリン−４−アセチル））プロピオネート（３１）の合成
７−Ｒ−クマリン−４−酢酸（Ｒ＝ジメチルアミノ、ヒドロキシ、１．１ｅｑ）、中間体３０（０．１ｇ）とＴＥＡ（５ｅｑ）をＤＭＦに溶かし、０℃で、１５分撹拌後、ＥＤＣ（１．５ｅｑ）とＨＯＢｔ（１．５ｅｑ）を加えた後、室温で、更に１２時間撹拌した。溶液を減圧濃縮後、残渣を酢酸エチルで希釈し、１０％クエン酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でそれぞれ洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）で乾燥した。溶液を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：１０）で精製して、中間体３１（Ｒ＝−ＯＨ、ｎ＝２、０．１４ｇ、収率：６１％）（Ｒ＝−ＯＨ、ｎ＝５、０．１５ｇ、収率：７４％）、（Ｒ＝−ＮＭｅ２、ｎ＝２、０．１０ｇ、収率：３９％）（Ｒ＝−ＮＭｅ２、ｎ＝５、０．１１ｇ、収率：４３％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-OH, n=2): 8.68(d,1H), 7.63(d,1H), 6.81(d,1H), 6.75(s,1H), 6.39(s,1H), 3.79(t,2H), 3.73(s,2H), 2.65(t,2H), 1.42(s,9H).
¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-OH, n=5): 8.66(s,1H), 7.61(d,1H), 6.76(d,1H), 6.74(s,1H), 6.24(s,1H), 3.70(s,2H), 3.19(q,2H), 2.20(t,2H), 1.65-1.30(m,6H), 1.43(s,9H).
¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-NMe2, n=2): 8.01(s,1H), 7.48(d,1H), 6.63(d,1H), 6.61(d,1H), 6.51(s,1H), 3.77(t,2H), 3.61(s,2H), 3.05(s,6H), 2.62(t,2H), 1.42(s,9H).
¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-NMe2, n=5): 8.03(s,1H), 7.45(d,1H), 6.62(d,1H), 6.60(d,1H), 6.49(s,1H), 3.71(s,2H), 3.23(q,2H), 3.19(s,6H), 2.24(t,2H), 1.66-1.34(m,6H), 1.42(s,9H).

３−（Ｎ−（７−ヒドロキシクマリン−４−アセチル））プロピオンアミド（３２）の合成
化合物３１（０．１ｇ）をＭＣ：ＴＦＡ（２：１、１ｍＬ）に溶かし、室温で、２時間撹拌した。反応物を再び塩化メチレンに溶かした後、減圧蒸留した。同過程を２回繰り返した後、残渣をメタノールとジエチルエーテルの組み合わせで再結晶をした。形成された結晶性目的物を真空乾燥して、化合物３２（Ｒ＝−ＯＨ、ｎ＝２、０．０６０ｇ、収率：７８％）（Ｒ＝−ＯＨ、ｎ＝５、０．０８０ｇ、収率：８４％）、（Ｒ＝−ＮＭｅ２、ｎ＝２、０．０５１ｇ、収率：６７％）（Ｒ＝−ＮＭｅ２、ｎ＝５、０．０８１ｇ、収率：８８％）を製造した。生成物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲを通して確認した。

¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-OH, n=2): 8.68(d,1H), 7.63(d,1H), 6.81(d,1H), 6.75(s,1H), 6.39(s,1H), 3.73(s,2H), 3.79(t,2H), 2.65(t,2H), 1.42(s,9H).
¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-OH, n=5): 8.66(s,1H), 7.61(d,1H), 6.76(d,1H), 6.74(s,1H), 6.24(s,1H), 3.70(s,2H), 3.19(q,2H), 2.20(t,2H), 1.65-1.30(m,6H).
¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-NMe2, n=2): 8.22(s,1H), 7.53(d,1H), 6.74(d,1H), 6.56(s,1H), 6.43(s,1H), 3.75(t,2H), 3.61(s,2H), 3.05(s,6H), 2.62(t,2H).
¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, R=-NMe2, n=5): 8.20(s,1H), 7.47(d,1H), 6.64(d,1H), 6.60(d,1H), 6.49(s,1H), 3.71(s,2H), 3.23(q,2H), 3.19(s,6H), 2.24(t,2H), 1.68-1.32(m,6H).

３−（Ｎ−（７−ヒドロキシクマリン−４−アセチル））プロピオンアミド−Ａｓｐ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−（ケトン）−ＣＦ_３（３３）の合成
化合物３２（１．２ｅｑ）、化合物２７（０．０３ｇ）及びＴＥＡ（５ｅｑ）をＤＭＦに溶かし、０℃で、１５分間撹拌した後、ＥＤＣ（１．５ｅｑ）とＨＯＢｔ（１．５ｅｑ）を加えて、室温で、更に１２時間撹拌した。溶液を減圧濃縮した後、残渣を酢酸エチルで希釈し、１０％クエン酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でそれぞれ洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：１０）で精製して、化合物３３（Ｒ＝−ＯＨ、ｎ＝２、０．０１３ｇ、収率：３２％）（Ｒ＝−ＯＨ、ｎ＝５、０．０１７ｇ、収率：４０％）、（Ｒ＝−ＮＭｅ２、ｎ＝２,０．０１６ｇ,収率：３９％）（Ｒ＝−ＮＭｅ２、ｎ＝５、０．０１３ｇ、収率：３０％）を製造した。生成物は質量分析を通して確認した。

LC/MS(R = -OH, n = 2): 970.4(M+H).
LC/MS(R = -OH, n = 5): 1012.5(M+H).
LC/MS(R = -NMe2, n = 2): 997.5(M+H).
LC/MS(R = -NMe2, n = 5): 1039.5(M+H).

３−（Ｎ−（７−ヒドロキシクマリン−４−アセチル））プロピオンアミド−Ａｓｐ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−（ケトン）−ＣＦ３（ＸＸＩＸ）の合成
化合物３３をＭＣ：ＴＦＡ（２：１、１ｍＬ）に溶かし、室温で、２時間撹拌した。反応物を再び塩化メチレンに溶かした後、減圧蒸留した。同過程を２回繰り返した後、残渣をメタノールとジエチルエーテルの組み合わせで再結晶した。形成された結晶性目的物を真空乾燥して、化合物ＸＸＩＸを製造した。

３−（Ｎ−（７−ヒドロキシクマリン−４−アセチル））プロピオンアミド−Ａｓｐ（ＣＯ_２Ｍｅ）−Ｌ−Ｇｌｕ（ＣＯ_２Ｍｅ）−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＣＯ_２Ｍｅ）−（ケトン ）−ＣＦ_３（ＸＸＸ）の合成
化合物ＸＸＩＸ、ＭｅＯＨ、ＥＤＣ及びＤＭＡＰを適当量のＴＨＦに溶かした後、０℃で、１５分間撹拌した。反応物にＴＥＡをゆっくり滴下した後、室温で、更に１６時間撹拌した。溶液を減圧濃縮した後、残渣を酢酸エチルで希釈し、１０％クエン酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でそれぞれ洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、化合物ＸＸＸを製造した。

Ｎ−（１−ナフチル）エチレンアミド−４−ブタンアミド−Ａｓｐ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＣＯ_２ｔＢｕ）−（ケトン）−ＣＦ_３（３４）の合成
Ｎ−（１−ナフチル）エチレンアミド−４−ブタン酸（１．１ｅｑ）、化合物２７（１ｅｑ）及びＴＥＡ（５ｅｑ）をＤＭＦに溶かし、０℃で、１５分間撹拌した後、ＥＤＣ（１．５ｅｑ）とＨＯＢｔ（１．５ｅｑ）を加え、室温で、更に１２時間撹拌した。溶液を減圧濃縮した後、残渣を酢酸エチルで希釈し、１０％クエン酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でそれぞれ洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、化合物３４を製造した。

Ｎ−（１−ナフチル）エチレンアミド−４−ブタンアミド−Ａｓｐ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−（ケトン）−ＣＦ_３（ＸＸＸＩ）の合成
化合物３４をＭＣ：ＴＦＡ（２：１）に溶かし、室温で、２時間撹拌した。反応物を再び塩化メチレンに溶かした後、減圧蒸留した。同過程を２回繰り返した後、残渣をメタノールとジエチルエーテルの組み合わせで再結晶した。形成された結晶性目的物を真空乾燥して、化合物ＸＸＸＩを製造した。

Ｎ−（１−ナフチル）エチレンアミド−４−ブタンアミド−Ａｓｐ（ＣＯ_２Ｍｅ）−Ｌ−Ｇｌｕ（ＣＯ_２Ｍｅ）−Ｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＣＯ_２Ｍｅ）−（ケトン）−ＣＦ_３（ＸＸＸＩＩ）の合成
化合物ＸＸＸＩ（１ｅｑ）、ＭｅＯＨ（５ｅｑ）、ＥＤＣ（１．２ｅｑ）及びＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を適当量のＴＨＦに溶かした後、０℃で、１５分間撹拌した。反応物にＴＥＡ（３ｅｑ）をゆっくり滴下した後、室温で、更に１６時間撹拌した。溶液を減圧濃縮した後、残渣を酢酸エチルで希釈し、１０％クエン酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でそれぞれ洗浄した。有機層を飽和塩溶液で再度洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、化合物ＸＸＸＩＩを製造した。

細胞内特定信号伝達により細胞死滅が誘導される過程をリアルタイムでイメージ化するために細胞透過が容易なカスパーゼｉＦＲＥＴ探針を合成した。広く知られたカスパーゼに選択的に結合するペプチド阻害剤である化合物２７を合成し、これのために化合物２１が用いられた。化合物２７のＮ末端部分はｉＦＲＥＴ蛍光母核の導入部位としての役割を果たす。カスパーゼ活性を抑制するペプチド阻害剤であるＤＥＶＤ−ＣＦ３に、蛍光体として働く合成物を導入するためのリンカー２０（ｎ＝２〜５）を合成した。合成された細胞透過用トリフルオロメチルアスパラギン酸の化合物２１は、末端に−ＣＦ_３基を有し、これは、標的タンパク質であるカスパーゼ−３と結合し、酵素の機能を阻害するようになる。様々な蛍光波長を示すようにするために、蛍光探針のＲ基を（−ＯＨ）、（−Ｎ（ＣＨ_３）_２）のように２種類を導入し、４３０ｎｍの蛍光値を有する式（ＸＸＸＩＩ）を有する蛍光探針も合成した。

Claims (32)

1. 標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子を様々な候補群から取得し、タンパク質の固有の蛍光(intrinsic fluorescence)に対するアクセプター（acceptor）機能を有する蛍光分子と直接又はリンカーを介して連結し、４５０ｎｍ又はそれ以上の長波長の光を放出する固有の蛍光共鳴エネルギー転移（ｉＦＲＥＴ；intrinsic Fluorescence Resonance Energy Transfer）用探針を製造する第１ステップと、
   前記標的タンパク質に第１ステップで製造されたｉＦＲＥＴ用探針を処理する第２ステップと、
   標的タンパク質内のアミノ酸であるトリプトファン（Tryptophan）、チロシン（Tyrosine）又はフェニルアラニン（Phenylalanine）を励起する波長を含む光を照射し、発光するｉＦＲＥＴ用探針を確認する第３ステップとを含み、
   タンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する蛍光分子が、下記式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物よりなる群から選ばれることを特徴とする、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子を検索する方法。
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   
2. 前記検索方法により確認された、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子が、前記標的タンパク質が関与する疾患を予防、改善又は治療するための物質又はその一部として用いられることを特徴とする、請求項１に記載の検索方法。
3. 第２ステップが、水、緩衝溶液、炭素数１〜６の低級アルコール及びこれらの混合物よりなる群から選ばれる溶媒内で又はバイオチップ、微粒子状、極微粒子状、細胞又は組織において行われることを特徴とする、請求項１に記載の検索方法。
4. 標的タンパク質が、２６０〜３００ｎｍの波長の光により励起され、２９０〜４００ｎｍの波長の光を発光し、
   ｉＦＲＥＴ用探針が、３００〜４００ｎｍの波長の光によって選択的に励起されることを特徴とする、請求項１に記載の検索方法。
5. 標的タンパク質に特異的な結合部位（bindingsite）又は前記結合部位を有する分子を様々な候補群から取得し、タンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する第１蛍光分子と直接又はリンカーを介して連結し、第１のｉＦＲＥＴ用探針を製造する第１ステップと、
   前記標的タンパク質に第１のｉＦＲＥＴ用探針を処理する第２ステップと、
   標的タンパク質内のアミノ酸であるトリプトファン（Tryptophan）、チロシン（Tyrosine）又はフェニルアラニン（Phenylalanine）を励起する波長を含む光を照射し、発光する第１のｉＦＲＥＴ用探針を確認する第３ステップと、
   前記第３ステップで発光する第１のｉＦＲＥＴ用探針を構成する、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子をタンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する第２蛍光分子と直接又はリンカーを介して連結し、第２のｉＦＲＥＴ用探針を製造する第４ステップとを含み、
   前記第１及び第２のｉＦＲＥＴ用探針は、４５０ｎｍ又はそれ以上の長波長の光を放出し、
   タンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する蛍光分子が、下記式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物よりなる群から選ばれることを特徴とする、ｉＦＲＥＴ用探針の製造方法。
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   
6. 第１蛍光分子及び第２蛍光分子が、同一又は異なることを特徴とする、請求項５に記載のｉＦＲＥＴ用探針の製造方法。
7. タンパク質の固有の蛍光を発揮するアミノ酸が、トリプトファン（Tryptophan）、チロシン（Tyrosine）、フェニルアラニン（Phenylalanine）又はこれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項５に記載のｉＦＲＥＴ用探針の製造方法。
8. 第３ステップが、水、緩衝溶液、炭素数１〜６の低級アルコール及びこれらの混合物よりなる群から選ばれる溶媒内で又はバイオチップ、微粒子状、極微粒子状、細胞又は組織で行われることを特徴とする、請求項５に記載のｉＦＲＥＴ用探針の製造方法。
9. タンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する第２蛍光分子が、それ自体が又は第２のｉＦＲＥＴ用探針内で標的タンパク質内の励起されたアミノ酸が放出する光により励起され、４５０ｎｍ又はそれ以上の長波長の光を放出することを特徴とする、請求項５に記載のｉＦＲＥＴ用探針の製造方法。
10. 標的タンパク質が、２６０〜３００ｎｍの波長の光により励起され、２９０〜４００ｎｍの波長の光を放出し、第１のｉＦＲＥＴ用探針が３００〜４００ｎｍの波長の光によって選択的に励起されることを特徴とする、請求項５に記載のｉＦＲＥＴ用探針の製造方法。
11. 標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子と、ｉＦＲＥＴアクセプター機能を有する蛍光分子として下記式（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）で表される化合物よりなる群から選ばれる分子と、が直接又はリンカーを介して結合され、
    ４５０ｎｍ又はそれ以上の長波長の光を放出することを特徴とする、ｉＦＲＥＴ用探針。
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    
12. 標的タンパク質が、カスパーゼ−３（Caspase-3）、ＨＳＰ９０（heat shock protein 90）又はストレプトアビジンであることを特徴とする、請求項１１に記載のｉＦＲＥＴ用探針。
13. 下記式（ＸＸＩＩＩ）、（ＸＸＩＶ）、又は（ＸＸＶＩ）〜（ＸＸＸＩＩ）よりなる群から選ばれる式で表されることを特徴とする、請求項１１に記載のｉＦＲＥＴ用探針：
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    

    
    

    
14. 請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法により製造された第２のｉＦＲＥＴ用探針又は請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のｉＦＲＥＴ用探針を、標的タンパク質を含有するサンプル内に添加する第１ステップと、
    標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長を含む光を照射し、前記ｉＦＲＥＴ用探針が発光する光を確認又は追跡する第２ステップと、
    を含み、
    ｉＦＲＥＴにより標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
15. 標的タンパク質の量又は標的タンパク質の活性を測定したり、標的タンパク質の作用機序又は移動経路の追跡のために用いられることを特徴とする、請求項１４に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
16. 前記ｉＦＲＥＴ用探針と併用して特定物質をサンプル内に添加し、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長を含む光を照射し、前記ｉＦＲＥＴ用探針が発光する光を確認又は追跡する第３ステップとを更に含み、特定物質の存在有無に応じて、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する光を照射して、前記ｉＦＲＥＴ用探針が発光する光の変化を確認し、
    標的タンパク質に対して所定機能を有する特定物質をスクリーニングしたり、又は前記特定物質の標的タンパク質に対する機能を確認することを特徴とする、請求項１４に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
17. 前記特定物質が、標的タンパク質と関連された疾患を予防、治療又は改善するための薬物又は食品添加剤であることを特徴とする、請求項１６に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
18. サンプルが、標的タンパク質自体、細胞、組織（tissue）、血液、糞尿、水、土壌、空気、食品、廃棄物、及び動植物組織及び生物体自体よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１４に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
19. 標的タンパク質の機能を確認したり、様々な検体から疾患関連標的タンパク質を検出する方法として用いて疾患診断したり、食品、飼料、飲料から微生物或いは微生物由来の標的タンパク質を検出する方法として用いられることを特徴とする、請求項１５に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
20. 第２ステップで、ｉＦＲＥＴ用探針が放出する光のうち、４５０ｎｍ又はそれ以上の長波長の光を確認又は追跡することを特徴とする、請求項１４に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
21. 自動化ワークステーションにより行われることを特徴とする、請求項１４に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
22. 請求項１１の固有の蛍光共鳴エネルギー転移（ｉＦＲＥＴ）用探針を用いた標的タンパク質の検出又はイメージ化の方法であって、
    前記ｉＦＲＥＴ用探針が、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子と、標的タンパク質の固有の蛍光に対するアクセプター機能を有する蛍光分子とが直接又はリンカーを介して結合されたものであり、
    前記ｉＦＲＥＴ用探針を標的タンパク質を含有する試料内に導入する第１ステップと、
    標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を交互に第１ステップで製造された試料に照射する第２ステップと、
    標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射し、ｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値とｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射し、ｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値とを分析し、第１発光信号値と第２発光信号値のレシオメトリック法（ratiometric measurement）により第３発光信号値を算出する第３ステップと
    を含むことを特徴とする、標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
23. 第１発光信号値、第２発光信号値及び第３発光信号値が、試料の２次元の各地点に対応される２次元的な映像値であることを特徴とする、請求項２２に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
24. 第１光の波長範囲が２６０ｎｍ〜３００ｎｍであり、第２光の波長範囲が３００ｎｍ〜４００ｎｍであることを特徴とする、請求項２２に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
25. 標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を一定時間の間隔で交互に照射し、
    標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射し、ｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射し、ｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値とからレシオメトリック法で第３発光信号値が一定時間の間隔で算出されて蓄積され、標的タンパク質の位置、量又は両者の経時的変化を確認することができることを特徴とする、請求項２２に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
26. 標的タンパク質の経時的変化が、動映像で算出されることを特徴とする、請求項２２に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
27. 標的タンパク質の量又は標的タンパク質の活性を測定したり、標的タンパク質の作用機序又は移動経路の追跡のために用いられることを特徴とする、請求項２２に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
28. 前記ｉＦＲＥＴ用探針と併用して特定物質を試料内に添加して標的タンパク質内のアミノ酸を励起する光を照射し、前記ｉＦＲＥＴ用探針が発光する光を確認又は追跡する第４ステップを更に含み、
    特定物質の存在有無に応じて、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する光を照射して前記ｉＦＲＥＴ用探針が発光する光の変化を確認し、標的タンパク質に対して所定機能を有する特定物質をスクリーニングしたり、前記特定物質の標的タンパク質に対する機能を確認することを特徴とする、請求項２２に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
29. 前記特定物質が、標的タンパク質に関連する疾患を予防、治療又は改善するための薬物又は食品添加剤であることを特徴とする、請求項２８に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
30. サンプルが、標的タンパク質自体、細胞、組織、血液、糞尿、水、土壌、空気、食品、廃棄物、及び動植物の組織及び生物体自体よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２２に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
31. 標的タンパク質の機能を確認したり、様々な検体から疾患関連標的タンパク質を検出する方法として用いて疾患診断したり、食品、飼料、飲料から微生物或いは微生物由来標的タンパク質を検出する方法として用いられることを特徴とする、請求項２８に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。
32. 自動化ワークステーションによって行われることを特徴とする、請求項２８に記載の標的タンパク質を検出又はイメージ化する方法。

Images