JP6206871B2 - 光学顕微鏡システム - Google Patents

Description

本開示は、光の回折限界サイズ以下であるナノメートルオーダーでの分解能で光学像を取得可能な超解像の光学顕微鏡システムに関し、特に、複数色の蛍光性粒子の位置を同時に把握することができる光学顕微鏡システムに関する。

光学顕微鏡とその周辺装置は、さまざまな分野での研究に貢献しているが、近年は特に観察対象物を撮像装置により撮像する機能を備え、撮像した静止画像や動画像の画像データをコンピュータや大型モニタなどの外部機器に送出して、画像解析や現象解析に供されるようになっている。また、光学顕微鏡により取得された画像を解析する解析手段が組み合わされることで、光学顕微鏡単体では把握不可能な、可視光域では数百ナノメートルオーダーである光の回折限界サイズ以下の微細な観察対象物を観察できる光学顕微鏡システムも実用化されている。

例えば、生命科学研究の分野では、高解像度の光学顕微鏡を用いて細胞内部の微細構造の変化や細胞分化パターンの解析など行うために、蛍光性物質を標識として用いて、その分布状況や位置の変化を観察することが行われている。生命科学研究分野における高解像度顕微鏡を用いた観察方法として、光活性化局在顕微鏡法、一分子蛍光追跡技術などが知られている。

光活性化局在顕微鏡法は、紫外線が照射されると活性化して励起光により発光する蛍光プローブによって観察対象の分子を標識し、分子内の蛍光プローブを順次活性化させてその位置を把握する作業を繰り返し、得た情報を画像として再構築するものである。活性化光の強度を制御して一度に活性化される蛍光プローブの数を制限することで、それぞれの蛍光プローブの発光を離散的な輝点として捉えることができ、得られた画像を合成することで、光学顕微鏡の光学系における回折解析サイズ以下の例えば１０ナノメートルの分解能で分子像を得ることができる（非特許文献１、特許文献１参照）。

また、一分子蛍光追跡技術は、モータータンパク質や膜タンパク質の動態などを、１分子ずつ観察する方法である。観察対象の分子を蛍光プローブで標識し、全反射照明蛍光顕微鏡などの背景光の小さい顕微鏡法により観察することで、分子の輝点の動きを動画として観察することができる。ガウスフィット法などによって輝点の位置を特定する作業を動画として得られた各フレームの画像に対して行うことで、数ミリ〜数十ミリ秒の分解能で分子のナノメートルレベルでの動態を追跡することができる（非特許文献２参照）。

特開２０１０−１０２３３２号公報

Eric Betzig et al. "Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution" SCIENCE vol.313 1642-1645 (2006) Yildiz A el al. "Myosin V walks hand-over-hand: single fluorescent imaging with 1.5-nm localization" SCIENCE vol.300 2061-5 (2003)

上記従来の光学顕微鏡を用いた観察手法によれば、いずれも光の回折限界サイズ以下の高い分解能での生体観察が可能である。

しかし、光活性化局在顕微鏡法では、一枚の超解像画像を得るために多数の画像を取得する必要があり、数分から数時間の時間が必要となる。このため、ナノメートル〜マイクロメートル空間で高速移動する生体分子の動態を観察することはできない。また、一分子蛍光追跡技術は、一分子の動態は観察できるが、光の回折限界以内の距離で近接する複数の分子の動きを同時に観察することができない。

そこで本願は、上記した従来の課題を解決して、光の回折限界サイズ内に存在する複数個の分子やナノ構造体が運動する様子を、ビデオレートと同等以上の高速で超解像観察することができる光学顕微鏡システムを得ることを目的とする。

上記課題を解決するために、本願で開示する光学顕微鏡システムは、複数色の蛍光プローブを用いて光の回折限界以下のサイズの対象物の光学画像を取得する光学顕微鏡システムであって、前記蛍光プローブを励起発光させる励起光を照射するレーザー光源と、前記励起光により励起された前記蛍光プローブの光像を得る光学系と、前記光学系で得られた光像をイメージング分光する分光器と、前記分光器で得られた分光画像を撮像して撮像画像を得る撮像装置とを有する光学顕微鏡と、前記撮像画像を解析してその輝点分布から前記複数色の蛍光プローブそれぞれの位置を推定する解析手段とを備え、前記光像において重なり合った複数の輝点を前記分光器によってスペクトル分離して観察することを特徴とする。

本願で開示する光学顕微鏡システムは、複数色の蛍光プローブの光像を分光器で分光し、得られた分光画像を撮像した撮像画像を解析することで蛍光プローブそれぞれの位置を推定する。このため、光の回折限界サイズ以下の領域に存在する複数の蛍光プローブの位置をその発光色に基づいて正確に分離推定することができ、観察対象物の超解像、かつ、高速での観察画像を得ることができる。

本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおける、光学顕微鏡部分の概略構成を説明するためのブロック図。 本開示にかかる光学顕微鏡の原理を説明するための模式図。 測定対象のミオシンＶと、本実施形態にかかる光学顕微鏡で得られた分光画像とを示す図。 ２つの量子ドットについて、観察開始時点の位置からの距離と時間との関係を示すグラフ。 本実施形態の光学顕微鏡システムの変形例の構成を説明するブロック構成図。 回転していない第１の光像と９０°回転した回転光像、さらに、それらが分光された分光画像とを模式的に示す図。 本実施形態の光学顕微鏡システムにより得られた、互いに回転した光像の具体例を示す図。 光の回折限界サイズ内の領域に配置された３つの蛍光プローブの二次元位置を分離観測した状態を示す図。 複数色の蛍光プローブの位置変化を二次元の動画像として捉えた様子を説明する図。 複数色の蛍光プローブの位置変化を二次元の動画像として捉えた様子を説明する図。 分離光学系により得られた２つの光像において、同一の蛍光プローブからの発光を特定する方法を説明する図。

本開示の光学顕微鏡システムは、複数色の蛍光プローブを用いて光の回折限界以下のサイズの対象物の光学画像を取得する光学顕微鏡システムであって、前記蛍光プローブを励起発光させる励起光を照射するレーザー光源と、前記励起光により励起された前記蛍光プローブの光像を得る光学系と、前記光学系で得られた光像をイメージング分光する分光器と、前記分光器で得られた分光画像を撮像して撮像画像を得る撮像装置とを有する光学顕微鏡と、前記撮像画像を解析してその輝点分布から前記複数色の蛍光プローブそれぞれの位置を推定する解析手段とを備えている。

このようにすることで、光の回折限界サイズである数百ナノメートルオーダーよりも小さい領域内に存在するため、光学的には互いに重なり合った状態で観察される複数色の蛍光プローブを、その発光色によって分離し、解析手段によってそれぞれの位置を推定することができる。このため、ナノメートルオーダーの高い分解能で対象物を観察することができる。また、カメラの撮像速度で、分光と空間座標取得が同時に行えるため、高速観察が可能となる。

本開示の光学顕微鏡システムにおいて、前記光学系が、前記蛍光プローブの第１の光像を得る第１の部分光学系と、前記第１の光像に対して左右いずれかに９０°回転した回転光像を得る第２の部分光学系とからなる分割光学系を有し、前記分光器は、前記第１の部分光学系により得られた前記第１の光像と前記第２の部分光学系で得られた前記回転光像とを同時にイメージング分光し、前記撮像装置は、前記第１の光像の分光画像と前記回転光像の分光画像とを一つの撮像画像として撮像することが好ましい。このようにすることで、互いに９０°回転した２つの光像に基づく分光画像を一つの撮像画像として取得することができる。

また、前記第１の光像の分光画像と前記回転光像の分光画像から得られた、前記複数色の蛍光プローブそれぞれの位置を対応させることで、前記複数色の蛍光プローブの二次元の配置位置を特定することが好ましい。このようにすることで、観察対象物の二次元での位置情報を容易に取得することができる。

さらに、前記蛍光プローブとして量子ドットを用いることが好ましい。一つの励起光により発光し、多数色の指標として実現可能である量子ドットを用いることで、最大十数個程度の複数色の蛍光プローブを同時に分離観察することができる。

前記解析手段が、ガウスフィット法により前記撮像画像の輝度分布から前記蛍光プローブの位置を推定することが好ましい。ガウス関数を用いるガウスフィット法を用いることで、それぞれの蛍光プローブの位置を、高速かつ正確に推定することができる。

前記撮像装置がビデオレート以上で前記撮像画像を撮像し、得られた撮像画像から前記蛍光プローブの位置変化の動画像を得ることが好ましい。このようにすることで、観察対象物の動態を動画像として観察することができる。

また、前記光学顕微鏡は、当該顕微鏡装置の動作制御を行う制御部をさらに備え、前記解析手段が前記制御部の機能として組み込まれていることが好ましい。このようにすることで、高い分解能を実現した光学顕微鏡を単体で実現することができる。

（実施の形態）
以下、本開示にかかる光学顕微鏡システムの実施形態について、図面を参照しながら説明する。

図１は、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおける、光学顕微鏡部分の概略構成を説明するためのブロック図である。

図１に示す光学顕微鏡において、観察対象物１は、図１では図示しないステージに配置され、ステージを操作することでｘ、ｙ、またはｚの各方向それぞれに微調整が可能となっている。

観察対象物１には、対物レンズ２を通して、レーザー光源３からのレーザー光４が照射される。レーザー光源３から照射されるレーザー光４は、一例として波長４８８ｎｍの青色半導体レーザーとすることができる。

レーザー光源３から照射されたレーザー光４は、ビームエキスパンダー５によって所定の太さの平行光束とされ、青色反射のダイクロイックミラー６によって反射されて、対物レンズ２を介して観察対象物１に照射される。対物レンズ２は、一例として開口数ＮＡ＝１．４、倍率１５０倍のものを用いることができる。

なお、図１では、レーザー光４が対物レンズ２を介して照射される同軸の落射照明の例を示したが、本実施形態の光学顕微鏡では、試料面全体を一様に照明する照明法（一様照明）であれば、図示した同軸の落射照明の他にも、側射照明、全反射照明、透過照明などの他の照明法も採用可能である。全反射照明を用いた場合には、溶液中に漂う蛍光物質からの背景光を抑制することができるので、試料中の蛍光プローブを検出しやすいというメリットがある。

観察対象物１に照射されたレーザー光４は、観察対象物１に標識されている蛍光プローブを励起発光させる。なお、本実施形態では、蛍光プローブとして量子ドット（Quantum dot：ＱＤ）を用いている。量子ドットについての詳細は、後述する。

レーザー光４により励起発光された蛍光プローブの光像７は、青色のレーザー光４に対して長波長側である緑色〜赤色側にシフトしている。このため、光像７は、対物レンズ２を通過した後青色反射のダイクロイックミラー６を透過し、レンズやミラー、絞りなどの光学部材により構成された拡大リレー光学系８により、トータル倍率が数百倍程度（本実施形態の場合は、一例として３７５倍）となるように拡大される。

拡大された観察対象物１の光像７は、集光レンズ９により集光されてスリット１０を介して分光器１１に入射し、分光される。本実施形態では、分光器１１として分散型イメージング分光器を用いている。分光器１１としては、反射型もしくは透過型の回折格子や反射型もしくは透過型のプリズムなどを用いた各種の分散型分光器を使用することができ、スリット１０と垂直な軸方向に光波を分光するとともに、スリット１０と平行な方向には空間位置情報がそのまま結像された分光画像が得られる。

分光器１１によって分光された蛍光プローブの発光７の分光画像は、分光器１１に取り付けられた撮像装置１２であるＥＭ−ＣＣＤ（Electron Multiplying CCD）により撮像されて、撮像画像が得られる。

撮像装置１２が撮像した撮像画像は、図示しない解析手段としての解析部に出力され、解析部において撮像画像上の輝点分布に基づいてその中心位置としての蛍光プローブ位置が算出される。本実施形態の光学顕微鏡システムでは、撮像画像データから、蛍光プローブの中心位置を推定する手法として最も優れているとされる、ガウス関数によりフィッティングを行うガウスフィット法を用いている。また、本実施形態の光学顕微鏡システムでは、撮像画像における輝点の分布形状を考慮して楕円ガウス関数を用いたガウスフィット法を用いている。なお、ガウスフィット法以外にも、相互相関によるパターンフィッティング法や、光強度を重みとした重心位置計算法などをはじめとする各種数値解析手法を用いることができる。

なお、本実施形態の光学顕微鏡システムにおける解析部は、取得した撮像画像データに対して一定の計算処理を行い、蛍光プローブの位置を把握してその位置データを出力可能なものであればよい。このため、解析部は、撮像装置１２で撮像された撮像画像が入力されたコンピュータとして実現することができる。また、光学顕微鏡がレーザー光源３や観察対象物１が配置されたステージの移動制御、オートフォーカス制御などの顕微鏡装置自体の各種制御を行う制御部を備えている場合などに、解析手段は、制御部におけるマイコンユニットに組み込まれた一つの機能として光学顕微鏡と一体で実現することができる。

さらに、撮像装置１２で撮像された画像、および／または、解析部で解析された結果としての蛍光プローブの位置を示す画像等を表示するモニタとして、解析部として機能する外部のコンピュータのディスプレイを用いることができる。さらに、光学顕微鏡が画像表示パネルを備え、この画像表示パネルを、解析部で解析された結果としての蛍光プローブの位置を示す画像等を表示するモニタとして利用する構成も可能である。

図２は、本開示にかかる光学顕微鏡システムによって、観察対象物として、光の回折限界サイズ以下である数十ナノメートルレベルの領域に配置された複数色の蛍光プローブを分離区別して、それぞれの蛍光プローブの位置を把握できる原理を説明するための模式図である。

図２において、図２（ａ）が観察対象物としての蛍光プローブの配置状態を、図２（ｂ）が図１を用いてその構成を説明した光学顕微鏡により光学的に把握された観察対象物の光像を、図２（ｃ）が分光器により分光された分光画像を、それぞれ示している。

図２（ａ）に示すように、４色の蛍光プローブが観察対象物において密集した状態で配置されているとする。図２（ａ）に示す蛍光プローブは、上から緑色２１、オレンジ２２、黄色２３、赤色２４の順に並んだ４色である。なお、本実施形態の光学顕微鏡システムでは、蛍光プローブとして各色の量子ドットが使用された状態を想定している。蛍光プローブとして使用される量子ドットは、ポリマーコーティングされた粒子径が数ナノメートル〜２０ナノメートル程度の半導体微粒子であり、市販品としては、５００ｎｍから８００ｎｍのものが広く流通している。

蛍光プローブである量子ドットの粒径が光の回折限界である数百ナノメートルを下回っているため、図２（ｂ）に示す、光学顕微鏡により得られた光像（一例として３７５倍のもの）では、４つの量子ドット２１〜２４の輝点がいずれも滲んで一つに重なり合っていて、これを区分することはできない状態である。

一方、図２（ｂ）に示した光像を分光器でスペクトル分離した、図２（ｃ）に示す分光画像では、４つの量子ドット２１〜２４が、左から緑色２１、黄色２３、オレンジ２２、赤色２４の順に分離して表示される。それぞれの輝点は光の回折限界以下のサイズであるために分光画像においても滲んでいるが、スペクトルに応じて図中横方向に分離されて表示されているため、４つの輝点を別々に把握することが可能である。このように、分光器によってスペクトル分離された４つの輝点それぞれに対して、ガウスフィット法による数値解析を行って、輝点の輝度分布形状からその中心位置を推定することができる。この結果、図２（ｃ）に示すように、４つの量子ドット２１〜２４のＹ方向の位置（Ｙ座標値）ｙ１〜ｙ４を特定することができる。

本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、分光画像を撮像した撮像画像の画像データを用いて、分光画像として現れた各輝点に対して解析部がガウスフィット法によりその中心位置を計算している。特に、図２（ｃ）に示すように、分光器によりスペクトル分光された分光画像における輝点が、スペクトル解析を行っている関係から真円ではなく横長の長円形となることに対応して、前述のように楕円ガウス関数を用いたガウスフィット法による解析を行い、横方向である分光の方向と縦方向とで幅が異なることを想定したフィッティングパラメータを用いている。このように、一つの輝点に対してガウスフィット法での解析を行う対象となる領域を、真円ではなく長円形であるとして解析対象のデータを予め限定するなどの工夫によって、撮像画像の画像データから輝点の中心位置を推定するまでに必要な処理時間を短縮することができる。

図３、および、図４は、本実施形態の光学顕微鏡システムを用いて、モータータンパク質であるミオシンＶがアクチンフィラメント上を移動している様子を、２つのモータード
メインそれぞれを異なる色の量子ドットで標識して観察した観察結果を示している。

図３の左側に模式図を示すように、アクチンフィラメント３１上を移動するミオシン３２の２本のそれぞれのモータードメイン（ヘッド部位）に、一方は緑色の量子ドット３３（発光波長５６５ｎｍ）、もう一方に赤色の量子ドット３４（発光波長６５５ｎｍ）の２色の量子ドットで標識する。具体的には、ミオシンのモータードメインをビオチン修飾し、ストレブトアビジン修飾した量子ドットをビオチンアビジン結合による標識を行った
このとき得られたビデオレートでの動画像から、１フレーム分の撮像画像をガウスフィット法を用いて解析して、それぞれの量子ドットの輝点位置を特定したものが、図３右側の写真である。図３右側の写真では、左側の輝点が緑色の量子ドット３３を、右側の輝点が赤色の量子ドット３４を、それぞれ示している。

また、図４は、２つの量子ドット３３、３４の、観察開始時点の位置である基点からの距離と時間との関係とを示すグラフである。

図４から、２つの量子ドット３３、３４が、時に前後の位置を入れ替えながら交互に歩くようにして基点位置から移動する様子を明確に把握することができる。また、２つの量子ドット３３、３４が移動する様子を動画像として観察することも可能である。

このように、本実施形態の光学顕微鏡システムによれば、光の回折限界サイズ以下の極めて小さな領域における複数個の蛍光プローブの位置を、それぞれが近接した状態であっても正確に特定することができ、さらに、蛍光プローブの位置の変化をビデオレートでの動画像として表すことができる。このため、従来は直接的に観察することが困難であったタンパク質の動態などを、容易に観察することができる。

次に、本実施形態の光学顕微鏡システムの変形例として、蛍光プローブの二次元の位置を特定することができる光学顕微鏡の構成と、解析手段における蛍光プローブの位置の特定方法について説明する。

図５は、本実施形態の光学顕微鏡システムの変形例の構成を説明するブロック構成図である。

図５に示す変形例の光学顕微鏡システムでは、図１を用いて説明した光学顕微鏡部分の構成に加えて、拡大リレー光学系で拡大された観察対象物の光像を、そのままの向きの第１の光像と９０°回転させた回転光像とに分割する分割光学系を備えている点が異なる。

なお、図５に示した、変形例の光学顕微鏡システムの光学顕微鏡部分の構成において、レーザー光源３や対物レンズ２、分光器１１や撮像装置１２については、図１に示したものと同じものをそのまま用いることができる。このため、図５において、これら図１で説明した光学顕微鏡の構成と共通する部材には同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。

図５に示す光学顕微鏡の構成では、対物レンズ２、青色反射のダイクロイックミラー６を透過して、拡大リレー光学系８でトータル３７５倍に拡大された観測対象物１の光像７は、分割光学系４１の無偏光型のハーフミラー４２によって、２つの光像４３、４４に分離される。

このうちの一方の光像である第１の光像４３は、第１のミラー４５、第２のミラー４６、第３のミラー４７と第１の集光レンズ４８からなる第１の部分光学系４９を経て、分光器１１のスリット１０に集光されて入射する。第１の部分光学系４９を形成する第１のミラー４５と第２のミラー４６とが、互いにその反射面が正対するように配置されているため、第１の部分光学系４９を経た第１の光像４３は、対物レンズで得られた観察対象物１の光像７からの回転は生じていない。

ハーフミラー４２によって分割された他方の光像である回転光像４４は、第４のミラー５０、第５のミラー５１、第６のミラー５２、集光レンズ５３からなる第２の部分光学系５４を経て、分光器１１のスリット１０に集光されて入射する。なお、スリット１０において、第１の部分光学系４９を経た第１の光像４３と、第２の部分光学系５４を経た回転光像４４とは、その入射位置が重ならないように上下方向にずれて入射する。図５に示した例の場合は、第１の部分光学系４９を経た第１の光像４３が上側に入射するようになっている。

第２の部分光学系５４では、第４のミラー５０の反射面がハーフミラー４２の反射面に対して９０°ずれた方向に配置されているため、第２の部分光学系５４を経た回転光像４４は、第１の部分光学系４９を経た第１の光像４３と比較して、９０°回転した光像となっている。

図６は、図５で説明した分割光学系を経て分光器に入射した、回転していない第１の光像と９０°回転した回転光像、さらに、それぞれの光像の分光器により分光された分光画像とを模式的に示したものである。

図６において、図６（ａ）が観察対象物としての蛍光プローブの配置位置の関係を、図６（ｂ）が第１の部分光学系を経た回転していない第１の光像を、図６（ｃ）が、図６（ｂ）に示した第１の光像から分光器により得られた分光画像を、それぞれ示している。また、図６（ｄ）が、第２の部分光学系を経た、第１の光像に対して９０°回転した状態の回転光像を、図６（ｅ）が、回転光像から分光器により得られた分光画像を示している。

なお、図６では、図６（ａ）に示したように、緑色６１、黄色６２、オレンジ６３、赤色６４の４色の蛍光プローブが二次元的に広がって配置されている状態を想定した。また、蛍光プローブとしては、図２の場合と同様に、いずれも量子ドットが用いられたことを想定している。

図６において、図６（ｂ）として示した第１の光像では、図２（ａ）と同様に、４つの量子ドット６１〜６４の輝点はいずれも滲んで一つに重なり合っているが、第１の光像を分光器でスペクトル分離した図６（ｃ）に示す分光画像では、左から緑色６１、黄色６３、オレンジ６２、赤色６４の順に輝点が分離して表示されているため、４つの量子ドット６１〜６４の輝点を別々に把握することが可能である。分光器によってスペクトル分離された撮像画像における４つの輝点それぞれに対して、ガウスフィット法による数値解析を行うことで輝点の輝点分布形状からその中心位置を推定し、それぞれの量子ドット６１〜６４のｙ座標を特定することができる。

また、図６（ｂ）に示した第１の光像に対して９０°回転させた状態の図６（ｄ）として示す回転光像を、分光器でスペクトル分離した図６（ｅ）に示す分光画像でも、４つの量子ドット６１〜６４の輝点は、緑色６１、黄色６３、オレンジ６２、赤色６４に分離して表示されるため、４つの輝点を別々に把握することが可能であり、それぞれに対してガウスフィット法による数値解析を行うことでその中心位置を推定することができる。回転光像は、第１の光像に対して９０°回転した状態のものであるから、回転光像の分光画像から推定した量子ドットの中心位置は、それぞれの量子ドットのｘ座標を特定するものとなる。

回折格子やプリズムなどを用いた、本実施形態の光学顕微鏡システムに用いられる分光器では、分光画像の一方向（図２および図６では横軸方向）に、スペクトル解析されるため、分光された輝点の位置情報としては、スリットの延在方向である一方向（図２および図６の場合における上下方向）のみが得られることになる。

そこで、本実施形態の光学顕微鏡システムでは、図５に示したように、光学顕微鏡の光学系として、分光器１１に集光入射される段階での光像が、互いに９０°回転した２つの光像となるようにする分割光学系を備え、それぞれの光像に対する２つの分光画像から得られた２軸方向の位置情報を互いに相関付けることにより、観察対象の蛍光プローブの二次元の配置位置を特定することができるようにしている。

図７は、本実施形態の光学顕微鏡システムにより取得された、互いに回転した光像の具体例を示している。なお、図７は、分割光学系で得られた２つの光像が正しく回転したものであることを検証するためのものとして、ガラス基板上に４つの蛍光プローブを配置した試料を観察対象物としている。

図７（ａ）が、スリット１０を介して分光器１１に入射された状態での互いに回転した第１の部分光学系４９を経た第１の光像４３と、第２の部分光学系５４を経た回転光像４４とを示したものである。図７（ｂ）として切り出された、第１の部分光学系４９を経て得られた第１の光像４３は、図に示すように左右方向がｘ軸、上下方向がｙ軸となっていて、観察対象物そのままの配置を示している。

一方、図７（ｃ）として切り出された、第２の部分光学系５４を経た回転光像４４は、図に示すように左右方向がｙ軸、上下方向がｘ軸となっていて、観察対象をそのまま表した第１の光像４３を９０°回転させたものであることがわかる。なお、図５に具体例を示した分割光学系４１によって得られた光像であるため、図７（ｃ）として示す９０°回転された状態の回転光像４４は、図７（ｂ）として示す回転していない第１の光像４３に対して裏返しの関係にある。図７（ｄ）として示すように、図７（ｃ）に示した回転光像４４を裏返して回転させた像４４’は、図７（ｂ）として示した回転していない状態の第１の光像４３と一致することがわかる。このように、図５に示した分割光学系４１を経ることで、互いに９０°回転した状態の２つの光像４３、４４を得ることができる。

なお、本実施形態の光学顕微鏡システムでは、回転していない第１の光像と９０°回転した状態の回転光像とをそれぞれ分光分析し、得られた分光画像から各輝点の位置情報である座標値を求めて、これを対応付けることで二次元の配置位置を特定している。このため、回転した光像から正しいｘ座標が得られれば、その画像がさらに軸対象操作が加わってＹ軸に対して反転していることは問題とならない。分光器におけるスリットの延在方向に対して、互いに９０°回転した状態の２つの光像を得ることができれば、それぞれ互いに直交する一次元方向の蛍光プローブの配置位置が特定でき、これを組み合わせることで二次元での蛍光プローブの配置位置を特定することができる。この場合、９０°回転の方向は右方向（時計回り）、または、左方向（半時計回り）のいずれでもよい。

図８は、本実施形態の光学顕微鏡システムにより、光の回折限界サイズ内の領域に配置された３つの蛍光プローブの二次元位置を分離観測した状態を示している。

図８（ａ）が、分光器に入射された状態の光像を、図８（ｂ）が分光器により分光分離された分光画像を示している。図８（ａ）、図８（ｂ）において、いずれも上側半分が、観察対象物そのままの配置状態の第１の光像および第１の光像から得られた分光画像であり、下側半分が、第１の光像を９０°回転させた回転光像および回転光像から得られた分光画像である。したがって、図８（ｂ）の上側半分からそれぞれの蛍光プローブのｙ軸座標が定まり、図８（ｂ）の下側半分からそれぞれの蛍光プローブのｘ軸座標が定まる。

図８（ａ）で、図中に矢印で示す輝点は、上半分の第１の光像における輝点７１、下半分の回転光像における輝点７２ともに、いずれも一つの輝点として見える。しかし、分光画像を示す図８（ｂ）によれば、輝点７１と輝点７２とは、いずれも青緑色の量子ドット７３（発光波長５２５ｎｍ）、緑色の量子ドット７４（発光波長５６５ｎｍ）、赤色の量子ドット７５（発光波長６５５ｎｍ）の３つの量子ドット７３〜７５の輝点が重なり合ったものであることがわかる。

図８（ｂ）で分光された３色の量子ドット７３〜７５の輝点に対して、それぞれガウスフィット法による解析を行うことで輝点の中心位置を推定し、それぞれの量子ドット７３〜７５のｘ座標とｙ座標の数値を特定した。３つの量子ドット７３〜７５について、それぞれ推定された座標値を元にｘ−ｙ座標の平面に二次元的に表したものが図８（ｃ）である。

図８（ｃ）での表示に当たっては、図８（ａ）、図８（ｂ）として、３０フレーム／秒のビデオレートで撮像した動画像の各フレーム画像に基づいてそれぞれの量子ドット７３〜７５のｘ座標値とｙ座標値を推定し、これをそのままプロットした。顕微鏡の物理的な振動や量子ドットの輝度や発光波長の微細な変化等により、各フレーム画像から得られた量子ドットの推定位置の数値に揺らぎがあるが、図８（ｃ）に示すように３つの量子ドット７３〜７５の位置が、数ナノ〜１０ナノメートルのオーダーで特定できていることがわかる。

図８（ｄ）は、参考までに、光学顕微鏡で得られた二次元の光像をそのまま表したものである。なお、参照のため、図８（ｄ）には、図８（ｃ）で把握された３つの量子ドット７３〜７５の二次元位置を重ねてプロットしている。図８（ｄ）に示すように、３つの量子ドット７３〜７５は光の回折限界サイズよりもはるかに小さな間隔で配置されているため、得られた光像では小さな滲んだ一つの輝点にしか見えない。これに対して、図８（ｃ）に示すように、３つの量子ドット７３〜７５の二次元位置が特定できる本開示の光学顕微鏡システムによる解析画像が、高い分解能を有するものであることが理解できる。

本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、分割光学系を用いて取得された二次元の蛍光プローブの配置位置情報についても、これを動画像として得ることが可能である。

以下、図９、図１０を用いて、モータータンパク質であるミオシンＶが、アクチンフィ
ラメント上を移動する様子を本開示の蛍光顕微鏡システムにより二次元的に動画解析をした結果を示す。図９、図１０においては、図３、図４を用いた場合と同様にミオシンＶの
モータードメインを４つの蛍光プローブで標識して、それぞれ蛍光プローブが移動する状態を示している。なお、図９、図１０で示す例では、図３，図４の場合に比べて量子ドットの濃度を低く抑えることで、ミオシンの２つのモータードメインの内の一方のみが標識されるようにした。

図９（ａ）は、ミオシンＶの初期状態における光像に基づいて分光器で得られた分光画
像である。図９（ａ）においても上記図８（ｂ）と同様に、上半分がｙ座標位置を決める回転していない第１の光像から得られた分光画像、下半分がｘ軸方向を特定する９０°回転した回転光像から得られた分光画像である。

図８を用いて説明したと同様に、図９（ａ）の上下それぞれの輝点に対して、ガウスフィット法に基づく解析を行ってその中心位置を推定し、それぞれの蛍光プローブのｘ座標とｙ座標とを求め、これを二次元的に示したものが図９（ｂ）である。すなわち、図９（ｂ）は、観察開始時点の初期状態における４つの量子ドット９１〜９４の位置を二次元で示している。

以下、図９（ｃ）が観察開始から１０秒後、図９（ｄ）が２０秒後、図１０（ａ）が３０秒後、図１０（ｂ）が４０秒後、図１０（ｃ）が５０秒後、図１０（ｄ）が６０秒後、図１０（ｅ）が７０秒後、図１０（ｆ）が８０秒後と、４つの量子ドット９１〜９４の１０秒ごとの二次元的な位置を示す。

図９（ｂ）から図１０（ｆ）として示した各図より、ミオシンの移動に伴って４つの量子ドットの位置が変化していることがわかる。図９と図１０では、途中の画像を省略して観察開始から１０秒経過ごとの４つの量子ドット９１〜９４の位置を示したが、本実施形態の光学顕微鏡システムでは、４つの量子ドット９１〜９４の二次元的な位置の変化をビデオレートで撮影、再現することができるので、ミオシンのモータードメインをそれぞれ指標した４つの量子ドット９１〜９４が移動する様子を動画像として観察することができる。

特に、図９、図１０における量子ドット９１、９２のように、複数の量子ドットが極めて近い位置に存在している場合でも、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムによれば、その発光波長に基づいて明瞭に区分することかできる。

なお、図８、図９、図１０を用いて説明した、二次元での蛍光プローブ位置を特定する場合には、回転していない第１の光像と９０°回転した回転光像との間で、どの２つの輝点が同一の量子ドットからの発光であるかを特定し、別々に得られるｘ座標値とｙ座標値とを正しく対応させる必要がある。特に、図７の例のようにスリット幅を輝点のサイズよりも大きく広げて計測する場合、分光された光像上の各輝点の波長は知ることができないため、同一の量子ドットからの輝点の組み合わせを特定することが難しい。

本実施形態の光学顕微鏡システムでは、このような場合に、分光画像における量子ドットのスペクトル揺らぎを利用して、同じ量子ドットからの発光であるか、異なる量子ドットからの発光であるかを区別する。

本実施形態の光学顕微鏡システムにおいて、蛍光プローブとして利用している量子ドットは、半導体ナノ粒子の蛍光発光であるため、発光強度と発光波長とが時間的にわずかに変化する（揺らぐ）という特徴を有する。上記説明したように、本実施形態の光学顕微鏡システムでは、対物レンズで得られた一つの光像を分離光学系によって光学的に分離して、回転していない第１の光像と９０°回転した回転光像とを得ているため、第１の光像と回転光像とは同じタイミングで取得されたものであるから、量子ドットの発光が揺らげば、２つの光像における輝点は同じタイミングで発光輝度や発光波長の微細な変化が生じる。したがって、発光輝度や発光波長の揺らぎを比較すれば、２つの輝点が同じ量子ドットの発光であるかそうでないのかを容易に判別することができる。

図１１は、２つの輝点の発光強度のゆらぎに基づいて、回転していない第１の光像から得られた分光画像における輝点と、９０°回転した回転光像からの分光画像における輝点とを対応付けた結果を示す。

図１１では、４色の量子ドット９１〜９４が回折限界サイズ内に存在している状態を観測し、撮像画像におけるそれぞれの輝点の発光輝度の変化から、第１の光像に基づく上半分の画像に現れた４つの輝点９１ａ、９２ａ、９３ａ、９４ａと、回転光像に基づく下半分の画像に現れた４つの輝点９１ｂ、９２ｂ、９３ｂ、９４ｂとを対応付けたものである。

図１１右側に示す表は、対応付けた４つの輝点９１〜９４について、発光輝度の揺らぎの相関を総当たりで求めた際の、ピアソンの積率相関係数における相関値を示したものである。図１１の右側に示した対応表に示すように、２つの光像から得られた輝点の発光輝度の揺らぎは、互いに対応すると想定した輝点同士で他の輝点との間のものよりも極めて高い相関度合いを示している。この結果から、４つの輝点について正しく対応付けられたと判断することができる。

本実施形態の光学顕微鏡システムでは、このようにして分離光学系によって得られた２つの光像に基づく２つの輝点を正しく対応付けることができるので、複数の蛍光プローブの二次元位置の特定を正確に行うことができる。

以上説明してきたように、本開示の光学顕微鏡システムによれば、回折限界サイズ以下の狭い領域に、複数色の蛍光プローブが存在している場合でも、光学顕微鏡で得られた光像を分光器でイメージング分光することにより、容易に分離してそれぞれの蛍光プローブの位置を推定することができる。

また、蛍光プローブの光像として、互いに９０°回転した２つの光像を光学的に得ることにより、蛍光プローブの分光画像からｘ座標とｙ座標とを特定することができるので、蛍光プローブの位置を二次元で表すことができる。

さらに、本開示の光学顕微鏡システムは、スペクトル情報と２次元空間情報を同時に取得する手段として、従来行われていた、空間的なビーム走査をしながら１点ずつスペクトルを取得する方法や光学フィルタなどを順次切り替えていくことで波長掃引していく方法のようにデータ取得に時間を要する方法とは異なり、空間走査や波長掃引をすることなく、カメラの撮像速度で分光と空間座標取得を同時に行うことができる。このため、高速での観察が可能となり、複数色の蛍光プローブの位置の変化を動画像として表すことができる。さらにまた、解析時間を短くすることなどにより、将来的にはリアルタイムでの動画表示が可能となることも想定できる。

なお、上記実施形態において、蛍光プローブとして量子ドットを用いる例を説明した。量子ドットは、一つの励起光によってそれぞれ特有の波長で発光し、蛍光発光のスペクトル幅が狭いため分光により分離しやすい。また、材料や粒径を工夫することで、現在市販されているもの以外にも、可視光から近赤外光までの幅広い領域に渡って、さまざまな波長のものが得られる可能性が高い。このため、複数色の蛍光プローブをその発光波長により分離して観測可能な本開示の光学顕微鏡システムでの観測における指標として好ましい。特に、分子を蛍光プローブで標識する場合に、どの分子がどの蛍光プローブで標識されるかは確率的に定まるため、分離観察したい分子の数以上の蛍光プローブが必要となる。このため、多数の蛍光スペクトルが実現可能である量子ドットは、本開示にかかる光学顕微鏡システムでの生命科学分野における観察に用いられる蛍光プローブとしてとても有効である。

なお、本開示の光学顕微鏡システムでは、異なる波長の蛍光プローブを分光画像により分離してそれぞれを判別するものであるため、発光波長が異なる複数種類の蛍光プローブであれば、量子ドット以外の従来からの各種蛍光プローブも使用可能である。量子ドット以外の蛍光プローブを用いる場合には、励起発光が維持される時間が長く、一回の励起光の照射で全ての蛍光プローブが発光するものであることが好ましい。

また、上記実施形態では、光学系による拡大倍率を約４００倍とした例を示した。本開示にかかる光学顕微鏡では、光学的に得られた光像を、分光器を介して分光画像を得、これを撮像装置で撮像した撮像画像に基づいて解析部で解析して輝点の中心位置を推定する関係から、撮像装置における撮像素子の大きさと撮像画像として得られた光像との関係において、一つの輝点を撮像する素子が少なすぎる場合には、輝点の輪郭部分の測定精度が落ちて、正確な中心位置の推定ができなくなるおそれがある。このため光学顕微鏡の拡大倍率は、撮像装置の撮像素子の大きさにより定まる解像度との関係で適宜定めるべきものである。一例として、少なくとも一つの輝点を、一辺が７〜１０個程度の撮像素子で撮像されるような状態、輝点全体を５０〜１００個以上の撮像素子で撮像できる状態となるように、光学倍率を確保することが好ましい。

また、上記実施形態において説明した光学顕微鏡部分の構成は例示に過ぎない。例えば、レンズやミラーの個数や配置位置などの光学系については、適宜設計により変更できるものである。さらに、蛍光プローブの二次元配置を測定する方法において、図５を用いて分割光学系を備える例について説明したが、互いに９０°回転した２つの光像を得る方法は分割光学系を用いる方法には限られない。本開示にかかる光学顕微鏡システムにおいては、上記例示した方法に限らず、ｘ軸方向とｙ軸方向の輝点の位置を対応付けて得ることができる各種の方法を採用することができる。また、光学顕微鏡として、分光器や撮像装置を２つ備え、それぞれが別々の分光画像や撮像画像を取得する構成とすることも可能である。

なお、数学的には、平行でない任意の２つのベクトルの線形結合によっても、二次元平面上の任意の位置を表すことができるため、回転角度は９０度である必要はなく、互いに異なる２つの軸方向における位置が検出可能な２つの光像が得られる各種の光学的、解析的な手法を採用することができる。

本開示にかかる光学顕微鏡によれば、光の回折限界サイズ以下の領域に配置された、数個から十数個の異なる発光色の蛍光プローブの位置を推定することができる。このため、特に生命科学研究の分野では、従来は動態観察結果と固定試料の観察結果との組み合わせでのみ議論されてきた、筋肉を構成する多数のミオシン分子の同時観察や、細胞膜上の受容体タンパク質の離合集散の観察など、分子の協同的な運動によって機能を生み出す生体ナノシステムの機構解明のための直截的なアプローチが可能となるという、極めて高い効果が期待できる。

本願で開示する光学顕微鏡システムは、光の回折限界以下の極めて微細な領域を観察対象として、複数種類の発光色の蛍光プローブの位置を分離把握することができる高い分解能と、動画像の取得も可能とする高速対応の光学顕微鏡システムとして、生命科学分野をはじめとする各種分野での研究への貢献が期待できる。

１ 観察対象物
３ レーザー光源
８ 拡大光学系（光学系）
１１ 分光器
１２ ＥＭ−ＣＣＤ（撮像装置）

Claims (7)

1. 複数色の蛍光プローブを用いて光の回折限界以下のサイズの対象物の光学画像を取得する光学顕微鏡システムであって、
   前記蛍光プローブを励起発光させる励起光を照射するレーザー光源と、
   前記励起光により励起された前記蛍光プローブの光像を得る光学系と、
   前記光学系で得られた光像をイメージング分光する分光器と、
   前記分光器で得られた分光画像を撮像して撮像画像を得る撮像装置とを有する光学顕微鏡と、
   前記撮像画像を解析してその輝点分布から前記複数色の蛍光プローブそれぞれの位置を推定する解析手段とを備え、
   前記光像において重なり合った複数の輝点を前記分光器によってスペクトル分離して観察することを特徴とする光学顕微鏡システム。
2. 前記光学系が、前記蛍光プローブの第１の光像を得る第１の部分光学系と、前記第１の光像に対して左右いずれかに９０°回転した回転光像を得る第２の部分光学系とからなる分割光学系を有し、
   前記分光器は、前記第１の部分光学系により得られた前記第１の光像と前記第２の部分光学系で得られた前記回転光像とを同時にイメージング分光し、
   前記撮像装置は、前記第１の光像の分光画像と前記回転光像の分光画像とを一つの撮像画像として撮像する請求項１に記載の光学顕微鏡システム。
3. 前記第１の光像の分光画像と前記回転光像の分光画像から得られた、前記複数色の蛍光プローブそれぞれの位置を対応させることで、前記複数色の蛍光プローブの二次元の配置位置を特定する請求項２に記載の光学顕微鏡システム。
4. 前記蛍光プローブとして量子ドットを用いる請求項１〜請求項３のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。
5. 前記解析手段が、ガウスフィット法により前記撮像画像の輝度分布から前記蛍光プローブの位置を推定する請求項１〜４のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。
6. 前記撮像装置がビデオレート以上で前記撮像画像を撮像し、得られた撮像画像から前記蛍光プローブの位置変化の動画像を得る請求項１〜５のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。
7. 前記光学顕微鏡は、当該顕微鏡装置の動作制御を行う制御部をさらに備え、前記解析手段が前記制御部の機能として組み込まれている、請求項１〜６のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。